CN106754713A - 一种脐带血来源的干细胞的制备方法 - Google Patents

一种脐带血来源的干细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种脐带血来源的干细胞的制备方法，包括以下步骤：沉淀细胞；选择新鲜的脐带血，经过低速离心沉淀血红细胞；分离细胞；高速离心，并加入分离液来获得干细胞；提取细胞；用吸管提取干细胞；洗涤细胞；提取后的干细胞用PBS溶液反复洗涤离心；孵育细胞；洗涤后的干细胞，加入培养液，放培养箱中孵育一定的时间；收获细胞；离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数；分装细胞；将制备得到的脐带血来源的干细胞进行分装，制成最终产品。本发明所述方法制备得到的干细胞液体制剂的纯度高，杂质少，对人体无副作用，安全可靠。

Description

一种脐带血来源的干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脐带血来源的干细胞的制备方法。
背景技术
随着社会的进步，工作生活压力的增大，越来越多的中青年人群都处于亚健康状态，特别是一些爱美的白领丽人，对自己的容颜渐渐老去也是忧心忡忡，这也就催生了一些保健品和抗衰产品的问世。
目前市场上的相关产品鱼龙混杂，良莠不齐，许多打着保健抗衰旗号的干细胞产品，大多是在挂羊头卖狗肉，效果不尽如人意，因为这些产品只是从表面上来做文章，并未从根本上解决问题。
脐血干细胞是一种可以重新激活身体免疫系统的细胞，由于这种细胞是一种原始新生的细胞，因此它可以使处于亚健康的身体焕发新的活力，同时也可以改变皮肤细胞的活性，达到抗衰老的目的，使40岁年纪拥有20岁的肌肤，但是目前市场上缺少脐带血来源的干细胞的良好制备方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种安全可靠、纯度高的脐带血来源的干细胞的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种脐带血来源的干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、沉淀细胞；首先选择新鲜的脐带血，经过低速离心沉淀血红细胞；
步骤b、分离细胞；再进行高速离心，并加入分离液来获得干细胞；
步骤c、提取细胞；用吸管提取干细胞；
步骤d、洗涤细胞；提取后的干细胞用PBS溶液反复洗涤离心；
步骤e、孵育细胞；洗涤后的干细胞，加入培养液，放培养箱中孵育一定的时间；
步骤f、收获细胞；离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数；
步骤g、分装细胞；将制备得到的脐带血来源的干细胞进行分装，首先将细胞转移至生理盐水袋中，加入稳定剂，然后分装制成最终产品。
优选地，所述步骤a中的脐带血来源于剖腹产新生儿的脐带血，脐带血无菌保存于采血袋中。
优选地，所述步骤b中的分离细胞时的高速离心转数为2500rpm，离心30分钟。
优选地，所述步骤c中的提取细胞，采用的吸管是3ml吸管。
优选地，所述步骤d中的洗涤细胞时采用的离心转速为1500rpm，离心5分钟。
优选地，所述步骤e中的孵育细胞的孵育温度是37℃，并且在5％二氧化碳培养箱中进行，孵育时间为3-4小时。
优选地，所述步骤f中的收获细胞时的细胞计数，细胞数大约在1×107至1×108范围内。
优选地，所述步骤g中的生理盐水袋为100ml生理盐水袋，所述稳定剂为人血白蛋白。
本发明的有益效果是通过采用所述脐带血来源的干细胞的制备方法，制备得到这种多能修复功能的干细胞，从而通过改变人体内免疫系统的大环境，提高机体的免疫力，改善亚健康人群的体质，增强身体的免疫力，延缓衰老；本发明所述方法制备得到的干细胞液体制剂的纯度高，杂质少，对人体无副作用，安全可靠，制备和回输能在一天之内完成。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明公开一种脐带血来源的干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、沉淀细胞；首先选择新鲜的脐带血，经过低速离心沉淀血红细胞；
步骤b、分离细胞；再进行高速离心，并加入分离液来获得干细胞；
步骤c、提取细胞；用吸管提取干细胞；
步骤d、洗涤细胞；提取后的干细胞用PBS溶液反复洗涤离心；
步骤e、孵育细胞；洗涤后的干细胞，加入培养液，放培养箱中孵育一定的时间；
