CN113101303B - 自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途，属于医药领域。一方面，本发明提供了自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：取间充质干细胞进行培养，收集培养基中漂浮的细胞于另一培养皿中，放置后仍未贴壁的细胞即为自发性凋亡的间充质干细胞。另一方面，本发明提供了自发性凋亡的间充质干细胞在制备修复组织损伤的药物中的用途。本发明通过建立肝损伤、肺损伤和脊髓损伤模型，注射MSCs和DMSCs对损伤小鼠进行治疗，结果显示DMSCs具有与MSCs类似的减轻组织损伤促进组织修复的作用，为受损组织修复提供了一种新的细胞治疗策略。

Description

自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法及用途，属于医药领域。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是从骨髓、脂肪组织、脐带等组织分离出来的一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。在特定条件下，MSCs可分化成神经细胞、上皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肝细胞等。此外，MSCs具有易于分离、扩增和纯化，免疫原性低、不易引起移植后的排斥反应等特性。这些优良特性使MSCs成为再生医学、受损组织修复等细胞治疗策略的候选细胞。目前，MSCs已被运用于心肌梗死、肝功能衰竭、肺损伤、中风、造血功能障碍等多种疾病的治疗，研究表明MSCs对上述疾病均有较好的治疗作用。

然而，针对无活力的间充质干细胞，尤其是自发性凋亡的间充质干细胞在疾病治疗中的作用，迄今还鲜有文献报道。Gupta等用H₂O₂诱导产生凋亡MSCs，但注射后对LPS诱导的肺损伤并没有展现出改善作用(参见：Gupta N,Su X,Popov B,et al.Intrapulmonarydelivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival andattenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice[J].J Immunol,2007,179(3)：1855-63)。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的之一在于提供自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法。本发明的另一目的在于提供自发性凋亡的间充质干细胞在制备修复组织损伤的药物中的用途。

本发明提供了自发性凋亡的间充质干细胞在制备修复组织损伤的药物中的用途。

进一步地，所述的间充质干细胞为骨髓、脂肪和/或脐静脉来源的间充质干细胞。

进一步地，所述的药物是以自发性凋亡的间充质干细胞为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的制剂。

进一步地，所述的制剂为注射制剂。

优选地，所述的制剂为静脉注射制剂。

进一步地，所述的药物是修复肝损伤、肺损伤、脊髓损伤的药物。

本发明提供了自发性凋亡的间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：取间充质干细胞进行培养，收集培养基中漂浮的细胞于另一培养皿中，放置后仍未贴壁的细胞即为自发性凋亡的间充质干细胞。

进一步地，间充质干细胞培养至4～6代时，收集培养基中漂浮的细胞；放置时间为12～24h。

进一步地，所述培养基为DMEM培养基。

优选地，所述培养基由如下方法得到：取DMEM低糖培养基，加入胎牛血清以及青霉素和链霉素，胎牛血清的终浓度为8～12％w/w，青霉素的终浓度为80～120U/ml，链霉素的终浓度为80～120μg/mL，混匀。

进一步优选地，所述DMEM低糖培养基的葡萄糖浓度为0.8～1.2g/L。

进一步地，所述的间充质干细胞为骨髓、脂肪和/或脐静脉来源的间充质干细胞。

本发明首先明确了MSCs培养过程中自发死亡的细胞为凋亡细胞；随后，通过建立肝损伤、肺损伤和脊髓损伤模型，注射MSCs和DMSCs对损伤小鼠进行治疗，结果显示DMSCs具有与MSCs类似的减轻组织损伤促进组织修复的作用，为受损组织修复提供了一种新的细胞治疗策略。

