CN114621916A - 抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用。具体公开了抗氧化剂在促进脐带间充质干细胞增殖和迁移、降低脐带间充质干细胞分泌TNF‑α以及维持脐带间充质干细胞分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞中的应用，抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。本申请不仅发现了三个可显著提高脐带间充质干细胞抗氧化能力的化合物，并考察了它们对干细胞增殖、衰老、细胞因子分泌、迁移、分化等多方面的作用，结果说明适当浓度的抗氧化剂可以不同程度提高脐带间充质干细胞的活力，因此可用于改善脐带间充质干细胞的体外培养性能和体内生物学活性即治疗效应，并且不改变干细胞的本质属性。

Description

抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用
技术领域
本申请涉及哺乳动物干细胞培养和应用技术领域，具体涉及抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用。
背景技术
人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是存在于脐带华通氏胶(Wharton’s jelly)和血管周围组织中的一种间充质干细胞。来源于脐带的间充质干细胞因其取材方便，无道德伦理争议，可获取的干细胞数量多、增殖能力强、免疫调节作用大、致癌性极低，分泌干细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代，同时又没有配型、排异等问题。因此，作为一种新型治疗用干细胞，脐带间充质干细胞具有非常广阔的临床应用前景。
间充质干细胞在许多疾病的治疗中表现出了它的优越性，主要表现在以下三个方面：一、间充质干细胞可以通过自身的分化作用分化成为相应组织的细胞，起到替代作用；二、间充质干细胞可以通过旁分泌效应分泌细胞因子，这些因子可以促进组织的自身修复效果；三、间充质干细胞可以分泌炎症抑制因子，从而抑制炎症反应和免疫排斥反应。迄今为止，脐带间充质干细胞已广泛用于多种疾病治疗研究，如急性肺损伤、肝脏缺血再灌注损伤、胰岛素抵抗7型糖尿病、阿尔茨海默病、急性心肌梗死、移植物抗宿主病、再生障碍性贫血、关节病、脊髓损伤、系统性红斑狼疮和中风等。
尽管间充质干细胞有许多优点，但在临床应用中仍面临挑战，如治疗需要大量干细胞、干细胞质量不均一、移植后存活能力低，旁分泌能力下降等。因此干细胞疗法的首要任务是在体外生产获得足够数量和均一性的高质量干细胞，同时需要提高输入干细胞在体内的活力，以满足临床需求。研究表明，培养代次的提高和体内微环境的胁迫会导致间充质干细胞的衰老(包括生长和增殖速度减缓，分泌抗炎因子能力下降等)。因此，在体外培养过程和体内微环境保持间充质干细胞的活力至关重要。
发明内容
本申请的各个实施例提供抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用，可以解决脐带间充质干细胞在体外连续传代培养时胞内活性氧水平不断增加导致衰老、增殖缓慢和输入体内后受到多种微环境胁迫导致活性氧水平上升和生物学活力降低的问题。
氧自由基作为正常利用氧代谢过程的副产物内源性形成，是导致衰老的重要因素。大量的研究表明，在许多生物体中，氧化损伤随年龄增长而增加，许多不同形式的活性氧(reactive oxygen species，ROS)可能是氧化损伤累积的元祸首，这通常被称为衰老的氧化应激理论。
之前已有一些专利和文献通过在间充质干细胞中添加抗氧化剂来提高干细胞的增殖能力或延缓干细胞的衰老，但主要集中在骨髓间充质干细胞的应用中，应用于脐带间充质干细胞的较少。即使应用于脐带间充质干细胞，也只是对干细胞的增殖与衰老能力进行了探索，或仅说明抗氧化剂降低了干细胞的ROS水平，缺少对抗氧化剂作用于干细胞生物活性的全面考察，比如干细胞的迁移能力，炎性/抗炎相关因子的分泌水平以及分化能力等。
本申请实施例提供抗氧化剂在促进脐带间充质干细胞迁移中的应用，其中，抗氧化剂包括β烟酰胺单核苷酸。
脐带间充质干细胞迁移是体现脐带间充质干细胞活力的一方面，β烟酰胺单核苷酸促进脐带间充质干细胞的迁移，那么β烟酰胺单核苷酸在体内应用时有利于动员并引导脐带间充质干细胞向损伤部位迁移，从而起到更好的组织损伤修复效果。
β烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)，具有如式1所示的结构，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体，后者又称辅酶I，是一种在所有活细胞中都发现的多功能代谢物，是糖酵解、三羧酸循环和电子传递链中的必须成分，且有助于DNA的修复，但其随着年龄增加在体内含量下降。NMN是NAD+的直接前体。
Figure BDA0003549106820000031
本申请实施例还提供抗氧化剂在降低脐带间充质干细胞分泌炎症因子TNF-α中的应用，其中，抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
进一步地，抗氧化剂降低过氧化氢诱导衰老后脐带间充质干细胞分泌TNF-α的水平。
免疫调节是评估脐带间充质干细胞生理功能的重要指标之一，TNF-α是重要的炎症因子，其参与多种重要的生理活动，大量的TNF-α产生会对机体产生严重的病理作用，与组织损伤有密切的关系。在体内微环境中，脐带间充质干细胞可以通过旁分泌效应分泌细胞因子调节TNF-α的分泌，抗氧化剂则可降低衰老脐带间充质干细胞分泌TNF-α从而促进组织自身的修复效果。
麦角硫因(ergothioneine，EGT)，具有如式2所示的结构，是一种天然化合物，由土壤细菌在真菌基质中合成，在许多细胞模型中表现出抗氧化功能。
辅酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)是一种普遍存在的脂溶性分子，具有如式3所示的结构，存在于许多真核细胞，对线粒体氧化磷酸化和电子传递链活性至关重要。随着年龄的增长，生物体内的辅酶Q10浓度逐渐降低，这种降低可能伴随着身体功能障碍的发生和疾病的出现。辅酶Q10在线粒体功能中的关键作用及其作为脂溶性抗氧化剂的地位已使其应用于临床试验。
Figure BDA0003549106820000032
本申请实施例还提供抗氧化剂在维持脐带间充质干细胞分化为成骨细胞、成脂细胞或成软骨细胞中的应用，其中，抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
脐带间充质干细胞的分化能力也是评估脐带间充质活力的重要特性之一。脐带间充质干细胞具有向骨、脂肪、软骨等组织分化的能力，在抗氧化剂的作用下，即使脐带间充质干细胞在体外连续传代或体内受到微环境的胁迫，依然能够维持干细胞的分化能力，有利于修复各种组织和器官。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，上述各应用中所采用的麦角硫因的浓度可以为1～10mM，也可以为2～9mM，还可以为3～8mM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，上述各应用中所采用的β烟酰胺单核苷酸的浓度可以为5～20μM，也可以为8～17μM，还可以为10～15μM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，上述各应用中所采用的辅酶Q10的浓度可以为10～100μM，也可以为20～90μM，还可以为50～80μM。
此外，本申请实施例还提供了一种抗氧化剂在脐带间充质干细胞体外培养或制备提高脐带间充质干细胞活力的辅助性药物中的应用，其中，抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。首先，抗氧化剂的使用可提高脐带间充质干细胞的增殖能力，可应用于脐带间充质干细胞的体外培养；另外，由于抗氧化剂可显著降低过氧化氢诱导干细胞衰老时的胞内活性氧水平和β半乳糖苷酶水平，可以修复由过氧化氢诱导衰老导致的炎性细胞因子水平上升且不影响干细胞的分化能力，因此可在脐带间充质干细胞临床治疗时作为辅助性药物提高干细胞在体内微环境胁迫下的活力。
相应的，本申请实施例还提供了一种提高脐带间充质干细胞活力的培养基，培养基为添加了抗氧化剂的间充质干细胞培养基，抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。利用该培养基培养脐带间充质干细胞，促进脐带间充质干细胞迁移，修复由过氧化氢诱导脐带间充质干细胞衰老导致的炎性细胞因子水平上升且不影响脐带间充质干细胞的分化能力。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，麦角硫因的浓度可以为1～10mM，也可以为2～9mM，还可以为3～8mM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，β烟酰胺单核苷酸的浓度可以为5～20μM，也可以为8～17μM，还可以为10～15μM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，辅酶Q10的浓度可以为10～100μM，也可以为20～90μM，还可以为50～80μM。
