CN110777120B - Tgfbi作为调控间充质干细胞成脂分化的标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TGFBI在制备调控间充质干细胞成脂分化的产品中的应用。本发明人通过实验发现,TGFBI基因通过PPAR‑γ信号通路调节间充质干细胞(MSC)成脂分化;具体地,利用siRNA瞬时转染技术将TGFBI siRNA导入传代培养后的人脐带来源的间充质干细胞(huMSC),通过敲低TGFBI基因使得成脂关键转录因子PPAR‑γ和晚期成脂分化基因Adi的表达明显下调,从而抑制huMSC成脂分化能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及TGFBI作为调控间充质干细胞成脂分化的标志物的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一种存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)、具有多向分化潜力的非造血干细胞,是一种能够分化为包括脂肪和骨骼在内等多个间质组织的多源细胞。
MSC作为脂肪细胞和成骨细胞的祖细胞,能够维持其良好的平衡分化。大量体外试验证实脂肪诱导因子抑制了成骨细胞的形成,反之,成骨诱导因子抑制了成脂细胞的形成。一些化学、物理和生物因素可以调控MSC的微环境,促进成脂细胞及成骨细胞之间的平衡分化。这些因素触发了不同的信号通路,激活转录因子,调控MSC的分化。脂肪成骨平衡的失调与一些病理生理过程有关,如衰老、肥胖、骨质疏松、骨化病和骨质疏松症。近年来对MSC分化的调控越来越受到人们的关注。对其外界影响的因素及其调控的信号通路展开了研究,从而调控了MSC向成脂细胞的分化能力,维持成脂及成骨细胞的分化平衡。TGFBI基因(transforming growth factor-βinduced gene,TGFβi)也称为big-H3,首次发现是在A549肺腺癌细胞形成的基因克隆。TGFBI基因所表达的产物被称为角膜上皮蛋白(keratoepithelin,KE蛋白),由683个氨基酸组成。TGFBI基因蛋白是由N-末端分泌信号,四个FAS1同源内部区域及C端RGD区域组成。TGFBI广泛分布于细胞质及细胞核,是TGF-β诱导的一种分泌蛋白。它与胶原蛋白结合,形成细胞外基质的一部分,并与细胞表面的整合素相互作用。TGFBI作为一种双功能蛋白,能够在一些功能紊乱的细胞中,调控细胞外基质与细胞间的粘连与迁移,通过调控细胞微管组织影响细胞周期,从而发挥作用。TGF-β调控TGFBI的表达,在高糖及TGF-β刺激下,TGFBI可以在平滑肌细胞、角质细胞、星形细胞、近端小管上皮细胞等几类细胞中产生。我们通过基因转录测序发现,TGFBI在MSC中高表达,已有研究证明,骨髓来源的MSC可以诱导小鼠体内造血干细胞及祖细胞(hematopoietic stem andprogenitor cell,HSPC)中TGFBI的表达,影响HSPC的迁移及分化能力。HSPC细胞中TGFBI的表达降低,将影响该细胞的稳定与迁移分化能力。
过氧化物酶体增殖体激活受体-γ(peroxisome proliferator activatedreceptorγ,PPAR-γ),是重要的细胞分化转录因子,在哺乳动物的脂肪组织、血管平滑肌组织、心肌组织中均有表达。PPAR-γ是由配体激活的核转录因子,活化后可以调控多种核内靶基因的表达。研究发现,PPAR-γ是成脂关键转录因子,具有调节脂肪代谢和调节炎症、免疫以及细胞分化等作用,参与诸多慢性免疫性疾病的发生及发展。
晚期成脂分化基因adipsin(降脂素,Adi)是广泛存在于体内的一种脂肪因子,在脂肪组织合成的生物学过程中发挥着重要的作用。adipsin是一种丝氨酸蛋白激酶,在3T3-F442A脂肪细胞中发现,主要由脂肪组织合成并释放入血液。人类adipsin与补体D因子为同一物质,表明adipsin和补体旁路途径在脂肪组织的生理功能和能量代谢中扮演着重要的角色。研究发现adipsin是促酰化蛋白(acylation stimulating protein,ASP)合成的必需因子之一,脂肪分化中后期adipsin表达水平增强,对脂肪细胞合成分泌ASP具有重要意义,adipisn-ASP系统上调脂肪组织对血浆游离脂肪酸的吸收率,显著促进脂肪细胞甘油三酯(TG)合成和抑制脂肪分解。
发明内容