步骤f、收获细胞；离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数；
步骤g、分装细胞；将制备得到的脐带血来源的干细胞进行分装，首先将细胞转移至生理盐水袋中，加入稳定剂，然后分装制成最终产品。
所述步骤a中的脐带血来源于剖腹产新生儿的脐带血，脐带血无菌保存于采血袋中。
所述步骤b中的分离细胞时的高速离心转数为2500rpm，离心30分钟。
所述步骤c中的提取细胞，采用的吸管是3ml吸管。
所述步骤d中的洗涤细胞时采用的离心转速为1500rpm，离心5分钟。
所述步骤e中的孵育细胞的孵育温度是37℃，并且在5％二氧化碳培养箱中进行，孵育时间为3-4小时。
所述步骤f中的收获细胞时的细胞计数，细胞数大约在1×107至1×108范围内。
所述步骤g中的生理盐水袋为100ml生理盐水袋，所述稳定剂为人血白蛋白。
实施例一：
一种脐带血来源的干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、沉淀细胞；首先选择新鲜的脐带血，经过低速离心沉淀血红细胞；脐带血来源于剖腹产新生儿的脐带血，脐带血无菌保存于采血袋中；正常剖腹产新生儿脐带血大约100ml，经检测合格无HIV病毒方可使用；离心：脐带血放入离心管中，放入离心机中，低速(500-1000转/分)离心8分钟；离心之后收集全血，将全血加入到新的离心管中，弃掉红细胞沉淀。
步骤b、分离细胞；再进行高速离心，并加入分离液来获得干细胞；将25ml分离液加入到50ml离心管中；取装有全血的离心管，用PBS稀释，比例为1∶1；吸取稀释好的全血25ml，取过有分离液的离心管，将血液缓缓加入到分离液的上层，加好之后轻轻放到试管架上；将加好血液和分离液的离心管中放入离心机中，转速：2000rpm-2500rpm，时间：30min。
步骤c、提取细胞；用吸管提取干细胞；离心之后取出离心管，可看到离心管分了四层：分别是：血浆层、细胞层(可见到白色的圆环)、分离液层和红细胞层(有少量红细胞残留)；把离心后的离心管打开，再拿一根3ml吸管，将吸管伸到细胞层吸取细胞，将吸出的细胞放入一个干净的50ml离心管中，取完之后加入PBS溶液至50ml制成混悬液。
步骤d、洗涤细胞；提取后的干细胞用PBS溶液反复洗涤离心；取出的干细胞混悬液需要经过三次洗涤；第一次洗涤：将装有细胞的离心管放入离心机转速：1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清，沉淀为干细胞；第二次洗涤：用PBS溶液将干细胞吹起，加入PBS溶液再次制成混悬液，继续离心1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清；第三次洗涤：用PBS溶液将干细胞吹起，加入PBS溶液再次制成混悬液，继续离心1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清。
步骤e、孵育细胞；洗涤后的干细胞，加入培养液，放培养箱中孵育一定的时间；取来第三次的沉淀细胞，用10ml无血清培养基将细胞吹起，制成混悬液，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育2.5-3小时。
步骤f、收获细胞；离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数；先将孵育好的细胞经过0.22um的晒网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm，离心10min连续离心三次每次10分钟。去除培养液，最后用PBS吹起沉淀；混匀之后进行细胞计数，细胞总数大约在1X107-1X108。
步骤g、分装细胞；取来100ml生理盐水袋，先打入10ml人血白蛋白作为稳定剂，混匀后用10ml一次性注射器吸取细胞，将细胞打入生理盐水袋中，混匀封口，即为成品。
实施例二：
一种脐带血来源的干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤a、沉淀细胞；选择正常脐带血：正常剖腹产新生儿脐带血大约100ml，经检测合格无HIV病毒的方可使用。离心：脐带血放入离心管中，放入离心机中，低速1000转/分，离心8分钟。离心之后收集全血，将全血加入到新的离心管中，弃掉红细胞沉淀。