附图说明

图1为实施例1中间充质干细胞形态图；

图2为实施例1中流式细胞术检测MSCs表面标志结果图；

图3为实施例1中MSCs的活力鉴定结果图；

图4为实施例1中MSCs的死亡方式鉴定结果图；

图5为实施例2中MSCs和DMSCs减轻肝损伤结果图；

图6为实施例2中小鼠血清AST、ALT水平的检测结果图；

图7为实施例2中肝脏组织的TUNEL染色及计数结果图；

图8为实施例2中各组小鼠血清中细胞因子水平检测结果图；

图9为实施例2中MSCs和DMSCs提高小鼠存活率结果图；

图10为实施例3中MSCs和DMSCs保护肺损伤结果图；

图11为实施例4中MSCs和DMSCs促进脊髓损伤小鼠下肢运动恢复结果图；

图12为实施例5中尾静脉注射的GFP-MSCs于体内发生凋亡结果图。

具体实施方式

本发明提供了自发性凋亡的间充质干细胞在制备修复组织损伤的药物中的用途。

现有技术虽然已经对间充质干细胞在再生医学、受损组织修复等细胞治疗策略方面进行了广泛研究，但迄今为止，对于无活力的间充质干细胞，尤其是自发性凋亡的间充质干细胞在疾病治疗中的作用，还鲜有文献报道。Gupta等用H₂O₂诱导产生凋亡MSCs，但注射后对LPS诱导的肺损伤并没有展现出改善作用。本发明也发现注射经H₂O₂诱导的凋亡MSCs并无保护作用，这一现象与Gupta等人的实验结果一致，即化学诱导产生的凋亡MSCs不能改善组织损伤。这可能是由于化学诱导产生的凋亡MSCs具有较高氧化应激水平。但另一方面，本发明通过动物实验证明，注射自发性凋亡的间充质干细胞对ConA诱导的肝损伤、LPS诱导的肺损伤和脊髓损伤等组织损伤均能够发挥明显的保护作用。这些结果表明自发凋亡的MSCs而非诱导死亡的MSCs才具有免疫调节作用。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。以下实施例中主要试剂的配制方法如下：

PBS缓冲液

称取8.5g NaCl、0.52g NaH₂PO₄、7.06g Na₂HPO₄·12H₂O，用ddH₂O定容至1L，0.22μm滤器过滤后，存储于室温备用。

红细胞裂解液

称取2.6g Tris碱、7.84g氯化铵，加入ddH₂O充分溶解。随后加入适量盐酸将pH值调整到7.4左右，并用ddH₂O定容至1L。需要使用无菌红细胞裂解液时用0.22μm滤器过滤使用。

4％多聚甲醛固定液

先配置1L PBS溶液，随后称量40g多聚甲醛粉末加入PBS溶液中，待其溶解后，用NaOH将溶液pH值调整到7.2～7.4，室温存储备用。

PI细胞染液

称量5mg PI、2mg RNase和100mg枸橼酸钠于烧杯中，加入6.5mL生理盐水和0.25mL1％Triton-X-10，随后加入ddH₂O定容至100mL。将pH值调整到7.2～7.6，于棕色瓶中4℃避光保存。

DMEM完全培养基

取1瓶DMEM低糖培养基(葡萄糖浓度为1g/L)，加入50mL胎牛血清(Fatal bovineserum，FBS)、5mL 100×青霉素-链霉素母液，FBS的终浓度为10％(w/w)，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100μg/mL，混匀后4℃保存。

实施例1自发性凋亡的间充质干细胞的制备

一、实验方法

1、MSCs的分离、培养

(1)取2～3周C57BL/6雌鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，随后将小鼠放置于75％酒精溶液中浸泡消毒3～5min。

(2)将小鼠放入10cm无菌培养皿中，用剪刀剪开脚掌至腹股沟区域的皮肤，剥离肌肉，切断后肢与躯干的连接，取出胫骨；随后用镊子夹住股骨，用无菌剪刀剪下股骨。将股骨和胫骨置于PBS溶液中，去掉骨头关节及附着的肌肉。

