CN105368780A - 分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。所述灌洗液包含青-链霉素双抗、酚妥拉明、维生素C和PBS。所述酶解液包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、1×肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK。所述方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注灌洗液，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得胎盘造血干细胞。本发明显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量高、存活率高，细胞污染率极低。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。
背景技术
造血干细胞(HemopoieticStemcell，HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源。
随着研究的日渐深入，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，HSC的主要来源是骨髓、外周血及脐血，骨髓和外周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而脐血HSC数量有限，这些限制因素使其不能满足日渐增长的HSC临床应用需求。近年来，国内外学者研究发现，胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。胎儿出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8～10倍，可供其自用几次，甚至可提供给多个成人患者进行治疗。
此外，胎盘中提取的造血干细胞不但具有含量丰富、移植后排斥反应低、无伦理障碍等优点，还有以下优点：胎盘中的造血干细胞更为早期，增殖能力强；胎盘众多的造血干细胞还可用来大规模制备红细胞和巨核细胞/血小板，用来替代输血。鉴于胎盘造血干细胞的这些优点，胎盘组织造血干细胞库技术的开展是干细胞研究领域的一大进展，将有效解决移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植治疗恶性血液系统疾病。
目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械酶解法。尽管机械酶解法能获取数量充足的细胞，但杂细胞含量高、造血干细胞含量较低，造血干细胞活率低。此外，现有技术中主要是对胎盘绒毛膜部位进行酶解消化，消化组织体积大，需要用大量的酶解液，生产成本高；整个提取过程操作繁复、耗时长，提取的细胞数量波动性较大、污染几率大大增加，不利于工业化。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供分离胎盘造血干细胞的灌洗液、酶解液及方法。
分离胎盘造血干细胞的灌洗液，包含缓冲液、双抗、血管扩张剂和抗氧化剂。
优选地，所述分离胎盘造血干细胞的灌洗液包含PBS、青-链霉素双抗、酚妥拉明和维生素C。
更优选地，所述灌洗液中各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗，0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C。
分离胎盘造血干细胞的酶解液，包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、血管扩张剂、抗氧化剂和抗凋亡试剂。
优选地，分离胎盘造血干细胞的酶解液包含RPMI-1640培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK(Caspase抑制剂)。
优选地，所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.01～0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.01～0.05mg/mL胰酶、10～50U/mL肝素钠、0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C、5～20ng/mLZ-VAD-FMK。
优选地，所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.025mg/mL胰酶、25U/mL肝素钠、0.1mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C、10ng/mLZ-VAD-FMK。
分离胎盘造血干细胞的方法，包括以下步骤：
S1、用灌洗液清洗胎盘内血液；
S2、向胎盘内灌注酶解液，室温酶解0.5～1.5h；
S3、收集酶解后的酶解液，离心取细胞沉淀；
S4、用PBS重悬细胞沉淀，再添加1～3倍体积的羟乙基淀粉溶液，室温下静置20～40min，取上层液体离心后弃去上清；用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5～15min，离心后弃上清；
S5、用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
优选地，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉的浓度为6m/v％。
优选地，所述步骤S3在收集酶解后的酶解液后，用灌洗液灌注冲洗胎盘，收集灌洗液并与收集的酶解后的酶解液合并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀。
优选地，所述步骤S4中用PBS重悬细胞沉淀，再添加1～3倍体积的羟乙基淀粉溶液，室温下静置20～40min；取上层液体300～800g离心5～10min；离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:5～1:10，涡旋振荡，室温下裂解残留的红细胞10min，200～500g离心5～10min，离心后弃上清；
优选地，所述步骤S5中用20～40mLRPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，200～500g离心5～10min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
