CN104694466A - 间充质干细胞来源的胞外体制备及在急性肺损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）来源胞外体（Exosomes）制备、纯化的生产工艺及该胞外体作为非细胞治疗手段在治疗急性肺损伤中的应用。该胞外体来源的MSCs属贴壁粘附型干细胞，其制备和纯化工艺的特色在于：（1）制备MSCs条件培养基时特别添加甲状旁腺激素；（2）不连续Ficoll密度梯度法与免疫磁珠法结合分离纯化获得该胞外体。经大鼠急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）模型实验证实该胞外体可用于ALI的治疗，为实现替代干细胞治疗的非干细胞治疗途径奠定了基础。

Description

间充质干细胞来源的胞外体制备及在急性肺损伤中的应用

 

技术领域

本发明涉及干细胞研究，属表观遗传学、细胞生物学及分子生物学领域，具体涉及一种间充质干细胞（MSCs）所分泌和释放的胞外体（Exosomes）的改良制备工艺，并利用其归巢机制，研究其在治疗急性肺损伤（ALI）中的作用机制。

 

背景技术

ALI是临床重症患者发生急性呼吸衰竭的主要原因，其发病机制复杂且未能完全阐明，病情易发生急骤变化，死亡率仍高于40%以上。MSCs是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成为多种功能细胞，是生物体保持形态与功能正常的重要基础，与生物体的生长发育、衰老、损伤修复和疾病均有着密切的关系。经研究证实，MSCs植入损伤肺部，虽可改善炎症因子等介导的炎症反应、减少死亡率，但鉴于MSCs目前尚无特异性的表面标记物，取材来源、培养条件的差异和培养代数的不同是否会引起MSCs的性质、功能的不同，较难长期保存和运输，存在治疗细胞的非治疗目的分化（成骨，成软骨细胞及其他分化），以及生物安全性隐患（肿瘤，基因污染，感染），使得ALI/ARDS的治疗仍未取得突破，寻找非干细胞的“干细胞”治疗途径日益成为该领域的研究焦点。

以往的研究提出干细胞治疗的机制有两种假说，即“分化替代”假说和“细胞因子旁分泌”假说。其中，“分化替代”假说认为，移植干细胞可分化为如心肌细胞、血管内皮细胞、成骨细胞等受损伤的组织细胞，从而发挥治疗作用。针对这一假说，虽有一定的实验证据，但尚不能解释干细胞的全部治疗作用及机制。随后有人又提出干细胞的“细胞因子旁分泌”假说，认为一方面干细胞可分泌各种细胞因子，作用于受损组织各细胞，抑制其凋亡，促进其生成，激活自身干细胞发挥作用，同时损伤部位微环境中也可分泌干细胞生长与分化因子等活性物质作用于治疗源干细胞，从而发挥治疗作用，但是该假说由于发现的细胞因子种类和含量均不能完全解释干细胞治疗的作用机制，因此，也不能被完全认可。

Exosomes是由多囊泡体(multivesicle body，MVB) 内吞，包裹细胞内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性物质，再由内吞小体出泡产生的一种亚细胞结构的复合信息体，被认为是一种介导细胞间信息传递的重要“内分泌”机制。与细胞分泌的其他囊泡相比，Exosomes具有更清晰的生物学特性。 Exosomes可保护其所携带的酶和化学物质不被降解；离体条件下可在-20℃保存6个月，无潜在毒性，且生物化学活性不受影响；其表面的复合分子为其靶向特定组织及微环境提供了一个潜在的归巢机制；可使治疗性的蛋白质、RNA通过吞噬、食菌、膜融合的方式进入受损细胞；既具有MSCs类似的生物学功能，又具有不同于细胞的众多优点，有足够的潜力参与广泛的生物化学及细胞活性反应，。

