CN111057750A - 检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法 - Google Patents

检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法 Download PDF

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CN111057750A CN201911063913.7A CN201911063913A CN111057750A CN 111057750 A CN111057750 A CN 111057750A CN 201911063913 A CN201911063913 A CN 201911063913A CN 111057750 A CN111057750 A CN 111057750A
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崔晓燕
段子一
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Abstract

一种检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，检测方法包括如下步骤：分别收集d0细胞和d7细胞，分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA；分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA；以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，检测计算出d0细胞和d7细胞的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量，当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。上述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，通过检测诱导第7天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量，能够判断间充质干细胞是否具有较大成脂潜力，对间充质干细胞的成脂诱导培养过程具有重要意义。

Description

检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，特别是涉及一种检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜、胎盘、脐带血及脐带组织中，在相应条件下可被诱导分化为骨、脂肪、软骨、神经和心肌等多种细胞和组织。
脂肪组织在机体中参与能力代谢，器官保护及塑性等生理功能的发挥。临床外科早已利用自体脂肪来进行面部、胸部，臀部等部位的整容及塑性治疗，然而，该类操作需要进行自体外科取脂，导致组织创伤，并引起手术操作后的疼痛及相关并发症。因此，大量研究尝试利用外源化学物质替代自体脂肪，进行相关整容塑性治疗，虽疗效显著，但化学材料引起的局部免疫排斥，及降解后的手术再替换都会导致二次损伤及相关并发病，为病人带来不必要的痛苦。近年来发现，人体中的脂肪细胞是由间充质干细胞分化得来，定向成脂分化已成为间充质干细胞功能鉴定的一项必备指标。同时，人们开始尝试通过诱导自体间充质干细胞定向成脂分化，为外科整容及塑性操作提供一定量的自体优质脂肪组织，从而避免机体排斥，提高移植疗效。但机体内环境特殊，人体内间充质干细胞定向成脂分化调控复杂，因此如何通过药物高效促进人间充质干细胞在体外定向成脂分化，是获得足量优质自体脂肪细胞，为临床整形及塑性提供合格移植用脂肪组织的关键，但在现有条件下，人间充质干细胞成脂分化效率有限。因此，间充质干细胞在体外被定向诱导分化为脂肪细胞的研究具有重要的意义。
然而，现有的间充质干细胞在定向向脂肪细胞的诱导培养中，培养周期通常长达20多天。如果间充质干细胞诱导分化失败，会徒增培养时间和培养成本，因此有必要提供一种在定向诱导培养过程中能够检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够检测间充质干细胞成脂潜力的检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法。
一种检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，包括如下步骤：
分别收集d0细胞和d7细胞，其中，d0细胞为成脂诱导前的间充质干细胞，d7细胞为间充质干细胞成脂诱导第7天的细胞；
分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA；
分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA；
以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d0细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X0，定义d7细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X7；
当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
在其中一个实施例中，所述较大成脂潜力为50％以上的细胞可被诱导为脂肪细胞。
在其中一个实施例中，所述检测方法还包括如下步骤：
收集d14细胞，其中，d14细胞为间充质干细胞成脂诱导第14天的细胞；
提取d14细胞的总RNA；
以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR检测计算出d14细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d14细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X14，
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，和/或，当X14：X0的比值大于等于20以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
