CN103330720B

CN103330720B - 一种混合干细胞注射剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103330720B
Application number: CN201310302780.0A
Authority: CN
Inventors: 魏伟; 嵐山芮; 许超
Original assignee: GUANGZHOU TIANHE NUOYA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU TIANHE NUOYA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2013-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2033-07-18
Also published as: CN103330720A

Abstract

本发明公开了一种混合干细胞注射剂及其制备方法，属于细胞制剂领域。本发明的注射剂是由脐带来源的间充质干细胞和脐血来源的造血干/祖细胞的混合物，其制备方法是从新鲜脐血中分离纯化CD34+的造血干细胞，并与脐带来源的间充质干细胞混合培养扩增，扩增过程培养体系为含体积分数为15%AB脐血浆的培养基及细胞因子，接种6×10⁴个间充质干细胞和5×10⁴个/ml浓度CD34+造血干细胞到培养瓶中，培养10天左右，同时收获两种细胞，制备成含5×10⁵个/ml的造血干/祖细胞和2×10⁵个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水的混合干细胞注射剂。

Description

一种混合干细胞注射剂及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞制剂领域，特别涉及一种混合干细胞注射剂及其制备方法。

背景技术

造血干细胞是血液成分之一，是生成各种血细胞的最起始细胞，又称造血多能干细胞，存在于骨髓、胚胎肝、外周血及脐带血中。它既具有高度自我更新能力，又具有进一步分化血液系统祖细胞的能力。目前在临床上，造血干细胞得到了广泛的应用。造血干细胞移植可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症、淋巴瘤等）、血红蛋白病、骨髓造血功能衰竭（如再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患等多种疾病。

目前临床上应用的造血干细胞主要来源于骨髓、外周血和脐带血。而脐血来源的造血干细胞以其采集方便、干细胞丰富、移植物抗宿主病发生率低而成为造血重建的重要的干细胞来源。与骨髓和外周血相比，脐血源的造血干细胞更为原始，自我增殖能力更强，并且研究表明脐血集落形成细胞数远高于外周血来源的造血干细胞，再植能力是骨髓来源造血干细胞的5倍。因而脐血造血干细胞具有极大的临床应用价值。

但是，脐血中有核细胞和CD34+细胞绝对数较低，由于细胞数量不足，所以对较大体重患者进行脐血移植时容易出现移植延迟。因此，增加每份造血干细胞的数量是解决问题的关键。脐血造血干细胞的体外扩增可以很好的解决细胞数量少的问题。而且扩增后的细胞也已经应用于临床实验中，临床实验表明，扩增后的细胞对病人是安全的，且与现在的移植方案相似，只要给与足够的剂量，它们可以提供快速短期植入所需要足够数量的祖细胞，降低实现短期植入所需要的时间。脐血造血干细胞的扩增技术有很多种，现在应用最多，最简便的技术是细胞因子组合联合间充质干细胞作为滋养层扩增造血干细胞。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。其广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。间充质干细胞免疫原性极低，免疫排斥概率极低，而且具有一定的免疫抑制功能。另外间充质干细胞可以支持造血和促进移植，治疗移植物抗宿主病等。基于以上特性，间充质干细胞和造血干细胞联合应用，可以促进造血干细胞的植入，对于提高造血干细胞的移植成功率有重要意义。有文献报道，脐血CD34+造血干细胞体外短期培养扩增过程中加入间充质干细胞能够维持造血干/祖细胞的表型，抑制其分化，还可以使总单个核细胞和CD34+细胞体外培养的扩增倍数大幅增加。

目前脐血干细胞注射剂中脐血造血干细胞数量不足制约了其临床应用范围。而且造血干细胞的植入会有移植物抗宿主病的发生，是目前脐血干细胞注射剂急需解决的问题。

发明内容

为克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供一种混合干细胞注射剂的制备方法。该方法采用可靠的供体，经分离、培养得到干细胞产品。制备过程简单、可靠、重复性好。同时间充质干细胞和脐血造血干细胞共培养，提高造血干细胞增殖能力，增加造血干/祖细胞数量的同时，还可以获得两种干细胞，制备成注射剂。临床应用更安全，方便，疗效更好。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的混合干细胞注射剂。该注射剂含有造血干/祖细胞和与其共培养的间充质干细胞。该注射剂将间充质干细胞和造血干/祖细胞混合进行输注，从而扩大临床的应用范围，降低移植物抗宿主病的发生，提高移植成功率，增加临床的治疗效果。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种混合干细胞注射剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）脐带间充质干细胞的分离和原代培养：将脐带去掉外层羊膜和剔除血管，去除残余血液，留取沃顿胶质，将沃顿胶质剪成1mm²的组织块，平铺在T25培养瓶底，加入MSC无血清培养基，置于37℃，饱和湿度，浓度5%的CO₂条件下培养6～8天，细胞进行换液继续培养；