利用动物模型研究MSCs来源Exosomes的应用已有一些报道，Lai等研究发现人类胚胎干细胞(ESC)来源的MSCs培养上清中提纯得到的Exosomes，能减少小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中的心肌梗死面积，对治疗心肌缺血再灌注损伤有显著的疗效；骨髓MSCs分泌的Exosomes在急性肾小管损伤的组织中通过mRNA水平转移激活幸存肾小管细胞中的增殖程序，抑制其凋亡达到修复损伤的作用；Lee等研究发现MSCs来源Exosomes能够抑制人肺动脉高压内皮细胞的Stat3信号，进而影响血管重塑。但在治疗急性肺损伤方面，MSCs来源Exosomes的应用尚未见报道，Exosomes的深入研究无疑为ALI/ARDS的治疗提供了广阔的前景。

    目前，Exosomes的制备技术主要依靠传统超高速密度梯度离心法，需要大型的超高速离心机及重水等特殊原料，但并不能将Exosomes与其它的小囊泡结构或大的蛋白聚集物区分开来，且由于离心机所用的专用转头及离心管容积的限制，无法大量制备，极大的限制了其应用。生物膜分离技术虽对设备及材料要求简单、步骤简化，大大缩短了制备时间，但仍未解决关键问题。本专利根据Exosomes结构和功能的特性，通过工艺的改良，一方面添加甲状旁腺激素增加体外培养MSCs中Exosomes的释放量，另一方面解决了上述关键问题，保证了Exosomes的高纯度与生物学活性，达到“低投入、高产出”的目的。并且我们认为Exosomes可进行人工或半人工的制备，既保留了与干细胞相同的生物学特性与功能，又可对其进行靶向加工，突破MSCs的局限性，制成更加具有临床应用前景且能够替代干细胞治疗的“Super Exosomes”。

 

发明内容

本发明专利主要目的是提供一种MSCs来源Exosomes的改良制备工艺，利用Exosomes可发挥MSCs类似的生物学功能，且具有众多优于细胞的特点，应用于ALI/ARDS的治疗，揭示MSCs治疗呼吸系统疾病的核心机制，进而为实现替代干细胞治疗的非干细胞治疗途径提供有力的技术基础。

本发明专利的要点之一：该胞外体既不分裂增殖，也不进行代谢，可发挥类似干细胞的功能作用，是干细胞发挥治疗作用的核心机制，安全性高，抑郁保存，具有广大的临床应用前景。

本发明专利的要点之二：提高该胞外体的提纯率，保证其生物活性的维持，从而进行该胞外体治疗目的性的规模化生产，本发明专利公开该胞外体生产工艺，为其作为新的非细胞治疗手段进入临床应用提供技术支持。

本发明专利提供一种间充质干细胞来源的胞外体，该胞外体为间充质干细胞分泌的亚细胞结构信息复合体，胞膜完整，携带其源细胞胞质内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性成分，除具有源细胞表面标记物CD29、CD44、CD105外，还特异性表达CD63、CD81。

其中，所述胞外体的来源的间充质干细胞包括不同种属及同一种属不同部位，具体为人脐带血及骨髓间充质干细胞，鼠骨髓间充质干细胞。

本发明专利还提供了一种间充质干细胞来源的胞外体生产工艺，制备该胞外体条件培养基，取生长良好的3-50代间充质干细胞，当细胞融合率达70%-80%时，弃去上清，PBS清洗后更换无血清培养基继续培养48h；无血清培养基中添加甲状旁腺激素1ng/ml。