(3)使用20mL注射器吸取DMEM培养基，随后将1mL的注射器的针头连接到20mL注射器上，插入骨腔中，小心的将股骨和胫骨中的细胞全部冲洗出来，直至骨头变得白色半透明状态。收集冲洗出来的细胞，1500rpm离心5min后用红细胞裂解液裂解红细胞，3min后加入无菌PBS终止。1500rpm离心5min后用PBS洗涤一遍，DMEM完全培养基重悬细胞，置于5％CO₂培养箱中37℃培养。

(4)用镊子小心夹住胫骨和股骨，用无菌手术剪刀股骨和胫骨剪成约1～3mm³的骨头小片。将骨头片放入15mL离心管中，加入5mL含1mg/mL胶原酶II和10％FBS的DMEM，37℃摇床消化1～2h，震荡速度为200rpm。

(5)当骨碎屑松散的附着在一起时停止胶原酶的消化，去掉液体后用DMEM清洗骨片。将骨片放入10cm细胞培养皿中，加入10mL DMEM完全培养基。放置于5％CO₂培养箱中培养，培养期间尽量不要挪动细胞培养皿。3天后小心去除未贴壁的细胞和碎片，加入新鲜培养基。

(6)培养3～5天后，当细胞密度为70％～80％时，对细胞进行传代。小心去除培养基，使用无菌PBS冲洗2遍，加入2mL 0.025％胰蛋白酶(含EDTA)，放于培养箱中消化1～2min。

(7)待细胞变圆，并有部分细胞漂浮时加入DMEM完全培养基终止消化，将贴壁细胞从培养皿中轻轻吹下来，1000rpm离心5min。

(8)离心完毕后弃上清，加入适量DMEM完全培养基悬浮细胞沉淀，按照1∶2或1∶3的比例加入到新的培养皿中，继续培养。每周传代2次。本实验所用骨髓来源的MSCs均为4～6代细胞。

2、MSCs的鉴定

对MSCs表面标志CD44，CD29，CD105，Sca-1，CD31，CD34，CD45，CD86，和CD11b进行流式鉴定，具体步骤如下：

(1)将培养的4～6代的MSCs去除培养基，PBS洗涤2次。

(2)加入2mL 0.025％胰蛋白酶(含EDTA)消化并收集细胞。

(3)1000rpm离心5min。

(4)用PBS洗涤沉淀，并将细胞调整至1×10⁶/mL浓度。

(5)取100μL 1×10⁶/mL浓度的MSCs于流式管中，分别加入流式抗体及相应的同型对照，4℃避光染色30min。

(6)染色完成后，每管加入2mL PBS洗去多余的抗体，并1500rpm离心3min。(7)以500μL PBS重悬洗涤后的细胞沉淀，使用ACEA NovoCyte Flow Cytometer进行流式分析，检测表面标志表达情况。MSCs的表面标志物为：CD29，CD44，CD105，Sca-1阳性表达且CD31，CD34，CD45，CD86，CD11b阴性表达。

3、DMSCs的收集和鉴定

MSCs培养至4～6代时，收集培养基中漂浮的细胞于新的培养皿中，过夜放置后仍未贴壁的细胞即为自发死亡的MSCs(DMSCs)。1800rpm离心5min后PBS洗涤两遍，调整DMSCs的浓度为1×10⁶/mL。取100μL进行细胞凋亡检测(详细方法见下)。另取100μL于流式管中，加入0.1μL细胞死活染料LIVE/DEAD^TM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit，室温染色30min后，流式细胞仪检测。再取部分MSCs和DMSCs利用细胞甩片的方法将细胞附着于粘附载玻片上，进行Cleaved caspase 3和Cathepsin B荧光染色。

4、流式细胞术检测细胞凋亡

(1)收集4～6代培养的MSCs及DMSCs。

(2)取1×10⁵个MSCs或DMSCs于流式管中，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染料，室温避光染色20min。

