CN104152405A - 从胎盘中分离提取造血干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，特别是涉及一种以灌洗的方式从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。在一个实施方案中，本发明方法包括以下步骤：(1)胎盘的收集、(2)胎盘的初检、(3)胎盘的预消毒、(4)胎盘及母血检测、(5)胎盘造血干细胞的灌洗、(6)造血干细胞的浓缩纯化。本发明的方法呈现如说明书所述的有益效果，特别是本发明方法所得造血干细胞进行流式细胞仪检测，呈现出非常高的CD34阳性细胞的比率。
Description
技术领域
本发明涉及一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，特别是涉及一种以灌洗的方式从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。
背景技术
造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。
造血干细胞移植目前广泛应用于恶性血液病(如急性白血病、慢性粒细胞白血病等)、非恶性难治性血液病(如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等)遗传性疾病(先天性免疫缺陷病﹑地中海贫血等)和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。
一般来说，造血干细胞存在于三个部位，分别是骨髓、外周血和脐带血，根据其来源分别称之为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，与上述三种来源的造血干细胞相比，胎盘中所含造血干细胞的数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，且移植后反应较轻且不需要采用药物。此外，作为胎盘造血干细胞来源-胎盘，来源广泛，孕妇生产后往往成为废弃物，其采集不会引起母亲和新生儿任何不适的感觉或产生任何不良的影响。诸多优点使胎盘造血干细胞有望取代骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带血造血干细胞用于造血干细胞移植中。
目前在国际血液系统疾病的治疗中主要采取的造血干细胞移植的方法，根据细胞的来源，可分为三类：骨髓造血干细胞移植(BMT)、动员周围血干细胞移植(MPST)和脐带血干细胞移植(UCBT)。前两者干细胞来源丰富，一般有核细胞数可达5-10×108/Kg，CD34+细胞(一种造血干/祖细胞的表面标记)可达1-5×106/Kg，可是由于供者和受体之间需HLA严格相符，才能保证移植的成功，否则供者造血干细胞不易在病人体内植活，即使成活也会发生较严重的移植物抗宿主病(GVHD)。在一个家庭的子女中，仅有1/4HLA相符的机率，而在非血缘关系的无关供者中，这种机率只有百分之一，极大的限制了BMT或MPST在临床上的广泛应用。
近十余年来脐带血造血干细胞移植在临床上成功的应用促进了脐带血造血干细胞研究的发展。脐带血来自于胎盘，通常在妇女分娩后废弃，现在发现脐带血中含丰富的造血干细胞，其CD34+细胞的浓度和骨髓类似，约占总细胞数的0.1-0.5％，而更早期的造血干细胞CD34-还较骨髓浓度更高。作为一种造血细胞的来源，现在利用脐带血移植手术正在逐渐增加。与BMT相比，UCBT的优势在于减少了严重的移植物抗宿主反应，有效的扩大了对于那些缺少合适的人类白细胞抗原配型家庭或者无关供体移植的可能性。脐带血移植主要的限制在于脐血中的造血干细胞数量有限。这种限制促使临床中使用2倍剂量单位脐血移植较大的成年受助人，另一种方法是进行体外造血干细胞扩增培养，但体外扩增需要花费时间，费用也高，更重要的是扩增的同时，造血干细胞也发生分化，临床应用的结果表明脐血细胞扩增前后对移植无多大差异。
人类足月胎盘存在大量的造血干细胞，比脐带血有更多的造血干细胞，而且这些胎盘造血干细胞在冷冻储存前后都可以分离出来。胎盘造血干细胞菌落形成单位(CFU)的活性是确定的，在免疫缺陷鼠中的移植实验已经证明胎盘细胞在移植中的潜力。这些结果有力地表明，人类足月胎盘有可能成为一种新型的用于移植的造血干细胞的来源。并且胎盘中有大量的造血干细胞，胎盘血干细胞是较为早期的干细胞，能在体内分化成各种细胞，胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，其含量大约是脐带血的十几倍，一个胎盘中的造血干细胞可完全满足于两个成年人的需求，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，使这造血干细胞可完全应用于所有的适用人群。
发明专利申请号01131190.8公开了一种通过剪碎消化的方法获得造血干细胞的方法，方法复杂，获得的造血干细胞数量少、纯度低，且细胞容易染菌。
发明专利申请号201410039328.4公开了一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，所述方法包括胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化六个步骤，所述方法和使用的设备简单，操作方便，洗脱出来的造血干细胞损伤小，数量多，浓度高，活性强，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复。
然而本领域仍然期待有新的、更有效的方法获取造血干细胞，例如期待有新的、更有效的从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、更有效的方法获取造血干细胞，例如提供一种新的、更有效的从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。或者说，本发明所要解决的技术问题是提供了一种从健康产妇的足月胎盘中灌洗造血干细胞的方法。本发明人出人意料地发现，具有本发明特征的从胎盘中分离提取造血干细胞的方法呈现出极其有效的特征，例如比之于现有技术更为有效的特征。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
胎盘的收集、
胎盘的初检、
胎盘的预消毒、
胎盘及母血检测、
胎盘造血干细胞的灌洗、
造血干细胞的浓缩纯化。
根据本发明第一方面的方法，其中各步骤具体为：
(1)胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10℃，24小时内送达实验室；
(2)胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；
(3)胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；
(4)胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)；