其中，所述的生产工艺包括初步的分离纯化步骤，具体为使用不连续Ficoll密度梯度离心法：（1） Ficoll—甘油分离液的配制：①将2g Ficoll干粉溶解于5ml蒸馏水中，再与40ml 60%甘油充分混合。取混合液22ml，蒸馏水最终定容至32ml，混匀后，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.125g/ml；②将2g Ficoll干粉溶解于4ml蒸馏水中，再与26ml 80%甘油充分混匀，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.206g/m；（2）50ml离心管中底层铺设1.206g/ml Ficoll—甘油分离液5ml，上层铺设1.125g/ml Ficoll—甘油分离液5ml，静置待稳定。收集条件培养上清液，3000rpm低温（4℃）离心10min，经0.2μm无菌滤膜过滤后即为粗提的Exosomes，缓慢将Exosomes的粗提液40ml移入已铺设好分离液的离心管中，11500g低温离心30min，吸出两梯度间“云雾层”组分，用PBS稀释后，3500rpm低温离心10 min，上清中得到初步纯化的Exosomes。

其中，所述的生产工艺还包括进一步的纯化步骤，具体为免疫磁珠法中加入CD29、CD44、CD105、CD63及CD81的单克隆抗体，筛选提纯该胞外体。

额外的，本发明专利还提供了间充质干细胞来源的胞外体作为非细胞治疗手段在治疗急性肺损伤中的应用，所述胞外体存在潜在归巢机制，通过膜融合方式，释放所携带的活性成分，可部分或全部发挥间充质干细胞的作用。

 

本发明专利的优点在于：

1、本发明专利中MSCs的来源包括不同种属（人源和鼠源）及同一种属不同部位（人脐带血和人骨髓），保证了Exosomes来源的广泛性，更加全面地比较了同源与异源Exosomes生物学特性与功能的差异。

2、本发明专利中使用现有成熟的MSCs体外培养方法，制备条件培养基（无血清培养48h）时，添加甲状旁腺激素（1ng/ml）促进胞内Ca⁺浓度升高，增加细胞内Exosomes的分泌与释放量，进而提高Exosomes的产量。

3、本发明专利中使用不连续Ficoll密度梯度离心法初步分离与纯化Exosomes，降低了生产设备及材料的要求，既保证了Exosomes结构与生物活性的完整，又缩短了耗时，操作简便易行。

4、本发明专利中使用免疫磁珠法与不连续Ficoll密度梯度法结合，解决了无法与其它小囊泡结构或大的蛋白聚集物区分的难题，所得Exosomes均一度高。

5、本发明专利中率先将MSCs来源Exosomes具有较高的安全性（无毒、副作用少）应用于ALI/ARDS的研究，揭示MSCs发挥治疗作用的核心机制，为ALI/ARDS的治疗提供了突破口。

6、本发明专利中MSCs来源Exosomes的制备和应用开辟了一种新型的无创治疗手段，进一步为其替代MSCs治疗提供技术支持。

 

附图说明

图1 传代间充质干细胞(MSCs)倒置显微镜下形态：成纤维样长梭形细胞，旋涡状或平行状生长（×40）。A、人脐带血MSCs；B、人骨髓MSCs；C、鼠骨髓MSCs。

图2 透射电镜下人骨髓MSCs-Exosomes的形态特征：有完整胞膜，胞内为低电子密度成分，呈圆形或椭圆形，直径在30~100nm的膜性囊泡状结构（×100000）。

图3 Bradford法测定Exosomes悬液中总蛋白质浓度（Exosomes的定量）：人骨髓MSCs-Exosomes稀释10倍后分别取出 0.01、0.02、0.03 ml 测得的 A₅₉₅值分别为 0.015、0.027、0.041，根据标准曲线得出的公式y=0.0022x+0.0025，计算得Exosomes 平均浓度为（5.69±0.131）mg/ml。A、Bradford法实验各组成分列表；B、BSA标准蛋白曲线。

图4 人骨髓MSCs-Exosomes SDS-PAGE凝胶电泳图像，初步分析Exosomes蛋白成分：人骨髓MSCs来源的Exosomes所含蛋白在49~90KD附近及19KD以下富集。1、人脐带MSCs分泌的Exosomes；2、经免疫磁珠法纯化后Exosomes的清洗液；3、经不连续Ficoll密度梯度法初步纯化的Exosomes；4、经0.2μm无菌滤膜过滤后粗提的Exosomes。

