CN108355170A - 一种浓缩纳米脂肪及其制备方法、应用 - Google Patents

一种浓缩纳米脂肪及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种浓缩纳米脂肪，以及制备这种浓缩纳米脂肪的方法。这种方法的步骤包括(1)离心去水、(2)纳米脂肪的制作、(3)负压离心、(4)第二次离心。本发明又公开浓缩纳米脂肪制备基质血管成分的应用。本发明再公开浓缩纳米脂肪在制备富血小板血浆应用。本发明还公开一种浓缩纳米脂肪复合富血小板血浆的移植材料。

Description

一种浓缩纳米脂肪及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于组织工程和生物材料领域，具体涉及一种浓缩纳米脂肪。
背景技术
脂肪由于含有干细胞和外基质等活性物质，已经在临床再生与修复领域被广泛应用。在脂肪的作用体系里面，SVF、外基质各自发挥各自的作用，SVF/脂肪干细胞治疗在临床开展受限，很大程度上由于其胶原酶应用的因素，单独用脂肪代替细胞治疗，存在许多由于油脂含量高导致的并发症的问题。2013年Tonnard等人提出大颗粒脂肪，小颗粒脂肪和纳米脂肪这一新概念，其中纳米脂肪由于具有良好的再生功能被广泛采用，但是脂肪存活率和并发症仍然是有待解决的问题。2017年鲁峰等人采用特殊的装置将脂肪进行去油去水处理，并将获得的脂肪命名为SVF-Gel，实验结果发现SVF-Gel更够加快创面愈合。但是他们在操作过程中，事先将上层的油分离出来，最后再混合，这些繁琐的步骤不仅延长了手术时间，还增加了污染的风险。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种浓缩纳米脂肪及其制备方法，本发明的次要目的是提供一种基质血管及其制备方法，本发明的再一目的是提供一种富血小板血浆及其制备方法，本发明的第四目的是提供一种浓缩纳米脂肪复合富血小板血浆的移植材料。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种浓缩纳米脂肪的制备方法，包括以下步骤：
(1)离心去水：提取和离心小颗粒脂肪，去除下层液体层；
(2)纳米脂肪的制作：将步骤(1)获取的脂肪切割，再过滤；
(3)负压离心：将步骤(2)获得的脂肪负压离心，所述负压范围是0-18kPa；
(4)第二次离心：将步骤(3)获得的脂肪离心，中层即是浓缩的纳米脂肪。
优选的，步骤(3)中，所述负压离心是将两个螺旋注射器通过注射器转换器连接，每个注射器里面平均放置所述步骤(2)获得的脂肪，然后同时将两个注射器拉至最大刻度，然后恢复原脂肪所在刻度。
优选的，所述的螺旋注射器的型号为10ml。
优选的，步骤(1)中，所述的小颗粒脂肪的温度保持在3-5℃；步骤(2)中，将步骤(1)获取的脂肪先用2.4mm的双螺母连接器各切割30次，再用1.2mm的双螺母连接器切割30次，再用500目筛网过滤。
一种浓缩纳米脂肪，根据上项所述的制备方法获得的。
所述的浓缩纳米脂肪在制备基质血管成分应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先用生理盐水配置胶原酶；
(2)在离心管里加入所述浓缩纳米脂肪与步骤(1)获得的胶原酶，所述浓缩纳米脂肪与步骤(1)获得的胶原酶的体积比是1:1；
(3)将步骤(2)获得的玻璃容器放在恒温摇床中消化；
(4)将步骤(3)获得的玻璃容器离心后，去除上层和中层的液体，留取下层混合物；
(5)向步骤(4)获得的玻璃容器加入生理盐水，重悬细胞，过滤去除条索脂肪结构，离心；
(6)用生理盐水冲洗步骤(5)获得的细胞，离心，获得基质血管成分。
所述的浓缩纳米脂肪在制备基质血管成分应用，其特征在于，所述步骤(1)中的胶原酶的浓度是0.1％-0.2％；所述步骤(3)中恒温摇床的温度是37℃，恒温摇床的的转速是200-300次/分钟，消化时间是30-45min；所述步骤(6)中用生理盐水冲洗步骤(5)获得的细胞的次数是三次，所述离心是以300-500g离心3-5min。