（2）间充质干细胞的培养和传代：步骤（1）换液培养3-4天后细胞进行传代，用质量分数为0.25%胰酶消化1分钟，MSC无血清培养基终止消化，500g离心去上清，留取细胞沉淀，用MSC无血清培养基重悬，接种在T75培养瓶中培养，按1：3的比例传代，三天传代一次，取第3代间充质干细胞与造血干细胞共培养；

（3）脐血造血干细胞的分离和培养：新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，收集细胞沉淀，用含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液再洗一次，离心力200g，离心时间10分钟；离心完后，收集细胞沉淀，用30ml含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，MiniMACS免疫磁珠分选法从单个核细胞中纯化出高表达CD34+的造血干细胞；分选出的CD34+造血干细胞与间充质干细胞按照15：1的数量比，同时接种在T75培养瓶中，根据得到的CD34+造血干细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保CD34+造血干细胞接种密度为5×10⁴个/ml，间充质干细胞接种数量6×10⁴个；每个T75培养瓶加入特定培养基的体积不得超过30ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度5%的培养箱培养，第6天，分别收集悬浮生长的造血干/祖细胞和贴壁生长的间充质干细胞，造血干/祖细胞与间充质干细胞按照50：1的数量比同时接种在T175培养瓶中，根据扩增后的造血干/祖细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保造血干/祖细胞密度为1×10⁶个/ml，间充质干细胞接种数量2×10⁶个，每个T175培养瓶加入特定培养基的体积不得超过50ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度为5%的培养箱培养，培养4天后收获细胞；

（4）将步骤（3）制备的造血干/祖细胞和间充质干细胞加入含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水定容至两种干细胞的浓度分别为5×10⁵个/ml和2×10⁵个/ml，制成混合干细胞注射剂。

步骤（1）中所述的脐带为无菌采取健康人的脐带；

步骤（1）和（2）中所述的MSC无血清培养基优选为Lonza公司的

TheraPEAK^TMMSCGM-CD^TMMedium；

步骤（3）中所述的新鲜脐血为从脐血采集到制备不应超过4小时；

步骤（3）中所述的新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞的条件为新鲜脐血与生理盐水体积比1：2稀释后，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心时间25min，离心力500g，离心加速度为7，减速度为2。温度20℃，离心结束后，取白膜层（白膜层在血浆层和分离液层之间）。加入3倍体积的生理盐水，洗涤一次，离心力600g，离心10min，收集细胞沉淀；

步骤（3）中所述的含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液优选为美天旎公司的CliniMACS PBS/EDTA Buffer。

步骤（3）中所述的MiniMACS免疫磁珠分选法采用阳性分选法分离造血干细胞，经两次过LS分选柱，分选出的CD34+造血干细胞的纯度可达到90%以上（见图5），而且所用免疫磁珠直径只有50nm，在细胞体外培养过程中，免疫磁珠很容易降解，输注人体，不会有任何影响。

步骤（3）中所述的特定培养基包含IMDM培养基、体积分数为15%人AB脐血浆、体积分数为0.04%低分子肝素钙、20ng/ml IL-6、20ng/ml IL-3、50ng/mlSCF、50ng/ml Flt-3L和20ng/ml TPO细胞因子，本发明使用的同时培养两种干细胞的培养基为自己配置的有特定效果的培养基，该培养基中加入低分子肝素钙注射液，有效的抑制了干细胞培养过程中的凝集现象，从而促进了两种干细胞的增殖。所述的细胞因子的全称分别为促血小板生成素（Thrombopoietin，TPO）、人干细胞生长因子（Stem cell factor，SCF）、人白细胞介素-3（Interleukin-3，IL-3）、人白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和人FMS样酪氨酸激酶3配体（Human FMS-like tyrosine kinase3ligand，Flt-3L）五种细胞因子。

两种干细胞在培养过程中，造血干细胞与间充质干细胞以合适的密度同时接种在培养瓶中培养，达到造血干细胞与间充质干细胞同时促进增殖与维持干细胞特性的效果，与其他专利经过丝裂霉素C处理或者射线照射后的间充质干细胞相比，本专利的间充质干细胞促进造血干细胞增殖的效果更好，得到的间充质干细胞安全性更高。