图5人骨髓MSCs-Exosomes移植治疗大鼠急性肺损伤模型病理切片，结果表明正常对照组肺泡结构清晰，间隔完整，肺泡腔清晰；急性肺损伤组可见肺泡正常结构消失，间隔明显增厚，肺间质及肺泡腔内大量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内广泛透明膜形成；hBMSCs移植组和hBMSCs-Exosomes移植组可见肺泡结构基本清晰，肺泡间隔仍较正常对照组增厚，较急性肺损伤组明显变薄，肺间质内少量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内无透明膜形成，肺组织损伤明显减轻。A、正常对照组（S组）；B、急性肺损伤组（L+N组）；C、hBMSCs移植组（L+M组）；D、hBMSCs-Exosomes移植组（L+E组）

图6 人骨髓MSCs-Exosomes移植治疗大鼠急性肺损伤模型24h死亡率观察，结果表明ALI 大鼠在伤后1h移植hUCMSCs及hUCMSCs-Exosomes能明显降低动物死亡率，且Exosomes移植组略优于间充质干细胞移植组。

 

具体实施方案

实施例1：间充质干细胞的分离与培养

1.1人脐带血间充质干细胞的分离与培养

经新生儿父母同意，采集健康足月剖宫产胎儿脐带血50~80ml，所采集样本于4h内处理。将抗凝脐血（20U/ml肝素抗凝）用同体积的PBS稀释一倍，混匀，再与37℃预温的3%明胶等比混合，室温下静置至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，2000 r/min 离心5min，收集细胞；用5ml DMEM/F12重悬所得细胞，按2:1的体积比加到人淋巴细胞分离液（1.077g/ml）表面，2000 r/min 离心20 min，离心后吸取白膜层，获得单个核细胞。PBS 洗两次，用 DMEM/F12 培养基(含体积分数为10%胎牛血清，10g/L碱性成纤维细胞生长因子 bFGF，100U/mL 青霉素和100 g/L的链霉素)悬浮上述细胞，计数，以1×10⁷/ml 浓度接种于 T-25cm²培养瓶，置于37℃，5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养 4 天后首次换液，以后每3天换液一次。倒置显微镜下观察细胞生长情况细胞生长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶 /EDTA 消化，传代培养。（见图1-A）

1.2 人骨髓间充质干细胞的分离与培养

采集健康志愿者髂骨内骨髓15mL，加等量PBS，室温下1500r/min离心10min两次，弃脂肪和上清液，加PBS制成4×10⁷细胞数的悬液。分次取5 mL加到5 mL Percoll分离液，1500r/min，离心30min后取中间细胞层加2倍量的PBS，1500r/min离心5min，弃上清，以l×10⁶/mL密度接种于50mL培养瓶中，加入hBMSCs完全培养基10mL，原代培养24h、48h各换液一次。培养7d，0.25％胰酶消化，传代培养。(见图1-B)

1.3鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

脱颈处死6周龄SD大鼠，无菌条件下剪去大鼠双侧股骨胫骨的两端，暴露骨髓腔，LG-DMEM培养基加15% 胎牛血清反复冲洗骨髓腔获得细胞，细胞悬液贴壁加入到预置等体积Percoll分离液（ 1.073g /mL)） 的离心管中，悬于上层， 离心（2500r/min，30min），收集云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中， LG-DMEM 洗涤两次，离心（1000r/min，5min），弃上清，用含15% 胎牛血清的LG-DMEM重悬细胞，以1. 5×105/cm²接种细胞于培养瓶中，于37℃、5% CO₂恒温培养箱培养，原代细胞达80% 融合时，进行细胞传代。(见图1-C)

实施例2：间充质干细胞中Exosomes的分离

取生长良好的3-50代间充质干细胞，当细胞融合达到70%-80%时，弃去上清，PBS清洗后更换无血清培养基（添加甲状旁腺激素1ng/ml）进行培养。培养48h后，收集培养上清液，3000rpm低温（4℃）离心10min，经0.2μm无菌滤膜过滤后即为粗提的Exosomes。