(5)胎盘造血干细胞的灌洗：将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
(6)造血干细胞的浓缩纯化：将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1-1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1-1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1-1：2的比例加生理盐水混匀，1200-1500rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉上清液，加入10-20mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
根据本发明第一方面的方法，其中所述的淋巴细胞分离液选自：Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。这些淋巴细胞分离液都是可以容易地从市场上购得的，例如可购自上海博升生物科技有限公司。在本发明的下文具体实例中，如未另外说明，所使用的淋巴细胞分离液是Ficoll淋巴细胞分离液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。在一个实施方案中，配制灌洗液所用的DMEM培养基、10％的FBS使用前先放置于37℃的水浴锅中，提前预热到37℃。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。
本发明所述AMD3100亦可称为octahydrochloride hydrate，或者可称为1,1’-[1,4-亚苯基双(亚甲基)]双[1,4,8,11-四氮杂环十四烷]，其可容易地从商业途径购得，例如从sigma公司购得，货号A5602。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500 mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，回收灌洗液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，回收灌洗液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(6)中，所述的造血干细胞浓缩纯化步骤为：
将灌洗出来的灌洗液，离心，离心的条件是：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间20min，离心结束后，将回收瓶转移到无菌操作台中，移液枪吸走上层液体，留血细胞沉淀，往血细胞沉淀中加入10-20mL的生理盐水，轻轻吹打起沉淀，取50mL离心管，每管加入20mL的淋巴细胞分离液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，用移液枪吸取吹打起来的血细胞沿着离心管管壁缓缓加入到淋巴细胞分离液上，加的过程要缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入血细胞25mL；
移液完成后，离心，离心条件：转速2200rpm，加速时间600s，减速时间600s，离心时间20min；
离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，每管20mL转移到新的50mL离心管中，然后每管加入20mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；
离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20mL的生理盐水吹打沉淀，然后离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；
离心结束后，去掉上清液，用20mL的10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，收集造血干细胞群，将细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
下面对本发明的各个方面作进一步描述。
造血干细胞移植中胎盘造血干细胞的含量十分重要，采用本方法提取的胎盘造血干细胞经过淋巴细胞分离液分离后，使用细胞计数仪计数，有(8-15)×107单个核细胞数，虽然个体差异较大，但也能够满足所有移植的病人的需要。其中约有5％以上的为CD34阳性细胞，体外集落细胞培养(CFU-GM)，可见集落巨大的细胞群。
通过本发明所述的方法灌洗得到的胎盘造血干细胞可以应用于各种恶性血液病，如白血病；遗传性疾病，如先天性溶血性贫血；血液再生不良性疾病，如再生障碍性贫血；放射性疾病，如放射线意外等。治疗方法是采用化疗或放疗等各种手段摧毁病人自身患病的骨髓细胞及免疫系统，然后输入健康的造血干细胞，通过本发明方法从胎盘灌洗获得的造血干细胞可以很好的用于化疗或放疗术后的造血细胞的重建，移植物抗宿主反应小，极大的提高了成活率。
本发明制备的胎盘干细胞的应用途径，可以是静脉注射、动脉注射，也可以局部注射，一般以静脉输入给病人，不排除采用其他方式的应用途径。
本发明所用到的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、硝酸甘油注射液、胎牛血清(FBS)、肝素纳注射液和AMD3100等，均是无菌、无热源的，均可适用于临床移植的病人。
本发明的所有操作步骤，都是药典允许的常规操作方法，包括采用无菌操作、无菌生理盐水洗涤、灭菌、无菌细胞浓缩和纯化等，所应用的试剂或药学成分，如生理盐水、DMEM培养基、硝酸甘油注射液、胎牛血清、肝素纳注射液和AMD3100等均是符合我国卫生机构的要求，操作完毕后做常规病毒、细胞检查及细菌、霉菌培养，只有合乎要求的胎盘造血干细胞才能应用于临床。
本发明所要求保护的制备方法的优点：
(1)本发明方法和使用的设备简单，操作方便，效率高，大大缩短的从制备到应用的周期，且胎盘来源丰富，供者无痛苦；
(2)本发明方法从胎盘中灌洗出来的造血干细胞损伤小，数量多，纯度高，活性高，可以应用于自体或者异体的造血干细胞的移植，并且有助于受损组织的修复，大大提高了病人的成活率；
(3)本发明方法的灌洗系统是封闭的系统，和空气外界没有接触，避免染菌；
(4)本发明方法能保持胎盘的完整性，方便从胎盘中提取其他细胞；
(5)本发明方法使用的试剂少，有效节约资源和成本。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