优选地，胎盘浸没于胎盘保存液中在0～4℃条件下保存运输，6～12小时内分离胎盘造血干细胞；所述胎盘保存液包含青-链霉素双抗、肝素钠、低分子右旋糖酐和PBS，各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗、10～50U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐。
本发明的发明人通过研究发现：灌注酶解法用于提取胎盘造血干细胞关键是提高造血干细胞的提取数量、保证造血干细胞的存活率。因此，酶解液的组成成分成为至关重要的因素。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)酶解液组分简单，除了培养基外，添加了抗凋亡试剂Caspase抑制剂、血管扩张剂酚妥拉明、抗氧化剂维生素C和酶。RPMI-1640培养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供营养供给，保证了细胞的活率。Caspase抑制剂极大的抑制了细胞启动凋亡程序，提高了细胞的活率。本发明酶解液比较温和，同时使用胶原酶Ⅷ和胰酶，不仅减少对细胞的损伤，还可以在短时间内更好的消化胎盘组织，释放出组织里面的造血干细胞，提高分离得到的胎盘造血干细胞的数量和活率。抗氧化剂维生素C可以增强细胞的抗氧化能力，提高其抗逆能力，进而提高细胞的活率。酶解液中血管扩张剂酚妥拉明具有良好的血管扩张作用，利用实验中的灌注操作。肝素钠则降低血管中的凝血现象，利于血液的排除。此外，酚妥拉明和肝素钠还有利于酶解液渗透至末端血管，充分消化胎盘组织。
(2)本发明灌洗液组分简单，除了双抗、PBS外，含有酚妥拉明、维生素C。青-链霉素双抗具有抗菌作用，防止污染。PBS用于维持细胞内外渗透压。酚妥拉明和维生素C的作用与其在酶解液中的作用相同，维生素C用于增强细胞的抗氧化能力，提高细胞的活率；酚妥拉明起血管扩张作用，利用实验中的灌注操作。
(3)本发明分离胎盘造血干细胞的方法不止局限于分离绒毛膜组织中的造血干细胞，还可通过酶解灌注法全方位提取胎盘的造血干细胞。整个操作过程简单有效，实验操作时间短，显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量大大提高，细胞数量较稳定；同时优化提取分离的条件，尽可能的提高造血干细胞的存活率，细胞污染率极低。
附图说明
图1为本发明实施例1中方法制备的HSC不加抗体对照组的流式检测结果。其中，图1-A和图1-B为不加抗体的对照组。图1-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P1即表示单个核细胞总数所占百分比。图1-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比。
图2为本发明实施例1中方法制备的HSC添加抗体检测组的流式检测结果。其中，图2-A和图2-B为不加抗体的对照组。图2-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P1即表示单个核细胞总数所占百分比。图2-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。本发明中羟乙基淀粉溶液使用的是羟乙基淀粉注射液，购自广州医药有限公司，500mL/包，其中羟乙基淀粉(HES)的含量为6m/v％；1×红细胞裂解液购自广州誉为生物科技仪器有限公司。本发明所述1×～3×的双抗为本领域常规的试剂浓度表示方法，一般所购买的青-链霉素双抗均为高倍母液，如所购买的青-链霉素双抗多数为100倍浓度，在使用时会稀释配置成低倍数，如1倍，1×双抗的浓度为青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL。在配制胎盘保存液时，低分子右旋糖直接使用低分子右旋糖酐葡萄糖注射液(购自广州医药公司)，其含有低分子右旋糖酐-40的浓度为6m/v％，含有葡萄糖的浓度为5m/v％。
本发明所用胎盘由某医院妇产科提供，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4℃条件下6～12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。优选地，所述胎盘保存液包含青-链霉素双抗、肝素钠、低分子右旋糖酐和PBS，各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗、10～50U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐。本发明选用健康分娩的胎盘，采用低温胎盘保存液对胎盘进行保存，在数小时后进入试验流程，在短时间内尽可能的提取出活性高的造血干细胞。胎盘保存液中含有脐血浆等营养物质，保证了胎盘组织的营养供给。
在使用本发明所述分离胎盘造血干细胞的方法分离胎盘造血干细胞前，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领域公知。预处理包括对胎盘进行消毒、除去胎盘羊膜以及洗涤等步骤。在分离造血干细胞前，本领域技术人员均知晓这些预处理步骤并能够根据实际情况选择具体的预处理步骤。
实施例1
分娩获得的胎盘浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输。胎盘保存液的配方为：PBS中含有1×青-链霉素双抗、25U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐-40。分娩后6小时内按如下方法进行胎盘造血干细胞的分离。
S1、剥离羊膜，用0～4℃灌洗液初步清洗胎盘。清洗胎盘的具体方法为：用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘，灌洗至胎盘内血液被清洗干净，流出透明的灌洗液为止。
灌洗液的配方为：PBS中含有1×青-链霉素双抗、0.05mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C。
S2、用一次性注射器吸取酶解液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，至静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，置于室温酶解1h。
酶解液的配方为：RPMI-1640培养基中含有0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.01mg/mL胰酶、50U/mL肝素钠、0.05mg/mL酚妥拉明，5mg/mL维生素C、5ng/mLZ-VAD-FMK。