在其中一个实施例中，所述检测方法还包括：以脂蛋白脂肪酶为引物，以18S rRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中脂蛋白脂肪酶的相对表达量；其中，定义d0细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y0，定义d7细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y7；
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，且当Y7：Y0的比值大于等于0.7以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
在其中一个实施例中，采用Trizol试剂分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA。
在其中一个实施例中，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞P9、人脐带间充质干细胞P3和人脐带间充质干细胞P8中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞采用间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行诱导培养。
在其中一个实施例中，所述间充质干细胞成脂诱导分化培养基包括如下组分：DMEM/F12基础培养基，体积浓度8％-12％胎牛血清，8-12μg/ml胰岛素，1‰青霉素链霉素，0.8-1.2μmol/L地塞米松，100-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
上述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，通过采用过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，来对间充质干细胞的成脂潜力进行检测，当诱导第7天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为第0天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量的10倍以上时，则可以得出间充质干细胞具有较大成脂潜力，进而能够对间充质干细胞的成脂诱导培养过程具有重要意义。
附图说明
图1为本发明一实施例的检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法的步骤图；
图2为一实施例的人脐带间充质干细胞P9的第22天的油红染色的电镜图；
图3为一实施例的人脂肪间充质干细胞P8的第22天的油红染色的电镜图；
图4为一实施例的人脐带间充质干细胞P3的第22天的油红染色的电镜图；
图5为一实施例的人脐带间充质干细胞P8的第22天的油红染色的电镜图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。一实施例中，请参阅图1，一种检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，包括如下步骤：
S110：分别收集d0细胞和d7细胞，其中，d0细胞为成脂诱导前的间充质干细胞，d7细胞为间充质干细胞成脂诱导第7天的细胞；
具体的，本实施例中，d0细胞是在加入间充质干细胞成脂诱导分化培养基之前的间充质干细胞，或者说，开始要成脂诱导培养时第0天的间充质干细胞。d7细胞是指加入间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行成脂诱导培养第7天的细胞。后续以此类推。需要说明的是，间充质干细胞如何进行成脂诱导培养，请参考现有技术。间充质干细胞成脂诱导分化培养基也可以采用现有或者现有市售的间充质干细胞成脂诱导分化培养基。
本实施例中，间充质干细胞为人脐带间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的至少一种。当然，间充质干细胞也可以为其它种属的间充质干细胞或者其它来源的间充质干细胞。例如，老鼠、猴等。再如，来源于骨髓等。
具体的，例如，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞P9、人脐带间充质干细胞P3和人脐带间充质干细胞P8中的至少一种。
一具体实施例中，所述间充质干细胞采用间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行诱导培养。例如，所述间充质干细胞成脂诱导分化培养基包括如下组分：DMEM/F12基础培养基，体积浓度8％-12％胎牛血清，8-12μg/ml胰岛素，1‰青霉素链霉素，0.8-1.2μmol/L地塞米松，100-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。经申请人研究发现，通过采用如上组分的间充质干细胞成脂诱导分化培养基来对间充质干细胞进行诱导培养，能够较好地进行成脂分化诱导培养。尤其是，采用上述间充质干细胞成脂诱导分化培养基，可高效并特异地诱导包括人骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞在内的多种组织来源人间充质干细胞向成脂细胞的定向分化，缩短人间充质干细胞成脂分化诱导时间，制备方法简便，使用方便，可实现稳定，高效的人间充质干细胞成脂诱导分化。一优选实施例中，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为250-500μmol/L，经申请人研究发现，相对于申请人之前的同类培养基，通过将该组分浓度优选为250-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，其与8-12μg/ml胰岛素共同使用时，能够使得间充质干细胞的成脂诱导分化时间缩短10％，具体的，缩短两天至三天以上。需要说明的是，当胰岛素浓度低于8μg/ml和高于12μg/ml时，其时间缩短不明显，而当3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度低于250μmol/L和高于500μmol/L时，其作为腺苷受体拮抗剂，对间充质干细胞成脂诱导分化时间的缩短也不明显。而当3-异丁基-1-甲基黄嘌呤250-500μmol/L且胰岛素8-12μg/ml时，能够使得间充质干细胞的成脂诱导分化时间缩短10％。