我们通过研究发现,TGFBI基因可影响人脐带间充质干细胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cell,huMSC)中成脂关键转录因子PPAR-γ和晚期成脂分化基因Adi的表达。
本发明一个目的在于提供TGFBI在制备调控间充质干细胞成脂分化的产品中的应用。本发明人利用成熟的干细胞分离培养技术和间充质干细胞体外诱导培养体系,经实验发现TGFBI基因通过PPAR-γ信号通路调节间充质干细胞成脂分化的特性;具体地,利用siRNA瞬时转染技术将TGFBI siRNA导入传代培养后的人脐间充质干细胞(huMSC),通过敲低TGFBI基因使得成脂关键转录因子PPAR-γ和晚期成脂分化基因Adi的表达明显下调,从而抑制huMSC成脂分化能力。
本发明一个方面提供了TGFBI在制备调控间充质干细胞(MSC)成脂分化的产品中的应用,其中TGFBI基因通过PPAR-γ信号通路调节间充质干细胞成脂分化。
在本发明上述应用的一些实施方案中,通过敲低TGFBI基因使得成脂关键转录因子PPAR-γ和晚期成脂分化基因Adi的表达明显下调,从而抑制MSC如huMSC的成脂分化能力。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述TGFBI基因是通过TGFBI抑制剂或促进剂影响PPAR-γ信号通路的。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述调控间充质干细胞成脂分化的产品为生物制剂、生物药剂等。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述TGFBI抑制剂为能降低TGFBI表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
在本发明上述应用的一些实施方案中,所述TGFBI促进剂为具有TGFBI生物活性的模拟物或类似物。
本发明另一个方面提供了调控间充质干细胞成脂分化的制剂,其中所述制剂包含TGFBI抑制剂或者具有TGFBI生物活性的模拟物或类似物,优选所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞。
在本发明上述制剂的一些实施方案中,所述TGFBI抑制剂为TGFBI siRNA,其具有SEQ ID NO:1(正向序列,GCAUGACCCUCACCUCUAUTT)和/或SEQ ID NO:2(反向序列,AUAGAGGUGAGGGUCAUGCTT)所示的核苷酸序列。
本发明又一个方面提供了一种抑制间充质干细胞成脂分化的方法,其包括如下步骤:
1)从人脐带组织分离获取间充质干细胞,然后进行原代培养和传代培养;
2)利用siRNA瞬时转染技术将TGFBI siRNA导入传代培养后的间充质干细胞,然后培养。
在本发明上述方法的一些实施方案中,siRNA瞬时转染的转染体系为:jetPRIMEreagent buffer 200ul/2ml、SiRNA 3ul/2ml、jetPRIME reagent 4ul/2ml,转染时间为24h。
在本发明上述方法的一些实施方案中,所述TGFBI siRNA的核苷酸序列为SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2。
有益效果
本发明人通过实验发现,TGFBI基因通过PPAR-γ信号通路调节间充质干细胞成脂分化的能力,为脐带间充质干细胞生物学特性的研究及临床、医用应用提供了理论基础;因此,可将TGFBI用于制备调控间充质干细胞成脂分化的产品,如MSC成脂分化的抑制剂或促进剂。本发明采用成熟的人脐带来源的分离培养技术,结合特定的成脂诱导化学体系及特定的接种细胞数,稳定的基因转染敲低技术,可操作性强,方便实用;本发明针对人脐带来源间充质干细胞(huMSC)成功并快速建立了稳定的TGFBI基因敲低效率,通过成脂诱导分化证实了诱导后所述huMSC脂滴数和成脂关键转录因子表达的明显差异。
附图说明
图1所示为倒置显微镜下观察的P1代huMSC形态;其中图1A为P1代huMSC(4×),图1B为P1代huMSC(10×)。
图2为TGFBI基因敲低效果以及敲低后成脂关键转录因子PPAR-γ的表达差异。
