CN103789262A

CN103789262A - 一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法

Info

Publication number: CN103789262A
Application number: CN201410052577.7A
Authority: CN
Inventors: 陈正琳; 夏佳音; 陈平
Original assignee: Ningbo Placentasc Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Taizhou grace Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明提供一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法：对新鲜娩出胎盘立即进行预处理，然后分离出脐动脉和脐静脉；用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；用酶消化液灌注胎盘绒毛血管，置37℃温度下消化5～20min；用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体；将得到的液体离心，弃上清后重悬细胞；重悬的细胞悬液经羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离，得到本发明临床应用级胎盘造血干细胞。该方法不仅能够提高所制备的胎盘造血干细胞的数量、活力以及CD34阳性细胞的含量，而且是临床应用级的，无潜在病原体污染，另外，该方法制备成本低。

Description

一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，以及该制得的胎盘造血干细胞的保存方法。

背景技术

最新研究表明，胎盘中含有大量造血干细胞，同脐带血中的造血干细胞一样，

胎盘造血干细胞是高度未分化细胞，也可以说它是一切血细胞（其中大多数是免疫细胞）的原始细胞，可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症、淋巴瘤等）、血红蛋白病、骨髓造血功能衰竭（如再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患等多种疾病。

胎盘中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的10倍，足可供小孩自用几次或1～2个成人患者使用1一次，有效解决了移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植。

目前，从胎盘中提取造血干细胞的流程为：（1）先将整个胎盘或胎盘绒毛膜组织用机械法分解成小块；（2）然后采用一种或几种酶进行消化，消化后过滤；（3）最后采用羟乙基淀粉(HES)法或淋巴分离液法回收含有造血干细胞的单个核细胞，有些还会在离心分离后采取免疫磁珠、流式细胞等方法，富集造血干细胞。现有技术存在以下缺陷：（1）分离得到的胎盘造血干细胞含量较低，如专利“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法” 中提取的单核细胞数为2～4×10⁹，其中CD34阳性的造血干细胞含量仅为0.3～0.7%，则CD34阳性的造血干细胞数最多为2.8×10⁷；（2）整个胎盘或胎盘绒毛膜组织体积都比较大，因此处理量大，不仅要用很大量的消化酶，增加了成本，而且还耗费时间，不利于细胞活性的保持。

另外，目前胎盘造血干细胞冻存液中大都添加血清或白蛋白等生物源性成份来保证冻存复苏后干细胞的生长需要/保持干细胞的高存活率。但目前还没有适合临床应用的血清，血清含有大量未知成分，质量不易控制，用于异体输注存在安全隐患，比如血清含有不能治愈的病毒或病原体，接受干细胞治疗的病人便会因而染病，后果十分严重。而合适浓度的白蛋白虽然在一定时间内也能保持细胞的高存活率，但目前所使用的白蛋白都是人源性或动物源性，存在安全隐患，不适合临床应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，该方法不仅能够提高所制备的胎盘造血干细胞的数量、活力以及CD34阳性细胞的含量，而且是临床应用级的，无潜在病原体污染，另外，该方法制备成本低。

本发明所采用的技术方案为：

一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜娩出胎盘立即进行预处理，然后分离出脐动脉和脐静脉；

（2）用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；

（3）用酶消化液灌注胎盘绒毛血管，置37℃温度下消化5～20min；

（4）用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体，该液体中包含了步骤（3）中消化后的酶消化液、灌注后的收集液；

（5）将步骤（2）、（4）得到的液体离心，弃上清后重悬细胞；

（6）重悬的细胞悬液经羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法分离，得到本发明临床应用级胎盘造血干细胞。

本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领域公知常识，即对胎盘进行消毒、除去胎盘包膜以及洗涤的步骤，在这里便不再详述。但是为争取时间，以尽量保持造血干细胞的活力，本发明对新鲜娩出的胎盘需立即进行这些预处理过程。

所述步骤（2）中清洗液为抗生素含量100～1000mg/L的溶液，其中所述抗生素为青霉素、链霉素、头孢氨苄、卡那霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素中的一种单独使用或几种联合使用，配制抗生素的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液或本领域其它常规培养液；优选为含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液，其中抗生素的浓度为100～300mg/L，青霉素、链霉素的加入比例为1：1。

