CN105505866A

CN105505866A - 脂肪干细胞的制备及应用

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Publication number: CN105505866A
Application number: CN201610056960.9A
Authority: CN
Inventors: 周滨
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明属于一种药物制备以及用途领域，具体涉及自体脂肪干细胞的制备以及治疗II型糖尿病用途。本发明的制备由抽脂、分离、培养三个主要步骤：在选定患者的抽脂部位后由手术医师进行一定量的脂肪无菌抽吸、对抽吸后的脂肪通过一系列洗涤，离心、消化后获得脂肪干细胞、最后将细胞放入培养设备中进行培养扩增。脂肪干细胞不仅能促进受损的胰岛组织修复，而且能调节免疫平衡，避免免疫损伤。

Description

脂肪干细胞的制备及应用

技术领域

本发明属于一种药物制备以及用途领域，具体涉及自体脂肪干细胞的制备以及治疗II型糖尿病用途。

背景技术

目前临床上II型糖尿病的治疗，目的是降低血糖，控制并发症。采取的措施是口服降糖药、注射胰岛素、控制饮食、适当运动。然而上述方法无法完全修复胰岛，当然无法控制这些疾病的进一步发展。而脂肪干细胞疗法不仅能促进受损的胰岛组织修复；而且能调节免疫平衡，避免免疫损伤，是一种标本皆治的好方法，属于生物医疗技术的重大创新。

与现有的胚胎干细胞、iPS多能干细胞和骨髓干细胞相比较，脂肪干细胞不仅具有各类干细胞具有的优势，还具有取材方便、创伤小、来源充足，一次可以获得大量新鲜的干细胞，自体使用没有免疫排斥反应等优点，而且避开了胚胎干细胞的伦理学困扰和骨髓干细胞的来源稀缺等麻烦。在临床和再生医学方面，脂肪干细胞取代其他各类干细胞服务于病人，成为必然的趋势。

发明内容

脂肪干细胞分离：去除抽取的人体脂肪组织的下层血性肿胀液，将脂肪以500G离心3-5分钟，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％胶原酶溶液充分混匀后放入37℃摇床，并以200rpm消化30-40分钟，消化结束后再以800G离心5-10分钟后获得干细胞沉淀，加入对应的患者血清10ml，充分混匀后加入以干细胞沉淀和生理盐水的体积比1:5加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，离心后去除上层溶液，剩余底部沉淀，以体积比1:7加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，重复3遍后，将最后得到沉淀通过100μm滤器过滤，得到的滤液为脂肪干细胞溶液。

脂肪干细胞培养：将脂肪干细胞加入由10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬，并用100目滤网过滤，将细胞悬液接种于培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。48小时后换液，去除未贴壁细胞，此后每72小时换液1次，至细胞融合至80％后弃去原培养液，PBS洗涤1次，加入适量0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA进行消化3-5分钟，加入高糖DMEM培养基终止消化，以800r/min离心5分钟，用含10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1:2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层融合70％时，可继续传代，传至第三代终止。

将得到的脂肪干细胞以1.0×10⁶个/公斤体重通过静脉注射治疗II型糖尿病。

附图说明

图1成脂诱导分化检测图

图2成骨诱导分化检测图

图3成软骨诱导分化检测图

具体实施方式

(1)脂肪组织的采集：患者术前检查常规检查无异常后进行抽脂手术。对于手术部位的选择：大腿内侧及髂腰最好，使用3mm抽脂管连接20ml注射器进行抽脂，抽脂量1000ml。

(2)脂肪干细胞的分离提取：

脂肪干细胞分离：去除下层血性肿胀液后，将脂肪以500G，3min离心，离心后脂肪分三层，底层为血性液体，中层为纯脂肪，上层为油脂层，去除上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％胶原酶充分混匀后放入37℃，200rpm摇床摇匀消化30min，消化结束后放入800G，5min离心，离心后去除上层消化后的脂肪及溶液，剩余底部5ml干细胞沉淀，取出37℃恒温箱内的患者血清，加入上述5ml干细胞沉淀用以中和胶原酶，充分混匀后加入生理盐水至40ml，再以300G，3min离心，离心后去除上层溶液，剩余底部5ml沉淀，再次加入生理盐水至40ml以300G，3分钟离心，重复3遍后，将最后得到5ml沉淀通过100μm滤器过滤，得到脂肪干细胞溶液3.6ml。