S3、松开动静脉，收集酶解液，并用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，收集灌洗液，将收集的酶解液和灌洗液合并为混合液，500g离心混合液10min。
S4、弃去上清；用PBS重悬细胞沉淀，再添加1倍体积的羟乙基淀粉注射液，室温下静置30min；吸取上层液体至50mL离心管中，500g离心10min，离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:10，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，500g离心10min，离心后弃上清。
S5、用40mLRPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，500g离心10min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
实施例2
分娩获得的胎盘浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输。胎盘保存液的配方为：PBS中含有2×双抗、25U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐-40。分娩后12小时内按如下方法进行胎盘造血干细胞的分离。
S1、剥离羊膜，用0～4℃灌洗液初步清洗胎盘。清洗胎盘的具体方法为：用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘，灌洗至胎盘内血液被清洗干净，流出透明的灌洗液为止。
灌洗液的配方为：PBS中含有2×双抗、0.05mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C。
S2、用一次性注射器吸取酶解液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，至静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，置于室温0.5～1.5h。
酶解液的配方为：RPMI-1640培养基中含有0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.025mg/mL胰酶、25U/mL肝素钠、0.1mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C、10ng/mLZ-VAD-FMK。
S3、松开动静脉，收集酶解液，并用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，收集灌洗液，将收集的酶解液和灌洗液合并为混合液，300g离心混合液5min。
S4、弃去上清；用PBS重悬细胞沉淀，再添加1倍体积的羟乙基淀粉注射液，室温下静置20min；吸取上层液体至50mL离心管中，300g离心5min，离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:10，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200g离心5min，离心后弃上清。
S5、用20mLRPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，200g离心5min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
实施例3
分娩获得的胎盘浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输。胎盘保存液的配方为：PBS中含有3×双抗、25U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐-40。分娩后6小时内按如下方法进行胎盘造血干细胞的分离。
S1、剥离羊膜，用0～4℃灌洗液初步清洗胎盘。清洗胎盘的具体方法为：用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘，灌洗至胎盘内血液被清洗干净，流出透明的灌洗液为止。
灌洗液的配方为：PBS中含有3×双抗、0.05mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C。
S2、用一次性注射器吸取酶解液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，至静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，置于室温0.5～1.5h。
酶解液的配方为：RPMI-1640培养基中含有0.01mg/mL胶原酶Ⅷ、0.05mg/mL胰酶、10U/mL肝素钠、0.01mg/mL酚妥拉明，1mg/mL维生素C、20ng/mLZ-VAD-FMK。
S3、松开动静脉，收集酶解液，并用一次性注射器吸取灌洗液自两条胎盘动脉灌注进胎盘中，收集灌洗液，将收集的酶解液和灌洗液合并为混合液，300～800g离心混合液5～10min。
S4、弃去上清；用PBS重悬细胞沉淀，再添加1倍体积的羟乙基淀粉注射液，室温下静置40min；吸取上层液体至50mL离心管中，800g离心10min，离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:10，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，300g离心10min，离心后弃上清。
S5、用30mLRPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，300g离心10min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
对比例1
按照公开号为CN104774806A的中国发明专利申请公开的其实施例1所述的方法分离胎盘造血干细胞。具体方法简述如下：
在无菌超净台内，取1～2mL胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离羊膜，用0～4℃灌洗液初步清洗胎盘，用一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，直至胎盘内血清被清洗干净；灌洗液：包括1×青-链霉素双抗、0.02％EDTA、1×枸橼酸盐缓冲溶液、0.05mg/mL的罂粟碱和1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液。