S120：分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA；
需要说明的是，如何提取细胞的总RNA，请参考现有技术进行实现。其中一个例子是，申请人采用Trizol试剂分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA。如此，提取过程和处理过程相对较为简单便捷。至于如何采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，请参考现有技术或者市售Trizol试剂的说明书。
为了测试总RNA的纯度和完整性，一实施例中，提取总RNA后，还可以进行如下步骤：以260nm和280nm光吸收度的比值确定纯度，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。如此，能够较好地测试总RAN的纯度和完整性。需要说明的是，具体实验过程也请参考现有技术，本申请在此不再赘述。
S130：分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA；
本实施例中，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA。其中，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser为TaKaRa生产。
S140：以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d0细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X0，定义d7细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X7；
本申请中，内参18S rRNA的正向引物为aggaccgcggttctattttgttgg，内参18SrRNA的反向引物为cccccggccgtccctctta。
本申请中，过氧化物酶体增生激活受体γ2的正向引物为tcaggtttgggcggatgc，过氧化物酶体增生激活受体γ2的反向引物为tcagcgggaaggactttatgtatg。
需要说明的是，如何基于内参并计算出相对表达量的过程，请参考现有技术。例如，分别进行内参体系反应和qPCR反应，绘制出相应的溶解曲线和扩增曲线，再计算出Ct值，应用2^-ΔΔCt法分析荧光定量PCR结果，进而得出相对表达量。
S150：当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
本实施例中，当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。具体的，所述较大成脂潜力为50％以上的细胞可被诱导为脂肪细胞。也就是说，第7天的细胞相对于第0天的细胞的过氧化物酶体增生激活受体表达量增加了10倍以上时，则揭示间充质干细胞具有较大的成脂潜力。否则，间充质干细胞成脂潜力不够时，则要考虑重新考虑成脂分化诱导培养或者调整成脂分化诱导培养条件。
上述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，通过采用过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，来对间充质干细胞的成脂潜力进行检测，当诱导第7天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为第0天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量的10倍以上时，则可以得出间充质干细胞具有较大成脂潜力，进而能够对间充质干细胞的成脂诱导培养过程具有重要意义。
需要说明的是，d0细胞和d7细胞的RNA提取可以在第0天、第7天进行，也可以在将d0天的细胞取了保存后和d7细胞于同一天提取RNA，并进行后续操作。
一实施例中，所述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法中，还包括对d14细胞的检测，即对成脂诱导第14的细胞进行过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量的检测和计算，具体的，所述检测方法还包括如下步骤：
收集d14细胞，其中，d14细胞为间充质干细胞成脂诱导第14天的细胞；
提取d14细胞的总RNA；
以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR检测计算出d14细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d14细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X14，
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，和/或，当X14：X0的比值大于等于20以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
如此，通过结合第14天，能够更好地检测间充质干细胞的成脂潜力。
为了进一步提高检测判断的准确性，一实施例中，还对d0细胞和d7细胞进行脂蛋白脂肪酶的表达量的检测。具体的，所述检测方法还包括：以脂蛋白脂肪酶为引物，以18SrRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中脂蛋白脂肪酶的相对表达量；其中，定义d0细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y0，定义d7细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y7；
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，且当Y7：Y0的比值大于等于0.7以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
也就是说，本实施例中，当第7天的脂蛋白脂肪酶的表达量相对于第0天增加0.7以上时，则可以进一步更为准确地确定间充质干细胞具有较大成脂潜力。