(3)加入2mL PBS洗涤细胞，随后DMSCs在1800rpm离心5min，MSCs在1200rpm离心5min，去掉上清。

(4)以500μL PBS重悬细胞沉淀，使用ACEA NovoCyte Flow Cytometer进行流式分析，检测细胞凋亡情况。

5、台盼蓝染色

收集细胞，将细胞悬液和0.4％台盼蓝溶液按照9：1的比例混合，室温染色3min后，立即将细胞置于载玻片上使用盖玻片压片后于显微镜下观察并拍照。死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色。

二、实验结果

1、MSCs的形态学观察

小鼠骨髓来源间充质干细胞在24～48h可见部分细胞贴壁生长，贴壁细胞呈圆球形，未长出典型的干细胞形态。培养至3～5天时，细胞开始呈梭形、三角形或纺锤形等。细胞折光性好，呈放射状或涡旋状生长。至P3代时，细胞形态均一，呈梭形或成纤维细胞样。见图1：光学显微镜观察第3天(左)和第7天(右)的MSCs形态，MSCs呈梭形、纺锤形，折光性较强，标尺表示100μm。

2、MSCs的表面标志鉴定

通过流式细胞术检测培养至第4到第6代MSCs的表面标志，结果如图2所示，MSCs表面抗原CD45、CD11b、CD31和CD86呈阴性，表达率分别为1.12％、0.42％、2.51％、1.47％。CD29、CD44、Sca-1呈阳性，表达率分别为99.65％、99.54％、98.38％。这些表面标志的表达与前人报道的一致。

3、MSCs的活力鉴定

由图3A MSC组可见，有活力的MSCs贴壁，细胞伸展呈梭形或纺锤形。收集4～6代MSCs培养过程中自发死亡漂浮于培养基中的细胞，如图3ADMSC组所示，自发死亡的MSCs漂浮在培养基中，圆形，折光性强。将贴壁的MSCs和漂浮的MSCs分别进行台盼蓝染色。台盼蓝不能穿过活细胞膜，使活细胞呈无色，但它可穿过死细胞的细胞膜，使死细胞着色成蓝色。结果发现收集的贴壁的MSCs呈无色，自发死亡漂浮于培养基的MSCs被台盼蓝染为蓝色(图3B)。同时，用细胞死活染料LIVE/DEAD^TM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit染色发现常规培养的MSC中约有5％的死细胞，漂浮的MSCs中99.8％为死细胞(图3C)。以上结果表明漂浮的MSCs为自发死亡的MSCs，本申请中以Dead MSCs(DMSCs)表示自发死亡的MSCs。

为明确DMSCs的死亡方式为凋亡或是坏死，本实验对MSCs和DMSCs进行Annexin V和PI染色后于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。如图4A所示，常规培养的MSCs含约5％的凋亡细胞，DMSCs中约97％为凋亡细胞。将收集的MSCs和DMSCs进行PI染色，与流式结果一致的是，MSCs中仅少数细胞有红色荧光，而DMSCs中多数细胞有红色荧光(图4B)。为进一步验证DMSCs的死亡方式为凋亡而不是坏死，使用免疫荧光染色方法检测了MSCs和DMSCs中Cleaved caspase 3和Cathepsin B的表达水平。Cleaved caspase 3是细胞凋亡的标志，细胞质Cathepsin B的扩散被认为是溶酶体膜完整性丧失的坏死标志。如图4C和图4D显示，MSCs中无Cleaved caspase 3表达，而DMSCs中有Cleaved caspase 3表达。同时，MSCs和DMSCs中Cathepsin B均呈点状颗粒存在，分布较为均匀，未发生弥散，表明DMSCs中溶酶体膜未破裂。以上结果表明DMSCs是通过细胞凋亡的方式死亡。

实施例2自发性凋亡的间充质干细胞对肝损伤的修复作用

通过上述结果发现，常规培养的MSCs中含有部分死细胞，约占5％。为了明确MSCs中这群死细胞的作用，本实验在注射MSCs前检测了其中所含DMSCs的细胞数，并设置单独注射与之等量DMSCs的组别。具体操作及C57小鼠的分组如下：