所述的浓缩纳米脂肪在制备富血小板血浆应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取所述浓缩纳米脂肪和抗凝血，所述浓缩纳米脂肪和抗凝血来自同一个体；
(2)将步骤(1)获得的抗凝血离心，留下中间白膜层和上清液；
(3)将步骤(2)获得的混合物离心，留下上清液和下层血小板沉淀，重悬沉淀，留下下层血小板；
(4)取下层血小板检测血小板浓度，当下层血小板浓度倍数保持全血的血小板浓度在4-6倍之间，即为富血小板血浆。
所述的浓缩纳米脂肪在制备富血小板血浆应用，步骤(1)中所述纳米脂肪和抗凝血的体积比是50ml：20ml；步骤(3)中留下上清液的体积是2-3ml。
浓缩纳米脂肪在制备浓缩纳米脂肪复合富血小板血浆的移植材料的应用，所述浓缩纳米脂肪与所述的富血小板血浆的体积比是1-3:1，所述浓缩纳米脂肪与富血小板血浆来自同一个体。
本发明的有益效果与优点
(1)刚抽吸出来的微颗粒脂肪呈现淡橘黄色外观颗粒明显，与水分界清析，纳米脂肪则颜色偏白，呈现均质乳糜状外观，浓缩后的纳米脂肪，相比于纳米脂肪而言变得整体形态更加稳定。
(2)与现有的脂肪浓缩方法相比，本发明的方法操作更加简单，用时较少，10ml脂肪经整个过程大概只需要10分钟。本发明的方法使用的都是物理方法，不添加任何有争议的化学试剂，更安全可靠。获取浓缩纳米脂肪的机械操作，对于脂肪的细胞增殖能力和迁移能力没有明显损伤。
(3)相对于传统的纳米脂肪而言，浓缩纳米脂肪含水量和脂肪细胞含量更低，10ml的纳米脂肪，可去除大约5.6ml油脂，3.17ml液体，大概10ml微颗粒脂肪能收获大约1.23ml浓缩后的纳米脂肪。浓缩倍数为8.02倍，细胞倍数增加了5.03倍，去除了大量的油滴和水分，油滴和水分在脂肪作用过程中可能会起到相反的作用。
(4)本发明方法提取的浓缩纳米脂肪的SVF含量达到传统纳米脂肪的5.03倍。用浓缩纳米脂肪提取SVF，使用的胶原酶含量明显降低，提高SVF的提取效率，脂肪移植的并发症也明显降低，脂肪存活率提高，提高脂肪移植治疗的作用效果，降低移植脂肪中的油脂含量从而降低术后钙化、囊肿形成等并发症。
(5)本方法制备的浓缩纳米脂肪来自完全来源于自体，具有生物活性，并且没有免疫排斥反应，不存在伦理问题。无需体外培养，减少动物血清等成分污染，可以即时移植应用。
(6)本方法所使用的负压方法对脂肪里面脂肪干细胞的活性无明显影响，细胞划痕实验显示纳米脂肪和浓缩纳米脂肪都能在24小时内长满。
附图说明
图1是获取微颗粒脂肪的抽脂针实物图：抽脂针的侧孔直径为1mm。
图2是纳米脂肪制备的流程图：左上图是脂肪经2.4mm的连接器切割的模式图，右上图是脂肪经1.2mm的连接器切割的模式图，左下图是经过2.4mm和1.2mm两种螺母连接器切割后脂肪形态图，右下图是脂肪经500目筛网过滤的示意图。
图3是微颗粒脂肪、纳米脂肪与浓缩纳米脂肪图：图(a)是微颗粒脂肪与纳米脂肪对比图，图(b)是纳米脂肪与浓缩纳米脂肪对比图。
图4是纳米脂肪浓缩后水油分层图：其中上层是油滴层，中层是浓缩纳米脂肪层，下层是液体层。
图5是两种脂肪提取的SVF生长图：图(a)是普通纳米脂肪，图(b)是浓缩纳米脂肪。
图6是细胞划痕实验结果图。
图7是纳米脂肪和浓缩纳米脂肪在新西兰兔体内的脂肪吸收率比较图。
具体实施方式
实施例1
提取新西兰兔腹部脂肪
(1)离心去水：对新西兰兔进行常规消毒后用10ml注射器获取该兔背部小颗粒脂肪50ml，用1000g的离心力离心3min小颗粒脂肪，去除下层液体层，将脂肪放置在放有冰块的冰桶内静置，小颗粒脂肪的温度保持在4℃，静置大约十分钟后可见脂肪和肿胀液液体层明显分层，去除液体层。去除下层液体层。
(2)纳米脂肪的制作：将步骤(1)获取的脂肪先用2.4mm的双螺母连接器各切割30次，再用1.2mm的双螺母连接器切割30次，再用500目筛网过滤。
(3)负压离心：将两个10ml螺旋注射器通过注射器转换器连接，每个注射器里面放置5ml所述步骤(2)获得的脂肪，然后同时将两个注射器拉至最大刻度，然后恢复原脂肪所在刻度。这个步骤重复5次。
