KR101834800B1

KR101834800B1 - 심장 조직-유래 세포

Info

Publication number: KR101834800B1
Application number: KR1020127003225A
Authority: KR
Inventors: 샤오쩐 왕; 이안 알. 해리스; 제프리 에스. 케네디; 징 양; 수산 문가
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2018-03-06
Also published as: MX2012000493A; AU2010271394A1; JP5894071B2; ZA201200949B; CN102712897A; AR077309A1; EP2451941B1; PL2451941T3; CN102712897B; MX338100B; AU2010271394B9; RU2642282C1; KR20120041212A; US20160346331A1; EP2451941A4; RU2012104553A; JP2012532609A; AU2010271394B2; EP2451941A1; CA2767825A1

Abstract

본 발명은 인간 심장 조직-유래 세포를 사용하여 손상된 심근을 회복시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 텔로머라아제를 발현하지 않는 확장된 인간 심장 조직-유래 세포를 사용하여 손상된 심근을 회복시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

심장 조직-유래 세포{CARDIAC TISSUE-DERIVED CELLS}

본 발명은 2009년 7월 9일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/224,446호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 인간 심장 조직-유래 세포(human cardiac tissue-derived cell; hCTC)를 사용하여 손상된 심근을 회복시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 텔로머라아제(telomerase)를 발현하지 않는 확장된 인간 심장 조직-유래 세포를 사용하여 손상된 심근을 회복시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

급성 심근 경색(acute myocardial infarction; AMI)은 미국에서 주요 사망 원인이다. AMI는 심장 영역으로의 혈액 유동의 갑작스런 그리고 지속된 결여에 의해 야기되며, 이는 일반적으로 관상 동맥의 협착에 의해 야기된다. 적당한 혈액 공급 없이는 상기 조직은 허혈성으로 되며, 이는 근세포 및 혈관 구조의 사멸에 이르게 된다. 이러한 괴사 조직 영역은 경색 부위로 칭해지며, 이는 결국 반흔 조직으로 될 것이다. 남아있는 심근세포는 괴사 조직을 재건할 수 없으며, 심장은 시간이 지남에 따라 악화된다. 상기 악화는 손상된 심근의 리모델링과 관련된 심장 근육의 기능 손실의 형태일 수 있다.

급성 심근 경색에 대한 몇몇의 현재의 치료법은 응고된 혈관을 열어 경색 부위로의 혈액 공급을 복원하기 위하여 혈전 용해 또는 대안적으로 혈관 성형술에 초점을 맞추고 있다. 이들 치료는 효과적으로 경색 부위 크기를 감소시켜 심장 수축 기능을 개선시킬 수 있지만, 손상된 심근의 리모델링과 관련된 심장 근육의 기능 손실을 역전시키지 못한다. 예를 들어 안지오텐신 전환 효소 저해제(angiotensin converting enzyme inhibitor; ACEI) 및 베타-차단제와 같은 기타 치료법은 포괄적 기능 및 생존성을 또한 개선시킨다. 그러나, 이들 약물치료로부터의 치료 효과는 AMI-후 환자에 있어서 생존률을 5% 미만만큼 개선시킬 수 있을 뿐이다.

세포 이식이 급성 심근 경색을 위한 다른 잠재적인 치료법일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Orlic et al., Nature 410: 701 - 705 (2001)]에는 손상된 심근 내로 Lin^- c-kit⁺ 골수 세포를 주사하는 것이 보고되어 있다. 올릭(Orlic) 등은 "우리의 연구는 국소적으로 전달된 골수 세포가 드노보식으로(de novo) 심근을 생성하여 관상 동맥 질환의 결과를 개선시킬 수 있음을 나타낸다"라고 기술하고 있다.

다른 예에서, 문헌[Nygren et al., Nature Medicine 10: 494 - 501 (2004)]에는 "우리는 분획화되지 않은 골수 세포 및 정제된 조혈 줄기 세포 및 전구 세포 집단이 경색된 심근 내에 효율적으로 생착됨을 보여주고 있다. 그러나 생착은 일시적이었으며, 사실상 조혈성 생착이었다. 이와는 대조적으로, 골수-유래 심근세포는 경색된 심근 외부에서 낮은 빈도로 관찰되었으며, 이는 배타적으로 세포 융합을 통하여 유래되었다."라고 기술되어 있다.