无菌条件下称取10mg ConA，加入5mL灭菌注射生理盐水，于无菌超净台中配制成2mg/mL的ConA溶液，现配现用。按照12mg/kg的剂量，尾静脉注射ConA建立肝损伤模型，随后尾静脉分别注射PBS、MSCs和DMSCs。12h后取各组小鼠眼球血，颈椎脱臼处死小鼠后取肝脏进行拍照和病理检测。小鼠分组如下：

(1)Con组：未经任何处理的正常组

(2)PBS组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL PBS

(3)MSC组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL MSCs(共1×10⁶MSCs，其中含5×10⁴DMSCs)

(4)DMSC 5×10⁴组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL DMSCs(共5×10⁴DMSCs)

(5)DMSC 1×10⁵组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL DMSCs(共1×10⁵DMSCs)

(6)DMSC 2.5×10⁵组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL DMSCs(共2.5×10⁵DMSCs)

(7)DMSC 5×10⁵组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL DMSCs(共5×10⁵DMSCs)

(8)DMSC 1×10⁶组：尾静脉注射12mg/kg ConA后尾静脉注射100μL DMSCs(共1×10⁶DMSCs)

结果如图5A所示，Con组肝脏呈红棕色，表面光滑柔软。PBS组小鼠肝脏呈暗红色，可观察到出血灶。注射MSCs(含有5×10⁴DMSCs)后改善了肝脏外观，肝脏表面无出血灶。而注射与MSCs中等量的DMSCs-即单纯注射DMSCs和注射MSCs的效果相似。组织病理学检测也印证了这一现象，Con组肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状排列于中心静脉周围，肝细胞胞浆呈均匀的红色；PBS组肝小叶结构紊乱，部分肝实质坏死，细胞核固缩，大量炎性细胞浸润，提示模型构建成功。而MSC组肝小叶结构较为完整，单纯注射5×10⁴DMSCs或注射1×10⁵～1×10⁶DMSCs也可保护肝脏的组织结构。对肝脏H&E染色的切片进行坏死面积统计分析发现，与PBS组相比，MSC组和5个DMSC组的肝脏坏死面积显著减少(图5B，图5C，***P<0.001，与PBS组相比)。

取各组小鼠眼球血，分离血清进行肝功水平测定。如图6所示(***P<0.001，****P<0.0001，与PBS组相比)，PBS组AST、ALT水平较Con组明显升高。与PBS组相比，尾静脉注射MSCs后AST、ALT显著下降。与注射MSCs效果相似的是，单纯注射5×10⁴DMSCs或注射1×10⁵～1×10⁶DMSCs也能降低AST、ALT水平，差异具有统计学意义。

为了进一步明确DMSCs可减轻ConA诱导的肝损伤，本实验检测了肝脏组织中的细胞凋亡。与形态、病理和肝功结果一致的是，TUNEL实验结果发现Con组小鼠肝组织仅有极少细胞发生凋亡更替，PBS组可观察到明显的细胞凋亡。与PBS组相比，注射MSCs或不同细胞数的DMSCs后凋亡肝脏细胞的数量减少(图7，***P<0.001，****P<0.0001，与PBS组相比)。

此外，检测各组小鼠血清中细胞因子水平，结果显示，与Con组相比，PBS组血清中促炎因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平显著升高。注射MSCs和DMSCs后，血清中促炎因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平回落，与PBS组的差异具有统计学意义。同时，与PBS组相比，注射MSCs和DMSCs后，肝脏组织中IL-10和HGF的水平升高(图8，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与PBS组相比)，提示DMSCs可降低肝脏炎症水平，促进肝损伤的修复。

随后在生存实验中，小鼠尾静脉注射25mg/kg ConA后分别注射PBS，1×10⁶MSCs(其中含5×10⁴DMSCs)，5×10⁴DMSCs，观察小鼠的存活。如图9所示(**P<0.01，与PBS组相比)，PBS组小鼠从4h开始死亡，于24h内全部死亡。MSC和DMSC组小鼠从6h开始死亡，两组最终存活率分别为70％和50％，表明MSCs和DMSCs可显著提高ConA损伤下的小鼠存活率。

