CN112852726A - 一种间充质干细胞的分离及扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞的分离及扩增方法，包括确定实验人员、确定实验器材和试剂、确定实验方法、进行间充质干细胞分离、进行间充质干细胞体外扩增。本发明的有益效果是：很好的缓解了人脐带间充质干细胞因过度传代导致细胞明显衰老或凋亡，且该种分离和扩增方法可以避免长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降的问题，而且有效的缓解了临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性,很难保证即离即用的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种间充质干细胞的分离及扩增方法，具体为一种间充质干细胞的分离及扩增方法，属于细胞研究技术领域。
背景技术
间充质干细胞mesenchymal stem cells, MSC是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymalstemcells，hUC-MSCs）已成为细胞治疗的重要候选种子细胞,特别在各种退行性疾病和自身免疫性疾病的组织修复和免疫调节方面有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种间充质干细胞的分离及扩增方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种间充质干细胞的分离及扩增方法，包括以下步骤：
包括以下步骤：
步骤一、确定实验人员。
步骤二、确定实验器材和试剂。
步骤三、确定实验方法。
步骤四、进行间充质干细胞分离。
步骤五、进行间充质干细胞体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，即可进行传代操作。
2．作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，实验器材包括以下：
流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，采用贴壁法进行间充质干细胞的分离。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，间充质干细胞的分离包括以下过程：
（1）、在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净。
（2）、将洗净的脐带剪成小于 1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中。
（3）、6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，进行间充质干细胞体外扩增包括以下过程：
（1）、轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来。
（2）、将含有组织块的培养上清液弃掉，用 PBS 冲洗培养瓶底部，PBS 清洗2次，加入1 mL 预热的0.05%胰酶。
（3）、用显微镜进行观察，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代。
本发明的有益效果是：该间充质干细胞的分离及扩增方法设计合理，很好的缓解了人脐带间充质干细胞因过度传代导致细胞明显衰老或凋亡，且该种分离和扩增方法可以避免长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降的问题，而且有效的缓解了临床上细胞移植的供体和受体往往存在不同时性,很难保证即离即用的问题。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种间充质干细胞的分离及扩增方法，包括以下步骤：
步骤一、确定实验人员。
步骤二、确定实验器材和试剂。
步骤三、确定实验方法。
步骤四、进行间充质干细胞分离。
步骤五、进行间充质干细胞体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，即可进行传代操作。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，实验器材包括以下：
流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，采用贴壁法进行间充质干细胞的分离。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，间充质干细胞的分离包括以下过程：
（1）、在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净。
（2）、将洗净的脐带剪成小于 1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中。
（3）、6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，进行间充质干细胞体外扩增包括以下过程：
（1）、轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来。
（2）、将含有组织块的培养上清液弃掉，用 PBS 冲洗培养瓶底部，PBS 清洗2次，加入1 mL 预热的0.05%胰酶。
（3）、用显微镜进行观察，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种间充质干细胞的分离及扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、确定实验人员；
步骤二、确定实验器材和试剂；
步骤三、确定实验方法；
步骤四、进行间充质干细胞分离；
步骤五、进行间充质干细胞体外扩增，细胞镜下观察生长且密度达70-80%时，即可进行传代操作。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离及扩增方法，其特征在于：所述步骤二中，实验器材包括以下：
流式细胞仪、CO2培养箱、台式离心机、生物安全柜、显微镜、程序降温仪、酶标仪间充质干细胞无血清条件培养基。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离及扩增方法，其特征在于：所述步骤三中，采用贴壁法进行间充质干细胞的分离。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离及扩增方法，其特征在于：所述步骤四中，间充质干细胞的分离包括以下过程：
（1）、在超净台内将脐带用无菌生理盐水冲洗干净；
（2）、将洗净的脐带剪成小于 1mm3的组织块碎后放入离心管中，将组织块平铺于10个T75培养瓶底部，加入含无血清培养基，置于37℃、含5%二氧化碳饱和湿度的恒温培养箱中；
（3）、6天后培养液全量换液一次，镜下观察是否有细胞从组织块周围爬出，以后每3天换液一次，直至可见细胞爬出且密度达70-80%,可以考虑进行传代操作。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的分离及扩增方法，其特征在于：所述步骤五中，进行间充质干细胞体外扩增包括以下过程：
（1）、轻轻拍打培养瓶侧壁，使组织块完全脱落下来；
（2）、将含有组织块的培养上清液弃掉，用 PBS 冲洗培养瓶底部，PBS 清洗2次，加入1mL 预热的0.05%胰酶；
（3）、用显微镜进行观察，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，4℃离心5min，收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代。
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