(4)第二次离心：将步骤(3)获得的脂肪离心，以2000g的离心力离心3min，中层即是浓缩的纳米脂肪。获取中层浓缩后的纳米脂肪大概6ml。
从浓缩纳米脂肪中提取基质血管成分(SVF)
(1)首先配置0.2％的一型胶原酶20ml，即在0.04g胶原酶中加入20ml生理盐水，用滤菌器过滤；
(2)在50ml离心管里面加入与浓缩纳米脂肪相同体积的胶原酶，整个反应体系胶原酶的浓度为0.1％；
(3)将加有胶原酶的脂肪放在恒温摇床中，37℃，200次/分钟，消化半个小时；
(4)以300g×10min离心后，去除上层未消化的脂肪和油脂，中层的消化液，留取下层SVF混合物；
(5)加入15ml生理盐水重悬细胞后，用100目筛网过滤去除大的条索结构，将细胞转入15ml离心管以300g5分钟离心；
(6)用15ml生理盐水反复冲洗细胞三次以上，用1ml生理盐水重悬留取备用。
用此种方法制备的SVF含量和活性如表格1所示，可见用浓缩纳米脂肪制备的SVF含量为27.98×105，纳米脂肪浓缩倍数为8.2±1.65，细胞数目增加倍数为5.03±0.14，对两种脂肪提取的SVF进行培养，如图5所示，浓缩纳米脂肪明显较纳米脂肪细胞密度大，细胞融合至80％的时间为5天左右，而纳米脂肪则需要8天左右。其中胶原酶的使用浓度相对减少了8.2倍，将获得的SVF反复用生理盐水冲洗，胶原酶的含量很少可以被忽略。细胞划痕实验如图6所示，两组细胞迁移速度无明显差别，都能在24小时之内融合。
表格1纳米脂肪与浓缩纳米脂肪特征对比表
测量浓缩纳米脂肪移植后的存活情况
用新西兰兔做浓缩纳米脂肪移植存活率的实验，操作步骤如下：
1)麻醉后将家兔固定，手术区消毒铺巾；
2)标记兔背部中线，从顶后10cm处到18cm处为手术区，以500ml生理盐水，20ml利多卡因，0.5ml肾上腺素的比例配肿胀液，用次肿胀液对兔背部手术区进行肿胀麻醉；
3)用侧孔1mm的抽脂针(如图1所示)，抽取微颗粒脂肪(如图3-a所示)大概30ml，用20ml制作浓缩纳米脂肪，10ml制作纳米脂肪(过程如图2所示)；
4)在相同兔子背部两侧分别移植2ml纳米脂肪和浓缩纳米脂肪，分别于1、3、6、9月份查看脂肪的体积，体积计算方法为将残留的脂肪放入装满水的离心管，再拿出，水减少的体积即是脂肪残留的体积，计算脂肪吸收率。
5)图3-b所示，与纳米脂肪相比，浓缩纳米脂肪结构更加稳定；图5和图6展示了浓缩纳米脂肪的SVF含量成倍增加，与此同时，机械和负压操作并没有损伤细胞的迁移能力。
6)结果如表格2和图7所示，浓缩纳米脂肪存活率在9个月达到稳定，纳米脂肪的吸收率大约50％，而浓缩纳米脂肪吸收率在10％以内。相当于浓缩纳米脂肪存活率在九个月后能保持90％，而纳米脂肪只有50％左右。
表格2纳米脂肪与浓缩纳米脂肪移植吸收率对比表
浓缩纳米脂肪混合富血小板血浆(PRP)
(1)获得新西兰兔的脂肪50ml，并获取该新西兰兔抗凝血20ml。
(2)将步骤(1)所获得的抗凝血以300g*15min离心，取中间白膜层和上层清液于两支15ml离心管。
(3)将步骤(2)获得的混合物以500g*15min离心，将上层清液转入另外的15ml离心管，留2ml清液和下层血小板沉淀，轻轻重悬离心管，后吸走上清。
(4)取少量检测血小板浓度，让血小板前后浓度倍数保持在4-6倍之间，即为PRP。
(5)按以上方法制作浓缩纳米脂肪，50ml普通脂肪大概获得浓缩纳米脂肪6ml(如图4所示)，混合步骤(4)PRP与浓缩纳米脂肪,浓缩纳米脂肪与所述的富血小板血浆的体积比是3:1。
本方法制备的浓缩纳米脂肪来自完全来源于新西兰兔自体，具有生物活性，并且没有免疫排斥反应，不存在伦理问题。无需体外培养，减少动物血清等成分污染，可以即时移植应用。其中SVF主要包含脂肪前体细胞、脂肪来源的干细胞、成纤维细胞、各种血细胞等，有助于提高移植脂肪组织的成活率。PRP含有转化生长因子β-1(TGFβ-1)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，具有良好的促进软组织修复与再生的能力。