그러나, 골수-유래 세포가 AMI를 치료하는 기작은 불명확하다. 예를 들어, 문헌[Murry et al., Nature 428: 664 - 668 (2004)]에는 "우리는 심근세포-제한된 그리고 편재적으로 발현된 리포터 트랜스진(reporter transgene) 둘 모두를 조혈 줄기 세포를 정상 및 상해를 입은 성체 생쥐 심장 내로 145개 이식한 후 그의 운명을 추적하기 위하여 사용하였다. 세포 운명을 뒤쫓기 위하여 이들 유전자 기술을 사용할 때 심근세포로의 트랜스분화(transdifferentiation)는 탐지가능하지 않았으며, 줄기 세포-생착된 심장은 샴(sham)-생착된 심장과 비교하여 심근세포의 명시적인 증가를 보여주지 못하였다. 이들 결과는 조혈 줄기 세포가 심장 표현형을 쉽게 획득하지 못하며, 경색 회복의 임상 연구에 있어서 경고성 주의를 제기한다. "라고 기술되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Werner et al., Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 5: 78-79 (2008)]에는 "그러나, 가장 효과적인 전구 세포 하위집단, 전구 세포 증대를 위한 최상의 기술, 근본적인 작용 기작, 및 당해 방법의 장기간 안전성 및 유효성과 관련하여 여전히 대답되어야 할 많은 질문이 있다. 게다가, AMI에 걸린 환자에 있어서 [골수 세포] 치료제의 몇몇 실험은 부정적인 결과를 생성하였으며, 이는 아마도 AMI 후 [골수 세포] 투여의 타이밍, 사용되는 전구 세포 제조 방법의 차이, 또는 이들 둘 모두 때문일 것이다."라고 기술되어 있다

다른 예에서, 문헌[Balsam et al., Nature 428: 668 - 673 (2004)]에는 "우리의 데이터는 심지어 상해를 입은 심장의 미세환경에서도 c-kit-풍부 BM 세포, Lin^- c-kit⁺ BM 세포 및 c-kit⁺ Thy1.1^lo Lin- Sca-1⁺ 장기간 재구성 조혈 줄기 세포가 단지 전통적인 조혈적 운명을 채용함을 시사한다."라고 기술되어 있다.

다른 가능한 세포 공급원으로는 배아 줄기 세포가 있다. 예를 들어, 골드(Gold) 등 (국제특허 공개 WO2005090558호)은 재생 의학에서 사용하기 위하여 배아 줄기 세포로부터 심근세포 계통 세포를 생성하는 방법을 개시한다.

다른 예에서, 골드 및 하사니포어(Hassanipour) (국제특허 공개 WO2007002136호)는 영장류 만능 줄기 세포를 심근세포-계통 세포로 분화시키는 방법을 개시한다.

다른 가능한 세포 공급원으로는 심장 전구 세포가 있다. 심장 전구 세포는 인간 및 쥐 심장에서 확인되었다. 심장 전구 세포는 자기-재생성이고 다능성이어서 모든 심장 계통이 생기게 한다.

예를 들어, 미국 특허 공개 제20040126879A1호에는 CD31⁺, CD38⁺ 및 c-kit^-인 심장 줄기 세포를 이용하여 손상된 심근을 치료하는 것이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Oh et al., PNAS 100: 12313 - 12318 (2003)]에는 성체 심장-유래 심장 전구 세포의 존재가 개시되어 있는데, 이는 Sca-1, CD31 및 CD38을 발현하고, CD4, CD8, B220, Gr-1, Mac-1, TER119, c-kit, Flk-1, e-카드헤린(Cadherin), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), CD45 및 CD34의 발현은 결여되어 있다.

다른 예에서, 미국 특허 공개 제20080241111A1호에는 (i) 포유류 유래의 심장 조직 단편을 효소로 처리하여 세포 현탁물을 제조하는 단계; (ii) 밀도 구배법에 의해 상기 세포 현탁물로부터 심장 조직-유래 세포 군을 분리하는 단계; 및 (iii) 얻어진 심장 조직-유래 세포 군을 섬유아세포 성장 인자 및 상피 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 현탁 배양하고 이어서 부유 구체를 형성하는 세포를 선발 및 분리하는 단계를 통하여 제조되는 포유류 심장 조직-유래 세포의 제조 방법이 개시되어 있다.

다른 예에서, 미국 특허 공개 제20080213231A1호에는 인간 또는 생쥐 골격근 조직으로부터 유래된 만능 줄기 세포로 구성된 만능 줄기 세포 군이 개시되어 있으며, 만능 줄기 세포는 c-met-음성, Pax-7-음성, Myf-5-음성, MyoD-음성, 마이오게닌(Myogenin)-음성, M-카드헤린-음성, CD105-양성, CD90-양성, c-kit-음성 및 CD45-음성이고, 만능 줄기 세포는 인간-유래 줄기 세포의 경우 CD34-음성이며, 생쥐-유래 줄기 세포의 경우 CD34-양성이고, 만능 줄기 세포 군은 단일 세포의 증식에 의해 얻어진다.