图3为油红O染色检测正常huMSC和进行TGFBI siRNA基因转染的TGFBI基因敲低huMSC(TGFBI-/-huMSC)成脂诱导结果,脂滴出现的差异。其中图3A为huMSC成脂诱导分化的自分化组;图3B为huMSC成脂诱导分化的诱导组;图3C为TGFBI-/-huMSC成脂诱导分化的自分化组;图3D为TGFBI-/-huMSC成脂诱导分化的诱导组;图3E为q-PCR检测huMSC成脂诱导后关键转录因子;图3F为q-PCR检测TGFBI-/-huMSC成脂诱导后关键转录因子。
图4为成脂诱导后,huMSC与TGFBI-/-huMSC表达的成脂基因Adi和PPAR-γ表达差异结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,本发明所使用的材料和装置,如无特殊说明,均为市售。
实施例1:间充质干细胞TGFBI基因敲低培养
首先按照常规方法从人脐带组织分离获取原代人脐带间充质干细胞(huMSC)培养后,接种到完全培养基中培养P1代huMSC。图1所示为倒置显微镜下观察的P1代huMSC形态;其中图1A为P1代huMSC(4×),图1B为P1代huMSC(10×);也可多次传代培养扩增,再用冻存液调整细胞悬液的细胞密度后分装于冻存管中,在液氮中冻存备用。
复苏P1代huMSC,于15mlα-MEM+10%胎牛血清(FBS)的完全培养基的T75瓶中培养,细胞融合度达80%-90%后,经0.125%胰酶消化传至P2代,待细胞融合度达70%左右,用于转染的TGFBI siRNA基因序列为:SEQ ID NO:1(正向序列,GCAUGACCCUCACCUCUAUTT)和/或SEQ ID NO:2(反向序列,AUAGAGGUGAGGGUCAUGCTT),转染前进行细胞换液。转染体系为:15mlα-MEM+10%胎牛血清(FBS)的完全培养基中包含jetPRIME reagent buffer 1500ul、SiRNA22.5ul、jetPRIME reagent 30ul,转染时间为24h。按上述体系配制转染试剂,轻轻混匀后,将转染试剂加入至T75培养瓶中,混匀后放入孵箱(37℃;5%CO2)培养24h后经胰酶消化,进行细胞计数,按规定细胞个数接种至六孔板进行成脂诱导培养,留取5×105个细胞放置1.5ml EP管中,加1ml TRIZOL提取RNA进行转染效果检测。
通过q-PCR检测上述未转染的正常huMSC和进行TGFBI siRNA基因转染的TGFBI基因敲低huMSC(TGFBI-/-huMSC)中的TGFBI基因表达情况,图2A所示为与正常huMSC相比,TGFBI基因敲低后的huMSC中TGFBI基因表达明显降低,差异显著;图2B所示为与正常huMSC对照(huMSC-control)相比,TGFBI基因敲低的huMSC对照(TGFBI-/-huMSC-control)的PPAR-γ基因表达明显降低,差异显著(这里“对照”是指未加“成脂诱导培养基”进行培养)。
实施例2:间充质干细胞成脂分化诱导
1)将实施例1中获得的未转染的正常huMSC和TGFBI基因敲低的huMSC(TGFBI-/-huMSC)这两种P3代huMSC,分别经胰酶消化后,未转染的正常huMSC分别按2x104/孔、8x104/孔接种于六孔板,TGFBI基因敲低huMSC分别按5x104/孔、8x104/孔接种于六孔板中,分别设为自分化组和诱导组,每组3个复孔;
2)向诱导组加入成脂诱导培养基(90%α-MEM培养基+10%FBS+胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)),自分化组则仅加入完全培养基(90%α-MEM培养基+10%FBS),每2-3天全量换液,共诱导14天;
3)将培养基弃除后,加入1%中性甲醛固定20min;
4)PBS清洗1遍,经油红O染色,室温避光30min;
5)PBS清洗1遍,每孔各加入1ml PBS,倒置显微镜下观察脂滴的形态大小及分布密度;如图3所示,油红O染色检测huMSC与TGFBI-/-huMSC成脂诱导结果表明,huMSC诱导组出现的脂滴数量明显多于TGFBI-/-huMSC组。其中图3A为huMSC成脂诱导分化的自分化组(control);图3B为huMSC成脂诱导分化的诱导组(induced)。图3C为TGFBI-/-huMSC成脂诱导分化的自分化组(control);图3D为TGFBI-/-huMSC成脂诱导分化的诱导组(induced)。可见,两种MSC自分化组基本看不到脂滴的存在(图3A、图3C),而诱导组可见大量的红色脂滴,图中颜色深的部分(图3B、图3D)。TGFBI-/-huMSC成脂诱导分化的诱导组(图3D)所出现的脂滴明显少于正常huMSC成脂诱导分化的诱导组(induced)(图3B)。