以上结果显示，ConA可诱导急性肝损伤，破坏肝脏组织结构，增加血清AST、ALT和促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平，高剂量ConA可诱导小鼠死亡。尾静脉注射1×10⁶MSCs(含有5×10⁴DMSCs)可显著改善肝脏的组织结构，恢复肝功，降低血清促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平，增加对肝脏组织起保护作用的IL-10和HGF水平，促进小鼠存活。更重要的是，注射5×10⁴DMSCs和注射MSCs对肝脏的保护效果类似，即注射5×10⁴DMSCs改善了肝脏外观，维持了肝脏的病理组织学结构，下调血清中促炎细胞因子水平，增加肝脏组织中IL-10和HGF水平，提高小鼠存活率。综上所述，与MSCs相似，DMSCs也可减轻ConA诱导的肝损伤，促进小鼠存活。

实施例3自发性凋亡的间充质干细胞对肺损伤的修复作用

本实验构建了LPS诱导的肺损伤模型，然后进行尾静脉注射PBS，1×10⁶MSCs(其中含5×10⁴DMSCs)，5×10⁴DMSCs，观察小鼠全肺形态及肺部病理特征。具体操作如下：

无菌条件下称取20mg LPS，加入5mL灭菌注射生理盐水，配制成浓度为4mg/mL的无菌LPS母液，-20℃分装保存。使用时，用灭菌注射生理盐水将LPS母液稀释成2mg/mL。使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，随后切开气管附近皮肤暴露气管，使用弯针按5mg/kg滴注LPS溶液建立LPS诱导的肺损伤模型，即每只小鼠滴注50μL 2mg/mL LPS溶液。随后尾静脉注射MSCs、DMSCs。72h后取小鼠眼球，取肺组织进行病理检测。小鼠分组如下：

(1)NS组：小鼠气管滴注50μL无菌生理盐水溶液

(2)PBS组：小鼠气管滴注50μL 2mg/mL LPS溶液后尾静脉注射100μL无菌PBS

(3)MSC组：小鼠气管滴注50μL 2mg/mL LPS溶液后尾静脉注射100μL MSCs(共1×10⁶MSCs，其中含5×10⁴DMSCs)

(4)DMSC组：小鼠气管滴注50μL 2mg/mL LPS溶液后尾静脉注射100μLDMSCs(共5×10⁴DMSCs)

小鼠肺部病理评分标准如下：

表1小鼠肺部病理评分表

如图10A所示，与仅气管滴注生理盐水的NS组相比，气管滴注LPS后，尾静脉注射PBS的小鼠肺部出现水肿变大，肺表面肉眼可见明显出血灶，经MSCs和DMSCs治疗的小鼠肺部外观较为正常，无明显出血灶。将各组肺组织进行病理分析发现，NS组小鼠肺部结构正常，肺泡清晰可见，无明显炎性细胞浸润。PBS组小鼠肺泡间隔增厚，部分肺泡结构消失，肺部结构破坏，可见大量炎性细胞浸润。MSC组和DMSC组小鼠肺组织仅在局部出现肺泡间隔轻微增厚，肺部结构较为完整，可见少量炎性细胞浸润(图10B)。经病理学评分发现与NS组相比，PBS组病理评分显著增加，提示气管滴注LPS造成了严重的肺损伤。与PBS组相比，MSC和DMSC组病理评分下降，差异有统计学意义，提示MSCs和DMSCs改善了LPS诱导的肺损伤(图10C，**P<0.01，***P<0.001，与PBS组相比)。