相应的，本申请还提供一种提高脐带间充质干细胞活力和减缓衰老的方法，包括：培养脐带间充质干细胞；在细胞培养液中添加抗氧化剂；抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，麦角硫因的浓度可以为1～10mM，也可以为2～9mM，还可以为3～8mM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，β烟酰胺单核苷酸的浓度可以为5～20μM，也可以为8～17μM，还可以为10～15μM。
具体的，以将抗氧化剂加入培养基后的总体积计，辅酶Q10的浓度可以为10～100μM，也可以为20～90μM，还可以为50～80μM。
进一步地，添加抗氧化剂时脐带间充质干细胞的密度可以为2～15×104个/mL，也可以为3～14×104个/mL，还可以为4～13×104个/mL。
进一步地，在细胞培养液中添加抗氧化剂后继续培养脐带间充质干细胞20～28小时后，更换细胞培养液从而去除抗氧化剂；优选地，在细胞培养液中添加抗氧化剂后继续培养脐带间充质干细胞24小时后，更换细胞培养液从而去除抗氧化剂。
在具体实施时，提高脐带间充质干细胞活力的方法包括：
1)将12代次脐带间充质干细胞按照2～3×104个/mL的密度接种于96孔板；
2)铺板4小时后添加抗氧化剂；
3)继续培养脐带间充质干细胞，隔天换液。
本申请具有以下有益效果：
本申请的一些实施例公开了对体外培养12代次脐带间充质干细胞具有明显促进效果的三种抗氧化剂麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10，及其应用浓度。在适当的抗氧化剂浓度下，得到抗氧化剂预保护能更好的降低过氧化氢诱导衰老后脐带间充质干细胞分泌TNF-α炎性因子的水平，β烟酰胺单核苷酸能够促进脐带间充质干细胞迁移能力，并且三种抗氧化剂均不会影响细胞的分化能力，从而能够应用于脐带间充质干细胞体外培养或制备提高脐带间充质干细胞活力的辅助性药物中。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是不同代次脐带间充质干细胞内活性氧水平；
图2是EGT、NMN、CoQ10添加后P12代次脐带间充质干细胞的增殖曲线；
图3是EGT，NMN，CoQ10与H2O2处理脐带间充质干细胞后胞内β半乳糖苷酶表达情况的染色检测图；
图4是根据图3进行图像分析而来的EGT，NMN，CoQ10与H2O2处理脐带间充质干细胞后表达β半乳糖苷酶的细胞含量占比(％)；
图5是抗氧化剂添加对脐带间充质干细胞炎性相关因子TNF-α基因表达的影响；
图6是抗氧化剂添加对脐带间充质干细胞迁移能力的影响；
图7是抗氧化剂添加对干细胞表面表型抗原表达量的影响；
图8是抗氧化剂添加对脐带间充质干细胞分化能力的影响。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
实施例一、检测脐带间充质干细胞胞内活性氧水平与培养代次的关系
本实施例检测连续传代培养条件下的脐带间充质干细胞胞内活性氧水平与培养代次的关系，具体步骤如下：
将P6，P9，P12代次干细胞以1×105cells/cm2的密度接种于六孔板，待干细胞汇合度达到80～90％时使用胰蛋白酶消化计数，吸取100ul于96孔不透光酶标板进行检测。
结果如图1所示，可见随着代次增加，后期干细胞胞内ROS水平上升，P6与P9没有显著性差异，P12代次ROS水平明显上升。
实施例二、抗氧化剂对脐带间充质干细胞增殖速度的作用
本实施例采用CCK-8法测定干细胞增殖曲线考察抗氧化剂对脐带间充质干细胞增殖速度的作用，具体步骤如下：
1)将12代次脐带间充质干细胞按照2.5×103cell/孔的密度接种于96孔板；
2)铺板4h后，在无血清培养基基础上添加10mM麦角硫因、10μMβ烟酰胺单核苷酸和50μM辅酶Q10；
3)继续培养，隔天换液。