一种混合干细胞注射剂由上述制备方法获得，为含5×10⁵个/ml的造血干/祖细胞和2×10⁵个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水注射剂。

所述的混合干细胞注射剂广泛应用于治疗白血病、难治性自身免疫性疾病、和抗衰老等方面。

本发明的制备方法通过扩增造血干细胞来增加其数量，同时与间充质干细胞共培养来促进造血干细胞增殖和抑制其分化。培养10天后同时收获这两种细胞，制备成临床应用的注射剂。本发明使用的同时培养两种干细胞的培养基为自己配置的有特定效果的培养基，该培养基中加入低分子肝素钙注射液，有效的抑制了干细胞培养过程中的凝集现象，从而促进了两种干细胞的增殖。

本发明相对于现有技术具有以下的优点和效果：

1.本发明通过扩增造血干细胞来增加其数量，同时与间充质干细胞共培养来促进造血干细胞增殖和抑制其分化，最终将两种细胞配比制备成混合干细胞注射剂。

2.本发明使用的同时培养两种干细胞的培养基为自己配置的有特定效果的培养基，该培养基中加入低分子肝素钙注射液，有效的抑制了干细胞培养过程中的凝集现象，从而促进了两种干细胞的增殖。

附图说明

图1为倒置显微镜观察第3代间充质干细胞的形态图。

图2为倒置显微镜观察第10天造血干/祖细胞的形态图。

图3为流式细胞仪检测第3代间充质干细胞的表面抗原的表达情况图。

图4为流式细胞仪检测第4代间充质干细胞的表面抗原的表达情况图。

图5为流式细胞仪检测第0天造血干细胞CD34表面抗原的表达情况图。

图6为流式细胞仪检测第10天造血干细胞CD34表面抗原的表达情况。

图7为集落培养检测第10天的造血干细胞集落形成情况图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

脐血和脐带标本取自健康产妇孕婴。经检测乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、TORCH检测、支原体、衣原体、G-6PD和地贫均阴性。标本采集后运回血库过程保持4-8℃运输条件。按照以下方法制备混合干细胞注射剂。

1.脐带间充质干细胞的制备

从健康人的脐带组织中提取间充质干细胞，获取的间充质干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1：3的比例进行传代培养，当细胞铺满瓶底约80%密度时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比例进行传代，最多传代培养至第3代，收集第3代的细胞，此时收集的细胞生物学性状稳定，细胞活性好，增殖能力强。具体过程如下：

1）无菌采取健康人的脐带

2）去掉脐带里的血管和外层羊膜，去除残余血液，留取沃顿胶质。

3）将脐带组织剪切成1-2cm²的小块。

4）将剪切后的小块接种T25的培养瓶中，加入MSC无血清培养基（Lonza公司），置于37度，饱和湿度，体积分数5%二氧化碳培养箱中培养；

5）经过7天后，细胞换液，3-4天后细胞可以传代。

6）利用0.25%的胰酶进行消化0.5-1分钟，收集细胞，接种在T75的培养瓶中传代培养。

7）当细胞铺满瓶底约80%密度时，利用质量分数为0.25%的胰酶进行消化，收集第1代细胞，按照1：3的比例进行传代，置于37度，饱和湿度，5%二氧化碳浓度的培养箱中培养；

8）若需传代重复第7步骤即可。

9）收集第3代的间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态，利用流式细胞仪进行细胞表面抗原的测定，分析其细胞纯度。

2.脐血造血干细胞的制备

从4小时内的新鲜健康人脐血中获取单个核细胞，然后经过免疫磁珠分选获取CD34+的造血干细胞，将分选后的造血干细胞连同间充质干细胞同时接种在T75的培养瓶中，加入特定的培养基（基础培养基IMDM，另含体积分数为15%的脐血浆，体积分数为0.04%的低分子肝素钙，20ng/ml IL-6，20ng/ml IL-3，50ng/ml SCF，50ng/ml Flt-3L和20ng/ml TPO）培养扩增。培养至第10天，收集两种干细胞。此时收集的细胞中造血干/祖细胞的含量最为丰富。具体过程如下：

1）采集健康人4小时内的新鲜脐血。

2）生理盐水与新鲜脐血体积比为2:1的比例稀释，混合均匀后，加到Ficoll淋巴细胞分离液上，进行单个核细胞的分离，离心时间25分钟，离心力500g，离心加速度为7，减速度为2，温度20℃。