一实施例中，还对d14细胞进行脂蛋白脂肪酶的表达量的检测。具体的，以脂蛋白脂肪酶为引物，以18S rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR检测计算出d14细胞的cDNA中脂蛋白脂肪酶的相对表达量；其中，定义d14细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y14，
当X7：X0的比值大于等于10以上时，且所述当Y7：Y0的比值大于等于0.7以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，且所述当Y7：Y0的比值大于等于0.7以上时和当Y14：Y0的比值大于等于2以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
如此，能够更加充分地确定间充质干细胞具有较大成脂潜力。
具体的，脂蛋白脂肪酶的正向引物为gaaccgctgcaacaatctgggctatga，脂蛋白脂肪酶的反向引物为tgctgcttcttttggctctgactttattga。
再如，qPCR的反应体系为：总体积25μl，具体包括TB Green Premix Ex Taq II12.5μl，PCRForward Primer(10μM)1μl，PCR Reverse Primer(10μM)1μl，DNA2μl，ddH2O8.5μl。PCR引物如过氧化物酶体增生激活受体γ2引物、18S rRNA的内参引物和脂蛋白脂肪酶引物均由生工生物公司合成。扩增的循环参数为：95℃变性30S；95℃5s，60℃30s，40个循环。如此，能够较好地进行检测，使得检测较为准确。
上述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，通过采用过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，来对间充质干细胞的成脂潜力进行检测，当诱导第7天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为第0天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量的10倍以上时，则可以得出间充质干细胞具有较大成脂潜力，进而能够对间充质干细胞的成脂诱导培养过程具有重要意义。
下面给出上面判断依据的具体实验过程。
一、实验对象分别为人脐带间充质干细胞P9、人脐带间充质干细胞P3和人脐带间充质干细胞P8，将各间充质干细胞复苏，复苏间充质干细胞至长到70％-90％；消化间充质干细胞，使用完全培养基培养1-3天；待细胞融合度达到70％-90％，吸走完全培养基，加入间充质干细胞成脂诱导分化培养基，间充质干细胞成脂诱导分化培养基由以下组分构成：DMEM/F12基础培养基，体积浓度8％-12％胎牛血清，8-12μg/ml胰岛素，1‰青霉素链霉素，0.8-1.2μmol/L地塞米松，250-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，采用间充质干细胞成脂诱导分化培养基对间充质干细胞进行培养，每隔3-4天换培养基。持续诱导第7和14天，采用实时定量PCR方法检测成脂特异性基因，PCR引物包括过氧化物酶体增生激活受体γ2(peroxisome proliferative activated receptor,gamma 2，PPAR-γ2)和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)等。当然也可以根据需要检测血管生成素相关基因(angiopoietin-related gene，PGAR)。具体检测过程如下：
i.提取各组细胞总RNA
实验分为4组：加诱导试剂前收集细胞(D0，对照组)，诱导第7天收集细胞(D7)，诱导第14天收集细胞(D14)，诱导第21天收集细胞(D21)。使用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。以260nm和280nm光吸收度的比值确定纯度。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性。同时，也进行对照组实验，即一样的培养体系和加液过程，但是未加入诱导试剂，即未加入间充质干细胞成脂诱导分化培养基，而是以DMEM/F12基础培养基代替，对照组的处理过程同诱导组。
ii.逆转录RNA合成cDNA
采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)逆转录RNA合成cDNA。合成cDNA储存在-70℃备用。
iii.实时荧光定量PCR
采用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)进行实时荧光定量PCR，反应体系为25μl：TB Green Premix Ex Taq II 12.5μl，PCR Forward Primer(10μM)1μl，PCRReverse Primer(10μM)1μl，DNA 2μl，ddH2O 8.5μl。PCR引物见表2由生工生物公司合成。扩增的循环参数为：95℃变性30S；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。
培养后的人脐带间充质干细胞P9的第22天的油红染色的电镜图如图2所示。培养后的人脂肪间充质干细胞P8的第22天的油红染色的电镜图如图3所示。培养后的人脐带间充质干细胞P3的第22天的油红染色的电镜图如图4所示。培养后的人脐带间充质干细胞P8的油红染色的电镜图的第22天如图5所示。均为采用油红染色，图2至图5表明本实施例的间充质干细胞均被成功被诱导分化成脂肪细胞。
经申请人实验发现，相对于对比组，诱导组的脂蛋白脂肪酶和过氧化物酶体增生激活受体γ2的表达量显著增加，且呈现出较大显著性差异(p<0.01)。诱导组的脂蛋白脂肪酶和过氧化物酶体增生激活受体γ2的表达，平均统计后的相对表达量的计算结果见表1所示。
表1
Figure BDA0002258625180000131
由上qPCR分析结果可以看出，诱导第7和14天与诱导前相比，LPL和PPAR-γ2的mRNA表达量均有显著升高。由此申请人分别将X7：X0的比值大于等于10、X14：X0的比值大于等于20、Y7：Y0的比值大于等于0.7和当Y14：Y0的比值大于等于2.0分别用作判断间充质干细胞成脂潜力的依据。
能够理解的是，间充质干细胞成脂诱导分化的周期较长，一般为21天。本发明可在诱导分化早中期通过特异基因表达检测，得知待检间充质干细胞的成脂潜力。
