CN113768953B - 凋亡小体用于制备治疗急性肺损伤药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了凋亡小体用于制备治疗哺乳动物急性肺损伤药物的应用。通过动物模型实验发现,凋亡小体滴注可显著改善小鼠的急性肺损伤症状;治疗后小鼠肺泡巨噬细胞由促炎型转变为抑炎型,进而有望用于治疗人急性肺损伤。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗及再生医学领域,尤其涉及凋亡小体用于制备治疗急性肺损伤药物的应用。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)及其严重阶段急性呼吸窘迫综合症(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)是以呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿为特征的临床常见的危重症。ALI/ARDS的病理机制非常复杂,研究至今目前仍不完全明了,临床上也缺乏有效的治疗手段,虽然糖皮质激素、机械通气等经典治疗方法在一定程度上能缓解患者的症状,但是据统计,ALI/ARDS病死率仍高达40%~45%,而且ALI/ARDS可严重损坏病人的呼吸功能,导致许多病人预后生活质量严重下降,给家庭和社会造成沉重的负担。因此,临床上亟需新的有效的治疗方法。目前有研究表明移植外源性人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)可以治疗ALI/ARDS。UC-MSCs移植后能够减轻肺组织炎症和肺水肿,并增强组织的抗感染作用,可在一定程度上减轻ALI/ARDS的症状。
发明内容
本发明的目的是提供凋亡小体用于制备治疗急性肺损伤药物的应用,以期达到对急性肺损伤的良好治疗效果。
为达到上述目的,本发明实施例采用如下技术方案:
凋亡小体用于制备治疗哺乳动物急性肺损伤药物的应用。
凋亡小体用于制备治疗人或小鼠急性肺损伤药物的应用。
可选的,所述的凋亡小体由凋亡的脐带间充质干细胞分泌得到。
可选的,脐带间充质干细胞为外源性的人脐带间充质干细胞。
可选的,所述的凋亡小体为600~1200nm直径的胞外囊泡。
可选的,所述的凋亡小体由体外培养的UC-MSCs加星孢菌素诱导凋亡,上清液依次经:800g离心10min和16,000g离心30min分离得到。
可选的,所述的凋亡小体的施药方式为气管滴注。
可选的,所述的凋亡小体的施药方式为给小鼠进行气管滴注;滴注剂量为10μg/20g。
一种滴注剂,所述滴注剂的有效成分为凋亡小体。
一种治疗急性肺损伤的药物,所述药物的有效成分为凋亡小体。
与现有药物相比,本发明具有以下有益的技术效果:凋亡小体滴注可显著改善小鼠的急性肺损伤症状;治疗后小鼠肺泡巨噬细胞由促炎型转变为抑炎型。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:
图1为凋亡小体扫描电镜结果;
图2为凋亡小体粒径分析结果;
图3为凋亡小体Annexin-V阳性图;
图4为凋亡小体表面标记western blot结果;
图5为应用22G Y型静脉留置针口咽滴注LPS建立小鼠急性肺损伤模型;
图6为急性肺损伤小鼠治疗后肺组织HE染色图;
图7为急性肺损伤小鼠治疗后肺泡灌洗液中炎性因子表达;
图8为AB进入肺部被肺泡巨噬细胞吞噬;
图9为治疗后肺泡巨噬细胞流式图;
图10为治疗后肺泡巨噬细胞炎性因子表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
急性肺损伤(acute lung injury,ALI)及其严重阶段急性呼吸窘迫综合症(acuterespiratory distress syndrome,ARDS)是以呼吸窘迫、顽固性低氧血症和非心源性肺水肿为特征的临床常见的危重症;简称ALI/ARDS。
移植外源性人脐带间充质干细胞(UC-MSCs),移植外源性间充质干细胞进入体内48h后大量凋亡。凋亡的间充质干细胞能够分泌凋亡小体(apoptotic body,AB),AB是直径范围为1~5μm的一种胞外囊泡,含有mRNA、miRNA、DNA、脂类和蛋白质。AB可以被巨噬细胞、树突状细胞、表皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞吞噬并最终被溶酶体消化降解。AB可参与机体免疫调节、血管新生、细胞增殖及凋亡等环节,从而发挥组织修复作用。与间充质干细胞相比,凋亡小体性质更稳定,保存运输方便、没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成风险。因此,本发明为急性肺损伤患者提供了有效的生物治疗手段。