实施例3：Exosomes的提取、纯化

3.1不连续Ficoll密度梯度法

3.1.1 Ficoll—甘油分离液的配制

①将2g Ficoll干粉溶解于5ml蒸馏水中，再与40ml 60%甘油充分混合。取混合液22ml，蒸馏水最终定容至32ml，混匀后，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.125g/ml；②将2g Ficoll干粉溶解于4ml蒸馏水中，再与26ml 80%甘油充分混匀，待温度冷却至4℃时，使用比重计测得密度1.206g/ml。

3.1.2不连续Ficoll密度梯度离心法

将Ficoll—甘油分离液，依密度从低到高的顺序置于同一离心管（50ml）中（即底层铺设1.206g/ml Ficoll—甘油分离液5ml，上层为1.125g/ml Ficoll—甘油分离液5ml），静置待稳定后缓慢移入Exosomes的粗提液40ml。11500g低温离心30min。吸出两梯度间“云雾层”组分，用PBS稀释后，3500rpm低温离心10 min，取上清；

3.2免疫磁珠法

①所得上清与PBE孵育液(0.5％BSA、0.08％EDTA  PH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体)1:1体积充分混悬，加入一抗(CD29、CD44、CD105、CD63、CD81，10~20μg/ml终浓度)，4℃孵育30分钟；②将分离柱安装入磁场中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱.；③将孵育完毕的细胞悬液添加到分离柱中，自然流尽；④以0.5ml PBE加入分离柱中，自然流尽，洗柱一次；⑤从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1~2ml PBE，用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的Exosomes，用PBS洗一次，离心，-80℃保存待用。

实施例4：Exosomes的鉴定

4.1电镜观察胞外体形态

   取6ul人骨髓来源Exosomes原液，悬置均匀后滴加于直径3mm的载样铜网上，室温（24℃）静置1min，用滤纸将液体从铜网边缘轻轻吸干，将2% 磷钨酸溶液（pH6.8）滴于铜网上，室温负染5min，滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干，透射电镜下观察。

透射电镜下人骨髓MSCs-Exosomes的形态特征：直径为30~100nm，有完整胞膜，胞内为低电子密度成分，呈圆形或椭圆形的膜性囊泡状结构。(见图2)

4.2Bradford法测定Exosomes悬液中总蛋白质浓度（Exosomes的定量）

4.2.1试剂与样品 

用牛血清白蛋白(BSA)配制成 1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液。待测样品经超声细胞破碎仪处理。准备9只管，分别编号，按照表1中顺序加样，第1号管作空白管；第2～6号管作标准品管；第7～9 号管作待测样品管。各管成分见图2-A，每加完一管，立即混匀。并按各个浓度重复一次。加完试剂振荡混匀，室温放置 5 min，用比色杯在分光光度计上（波长 595nm）测定各样品光吸收值。用标准蛋白质量（μg）为横座标，用吸光度值 A₅₉₅为纵座标绘制标准曲线，求得直线回归方程；测定待测样品的 A₅₉₅值，从标准曲线(见图2-B)中确定待测样品浓度。

4.2.2实验结果

人骨髓MSCs-Exosomes稀释10倍后分别取出 0.01、0.02、0.03 ml 测得的 A₅₉₅值分别为 0.015、0.027、0.041，根据标准曲线得出的公式y=0.0022x+0.0025，分别算出相应的蛋白量，测得Exosomes 平均浓度为（5.69±0.131）mg/ml。

4.3SDS-PAGE蛋白凝胶电泳及凝胶图象分析

分析人骨髓MSCs-Exosomes的蛋白组分，将分离纯化的Exosomes进行12％SDS-PGAE电泳分离蛋白，电泳结束后取出分离胶并用0.25％考马斯亮蓝R250染色，脱色后采用影像分析仪扫描图像对凝胶图像进行分析。（见图4）

