CN103451150A - 一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：（1）胎盘源母体间充质干细胞的分离；和（2）胎盘源母体间充质干细胞的培养。其中，步骤（1）使用了trypLE^TM酶溶液分两步处理胎盘组织；步骤（2）使用无血清培养基。本发明的方法经过短串联重复序列（STR）图谱分析为完全母体来源，经染色体核型检查，细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度鉴定，细胞生物学功能鉴定为合格。因此，本发明方法获得的胎盘源母体间充质干细胞不含异种蛋白，可以满足临床使用的需要，尤其适合母亲自己使用，也为建立优良的胎盘源母体间充质干细胞库提供了技术保障。

Description

一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞的分离、培养的方法，特别是指一种一种胎盘源母体间充质干细胞的分离、制备的方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点：1)造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干/祖细胞，MSCs与造血干细胞共同移植可促进造血干祖细胞的植入。2)免疫调控。MSCs不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义。3)基因治疗。由于MSCs体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景。4)多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。

目前，从胎盘、脐带获得间充质干细胞常用多步多酶消化法，如：卢国辉等《卢国辉，张世忠，陈强,等.人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究.南方医科大学学报，2011;31(2)：262-265》采用双酶消化加密度梯度离心法从足月胎盘底蜕膜中分离出呈克隆样贴壁生长细胞，表达典型的MSCs表面抗原，但由于胎盘组织比较复杂，同时存在母体和胎儿的细胞，卢国辉等并未检测所得到的为母体细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于一种对细胞损伤小、更快的得到完全来自母体的胎盘源间充质干细胞的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，其特征是由下述步骤组成：

（1）胎盘源母体间充质干细胞的分离：取胎盘小心剥离底蜕膜组织，先用机械方法处理成小于0.5-1平方厘米的小片，用组织块1-5倍体积的trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块0.3-0.5小时，后清洗去除消化液，该步目的为了去除小组织块表面可能粘连的胎儿组织。我们再将第一步消化后的残留组织块，再用组织块1-5倍体积的trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块0.5-1小时，得到消化后的混合液，将混合液用滤网过滤得到单细胞为主的悬液；将细胞悬液离心；通过分两步处理，我们可以得到很纯的母体细胞。

（2）胎盘源母体间充质干细胞的培养：将上述细胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行原代细胞培养。所用培养基为无血清培养基，细胞培养到80-90%融合时，用trypLE^TM消化，按分种率1：2--1：10接种到新培养瓶中培养。经过数次传代，间充质干细胞得到纯化，可以将细胞作为原代传代细胞库冻存到液氮中长期保存。

本发明的优点：

本发明提供一种对细胞损伤小、更快的得到完全来自母体的胎盘源间充质干细胞的制备方法，与现有技术相比至少有以下优点：

1）本发明的方法更加简便快捷，并能获得完全来自母体的细胞：

本发明的方法只使用了二步消化的方法，更加方便和快捷，较卢国辉等的多步多酶消化法的方法简单，且能得到完全来自母体的细胞。

由于胎盘由羊膜、叶状绒毛膜（也称丛密绒毛膜）和底蜕膜构成。羊膜：构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的最内层，羊膜是附着在绒毛膜板表面的半透明膜；叶状绒毛膜：构成胎盘的胎儿部分，占妊娠胎盘的主要部分；底蜕膜：构成胎盘的母体部分，占妊娠足月胎盘很小部分，底蜕膜表面覆盖一层来自固定绒毛的滋养层细胞与底蜕膜共同形成绒毛间隙的底，称为蜕膜板，从此板向绒毛膜方向伸出一些蜕膜间隔，一般不超过胎盘全层厚度的2/3，将胎盘母体面分成肉眼可见的20个左右母体叶。

由于胎盘结构的复杂性，使用现有技术的多步多酶消化法会导致分离过程污染母体或胎儿的细胞，获得的异源细胞可能会引起人体免疫反应等问题，而本发明的方法则可以获得来源单一的组织干细胞，如本发明后续实施例所示，通过使用短串联重复序列（STR）分析，（称DNA指纹图谱，能灵敏的检测出细胞交叉污染），可以证明即使在分离如胎盘这样多重来源组织细胞，本发明的方法也可以获得完全来自母体的细胞。