用一次性注射器吸取动员剂灌注进胎盘中的两条动脉，当静脉流出来的液体为动员剂时，结扎动静脉后置于室温2～5h；动员剂：包括1.0mg/LAMD3100、1×枸橼酸盐缓冲溶液、1×青-链霉素双抗、0.05mg/mL的罂粟碱、1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、0.3mg/mL维生素C和50ng/mL的Z-VAD-FMK的DMEM高糖基础培养基。
松开动静脉，一次性注射器吸取与前述同量的动员剂灌注进胎盘中的两条动脉，收集全部液体。收集的液体300～800g离心5～10min，弃去上清；按细胞沉淀：羟乙基淀粉注射液(V:V)＝1:2的比例，用羟乙基淀粉注射液重悬细胞沉淀，室温下静置20～40min，吸取上清至50mL离心管中，300～800g离心5～10min；离心后弃去上清；按细胞沉淀：1×红细胞裂解液(V:V)＝1:8的比例，用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200～500g离心5～10min；离心后弃上清，获得包含造血干细胞的单个核细胞，加入20～40mLDMEM高糖培养基，重悬细胞沉淀，200～500g离心5～10min，沉淀用DMEM高糖基础培养基重悬细胞，获得所述胎盘造血干细胞。
对比例2
按照公开号为CN104711226A的中国发明专利申请公开的其实施例1所述的方法分离胎盘造血干细胞。具体方法简述如下：
在无菌超净台内，取1～2mL胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离羊膜，用0～4℃灌洗液初步清洗胎盘，用一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，直至胎盘内血清被清洗干净；灌洗液：包括1×青-链霉素双抗、0.02％EDTA、1×枸橼酸盐缓冲溶液、0.05mg/mL的罂粟碱和1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液。
用一次性注射器吸取酶解液灌注进胎盘中的两条动脉，当静脉流出来的液体为酶解液时，结扎动静脉后置于室温2～5h；酶解液：0.05mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.02mg/mL的透明质酸酶、0.001％(质量百分比)的胰蛋白酶、1×枸橼酸盐缓冲溶液、1×青-链霉素双抗、0.05mg/mL的罂粟碱、1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。
松开动静脉，一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，收集全部酶解液体。收集的液体300～800g离心5～10min，弃去上清；按细胞沉淀：羟乙基淀粉注射液(V:V)＝1:2的比例，用羟乙基淀粉注射液重悬细胞沉淀，室温下静置20～40min，吸取上清至50mL离心管中，300～800g离心5～10min；离心后弃去上清；按细胞沉淀：1×红细胞裂解液(V:V)＝1:8的比例，用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200～500g离心5～10min；离心后弃上清，获得包含造血干细胞的单个核细胞，加入20～40mLDMEM高糖培养基，重悬细胞沉淀，200～500g离心5～10min，沉淀用DMEM高糖基础培养基重悬细胞，获得所述胎盘造血干细胞。
对比例3
按照公开号为CN103789262A的中国发明专利申请公开的其实施例1中酶消化方法A所述的方法分离胎盘造血干细胞。具体方法简述如下：
1、无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎盘，立即进行预处理，然后分离出两条脐动脉和一条脐静脉，将连接注射器或恒流泵的穿刺针或小儿头皮针刺入脐带静脉，用300mL含青霉素、链霉素双抗的DEME培养液(抗生素的浓度为200mg/L，其中青霉素、链霉素的加入比例为1：1)作为清洗液灌注胎盘绒毛血管，收集灌注后的清洗液；
2、酶消化方法A：用150mL经37℃预热的0.1％胶原酶I和0.1％胶原酶II等比例混合、溶剂为DEME培养液的消化液灌注胎盘绒毛血管，然后钳住两条脐动脉和脐静脉，置37℃消化12min；
3、将两条脐动脉置于收集管中，然后放开两条脐动脉和一条脐静脉的钳制，用300mlDMEM培养液作为收集液从脐静脉处进行灌注，收集灌注后的液体；
4、将步骤1和步骤3中得到的液体在10℃以下，1500r/min，离心15min，弃上清，加入DEME培养液，吹打混匀。根据需要，可以重复离心洗涤几次，以去除多余的组织碎片和红细胞；
5、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分离：6m/v％羟乙基淀粉与细胞悬液按1：4体积比混合，10℃以下静置30min，取上清液，10℃以下，1000r/min离心10min，去除上清液；用PBS重悬细胞沉淀后，将其缓慢加至含有等体积Ficoll分离液上，10℃以下，2000r/min离心20min，取中间白膜层，用PBS以1000r/min离心5min洗涤2次后用PBS重悬。
效果实施例1、细胞数量计算及活率检测
用RPMI-1640培养基重悬上述各实施例、对比例分离的细胞，调整细胞密度为1×106cells/mL；按照细胞悬液：0.4％台盼蓝(V:V)＝1:3的比例，取少量细胞悬液进行细胞数量计算及活率检测。实施例1～3分离的胎盘造血干细胞为实验组1～3，对比例1～3分离的胎盘造血干细胞为对照组1～3。结果如表1所示。
表1、细胞数量及活率检测结果
| 组别 | 单个核细胞活细胞数 | 单个核细胞总细胞数 | 细胞活率 |
| 实验组1 | 6.037×108cells | 6.442×108cells | 93.72％ |
| 实验组2 | 6.502×108cells | 6.876×108cells | 94.56％ |
| 实验组3 | 6.172×108cells | 6.655×108cells | 92.74％ |
| 对照组1 | 6.61×108cells | 7.14×108cells | 92.58％ |
| 对照组2 | 8.45×108cells | 9.87×108cells | 85.65％ |
| 对照组3 | 5.79×107cells | 8.86×107cells | 65.34％ |