实施例3:测定体外成脂诱导分化后,正常MSC和TGFBI基因敲低的MSC中成脂关键转录因子的表达差异
分别收集自以上实施例2的步骤2)培养的分化组及诱导组的细胞,1000rpm离心10min后,弃去上清,用1ml TRIZOL重悬离心管中的细胞沉淀,转移至干净的1.5ml的EP管中,提取总RNA。进行实时荧光定量PCR(q-PCR),检测成脂关键转录因子过氧化物酶增殖体激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPAR-γ)和晚期成脂基因adipsin(降脂素,Adi)的表达差异。具体实验操作步骤如下:
1.总RNA的提取
1)从-80℃冰箱中取出细胞样本,放置于涡旋震荡器中,震荡30min,期间可用移液枪吹散细胞团块,使之充分裂解;
2)室温静置10min后,置于低温离心机中,12000rpm,4℃,10min离心;
3)收集上清到新的EP管中,加入氯仿(按1ml上清加入200μl氯仿的比例),涡旋震荡,充分混匀,室温静置10min;
4)4℃,低温离心,12000rpm,15min;
5)小心吸取上清500μl,转移到新的EP管中(注意不要吸到白膜层);
6)每管加入等体积的异丙醇(约500μl),混匀,室温静置10min;
7)4℃,低温离心,12000rpm,10min;
8)弃上清,在EP管底部可见白色沉淀,每管再加入1ml 75%的乙醇(DEPC水配制,预冷)洗涤沉淀2次,放置冰上,待其自然晾干;
9)15-20min后,每管加入14μl的无RNA酶水溶解RNA,同时再加入1μl RNaseInhibit以防止RNA降解。
2.RNA浓度的测定
2)将RNA原液先稀释50倍后,再取出1μl加入工作液中,稀释200倍,静置2min;
3.RNA逆转录
1)在PCR管内按照以下表1配制逆转录体系A
表1:逆转录体系A
2)混匀后,置于PCR仪内70℃处理10min,后立即转到冰上放置2min;
3)离心数秒,使模板RNA+引物发生变性,溶液聚集于PCR管底部;
4)按照以下表2配制逆转录体系B
表2:逆转录体系B
5)混匀B体系,加入A体系,离心,放于PCR仪中(程序设置为42℃,60min,70℃,15min),结束后立即置于冰上冷却;
6)得到cDNA溶液,用于实时荧光定量PCR操作。
4.实时荧光定量PCR(q-PCR)检测成脂分化的关键转录因子PPAR-γ和CEBP/α的表达
1)按照以下表3配制体系
表3:q-PCR反应体系
2)将GAPDH基因作为对照,把混合体系加入到MicroTM Optical 8-Tube Strip,每组4个复孔,用MicroTM Optical 8-Cap Strip密封反应孔,放入7500real time system系统的机器中,按照以下表4的反应程序进行反应,并且反应所用的引物序列如表5所示。
表4:反应程序
表5:引物序列
图3E为q-PCR检测huMSC成脂诱导后关键转录因子PPAR-γ和Adi发生显著变化,诱导组明显高于对照组;图3F为q-PCR检测TGFBI-/-huMSC成脂诱导后关键转录因子PPAR-γ和Adi发生显著变化,诱导组明显高于对照组。图3E与图3F相比之下,可以看出,经TGFBI敲低,成脂诱导后关键转录因子PPAR-γ和Adi在对照组和诱导组之间的表达差异明显进一步增大,可见TGFBI敲低明显抑制了huMSC的成脂分化能力。
图4所示为成脂诱导后,huMSC的诱导组(induced)与TGFβI-/-huMSC的诱导组(induced)的成脂基因Adi和PPAR-γ表达差异,从图中结果可知,在诱导的情况下,经TGFBI敲低的huMSC中,成脂诱导后关键转录因子PPAR-γ和Adi表达均明显低于正常huMSC。
我们的实验表明,TGFBI基因敲低后PPAR-γ表达下调,在成脂诱导体系中这种抑制效果一直存在并且最终抑制间充质干细胞成脂分化能力。本发明首次证实了TGFBI通过PPAR-γ信号通路调控间充质干细胞成脂分化能力。
以上结果表明,本发明可快速建立稳定的TGFBI基因敲低效率,并成功地进行人脐带来源间充质干细胞的成脂诱导分化。本发明方法具有稳定的敲低效率,成脂诱导分化率高,细胞死亡数少,成脂诱导成功后,显示出明显的成脂基因表达差异。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> TGFBI作为调控间充质干细胞成脂分化的标志物的应用
<130> P190350