2）本发明采用trypLE^TM进行消化组织，trypLE^TM消化细胞不需要用血清中和，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤；，使其具有更高活率，如本发明后续实施例所示，本发明方法获得的间充质干细胞可以更加有效进行成脂、成骨诱导分化。

3）本发明的间充质干细胞的培养和扩增方法中使用了无血清培养基，而现有技术中培养间充质干细胞为采用含2-20%血清的培养基，具有导致血清源性污染，批次间差异大、某些残留的异种蛋白可能引起人体免疫反应等风险。

而本发明采用的无血清培养基（Serum Free Medium,SFM）是全部用已知成分组配的不加血清的合成培养基，为在含有细胞所需营养和贴壁因子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，在保证细胞良好生长和提高细胞培养质量的同时，可避免血清批次间的质量变动，避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，因此，特别适合在制药生产的中的用途。

最后，本发明方法获得的胎盘源母体间充质干细胞不含异种蛋白，可以满足临床使用的需要，尤其适合母亲自己使用，也为建立优良的胎盘源母体间充质干细胞库提供了技术保障。

附图说明

图1为人胎盘源母体间充质干细胞形态图；

图2为人胎盘源母体间充质干细胞STR图谱分析；

图3为人胎盘源母体间充质干细胞流式表型图；

图4为人胎盘源母体间充质干细胞的成脂诱导分化图；

图5为人胎盘源母体间充质干细胞的成骨诱导分化图；

图6为人胎盘源母体间充质干细胞抑制γ-干扰素分泌的能力检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1人胎盘源母体间充质干细胞的分离、培养及原代传代细胞库冻存

（1）用磷酸缓冲液（PBS）反复冲洗胎盘后，小心分离胎盘底蜕膜部分，再用PBS反复冲洗，去除残留的血液，剪碎至小于0.5-1平方厘米的小块；

（2）根据组织块的总体积加入1倍体积的trypLE^TM（Invitrogen,USA）混合酶溶液37℃消化组织块0.3小时，在消化过程中用转子搅拌；然后清洗去除消化液，再将第一步消化后的残留组织块，再用组织块2倍体积的trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块0.5小时，得到消化后的消化液，

（3）步骤（2）获得的消化液用筛网过滤，先后用100目及200目的滤网过滤，去除未消化的组织；

（4）离心，获得细胞：离心机的转速为1500g/min离心15min，获得人胎盘源母体间充质干细胞；

（5）将上述人胎盘源母体间充质干细胞按1～2×10⁴/cm²接种于塑料培养瓶，采用无血清培养基（LONZA），置37℃，5%CO₂培养箱培养，3-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。待细胞80%融合，trypLE^TM消化，按1：3传代。

（6）将P2代细胞用trypLE^TM消化，计数，用配制好细胞冻存保护液按3×10⁶细胞/ml浓度重悬细胞，分装入冻存管冻存；

（7）取部分冻存细胞，用本领域所熟知的方法进行短串联重复序列（STR）图谱分析，染色体核型检查，细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度鉴定，细胞生物学功能鉴定，将所有项目合格的原代传代细胞库长期冻存备用。

结果：我们获得的细胞形态为均一的长梭形（图1），进行短串联重复序列（STR）图谱分析，确认为母体来源细胞（图2，以同一来源胎儿源的脐带间充质干细胞为对照（图2左半部分），证明得到的胎盘源间充质干细胞为母体来源细胞（图2右半部分）），将细胞进行流式检测分析，其流式表型符合间充质干细胞特征（图3）。

因此，可以确认获得了一种母体来源的间充质干细胞。

实施例2人胎盘源母体间充质干细胞的扩增和制剂制备

（1）从实施例1获得的合格的原代传代细胞库取出含3×10⁶细胞的冻存管，在37℃解冻复苏细胞；

（2）用无血清培养基（LONZA）按2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90%融合时按1：3传代，经过3次传代；