3）离心结束后，取白膜层（白膜层在血浆层和分离液层之间）。加入3倍体积的生理盐水，洗涤一次，离心力600g，离心10分钟。

4）收集细胞沉淀，用CliniMACS PBS/EDTA Buffer（美天旎公司）的缓冲液再洗一次，离心力200g,离心时间10分钟。

5）离心完后，收集细胞沉淀，用30ml CliniMACS PBS/EDTA Buffer（美天旎公司）的缓冲液重悬，MiniMACS免疫磁珠方法获取纯度高的CD34+造血干细胞。

6）将造血干细胞与间充质干细胞同时接种在T75培养瓶中，加入适量培养基。（间充质干细胞调整细胞浓度为6×10⁴个/T75，造血干细胞调整细胞浓度为5×10⁴/ml）。

7）第6天将间充质干细胞进行传代，取传代后2×10⁶个细胞接种到T175培养瓶中，同时将扩增后的造血干/祖细胞悬液接种在上述培养瓶中，补加5-10ml新鲜培养基，继续培养4天即可收集细胞。

8）收集细胞方法：将悬浮生长的造血干/祖细胞倒入离心管，贴壁生长的间充质干细胞经质量分数为0.25%的胰酶消化，倒入另一个离心管，向两组离心管中分别加入生理盐水离心洗涤两次，然后生理盐水重悬后备用。

3．间充质干细胞和造血干细胞的鉴定

1）间充质干细胞的鉴定通过以下方法

a）间充质干细胞的形态学分析及细胞计数：将培养至第2代的细胞，在倒置显微镜观察细胞状态，并拍照。

b）流式细胞仪的表型测定：取第2代和第4代细胞，经质量分数为0.25%胰蛋白酶消化收集后，生理盐水离心洗涤2次。同型对照管加入鼠IgG–FITC、IgG–PE，检测管分别加入鼠抗人CD₁₀₅-PE、CD₉₀–FITC、CD₇₃-PE、CD₄₅–FITC、CD₃₄–PE各5μl。室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。

2）造血干细胞的鉴定通过以下方法

a）造血干细胞的形态学分析及细胞计数：将培养至第10天的细胞，在倒置显微镜观察，并拍照。取微量细胞悬液，计数细胞数量。

b）流式细胞仪的表型测定:取第10天细胞，经离心收集后，生理盐水离心洗涤2次。同型对照管加入鼠IgG–FITC、IgG–PE，检测管分别加入鼠抗人CD₄₅–FITC、CD₃₄–PE各5μl。室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。

c）造血干细胞的集落培养：采用Stem cell公司的甲基纤维素半固体培养基H4434和H4534，检测脐血CD34+细胞扩增后的CFU-GM。检测于6孔板中进行，脐血CD34+扩增细胞的CFU-GM检测为5×10³细胞/孔，培养10天后，显微镜下观察，并计算集落数。

1.干细胞鉴定结果及细胞活性分析

1）倒置显微镜下观察第2代间充质干细胞细胞形态较单一，长梭形细胞多见，少量的星形细胞，圆形细胞极少。细胞低密度时长成扁平单层细胞，细胞生长密度增加时，细胞形态变得细长，形态类似成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长（见图1）。经流式细胞仪检测显示，细胞表面抗原CD₁₀₅、CD₉₀、CD₇₃阳性表达率达到95%以上，CD₄₅、CD₃₄阳性表达率2%以下（见图3）。综上所述，按照本发明专利方法制备出的间充质干细胞纯度高，活性好，符合要求。

2）倒置显微镜下观察第4代间充质干细胞细胞形态类似成纤维细胞，与第2代细胞形态相似。间充质干细胞上可见少量脐血细胞粘附生长。经流式细胞仪检测间充质干细胞和少量脐血细胞混合液，流式结果显示细胞表面抗原CD₁₀₅、CD₉₀、CD₇₃阳性表达率分别为83.12%、84.66%和83.12%，CD₄₅、CD₃₄阳性表达率分别为7.28%和0.06%（见图4）。综上所述，与脐血细胞共培养后的间充质干细胞流式结果符合临床应用要求。