上述检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，通过采用过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，来对间充质干细胞的成脂潜力进行检测，当诱导第7天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为第0天的过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量的10倍以上时，则可以得出间充质干细胞具有较大成脂潜力，进而能够对间充质干细胞的成脂诱导培养过程具有重要意义。
本发明还提供一种检测间充质干细胞成脂潜力的套装试剂，包括成脂诱导分化试剂和检测成脂特异性基因的PCR引物，包括步骤：1)复苏间充质干细胞至长到70％-90％；2)消化间充质干细胞，使用完全培养基培养1-3天；3)待细胞融合度达到70％-90％，吸走完全培养基，加入间充质干细胞成脂诱导分化培养基(由以下组分构成：DMEM/F12基础培养基，体积浓度8％-12％胎牛血清，8-12μg/ml胰岛素，1‰青霉素链霉素，0.8-1.2μmol/L地塞米松，100-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)培养，每隔3-4天换培养基；4)持续诱导第7和14天，采用实时定量PCR方法检测成脂特异性基因，PCR引物包括过氧化物酶体增生激活受体γ2(peroxisome proliferative activated receptor,gamma 2，PPAR-γ2)，血管生成素相关基因(angiopoietin-related gene，PGAR)，脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)等。
需要说明的是，本申请的成脂潜力，仅作为一种判断的参考，只是说概率上具有较大的成脂潜力，或者说，较大概率上，整体细胞的50％以上的细胞数量的细胞具有成脂潜力。不能因为偶然事件或者小概率事件就否定本申请。本申请的成脂潜力的检测方法仅作为一种研究的参考。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。需要说明的是，本申请的“一实施例中”、“例如”、“又如”等，旨在对本申请进行举例说明，而不是用于限制本申请。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测间充质干细胞成脂潜力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别收集d0细胞和d7细胞，其中，d0细胞为成脂诱导前的间充质干细胞，d7细胞为间充质干细胞成脂诱导第7天的细胞；
分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA；
分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA；
以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d0细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X0，定义d7细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X7；
当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述较大成脂潜力为50％以上的细胞可被诱导为脂肪细胞。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括如下步骤：
收集d14细胞，其中，d14细胞为间充质干细胞成脂诱导第14天的细胞；
提取d14细胞的总RNA；
以过氧化物酶体增生激活受体γ2为引物，以18S rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR检测计算出d14细胞的cDNA中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量；其中，定义d14细胞中过氧化物酶体增生激活受体γ2的相对表达量为X14；
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，和/或，当X14：X0的比值大于等于20以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：以脂蛋白脂肪酶为引物，以18S rRNA为内参，分别采用实时荧光定量PCR检测计算出d0细胞和d7细胞的cDNA中脂蛋白脂肪酶的相对表达量；其中，定义d0细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y0，定义d7细胞中脂蛋白脂肪酶的相对表达量为Y7；
所述当X7：X0的比值大于等于10以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力，具体为：
当X7：X0的比值大于等于10以上时，且当Y7：Y0的比值大于等于0.7以上时，则判断间充质干细胞具有较大成脂潜力。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用Trizol试剂分别提取d0细胞和d7细胞的总RNA。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNAEraser分别以d0细胞和d7细胞的总RNA合成cDNA。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞P9、人脐带间充质干细胞P3和人脐带间充质干细胞P8中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞采用间充质干细胞成脂诱导分化培养基进行诱导培养。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述间充质干细胞成脂诱导分化培养基包括如下组分：DMEM/F12基础培养基，体积浓度8％-12％胎牛血清，8-12μg/ml胰岛素，1‰青霉素链霉素，0.8-1.2μmol/L地塞米松，100-500μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
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