（3）在第三次传代细胞融合度达90%时，用trypLE^TM消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存。

（4）取部分细胞重悬液制剂用本领域专业人事熟知的方法进行细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度检查，细胞活力检测、内毒素检测、相关残留物检测。

结果：获得的细胞无细菌、真菌和病毒的病原微生物污染，细胞纯度检查，细胞活力检测、内毒素检测、相关残留物检测均合格。

实施例3人胎盘源母体间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化

（1）成骨分化检测：选取第4代胎盘底蜕膜间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%时更换成骨培养基(Hyclone公司)，然后每3d换液1次，21d后茜素红染色检测成骨情况。

（2）成脂分化检测：选取第4代胎盘底蜕膜间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×10⁴/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%时更换成脂培养基(Hyclone公司)。然后每3d换液1次，21d后油红O染色检测成脂情况。

结果：成脂诱导的细胞连续培养，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合，培养3周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，经油红O染色可见被染成红色的脂滴(图4)。成骨诱导后培养3周以上，细胞基质矿化物逐渐出现，形成多层小结结构，可见明显钙化结节，经茜素红染色后呈深红色(图5)。由图可以看出，本发明获得细胞更加有活力，具有更佳的成脂和成骨诱导分化能力。

实施例4人胎盘源母体间充质干细胞对活化淋巴细胞的γ-干扰素分泌抑制试验

经供者授权同意后，无菌条件下采集健康供者外周静脉血10ml，分离单个核细胞备用。将融合度为80-90%的胎盘源母体间充质干细胞以铯源照射20Gy，以2×10⁴/孔和5×10³/孔两种浓度接种于96孔板，在37℃，体积分数5%CO2，饱和湿度培养箱中培养1h，待细胞贴壁后每孔加入1×10⁵人外周血单个核细胞，2μL植物血凝素(10mg/L)与人胎盘源母体间充质干细胞共培养。72h后1600r/min离心10min，采集上清。ELISA检测培养上清中γ-干扰素水平。

结果：经检测人胎盘源母体间充质干细胞在1:5和1:20的浓度时均可以明显抑制活化淋巴细胞分泌γ-干扰素的能力，在1:5时抑制率在75%。（图6）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种胎盘源母体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）胎盘源母体间充质干细胞的分离：取胎盘组织，先用机械方法处理成组织块小片，用trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块，清洗去除消化液后，再用trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块，得到消化后的消化液，过滤后将细胞悬液离心，即获得胎盘源母体间充质干细胞；

（2）胎盘源母体间充质干细胞的培养：将上述步骤（1）获得的细胞按0.5-2×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90%融合时，用trypLE^TM消化，按分种率1：2--1：10接种到新培养瓶中培养；经过数次传代后，将细胞作为原代传代细胞库，冻存到液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中胎盘组织为来自母体的底蜕膜部分。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中使用机械方法获得组织块小片的大小为小于0.5-1平方厘米。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中第一次用trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块的处理时间为0.3-0.5小时；第二次用trypLE^TM酶溶液37℃消化组织块的处理时间为0.5-1小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中过滤方法为滤网过滤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述滤网的目数为100目-200目。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中细胞培养所用培养基为无血清培养基。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中传代次数为1-5代。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中冻存所用的冻存保护液含5-10%的DMSO和1-10%的人血清白蛋白和适量DMEM/F12，也可以使用商业化的冻存保护液。

10.一种如权利要求1-9任意一项所述的方法获得的胎盘源母体间充质干细胞。

11.根据权利要求10所述的胎盘源母体间充质干细胞，其特征在于，所述的胎盘源母体间充质干细胞经过短串联重复序列（STR）图谱分析为母体来源；经染色体核型检查，细菌、真菌和病毒的病原微生物检查，细胞纯度鉴定，细胞生物学功能鉴定为合格。

12.如权利要求1-9任意一项所述的方法获得的胎盘源母体间充质干细胞在组织工程、制备治疗免疫系统疾病的药物以及组织再生修复中的应用。

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