3）倒置显微镜下观察第10天的造血干/祖细胞，细胞数量多，呈分散状态，细胞体积大而圆，包体透亮，细胞胞质丰富（见图2）。细胞计数，体外培养10天，造血干/祖细胞数量达到1×10⁷～5×10⁷个，细胞增殖能力强。流式细胞仪检测显示，细胞表面抗原CD34阳性表达率29%左右（见图6），且经CFU-GM集落培养计数，细胞集落数达到254个/5×10³细胞（见图7）。综上所述，按照本发明专利方法扩增出的造血干/祖细胞活性好，质量高，符合要求。

实施例2

参照实施例1的方法，得到约1×10⁷～5×10⁷个造血干/祖细胞和2×10⁷个间充质干细胞。制备的造血干/祖细胞和间充质干细胞加入含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水定容至两种干细胞的浓度分别为5×10⁵/ml和2×10⁵/ml，制备成混合干细胞注射剂。

实施例3

实施例2制备得到的混合干细胞注射剂可以与按常规方法分离得到的脐血单个核细胞混合应用。脐血单个核细胞的数量不得少于5×10⁸个。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离和原代培养：将脐带去掉外层羊膜和剔除血管，去除残余血液，留取沃顿胶质，将沃顿胶质剪成1mm²的组织块，平铺在T25培养瓶底，加入MSC无血清培养基，置于37℃，饱和湿度，浓度5％的CO₂条件下培养6～8天，细胞进行换液继续培养；

(2)间充质干细胞的培养和传代：步骤(1)换液培养3-4天后细胞进行传代，用质量分数为0.25％胰酶消化1分钟，MSC无血清培养基终止消化，500g离心去上清，留取细胞沉淀，用MSC无血清培养基重悬，接种在T75培养瓶中培养，按1：3的比例传代，三天传代一次，取第3代间充质干细胞与造血干细胞共培养；

(3)脐血造血干细胞的分离和培养：新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，收集细胞沉淀，用含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液再洗一次，离心力200g，离心时间10分钟；离心完后，收集细胞沉淀，用30ml含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬，MiniMACS免疫磁珠分选法从单个核细胞中纯化出高表达CD34+的造血干细胞；分选出的CD34+造血干细胞与间充质干细胞按照15：1的数量比，同时接种在T75培养瓶中，根据得到的CD34+造血干细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保CD34+造血干细胞接种密度为5×10⁴个/ml，间充质干细胞接种数量6×10⁴个；每个T75培养瓶加入特定培养基的体积不得超过30ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度5％的培养箱培养，第6天，分别收集悬浮生长的造血干/祖细胞和贴壁生长的间充质干细胞，造血干/祖细胞与间充质干细胞按照50：1的数量比同时接种在T175培养瓶中，根据扩增后的造血干/祖细胞的数量来确定加入特定培养基的体积，确保造血干/祖细胞密度为1×10⁶个/ml，间充质干细胞接种数量2×10⁶个，每个T175培养瓶加入特定培养基的体积不得超过50ml；然后加入特定培养基，放置在37℃，二氧化碳浓度为5％的培养箱培养，培养4天后收获细胞；

(4)将步骤(3)制备的造血干/祖细胞和间充质干细胞加入含有体积分数为5％AB脐血浆的生理盐水定容至两种干细胞的浓度分别为5×10⁵/ml和2×10⁵/ml，制成混合干细胞注射剂；

步骤(3)中所述的特定培养基包含IMDM培养基、体积分数为15％人AB脐血浆、体积分数为0.04％低分子肝素钙、20ng/ml IL-6、20ng/ml IL-3、50ng/mlSCF、50ng/ml Flt-3L和20ng/ml TPO细胞因子。

2.根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中所述的MSC无血清培养基为Lonza公司的TheraPEAK^TMMSCGM-CD^TM Medium。

3.根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的新鲜脐血为从脐血采集到制备不应超过4小时。

4.根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞的条件为新鲜脐血与生理盐水体积比1：2稀释后，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心时间25min，离心力500g，离心加速度为7，减速度为2；温度20℃，离心结束后，取白膜层；加入3倍体积的生理盐水，洗涤一次，离心力600g，离心10min，收集细胞沉淀。

5.根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液为美天旎公司的CliniMACS PBS/EDTA Buffer。

6.根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的MiniMACS免疫磁珠分选法：经两次过LS分选柱，分选出的CD34+造血干细胞的纯度达到90％以上。

7.权利要求1～6任一项所述的制备方法获得的混合干细胞注射剂，其特征在于为含5×10⁵个/ml的造血干/祖细胞和2×10⁵个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5％AB脐血浆的生理盐水注射剂。