本发明涉及的技术方案为提供了一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的从胎盘中灌洗造血干细胞的方法包括胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化的步骤。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(1)胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10℃，24小时内送达实验室。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(2)胎盘的初检：打开胎盘储运盒，检查盒内温度计标度，要求盒内温度保持在4-10℃之间；标签检查，胎盘储运盒上所贴标签应完整、清晰，且送达日期在胎盘储运盒失效日期前，否则视为不合格，不予接收；检查胎盘储运盒是否有渗漏，如有渗漏，不予接收；检查是否有母血血样，且标示完整，若无母亲血样，不予接收。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(3)胎盘的预消毒：将胎盘小心的用镊子整体取出，平缓放置于已经提前消毒处理的胎盘冲洗盒中，展开胎盘，将胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况，胎盘钙化是由于孕妇晚期胎盘发生局灶性梗死所致，梗死灶越多，出现钙化点就越多，B超下表现的较强光斑点就越多，B超检测时可根据胎盘钙化斑点分布大小将钙化程度分为三度，即I度、II度、III度，B超下诊断的钙化情况不一定与实际相符，而确诊须根据产后检查胎盘钙化面积来断定，根据胎盘表面钙化情况确定钙化程度I度、II度、III度，保存记录。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(4)胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(5)胎盘造血干细胞的灌洗：
将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗，清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将胎盘的目前面、胎儿面及脐带横截面拍照存档，然后将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，脐带中有两条脐动脉，只插入其中一条即可，止血钳加紧插入脐动脉的针头，由于静脉窦的存在，灌洗液不会从另一条脐动脉中流出，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧插入脐静脉的针头，将灌洗液放置在32℃恒温电热片上，将存放胎盘的盒子放置于32℃的恒温电热片中，待温度稳定后，缓慢开启恒流泵的开关(插管之前要开启一下恒流泵，将管道中的空气排出，使胶管中充满灌洗液)，将速度调节至中速(以每秒钟3滴灌洗液的速度)，确保冲洗通路流畅，冲洗开始的一段时间要时刻注意接收端灌洗液的流出速度，如果突然停止流出或者流出的速度明显下降，要关闭恒流泵，打开静脉止血钳，取出回收瓶针头，查看是否有凝血块堵塞针头，然后再插针头，夹紧止血钳，开启恒流泵；冲洗的过程中也要时刻注意回收瓶中液体的收集速度，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液。
在本发明方法的一个示例性实施方案中，本发明所述的步骤(6)造血干细胞的浓缩纯化：将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500rpm离心20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按1∶1的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按1∶1的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200转离心20分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，离心管从上到下溶液分为四层，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液，第四层为红细胞层。收集第二层白膜层到新的离心管中，加10-20mL生理盐水混匀，1500转离心15分钟；离心结束后去掉上清液，生理盐水吹打沉淀，再1500转离心15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
实施例1：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签、条码。胎盘储运过程中的盒内温度保持在4-10℃，在24小时内运送到实验室。
到实验室后将条码和标签都输入电脑中，将胎盘小心的用镊子整体取出，平缓放置于已经提前消毒处理的胎盘冲洗盒中，展开胎盘，将胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水。检查胎盘表面钙化情况。对所取的母血和胎盘样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测，造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)。
将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗，清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒液消毒后，将胎盘的目前面、胎儿面及脐带横截面拍照存档。然后将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，脐带中有两条脐动脉，只插入其中一条即可，止血钳加紧，由于静脉窦的存在，灌洗液不会从其中一条动脉中流出，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，开启灌流系统，以进行灌洗；
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(A5602，5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
将250mL回收瓶中回收到的灌洗液，配平，离心，离心的条件是：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间20min；离心结束后，将回收瓶转移到无菌操作台中，移液枪吸走上层液体倒入废液缸中，留血细胞沉淀，根据血细胞沉淀加入20mL的生理盐水，轻轻吹打起沉淀。取50mL离心管，每管加入20mL的淋巴细胞分离液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，用移液枪吸取吹打起来的血细胞，沿着离心管管壁缓缓加入到淋巴细胞分离液上，加的过程一定要注意缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入血细胞25mL；移液完成后，离心，离心条件：转速2200rpm，加速时间600s，减速时间600s，离心时间20min；离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，每管20mL转移到新的50mL离心管中，然后每管加入20mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20mL的生理盐水，吹打沉淀，然后离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；离心结束后，去掉上清，将20mL的10％FBS的DMEM培养基加入到去掉上清液的离心管中，缓慢震荡离心管，将沉淀都吹打起来，形成溶液。然后从其中取20μl到1.5mL离心管中，取两管，用于细胞计数和活性检测(台盼蓝染色)；然后再从其中分别取200μl到1.5mL的离心管中，三管，第一管加入1μl的生理盐水，第二管加入CD34的同型对照PE，第三管加入CD34抗体，将三管混匀后放置在黑暗处孵育15分钟，然后流式细胞仪检测。