4)将96孔板中的细胞培养液吸弃，使用DMEM/F12基础培养基洗2-3次，每孔加入100μl的DMEM/F12，10μl的CCK-8，37℃避光孵育2h，吸取100μl上清于酶标仪450nm处测定OD值。
结果如图2所示，可见EGT、NMN、CoQ10处理均可以显著提高12代次干细胞的增殖能力。
实施例三、抗氧化剂对过氧化氢诱导衰老脐带间充质干细胞生物学活力的影响
本实施例通过构建脐带间充质干细胞衰老模型，考察抗氧化剂对过氧化氢诱导衰老脐带间充质干细胞生物学活力的影响，具体步骤如下：
1)将细胞以6×105/瓶的密度接种于T25细胞培养瓶；
2)贴壁4h后对细胞进行药物保护与修复处理：
药物保护：在无血清培养基基础上加入适当浓度的抗氧化剂(麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10)处理24h后200μM H2O2处理2h，处理结束后更换为无血清培养基继续培养2h；
药物修复：200μM H2O2处理2h后用适当浓度的抗氧化剂(麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10)处理24h，处理结束后更换为无血清培养基继续培养2h；
3)对干细胞进行β-半乳糖苷酶染色；
4)收取脐带间充质干细胞，参照艾科瑞RNA提取试剂盒对RNA进行提取。
5)对提取的RNA进行反转录，参照艾科瑞反转录试剂盒，保存备用。利用下列所述的TNFα基因引物进行qPCR，引物序列举例如下：
SEQ ID NO.1:GAGACAGAAAGAGCGGGAAATA
SEQ ID NO.2:ATTCACCTTCCAGGCATTCA
如图3所示为抗氧化剂与过氧化氢处理脐带间充质干细胞内β半乳糖苷酶染色图，如图4所示为抗氧化剂与过氧化氢处理胞内β半乳糖苷酶含量，可见过氧化氢处理引起干细胞β半乳糖苷酶水平升高，而三种抗氧化剂处理均不会引起干细胞β半乳糖苷酶水平升高，β半乳糖苷酶是细胞衰老相关的生物学标志，可见，麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10均能够延缓细胞衰老。
如图5所示为抗氧化剂添加对脐带间充质干细胞炎性相关因子TNF-α基因表达的影响，EGT、NMN、CoQ10预保护能够修复由过氧化氢诱导衰老导致的TNF-α炎性细胞因子水平上升。
实施例四、抗氧化剂对间充质干细胞迁移的影响
本实施例采用干细胞划痕迁移实验研究抗氧化剂对间充质干细胞迁移的影响，具体步骤如下：
1)将12代次干细胞以2×104cells/孔的密度接种于24孔板；
2)铺板4h后对干细胞进行划痕，并添加抗氧化剂继续培养，共培养40h；
3)用显微镜分别记录抗氧化剂添加0h、12h及36h的干细胞生长图像。
由图6的实验结果可知，NMN的添加能够显著提高干细胞的迁移能力。
实施例五、细胞免疫表型鉴定
本实施例的细胞免疫表型鉴定方法如下：
1)将细胞以2×106/孔的密度接种于T75瓶，贴壁4h后对细胞进行抗氧化剂处理；
2)取抗氧化剂作用结束后的细胞，0.25％胰酶消化后，以10％胎牛血清的DMEM/F12终止消化，1200rpm离心3min，PBS清洗3遍以除去血清。调整细胞密度至106cells/ml，以1ml体积分装至无菌离心管中；
3)分别按照说明书上的量加入鼠抗人CD73-FITC、CD90-PE、CD105-APC、CD34-FITC、CD45-APC、HLA-DR-PE抗体，混匀，4℃，避光孵育30min。同时以未加抗体的细胞作为阴性对照；
4)孵育结束后，加入流式细胞术400-600g离心5分钟，弃上清，清洗3遍除去未结合的抗体，BD流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。
由图7的实验结果可知，抗氧化剂麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10的添加不影响干细胞表面抗原表型的表达。
实施例六、抗氧化剂对脐带间充质干细胞分化能力的影响
本实施例通过干细胞诱导分化实验研究抗氧化剂对脐带间充质干细胞分化能力的影响，具体步骤如下：
1)将12代次干细胞以2×105cells/孔的密度接种于六孔板；
2)铺板4h后添加抗氧化剂继续培养24h；
3)待干细胞汇合度达到80～90％时换用干细胞诱导培养基进行成骨，成脂与成软骨方向的干细胞诱导。
由图8的结果可知，抗氧化剂麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10的添加不影响干细胞成骨，成脂及成脂肪细胞的能力。