上述清洗液的使用量为150～400ml。

对于酶消化技术，消化酶种类选择、消化酶工作浓度、消化时间、消化酶的先后使用顺序都会影响到最终得到的细胞数量。本发明所述步骤（3）中酶消化液为含有0.03%~0.3%消化酶的溶液，其中所述消化酶为Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶、胰蛋白酶中的一种单独使用或几种联合使用，配制消化酶的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液或本领域其它常规培养液。如果采用多种消化酶，可以是多种消化酶同时作用，也可以选择分开作用。

上述酶消化液优选为0.08%～0.22% I型胶原酶和0.08%～0.22% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液（使用该酶消化液时消化时间优选为8～15min）；进一步优选为0.1% I型胶原酶和0.1% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液（使用该酶消化液时消化时间优选为12min）。

上述酶消化液的使用量为150～200ml。

上述酶消化液在使用前必须完全解冻，且预热至37℃。

所述步骤（4）中收集液为生理盐水或PBS或DEME培养液或本领域其它常规培养液；优选为DMEM培养液。

上述收集液的使用量为150～400ml。

本发明进一步提供上述制备所得的临床应用级胎盘造血干细胞的保存方法：在临床应用级胎盘造血干细胞中加入冻存液，所述冻存液为含10%DMSO、5%人重组白蛋白的DEME溶液，所述冻存液的加入量为20～40%（体积比），然后直接冻存于-196℃。

本发明所用胎盘经无菌采集，无菌运送，干细胞分离前检测肝炎病毒及相应抗体、艾滋病抗体、梅毒，检测合格后，从胎盘组织中无菌分离出造血干细胞，为了争取时间、提高细胞活力，在分离的同时进行细菌和真菌检测，分离得到的细胞立即进行造血干细胞定量检测（CD34）、造血干细胞活性检测（台盼兰染色），然后冻存，用上述方法获得的胎盘造血干细胞含量高，细胞活性高，非常适用于临床应用，安全有效。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

1、本发明采用灌注法从胎盘绒毛血管中提取造血干细胞，分离得到的CD34阳性的造血干细胞经检测数量多达1.2～1.6×10⁹，效果明显优于现有技术；

2、现有技术处理的是整个胎盘或胎盘绒毛膜组织，处理体积大，因此出于成本考虑，不会选用培养液作为组织清洗液和消化酶的配制溶液，而且体积大，消化酶的用量也大，而本发明处理的仅仅是胎盘绒毛血管，文献报道胎盘动静脉系统容积为152.5±45.3ml，因此所需用到的组织清洗液和消化酶非常少，就可以采用有利于保持细胞活性的培养液作为组织清洗液和消化酶的配制溶液，而且消化酶用量的减少，使最终成本降低；

3、本发明省去了现有技术中机械分解组织、消化后过滤等步骤，因此节省了制备时间，有利于细胞活力的保持；

4、本发明采用羟乙基淀粉和淋巴细胞分离液两步法回收造血干细胞，回收效率更高；

5、本发明采用重组人白蛋白作为冻存液中的保护剂，该冻存液不含有生物源性成分，安全有效，不仅能够维持胎盘造血干细胞活性，而且更有利于临床应用。

附图说明

图1所示的是按本实施例酶消化方法A得到的CD34⁺胎盘造血干细胞的流式鉴定结果图；

图2所示的是按本实施例酶消化方法B得到的CD34⁺胎盘造血干细胞的流式鉴定结果图；

图3所示的是按本实施例酶消化方法C得到的CD34⁺胎盘造血干细胞的流式鉴定结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：胎盘造血干细胞的获得

1、无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎盘，立即进行预处理，然后分离出两条脐动脉和一条脐静脉，将连接注射器或恒流泵的穿刺针或小儿头皮针刺入脐带静脉，用300ml含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液（抗生素的浓度为200mg/L，其中青霉素、链霉素的加入比例为1：1）作为清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；

2、酶消化，为了更好地说明本发明的可实施性，这里列举三种不同的消化方法进行具体说明，但本发明酶消化方法不局限于此：

酶消化方法A：用150ml经37˚C预热的0.1%胶原酶I和0.1%胶原酶II等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液灌注胎盘绒毛血管，然后钳住两条脐动脉和条条脐静脉，置37℃消化12min；

酶消化方法B：用150ml经37˚C预热的0.2%胶原酶I和0.2%胶原酶II等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液灌注胎盘绒毛血管，然后钳住两条脐动脉和一条脐静脉，置37℃消化8min；

酶消化方法C：用150ml经37˚C预热的0.1%胶原酶I、溶剂为DEME培养液的消化液先灌注胎盘绒毛血管，然后钳住两条脐动脉和一条脐静脉，置37℃消化6min，然后放开钳制，再用经37˚C预热的0.1%胶原酶II消化液再灌注，血管钳制后置37℃消化6min。