实施例4自发性凋亡的间充质干细胞对脊髓损伤的修复作用

构建小鼠脊髓损伤模型，具体步骤如下：用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，沿背部中线切开1cm左右的切口，暴露出T9～T11节段椎骨。于体视显微镜下，小心去除T9和T10的水平椎板，避免出血。随后将小鼠放在定位台上，使用脊髓打击器以70kdyn的力撞击脊髓。随后，用伤口夹封闭皮肤，使用可吸收缝合线将背部皮肤缝合并消毒。随后将小鼠随机分为3组，分别尾静脉注射PBS，1×10⁶MSCs(约含5×10⁴DMSCs)或5×10⁴DMSCs。从造模当天起，连续3天给小鼠注射青霉素防止感染。试验期间给小鼠提供软性食物和水。每天进行两次膀胱按压排尿，直至小鼠排尿正常。

小鼠在手术前进行测试环境适应训练，每3天适应一次，共适应3次。术后第0天，对所有动物左右下肢分别进行BMS评分测试，取其平均值为最终BMS评分值。评分≤0.5分的小鼠进入下一实验阶段，评分>0.5分视为造模失败，对造模失败的动物实施安乐死。

实验中按双盲法进行行为学测试，即进行行为学评分的测试人员对所测小鼠的分组不知情，每只小鼠由3个独立的测试者进行评分后取平均值。评分判断标准如下：

表2 BMS主评分系统

如图11所示(**P<0.01，***P<0.001，MSC组与PBS组相比；#P<0.05，##P<0.01，DMSC组与PBS组相比)，在脊髓损伤术后第3天，PBS组、MSC组和DMSC组小鼠的BMS评分无统计学差异，但在第7天和第14天，MSC组和DMSC组小鼠的BMS评分开始高于PBS组。第21和28天时，MSC组和DMSC组小鼠的BMS评分显著高于PBS组，而MSC组和DMSC组之间的差异无统计学意义，提示MSCs和DMSCs均对脊髓损伤后的小鼠下肢运动恢复有促进作用。

综合实施例2～4的实验结果可以看出，DMSCs具有修复组织损伤的作用，其保护效果与MSCs类似，即使将DMSCs的细胞数量降低至MSCs注射液中所含的死细胞数也仍有减轻组织损伤的作用。

实施例5 MSCs在体内凋亡而转变为DMSCs

已知本发明所用DMSCs由MSCs凋亡而产生，那么，注射到小鼠体内的MSCs是否会发生凋亡而转变为DMSCs呢？为此，本实验从GFP小鼠体内分离了GFP标记的MSCs，并尾静脉注射到正常小鼠体内，分别于0.5h、2h、4h、12h和24h取小鼠的肺和肝脏进行冰冻切片，立即进行Cleaved caspase 3免疫荧光染色，检测注射的GFP-MSCs是否在体内凋亡。结果如图12所示(**P<0.01，***P<0.001，与0.5h组相比)，在0.5h时，在肺部和肝脏切片中均可观察到GFP荧光，但无Cleaved caspase 3染色，提示此时MSCs尚未发生凋亡。在2h时可见少量细胞呈GFP和Cleaved caspase 3双染。随着时间的推移，4h时可明显观察到GFP和Cleavedcaspase 3双染，提示尾静脉注射的MSCs在注射4h后出现细胞凋亡。进一步对肺和肝脏组织中的GFP-MSCs进行计数分析发现，在注射MSCs 12h后，肺和肝脏组织中的GFP-MSCs数量显著下降，24h后GFP-MSCs数量进一步减少，提示大部分尾静脉注射的MSCs在12h内死亡。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims (4)

1.自发性凋亡的间充质干细胞在制备修复组织损伤的药物中的用途；所述的药物是修复ConA诱导的肝损伤，LPS诱导的肺损伤，用脊髓打击器以70 kdyn 的力撞击脊髓引起的脊髓损伤的药物；所述的间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药物是以自发性凋亡的间充质干细胞为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分，制备而成的制剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征是：所述的制剂为注射制剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征是：所述的制剂为静脉注射制剂。

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