对得到的造血干细胞进行细胞计数、细胞活性检测、流式细胞仪检测和集落培养实验。将一管20μl的细胞液到细胞计数仪上，计数细胞个数1.0×108个单个核细胞；将另一管20μl的细胞液，加入20μl浓度0.08％的台盼蓝染液，混匀，然后取4μl到载玻片上，在显微镜下观察，并没有观察到细胞被染色，说明细胞活性较好，而且细胞的形态很好(完全达到CN 103756965 A附图3的程度)；细胞定量检测(CD34)将三管200μl孵育后的细胞液到流式细胞仪上检测，通过检测，CD34阳性细胞的比率达到1.65％，此次检测CD34阳性细胞是加了阴性对照的，数据比较保守，正常实验中所得到的CD34阳性细胞的比率最高能达到3.6％，这充分说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率是很高的，数量可观，临床的应用价值很高；对得到的造血干细胞进行甲基纤维素半固体培养基培养(CFU-GM)，取细胞培养板一个孔，在孔中加入甲基纤维素半固体培养基3mL，然后取1μl的细胞液，加到甲基纤维素半固体培养基中，并另取一个孔加2mL蒸馏水，加好后，盖好培养板盖子，放置到二氧化碳细胞培养箱中，培养箱的条件7℃、5％CO2、湿度90％培养14天，观察到完整的细胞集落，这说明得到的造血干细胞的具有增殖能力(完全达到CN 103756965 A附图2的程度)。
实施例2：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签、条码。胎盘储运过程中的盒内温度保持在4-10℃，在24小时内运送到实验室。
参考实施例1的方法进行胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测，将胎盘造血干细胞的灌洗方法改为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
参考实施例1的方法对造血干细胞进行浓缩纯化，处理样品后，对得到的造血干细胞进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率达到3.2％，说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率很高，数量可观。
实施例3：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签、条码。胎盘储运过程中的盒内温度保持在4-10℃，在24小时内运送到实验室。
参考实施例1的方法进行胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测，将胎盘造血干细胞的灌洗方法改为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(A5602，5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
参考实施例1的方法对造血干细胞进行浓缩纯化，处理样品后，对得到的造血干细胞进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率达到5.8％(比实施例1的3.6％高出61％)，说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率远比实施例1的高，并且数量可观。
补充试验：参照本实施例3，不同的仅是将其中的赖氨酸改为等量的精氨酸、甘氨酸、谷氨酸，得到三批造血干细胞，对它们进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率均在2.6～3.1％范围内。
实施例4：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
参照实施例3的方法，不同的仅是在进行两个灌洗步骤时，两种灌洗液中均额外添加赖氨酸50mg、75mg、100mg，得到四批造血干细胞。
参考实施例1的方法对这四批造血干细胞进行浓缩纯化，处理样品后，对得到的造血干细胞进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率分别达到5.6％、6.3％、5.9％、6.0％(比实施例1的3.6％高出55％以上)，说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率远比实施例1的高，并且数量可观。
实施例5：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
胎盘来自于当地的医院妇产科。首先，征得孕妇或者其家属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检查报告，证实无任何的病毒、梅毒和血液有关的病毒感染，然后询问孕妇的家族病史、传染和感染病史。在确定一切正常后，采集母血5mL，将胎盘和母血一起盛装入胎盘储运盒，贴好标签、条码。胎盘储运过程中的盒内温度保持在4-10℃，在24小时内运送到实验室。
参考实施例1的方法进行胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测，将胎盘造血干细胞的灌洗方法改为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，在接收端，接收灌洗液。
参考实施例1的方法对造血干细胞进行浓缩纯化，处理样品后，对得到的造血干细胞进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率达到6.1％(比实施例2的3.2％高出90％)，说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率很高，数量可观。
补充试验：参照本实施例5，不同的仅是将其中的赖氨酸改为等量的精氨酸、甘氨酸、谷氨酸，得到三批造血干细胞，对它们进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率均在2.4～3.3％范围内。
实施例6：从胎盘中分离提取造血干细胞的方法
参照实施例5的方法，不同的仅是在进行三个灌洗步骤时，在第一种灌洗液和第三种灌洗液中均额外添加赖氨酸50mg、75mg、100mg，得到四批造血干细胞。