<141> 2019-11-28
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gcaugacccu caccucuaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
auagagguga gggucaugct t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
tcaagatcat cagcaatgcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
cgataccaaa gttgtcatgg a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gaccactccc actcctttga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
attcaattgc catgagggag 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
tcacccaagc aacaaagtc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
aaagaccaac cagatgcag 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
cagaaggtta ttggcactaa tagg 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
ctgatgactg ttgatttgcc a 21
Claims (4)
1.TGFBI抑制剂在制备抑制脐带来源的间充质干细胞成脂分化的产品中的应用,其特征在于,所述TGFBI抑制剂通过PPAR-γ信号通路调节脐带间充质干细胞成脂分化;通过敲低所述TGFBI基因使得成脂关键转录因子PPAR-γ和晚期成脂分化标志基因Adi的表达明显下调,从而抑制脐带间充质干细胞成脂分化能力。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述TGFBI抑制剂为能降低TGFBI表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸;或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核苷酸的构建物。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述TGFBI抑制剂为抑制脐带间充质干细胞成脂分化的TGFBI siRNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。
4.一种抑制脐带间充质干细胞成脂分化的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)从人脐带组织分离获取间充质干细胞,使用α-MEM+10%胎牛血清的完全培养基进行原代培养和传代培养;
2)利用转染试剂jetPRIME reagent将TGFBI siRNA导入传代培养后的脐带间充质干细胞,所述siRNA瞬时转染的转染体系为:jetPRIME reagent buffer 200μl/2ml、siRNA 3μl/2ml、jetPRIME reagent 4μl /2ml,转染时间为24h;然后培养;
3)分别将未转染的正常huMSC和TGFBI基因敲低的huMSC接种至6孔板,其中huMSC自分化组为2x104/孔、诱导组为8x104/孔;TGFBI-/-huMSC自分化组为5x104/孔、诱导组为8x104/孔;向诱导组加入成脂诱导培养基,所述成脂诱导培养基为90% α-MEM培养基+10%FBS+胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,自分化组则仅加入完全培养基,每2-3天全量换液,诱导时间大约为14天,其中TGFBI-/-huMSC在第7天再次转染TGFBI siRNA;诱导结束加入多聚甲醛固定,用油红O染色观察评价各组细胞出现脂滴数量,q-PCR检测成脂关键转录因子表达变化。
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