3、将两条脐动脉置于收集管中，然后放开两条脐动脉和一条脐静脉的钳制，用300ml DMEM培养液作为收集液从脐静脉处进行灌注，收集灌注后的液体；

4、将步骤1和步骤3中得到的液体在10˚C以下，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀。根据需要，可以重复离心洗涤几次，以去除多余的组织碎片和红细胞；

5、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分离：6%羟乙基淀粉与细胞悬液按1：4体积比混合，10˚C以下静置30min，取上清液，10˚C以下，1000r/min离心10min，去除上清液；用PBS重悬细胞沉淀后，将其缓慢加至含有等体积Ficoll分离液上，10˚C以下，2000r/min离心20min，取中间白膜层，用PBS以1000r/min离心5min洗涤2次后用PBS重悬。

对上述制得的造血干细胞进行造血干细胞定量检测（CD34）和造血干细胞活性检测（台盼兰染色），造血干细胞数量达1.2～1.6×10⁹，具体结果如表1、图1-3所示。

表1：三种酶消化方法得到的造血干细胞数量：

	酶消化方法A	酶消化方法B	酶消化方法C
				造血干细胞数量	1.60×10⁹	1.59×10⁹	1.20×10⁹

实施例2：胎盘造血干细胞检测

1、新鲜娩出胎盘预处理后、胎盘造血干细胞制备前：进行肝炎病毒及相应抗体检测，艾滋病抗体检测，梅毒抗体检测；

2、胎盘造血干细胞制备的同时：进行细菌和真菌检测；

3、胎盘造血干细胞制备好后：进行造血干细胞定量检测（CD34），造血干细胞活性检测（台盼兰染色）。

实施例3：胎盘造血干细胞冻存

1、配制冻存液（配方10%DMSO+5%人重组白蛋白+DEME培养液）：取一离心管，加入9ml DEME培养液，再往离心管里缓慢滴加6.75ml DMSO，边滴加边振荡摇匀后，盖上盖子，拧紧，置于4˚C冰箱预冷，待预冷完成，缓慢滴加6.75ml人重组白蛋白（购自日本三菱制药集团公司），边滴加边摇匀，避免产生沉淀，盖上盖子，拧紧，置于4˚C冰箱预冷以备用；

2、取出事先备好的冻存液，缓缓滴入到细胞悬液中，每管加10ml，边滴边震荡，迅速打匀后盖上盖子，置4˚C冰箱中预冷；

3、取出预冷好的细胞悬液，将其注入到低温冻存管中，封口，放入标签，置于4˚C冰箱，离开洁净区后将造血干细胞转入-80˚C冰箱冻存一段时间后转到液氮灌长期保存。

实施例所用的原料，除另有说明外，均为适合生物技术使用的市售工业品。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）用清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；

（4）用收集液灌注胎盘，收集灌注后的液体；

2.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中清洗液为抗生素含量100～1000mg/L的溶液，所述抗生素为青霉素、链霉素、头孢氨苄、卡那霉素、庆大霉素、两性霉素B、万古霉素中的一种单独使用或几种联合使用，配制抗生素的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述清洗液的使用量为150～400ml。

3.根据权利要求2所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中清洗液为含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液，抗生素的浓度为100～300mg/L，其中青霉素、链霉素的加入比例为1：1。

4.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为含有0.03%~0.3%消化酶的溶液，所述消化酶为Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅲ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶、胰蛋白酶中的一种单独使用或几种联合使用，配制消化酶的溶剂为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述酶消化液的使用量为150～200ml。

5.根据权利要求4所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为0.08%～0.22% I型胶原酶和0.08%～0.22% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液，使用该酶消化液时消化时间为8～15min。

6.根据权利要求5所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液为0.1% I型胶原酶和0.1% II型胶原酶等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液，使用该酶消化液时消化时间为12min。

7.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶消化液在使用前先经过解冻，且预热至37℃。

8.根据权利要求1所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中收集液为生理盐水或PBS或DEME培养液，所述收集液的使用量为150～400ml。

9.根据权利要求8所述的一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中收集液为DMEM培养液。

10.权利要求1所述的临床应用级胎盘造血干细胞的保存方法，其特征在于：在制备得到的临床应用级胎盘造血干细胞中加入冻存液，所述冻存液为含10%DMSO、5%人重组白蛋白的DEME溶液，所述冻存液的加入量为20～40%，然后冻存于-196℃。