参考实施例1的方法对这四批造血干细胞进行浓缩纯化，处理样品后，对得到的造血干细胞进行流式细胞仪检测，CD34阳性细胞的比率分别达到6.0％、5.4％、5.8％、6.1％(比实施例2的3.2％高出68％以上)，说明胎盘灌洗得到的造血干细胞的比率远比实施例2的高，并且数量可观。
产业适用性
本发明提供了一种从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，特别是涉及一种以灌洗的方式从胎盘中分离提取造血干细胞的方法。本发明的方法呈现如说明书所述的有益效果。
Claims (10)
1.从胎盘中分离提取造血干细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(1)胎盘的收集、
(2)胎盘的初检、
(3)胎盘的预消毒、
(4)胎盘及母血检测、
(5)胎盘造血干细胞的灌洗、
(6)造血干细胞的浓缩纯化。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)至步骤(4)具体为：
(1)胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10℃，24小时内送达实验室；
(2)胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；
(3)胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；
(4)胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型(HLA)检测、造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)。
3.根据权利要求1-2的方法，其中步骤(5)胎盘造血干细胞的灌洗：
将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌洗液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液。
4.根据权利要求1-3的方法，其中步骤(6)造血干细胞的浓缩纯化：
将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1-1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1-1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1-1：2的比例加生理盐水混匀，1200-1500rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉 上清液，加入10-20mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
5.根据权利要求1-4的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。
6.根据权利要求1-5的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液。
7.根据权利要求1-6的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，回收灌洗液。
8.根据权利要求1-6的方法，其中步骤(5)中，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：
开始灌洗时使用的灌洗液是每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL、硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支、肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，混匀制得的灌洗液，以 每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000mL灌洗液；
关闭恒流泵，将灌洗液换成50mL含AMD3100的浓度为100mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟；
关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500mL DMEM培养基中加入赖氨酸25～100mg、10％FBS50mL，硝酸甘油注射液(1mL：5mg)2支，肝素钠注射液(2mL：12500单位)2支，AMD3100(5mg/瓶)0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500mL灌洗液，回收灌洗液。
9.根据权利要求1-8的方法，其中步骤(6)中，所述的造血干细胞浓缩纯化步骤为：
将灌洗出来的灌洗液，离心，离心的条件是：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间20min，离心结束后，将回收瓶转移到无菌操作台中，移液枪吸走上层液体，留血细胞沉淀，往血细胞沉淀中加入10-20mL的生理盐水，轻轻吹打起沉淀，取50mL离心管，每管加入20mL的淋巴细胞分离液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，用移液枪吸取吹打起来的血细胞沿着离心管管壁缓缓加入到淋巴细胞分离液上，加的过程要缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入血细胞25mL；
移液完成后，离心，离心条件：转速2200rpm，加速时间600s，减速时间600s，离心时间20min；
离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，每管20mL转移到新的50mL离心管中，然后每管加入20mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；
离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20mL的生理盐水吹打沉淀，然后离心，离心的条件：转速1500rpm，加速时间45s，减速时间45s，离心时间15min；
离心结束后，去掉上清液，用20mL的10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，收集造血干细胞群，将细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测(CD34)，造血干细胞活性检测(台盼蓝染色)，造血干细胞定性检测(CFU-GM)。
10.根据权利要求1-9的方法，配制灌洗液所用的DMEM培养基、10％的FBS使用前先放置于37℃的水浴锅中，提前预热到37℃。
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