从表1可知，使用本发明方法从胎盘中提取出6.442×108～6.8762×108个单个核细胞，稍低于对照组1～3获得的单个核细胞，但使用本发明获得的单个核细胞活细胞数量为6.037×108～6.502×108个细胞，细胞活率高达92.74％～94.56％，明显高于对照组1～3分离的HSC的细胞活率。因此，本发明的灌注酶解法所提出来的细胞活率高、活力好。
效果实施例2、流式检测
取各实施例、对比例分离的细胞各1×106～3×106cells进行流式检测。细胞悬液用含10％FBS的PBS清洗两遍；分成两管细胞，用10％FBS的PBS重悬，其中一管(样品组)加入2.5μLCD34的抗体，充分混匀，另一管(对照组)不添加抗体，同时闭关孵育30min，用10％FBS的PBS洗两遍后，用1640重悬，上流式仪检测CD34+的细胞含量。实施例1～3分离的胎盘造血干细胞为实验组1～3，对比例1～3分离的胎盘造血干细胞为对照组1～3。结果如图1-2和表2所示。
表2、流式检测结果
| 组别 | CD34+的细胞数量 |
| 实验组1 | 29.0％ |
| 实验组2 | 30.4％ |
| 实验组3 | 28.9％ |
| 对照组1 | 30.2％ |
| 对照组2 | 30.5％ |
| 对照组3 | 29.4％ |
由表2可知，本发明方法分离得到的造血干细胞中CD34+细胞的百分含量为28.9％～30.4％，与现有技术相当。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.分离胎盘造血干细胞的灌洗液，其特征在于，包含缓冲液、双抗、血管扩张剂和抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的分离胎盘造血干细胞的灌洗液，其特征在于，所述灌洗液中各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗，0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C。
3.分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于，包含基础培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、血管扩张剂、抗氧化剂和抗凋亡试剂。
4.根据权利要求3所述的分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于，包含RPMI-1640培养基、胶原酶Ⅷ、胰酶、肝素钠、酚妥拉明、维生素C和Z-VAD-FMK。
5.根据权利要求4所述的分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于，所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.01～0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.01～0.05mg/mL胰酶、10～50U/mL肝素钠、0.01～0.1mg/mL酚妥拉明，1～5mg/mL维生素C、5～20ng/mLZ-VAD-FMK。
6.根据权利要求5所述的分离胎盘造血干细胞的酶解液，其特征在于所述酶解液各组分在RPMI-1640培养基中的含量为：0.05mg/mL胶原酶Ⅷ、0.025mg/mL胰酶、25U/mL肝素钠、0.1mg/mL酚妥拉明，3mg/mL维生素C、10ng/mLZ-VAD-FMK。
7.分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、用灌洗液清洗胎盘内血液；
S2、向胎盘内灌注酶解液，室温酶解0.5～1.5h；
S3、收集酶解后的酶解液，离心取细胞沉淀；
S4、用羟乙基淀粉溶液重悬细胞沉淀，室温下静置20～40min，取上层液体离心后弃去上清；用红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温下裂解残留的红细胞5～15min，离心后弃上清；
S5、用RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
8.根据权利要求7所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3在收集酶解后的酶解液后，用灌洗液灌注冲洗胎盘，收集灌洗液并与收集的酶解后的酶解液合并为混合液，混合液离心后取细胞沉淀。
9.根据权利要求7所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S4中用PBS重悬细胞沉淀，再添加1～3倍体积的羟乙基淀粉溶液，室温下静置20～40min；取上层液体300～800g离心5～10min；离心后弃去上清；用1×红细胞裂解液重悬细胞沉淀，细胞沉淀与1×红细胞裂解液的体积比为1:5～1:10，涡旋振荡，室温下裂解残留的红细胞10min，200～500g离心5～10min，离心后弃上清；所述步骤S5中用20～40mLRPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，200～500g离心5～10min，离心后弃上清，所得细胞沉淀即为胎盘造血干细胞。
10.根据权利要求7所述的分离胎盘造血干细胞的方法，其特征在于，胎盘浸没于胎盘保存液中在0～4℃条件下保存运输，6～12小时内分离胎盘造血干细胞；所述胎盘保存液包含青-链霉素双抗、肝素钠、低分子右旋糖酐和PBS，各组分在PBS中的含量为：1×～3×青-链霉素双抗、10～50U/mL肝素钠、1m/v％低分子右旋糖酐。
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Denomination of invention: Lavage solution, enzymatic hydrolysate, and method for separating placental hematopoietic stem cells Effective date of registration: 20230926 Granted publication date: 20190924 Pledgee: Societe Generale Bank Limited by Share Ltd. Guangzhou branch Pledgor: GUANGZHOU SALIAI STEM CELL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980059091 |