本发明方法制备的浓缩纳米脂肪联合PRP移植材料的特点主要有来源丰富、价格低廉、获取简单、制备容易、无免疫排斥、安全有效等。将浓缩纳米脂肪联合运用，同时发挥了两者的优势，能够在很大程度上提高脂肪移植的存活率和作用效果。
本发明的实施方式不限于此，按照本发明的上述内容，利用本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种浓缩纳米脂肪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)离心去水：提取和离心小颗粒脂肪，去除下层液体层；
(2)纳米脂肪的制作：将步骤(1)获取的脂肪切割，再过滤；
(3)负压离心：将步骤(2)获得的脂肪负压离心，所述负压范围是0-18kPa；
(4)第二次离心：将步骤(3)获得的脂肪离心，中层即是浓缩的纳米脂肪。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述负压离心是将两个螺旋注射器通过注射器转换器连接，每个注射器里面平均放置所述步骤(2)获得的脂肪，然后同时将两个注射器拉至最大刻度，然后恢复原脂肪所在刻度。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的螺旋注射器的型号为10ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的小颗粒脂肪的温度保持在3-5℃；步骤(2)中，将步骤(1)获取的脂肪先用2.4mm的双螺母连接器各切割30次，再用1.2mm的双螺母连接器切割30次，再用500目筛网过滤。
5.一种浓缩纳米脂肪，其特征在于，根据权利要求1-4任一项所述的制备方法获得的。
6.根据权利要求5所述的浓缩纳米脂肪在制备基质血管成分应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首先用生理盐水配置胶原酶；
(2)在离心管里加入所述浓缩纳米脂肪与步骤(1)获得的胶原酶，所述浓缩纳米脂肪与步骤(1)获得的胶原酶的体积比是1:1；
(3)将步骤(2)获得的玻璃容器放在恒温摇床中消化；
(4)将步骤(3)获得的玻璃容器离心后，去除上层和中层的液体，留取下层混合物；
(5)向步骤(4)获得的玻璃容器加入生理盐水，重悬细胞，过滤去除条索脂肪结构，离心；
(6)用生理盐水冲洗步骤(5)获得的细胞，离心，获得基质血管成分。
7.根据权利要求6所述的浓缩纳米脂肪在制备基质血管成分应用，其特征在于，所述步骤(1)中的胶原酶的浓度是0.1％-0.2％；所述步骤(3)中恒温摇床的温度是37℃，恒温摇床的的转速是200-300次/分钟，消化时间是30-45min；所述步骤(6)中用生理盐水冲洗步骤(5)获得的细胞的次数是三次，所述离心是以300-500g离心3-5min。
8.根据权利要求5所述的浓缩纳米脂肪在制备富血小板血浆应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取所述浓缩纳米脂肪和抗凝血，所述浓缩纳米脂肪和抗凝血来自同一个体；
(2)将步骤(1)获得的抗凝血离心，留下中间白膜层和上清液；
(3)将步骤(2)获得的混合物离心，留下上清液和下层血小板沉淀，重悬沉淀，留下下层血小板；
(4)取下层血小板检测血小板浓度，当下层血小板浓度倍数保持全血的血小板浓度在4-6倍之间，即为富血小板血浆。
9.根据权利要求8所述的浓缩纳米脂肪在制备富血小板血浆应用，其特征在于，步骤(1)中所述纳米脂肪和抗凝血的体积比是50ml：20ml；步骤(3)中留下上清液的体积是2-3ml。
10.浓缩纳米脂肪在制备浓缩纳米脂肪复合富血小板血浆的移植材料的应用，其特征在于，所述浓缩纳米脂肪与所述的富血小板血浆的体积比是1-3:1，所述浓缩纳米脂肪与富血小板血浆来自同一个体。
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