本发明公开了凋亡小体用于制备治疗急性肺损伤药物的应用,即人脐带间充质干细胞(umbi lical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)来源的凋亡小体(apoptoticbody,AB),该凋亡小体由体外培养的UC-MSCs加星孢菌素(STS)诱导凋亡,收集上清,800g离心10min,16,000g离心30min分离得到。同时本发明对该凋亡小体的使用方法进行了详细说明,为临床开展急性肺损伤的治疗奠定坚实的基础。
AB在小鼠急性肺损伤模型造模完成后,经气管滴注进行治疗。在造模后24h对小鼠进行AB气管滴注,AB剂量为10μg/20g。AB治疗24h后收集肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid,BALF),利用ELISA检测BALF蛋白及炎性因子IL-6和TNF-α的表达。取肺组织进行HE染色,同时分离肺泡巨噬细胞,流式检测治疗后促炎型M1型及抑炎型M2型巨噬细胞表面marker的表达。进而有望用于治疗人急性肺损伤。
以下实验中出现的%浓度指的是体积浓度(v/v)。
实施例1 UC-MSCs凋亡诱导及AB提取、鉴定
正常培养UC-MSCs,汇合度大于80%后加10μg/mL STS诱导12~16h,收集培养液上清,800g离心10min,去除细胞碎片,取上清,16,000g离心30min,所得沉淀即为AB,用PBS重悬,-80℃冻存备用。
取部分AB用2.5%(v/v)戊二醛固定后,滴加到盖玻片上,干燥,喷金,扫描电镜观察,如图1所示所得AB具有完整的膜结构,直径约1μm。粒径分析结果显示所得AB粒径分布在600nm~1200nm之间,如图2所示。
如图3所示,所得AB表达Annexin-V。表明所得AB表达凋亡小体特异性表面标记。
将所得AB加蛋白裂解液,以UC-MSCs为对照,进行western blot检测,结果显示AB表达cleaved-caspase3,表明所得AB为凋亡小体,如图4所示。
实施例2小鼠急性肺损伤模型的建立
选择7~8周龄的雄性C57小鼠,麻醉后如图5所示,用22GY型静脉留置针口咽滴注经气管注入20μg LPS诱导小鼠急性肺损伤模型。
AIL模型造好后,将小鼠随机分成三组,分别为PBS组,UC-MSCs治疗组及AB治疗组。同时以正常小鼠作为对照。其中UC-MSCs治疗组经气管滴注1×106细胞,AB治疗组小鼠经气管滴注10μg/20g AB。24h后,检测治疗效果。
实施例3小鼠急性肺损伤治疗效果的检测
对治疗后的小鼠进行取材,将肺组织石蜡包埋,切片,HE染色发现,UC-MSCs和AB都对肺组织损伤程度有所缓解;如图6所示。
收集肺泡灌洗液,利用ELISA检测BALF蛋白及炎性因子IL-6和TNF-α的表达,结果表明UC-MSCs和AB都能降低炎性因子表达,但AB效果更显著。如图7所示。
将绿色荧光标记的AB滴注到小鼠肺组织后,分离肺组织,冰冻切片后,通过对肺组织进行免疫荧光染色,其中DAPI(蓝色)标记细胞核,F4/80(红色)标记巨噬细胞,Ly6G(红色)标记中性粒细胞。如图8所示,滴注进去的AB(绿色荧光)与F4/80标记的巨噬细胞(红色荧光)重合(黄色荧光),而与Ly6G标记的中性粒细胞(红色荧光)不重合,表明滴注进去的AB被肺泡巨噬细胞吞噬,进而调控巨噬细胞功能发挥治疗作用。
分离肺泡巨噬细胞,流式检测促炎型巨噬细胞表面标记CD64和CD80的表达,同时检测抑炎型巨噬细胞表面标记CD206的表达。结果发现AB治疗后,与LPS模型组相比,CD64和CD80的表达显著降低,CD206的表达显著升高,如图9所示。结果表明AB抑制促炎性巨噬细胞,促进抑炎型巨噬细胞的极化。
将分离的肺泡巨噬细胞加TRIZOL裂解后,提取RNA,qRT-PCR检测促炎型和抑炎型巨噬细胞标记基因的表达。结果表明AB治疗后,巨噬细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α及NOS2表达降低,抑炎因子ARG1和MCR1表达升高,如图10所示。结果表明AB抑制促炎性巨噬细胞,促进抑炎型巨噬细胞的极化。
以上结果表明AB进入肺组织后,被肺泡巨噬细胞吞噬,通过抑制促炎性巨噬细胞,促进抑炎型巨噬细胞的极化达到治疗急性肺损伤的目的。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (1)
1.凋亡小体用于制备治疗人或小鼠急性肺损伤药物的应用;
所述的凋亡小体由凋亡的脐带间充质干细胞分泌得到,脐带间充质干细胞为外源性的人脐带间充质干细胞;所述的凋亡小体为600~1200nm直径的胞外囊泡;
所述的凋亡小体由体外培养的UC-MSCs加星孢菌素诱导凋亡,上清液依次经:800g离心10min和16,000g离心30min分离得到;
所述的凋亡小体的施药方式为气管滴注;滴注剂量为10μg/20g。
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