(3)培养：

将3.6ml脂肪干细胞溶液加入盛有20ml高糖DMEM培养基的75cm²塑料培养瓶中重悬，100目滤网过滤得到细胞悬液22ml。将细胞悬液接种于培养瓶中，37℃饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。48小时后换液，去除未贴壁细胞，此后每72小时换液1次，至细胞融合至80％后弃去原培养液，使用磷酸缓冲盐溶液洗涤1次，加入10ml0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA进行消化3-5分钟，加入高糖DMEM培养基20ml终止消化，以800r/min离心5分钟，用高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1:2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层融合70％时，可继续传代，传至第三代终止。

(4)检测：

①成脂诱导分化：选择第3代的脂肪干细胞进行脂肪细胞的体外定向诱导分化。粘附贴壁的细胞使用0.25％的胰蛋白酶消化后进行细胞记数，将细胞密度调整到1×10⁵个/75cm²培养皿。细胞在完全基础培养基下孵育24小时，使细胞贴壁并伸展。24小时后，更换脂肪诱导DMEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗、1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，200μmol/L吲哚美辛，500μmol/L异丁基甲基黄嘌呤IBMX)。每72小时更换1次培养基，定向分化诱导第14天后即可以使用油红O染色定性观察体外诱导分化的结果。

称取0.5g油红干粉，溶于100ml异丙醇中，配成0.5％油红O储存液，棕色瓶保存。稀释油红O储存液，油红O:去离子水＝2:1，滤纸过滤3次。细胞弃去原培养液，磷酸缓冲盐溶液漂洗1遍后使用10％中性甲醛固定5分钟。培养皿加入油红O染剂覆盖住板底，染色30分钟，用60％异丙醇去除残留染液后蒸馏水多次漂洗，显微镜观察。

观察结果显示，脂肪干细胞被成脂定向分化诱导后第5天开始，胞浆内出现脂滴并逐渐聚集。细胞形态逐渐发生明显改变，从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变不规则状，而后变成圆形，可观察到细胞中小脂滴逐渐融合形成大的脂滴，将细胞核挤向一侧。脂肪诱导分化14天后出现了大量的脂滴，油红“O”染色后细胞内出现大量红染颗粒，证明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴。实验表明，脂肪干细胞具有向脂肪细胞诱导分化的能力(图1)。

②成骨诱导分化：选择第3代的脂肪干细胞进行体外成骨定向诱导分化。粘附贴壁的细胞使用0.25％的胰蛋白酶消化后进行细胞记数，将细胞密度调整到1×10⁴个/75cm²培养皿。细胞在完全基础培养基下孵育48小时，使细胞贴壁并伸展。48小时后，更换成骨诱导DMEM培养基(含10％胎牛血清，0.01μmol/L地塞米松，50μg/mlVitC，10μmol/Lβ-磷酸甘油钠)。每3天更换1次培养基，定向分化诱导第14天后即可以使用茜素红染色定性观察体外诱导分化的结果。

培养皿用磷酸缓冲盐溶液冲洗2次，95％乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次。0.1％茜素红-Tris-HCl(PH8.3)37℃下染30分钟。蒸馏水冲洗、干燥、封片，显微镜观察。

观察结果显示，成骨诱导的第5天开始，在相差显微镜下可观察到一些脂肪干细胞形态由梭形转变为立方状、多角形或不规则形，体积增大，细胞开始聚集，局部细胞折叠生长，具有钙化的趋势。在诱导的第10天左右开始出现小的点状钙化斑，随后钙盐沉积开始增多。诱导第14天，经茜素红染色鉴定可发现成骨细胞内布满被红染颗粒，颗粒大小不均一，证实为钙盐沉积，为典型钙化结节。实验证明，脂肪干细胞具有向骨细胞分化的能力(图2)。