初步分析可见人骨髓MSCs来源的Exosomes含有多种蛋白，并在49~90KD附近及19KD以下富集。

实施例5：Exosomes对内毒素诱导的大鼠急性肺损伤模型的影响

5.1实验分组

健康雄性SD大鼠64只，8周龄，体重180-200克，清洁级，大鼠随机分成4组：正常对照组（S）、急性肺损伤组（L+N）、人骨髓MSCs（hBMSCs）移植组（L+M）和hBMSCs-Exosomes移植组（L+E)，每组16只。

5.2模型建立及干预方案

急性肺损伤组、hBMSCs移植组及hBMSCs-Exosomes移植组经气管内滴注LPS（5mg/kg）0.1ml建立急性肺损伤模型，成功造模1小时后，hBMSCs移植组经气管内滴注hBMSCs混悬液（1×10⁶溶于0.1ml生理盐水中），hBMSCs-Exosomes移植组经气管内滴注Exosomes悬液（10μg蛋白总量溶于0.1ml生理盐水中），正常对照组及急性肺损伤组经气管内滴注等量的生理盐水。移植后24h观察大鼠肺组织病理改变及死亡率统计。（见图5、图6）

5.3实验结果

    由病理切片可见，S组肺泡结构清晰，间隔完整，肺泡腔清晰；L+N组可见肺泡正常结构消失，间隔明显增厚，肺间质及肺泡腔内大量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内广泛透明膜形成；L+M和L+E移植组可见肺泡结构基本清晰，肺泡间隔仍较正常对照组增厚，较急性肺损伤组明显变薄，肺间质内少量炎性细胞浸润及红细胞漏出，肺泡腔内无透明膜形成，肺组织损伤明显减轻。hUCMSCs-Exosomes可促进ALI 大鼠的病理恢复，伤后1h移植hUCMSCs-Exosomes能明显降低动物死亡率，且Exosomes移植组略优于间充质干细胞移植组，认为Exosomes可部分或全部发挥间充质干细胞的功能，达到治疗目的。

Claims (7)

1.一种从间充质干细胞中提取的胞外体，其特征在于：所述胞外体为间充质干细胞分泌的亚细胞结构信息复合体，胞膜完整，携带其源细胞胞质内特殊的蛋白质、mRNA、microRNA及DNA碎片等活性成分，除具有源细胞表面标记物CD29、CD44、CD105外，还特异性表达CD63、CD81。

2.根据权利要求1所述的胞外体，其特征在于：所述胞外体的来源的间充质干细胞包括不同种属及同一种属不同部位，具体为人脐带血及骨髓间充质干细胞，鼠骨髓间充质干细胞。

3.权利要求1—2所述胞外体的制备方法，其步骤包括：(1)制备胞外体条件培养基；(2) 使用不连续Ficoll密度梯度离心法与免疫磁珠法配伍高效提纯胞外体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述胞外体条件培养基的制备方法为：取生长良好的3-50代间充质干细胞，当细胞融合率达70%-80%时，弃去上清，PBS清洗后更换无血清培养基继续培养48h；无血清培养基中添加甲状旁腺激素1ng/ml。

5.如权利要求4所述胞外体的制备、纯化方法，其特征在于不连续Ficoll密度梯度离心法，Ficoll—甘油分离液的密度梯度由上而下为1.125g/ml，1.206g/m。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述免疫磁珠法中加入CD29、CD44、CD105、CD63及CD81的单克隆抗体进行筛选提纯。

7.如权利要求1—2所述的胞外体作为非细胞治疗手段在治疗急性肺损伤中的应用，其特征在于：利用所述胞外体存在的潜在归巢机制，通过膜融合方式，释放所携带的活性成分，可部分或全部发挥间充质干细胞的作用。