步骤b、分离细胞；将25ml分离液加入到50ml离心管中；取装有全血的离心管，用PBS稀释，比例为1∶1；吸取稀释好的全血25ml，取过有分离液的离心管，将血液缓缓加入到分离液的上层，加好之后轻轻放到试管架上；将加好血液和分离液的离心管中放入离心机中，2000rpm离心30min。
步骤c、提取细胞；离心之后取出离心管，可看到离心管分了四层：分别是：血浆层、细胞层(可见到白色的圆环)、分离液层和红细胞层(有少量红细胞残留)；把离心后的离心管打开，再拿一根3ml吸管，将吸管伸到细胞层吸取细胞，将吸出的细胞放入一个干净的50ml离心管中，取完之后加入PBS溶液至50ml制成混悬液。
步骤d、洗涤细胞；取出的干细胞混悬液需要经过三次洗涤；第一次洗涤：将装有细胞的离心管放入离心机转速：1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清，沉淀为干细胞；第二次洗涤：用PBS溶液将干细胞吹起，加入PBS溶液再次制成混悬液，继续离心1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清；第三次洗涤：用PBS溶液将干细胞吹起，加入PBS溶液再次制成混悬液，继续离心1500rpm离心10分钟，离心后弃去上清。
步骤e、孵育细胞；取来第三次的沉淀细胞，用10ml无血清培养基将细胞吹起，制成混悬液，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育2.5-3小时。
步骤f、收获细胞；先将孵育好的细胞经过0.22um的晒网过滤，然后进行高速离心，离心转速是2500rpm，离心10min。连续离心三次每次10分钟。去除培养液，最后用PBS吹起沉淀。混匀之后进行细胞计数，细胞总数大约在1X107-1X108。
步骤g、分装细胞；取来100ml生理盐水袋，先打入5ml人血白蛋白，混匀之后，再用20ml一次性注射器吸取细胞，将细胞打入生理盐水袋中，混匀封口，即为成品。
本发明所述方法制成的干细胞液体制剂细胞数多，形态正常，无杂质，人体回输无不适反应。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (8)

1.一种脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、沉淀细胞；首先选择新鲜的脐带血，经过低速离心沉淀血红细胞；
步骤b、分离细胞；再进行高速离心，并加入分离液来获得干细胞；
步骤c、提取细胞；用吸管提取干细胞；
步骤d、洗涤细胞；提取后的干细胞用PBS溶液反复洗涤离心；
步骤e、孵育细胞；洗涤后的干细胞，加入培养液，放培养箱中孵育一定的时间；
步骤f、收获细胞；离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数；
步骤g、分装细胞；将制备得到的脐带血来源的干细胞进行分装，首先将细胞转移至生理盐水袋中，加入稳定剂，然后分装制成最终产品。
2.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤a中的脐带血来源于剖腹产新生儿的脐带血，脐带血无菌保存于采血袋中。
3.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的分离细胞时的高速离心转数为2500rpm，离心30分钟。
4.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤c中的提取细胞，采用的吸管是3ml吸管。
5.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤d中的洗涤细胞时采用的离心转速为1500rpm，离心5分钟。
6.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤e中的孵育细胞的孵育温度是37℃，并且在5％二氧化碳培养箱中进行，孵育时间为3-4小时。
7.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤f中的收获细胞时的细胞计数，细胞数大约在1×107至1×108范围内。
8.根据权利要求1所述的脐带血来源的干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤g中的生理盐水袋为100ml生理盐水袋，所述稳定剂为人血白蛋白。
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