本申请在脐带间充质干细胞培养时添加抗氧化剂麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸和辅酶Q10，β烟酰胺单核苷酸促进脐带间充质干细胞的迁移，三种抗氧化剂均可促进细胞增殖并延缓衰老，能够有效缓解脐带间充质干细胞输入体内后可能由微环境中各种胁迫因素引起的氧化应激水平上升和活力下降，且不影响干细胞基本属性(特征性细胞表面抗原和多向分化能力)，并可修复由过氧化氢诱导脐带间充质干细胞衰老导致的胞内活性氧水平上升、炎性细胞因子水平上升和β半乳糖苷酶表达上升。
以上对本申请实施例所提供的抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
序列表
<110> 北京唐颐惠康生物医药技术有限公司
华东理工大学
<120> 抗氧化剂在提高脐带间充质干细胞活力中的应用
<141> 2022-03-03
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gagacagaaa gagcgggaaa ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
attcaccttc caggcattca 20

Claims (14)

1.抗氧化剂在促进脐带间充质干细胞迁移中的应用，其中，所述抗氧化剂包括β烟酰胺单核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以将所述抗氧化剂加入培养基后的总体积计，所述β烟酰胺单核苷酸的浓度为5～20μM。
3.抗氧化剂在降低脐带间充质干细胞分泌炎症因子TNF-α中的应用，其中，所述抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗氧化剂降低过氧化氢诱导衰老后所述脐带间充质干细胞分泌TNF-α的水平。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以将所述抗氧化剂加入培养基后的总体积计，所述麦角硫因的浓度为1～10mM；和/或，所述β烟酰胺单核苷酸的浓度为5～20μM；和/或，所述辅酶Q10的浓度为10～100μM。
6.抗氧化剂在维持脐带间充质干细胞分化为成骨细胞、成脂细胞或成软骨细胞中的应用，其中，所述抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以将所述抗氧化剂加入培养基后的总体积计，所述麦角硫因的浓度为1～10mM；和/或，所述β烟酰胺单核苷酸的浓度为5～20μM；和/或，所述辅酶Q10的浓度为10～100μM。
8.抗氧化剂在脐带间充质干细胞体外培养或制备提高脐带间充质干细胞活力的辅助性药物中的应用，其中，所述抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
9.一种提高脐带间充质干细胞活力的培养基，其特征在于，所述培养基为添加了抗氧化剂的间充质干细胞培养基，所述抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，以将所述抗氧化剂加入培养基后的总体积计，所述麦角硫因的浓度为1～10mM；和/或，所述β烟酰胺单核苷酸的浓度为5～20μM；和/或，所述辅酶Q10的浓度为10～100μM。
11.一种提高脐带间充质干细胞增殖活力和减缓衰老的方法，其特征在于，包括：培养脐带间充质干细胞；在细胞培养液中添加抗氧化剂；所述抗氧化剂包括麦角硫因、β烟酰胺单核苷酸或辅酶Q10。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以将所述抗氧化剂加入培养基后的总体积计，所述麦角硫因的浓度为1～10mM；和/或，所述β烟酰胺单核苷酸的浓度为5～20μM；和/或，所述辅酶Q10的浓度为10～100μM。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，添加所述抗氧化剂时所述脐带间充质干细胞的密度为2～15×104个/mL。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养液中添加所述抗氧化剂后继续培养所述脐带间充质干细胞20～28小时后，更换所述细胞培养液从而去除所述抗氧化剂。
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