③成软骨诱导分化：选择第3代的脂肪干细胞进行体外成软骨定向诱导分化。粘附贴壁的细胞使用0.25％的胰蛋白酶消化后进行细胞记数，将细胞密度调整到1×10⁶/ml，接种到6孔板中，置入在37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱内培养，先让细胞在完全培养基条件下贴壁并伸展，待细胞生长至培养瓶底呈现极度密集融合时(呈过度培养状态)，更换成软骨细胞诱导DMEM培养基(10％胎牛血清、10ng/mlTGF-β₁、50ng/mlIGF、6.25μg/ml转铁蛋白、0.1μmol/L地塞米松和1％双抗)进行成软骨诱导分化实验。每2天更换一次诱导培养基，定向分化诱导14天后进行阿尔辛蓝染色定性观察体外诱导分化的结果。

培养板内加入阿尔辛蓝液30分钟，30g/L醋酸液3分钟，蒸馏水冲洗3次。0.5g/100ml过碘酸氧化10分钟，自来水冲洗2分钟，蒸馏水洗2次。无水乙醇脱水，显微镜观察。

脂肪干细胞诱导培养后，细胞形态均发生改变，逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14天后呈密集生长，多数细胞呈平坦的多边角形状细胞，其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞，呈放射性集落状，每个细胞集落中漂浮有不定形状物质，有典型结节生成。阿尔辛蓝染色结果，脂肪干细胞的阿尔辛蓝染色结果呈阳性反应，集落中央蓝染，细胞呈放射状，细胞轮廓清晰可见。实验表明，脂肪干细胞具有向软骨细胞诱导分化的能力(图3)。

④流式细胞仪鉴定细胞分子的表达

取第3代的脂肪干细胞做流式细胞仪鉴定。在1-1号试管和2-1号试管内分别放入20μlIgG1-PE和IgG1-FITC，在1-2号试管和2-2号试管内分别放入20μl单抗试剂鼠抗人CD29-PE和CD44-FITC。每管分别加入细胞悬液100μl，20℃避光反应20分钟，然后用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，加0.8ml磷酸缓冲盐溶液稀释，混匀后放入流式细胞仪进行检测，结果表明，第3代的脂肪干细胞中CD29，CD44两种表面分子的表达分别为96.95％和27.95％，证明脂肪干细胞的表面分子CD29、CD44均为高表达。

将得到的脂肪干细胞以1.0×10⁶个/公斤体重通过静脉注射，能够降低空腹血糖和餐后血糖，改善胰岛素抵抗状况，提高胰岛细胞的功能，改善病人的生活质量。

Claims

1.一种脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：

(1)脂肪干细胞分离：去除抽取的人体脂肪组织的下层血性肿胀液，将脂肪以500G离心3-5分钟，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％胶原酶溶液充分混匀后放入37℃摇床，并以200rpm消化30-40分钟，消化结束后再以800G离心5-10分钟后获得干细胞沉淀，加入对应的患者血清10ml，充分混匀后加入以干细胞沉淀和生理盐水的体积比1:5加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，离心后去除上层溶液，剩余底部沉淀，以体积比1:7加入生理盐水，再以300G离心3-5分钟，重复3遍后，将最后得到沉淀通过100μm滤器过滤，得到的滤液为脂肪干细胞溶液。

(2)脂肪干细胞培养：将脂肪干细胞加入由10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬，并用100目滤网过滤，将细胞悬液接种于培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。48小时后换液，去除未贴壁细胞，此后每72小时换液1次，至细胞融合至80％后弃去原培养液，PBS洗涤1次，加入适量0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA进行消化3-5分钟，加入高糖DMEM培养基终止消化，以800r/min离心5分钟，用含10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1:2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层融合70％时，可继续传代，传至第三代终止。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞，其特征在于用于治疗II型糖尿病。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于治疗II型糖尿病的脂肪干细胞溶液的浓度为1.0×10⁶个/公斤体重。