다른 예에서, 문헌[Laugwitz et al., Nature 433: 647 - 653 (2005)]에는 생후 쥐, 생쥐 및 인간의 심근에서의 isl1-1⁺ 심장 전구 세포가 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Messina at al., Circulation Research 95: 911 - 921, (2004)]에는 "생후 인간 심방 또는 심실 생검 시료의 이차 배양물로부터의 그리고 쥐과 심장으로부터의, 자기-부착성 클러스터 (우리는 이를 "심구체(cardiosphere) "로 칭하였음)로서 성장하는 미분화 세포의 단리. 이들 세포는 클론원성(clonogenic)이며, 줄기 및 내피 전구 세포 항원/마커를 발현하며, 성체 심장 줄기 세포의 특성을 갖는 것으로 보인다."라고 개시되어 있다. 메시나(Messina) 등은 "새롭게 발달 중인 인간 및 생쥐 심구체는 내피 (KDR (인간)/flk-1 [생쥐], CD-31) 및 줄기 세포 (CD-34, c-kit, sca-1) 마커의 발현을 나타냈다."라고 기술하고 있다.

다른 예에서, 문헌[Smith et al., Circulation 115(7): 896 - 908 (2007)]에는 "일차 배양에서 성장시킨 경피적 심근내막 생검 시료는 심구체로 공지된 다중세포 클러스터를 발생시켰으며, 이는 도말되어 심구체-유래 세포(cardiosphere-derived cell; CDC)를 생성하였다."라고 기술되어 있다.

다른 예에서, 미국 특허 공개 제20070020758호에는 세포 이식 및 심근 또는 기타 기관의 기능 회복에서 이용되는 인간 또는 동물 조직 생검 샘플로부터의 심장 줄기 세포의 단리, 확장 및 보존 방법이 개시되어 있다.

다른 예에서, 문헌[Beltrami et al., Cell 114(6): 763 - 776 (2003)]에는 "심장 줄기 세포의 특성을 갖는 Lin- c-kitPOS 세포의 존재. 상기 세포는 자기-재생성이며, 클론원성이고, 다능성이어서 근세포, 평활근 및 내피 세포가 생기게 한다."라고 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008054819호에는 마커 isl1⁺/ Nkx 2.5⁺/ flk1⁺에 대하여 양성인 심혈관 줄기 세포 및 내피, 심장 및 평활근 세포 계통으로 분화될 수 있는 심혈관 줄기 세포가 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008109839A1호에는 CXCR4 폴리펩티드 및 FIk-I 폴리펩티드를 포함하는 풍부화된 줄기 세포 집단이 개시되어 있으며, 여기서 상기 줄기 세포는 Mef2C, GATA-4, 마이오카딘(Myocardin) 및 Nkx2.5 폴리펩티드를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008081457A2호에는 심장 줄기 세포의 단리 방법이 개시되어 있으며, 이 방법은 심장 줄기 세포를 포함하는 조직을 세포 분화를 유도하기에 충분한 조건 하에 디스파아제(dispase) Il를 포함하는 조성물과 접촉시키고 이로써 심장 줄기 세포를 단리하는 것을 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008058273A2호에는 심방 또는 심실 심장 조직으로부터 포유류 줄기 세포-유사 심근세포-유래 세포(MDC)를 얻는 방법이 개시되어 있으며, 이는 세포를 심방 또는 심실 심장 조직으로부터 단리하여 세포 현탁물을 형성하는 단계, 및 미토겐을 포함하는 배지에서 상기 세포를 배양하고 이로써 MDC를 함유하는 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008054819A2호에는 심혈관 줄기 세포의 단리 방법이 개시되어 있으며, 이 방법은 세포 집단을 Islet1, Nkx2.5 및 flk1에 대하여 반응성인 에이전트(agent)와 접촉시키는 단계 및 반응성 양성 세포를 비-반응성 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 공개 제20070212423A1호에는 근육 기원의 c-kit^-/c-met^- 심근세포 선구 세포의 단리 방법이 개시되어 있으며, 이는 직경이 40 ㎛ 미만인 세포를 근육 세포의 현탁물로부터 분리하는 단계, 고형 기재 상에서 조직 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 상기 배지 중 현탁물 중 세포를 단리하고 이로써 근육 기원의 c-kit^-/c-met^- 심근세포 선구 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 제20050058633호에는 근육 기원의 단리된 포유류 c-kit-/c-met-심근세포 선구 세포가 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2004019767호에는 c-kitneg/CD31+ /CD38+를 가지며 텔로머라아제 역전사효소를 발현하는 단리된 포유류 심근세포 줄기 세포가 개시되어 있다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO 2008083962A1호에는 심근세포 전구 세포(CMPC)가 개시되어 있으며, 이는 그의 세포 표면 상의 Sca-1 또는 Sca-1 유사 에피토프(epitope) 및 CD31을 특징으로 한다.

다른 예에서, 미국 특허 공개 제20080213230A1호에는 줄기 세포 또는 전구 세포가 풍부한 단리된 세포 집단의 제조 방법이 개시되어 있으며, 이는 (a) 조직 샘플을 배양하는 단계; (b) 상기 배양 동안 부착성 섬유아세포 위를 이동하는 세포를 얻는 단계; (c) (b)에서 얻은 하나 이상의 세포를 클로닝하여 하나 이상의 클론원성 집단을 생성하는 단계; (d) 원하는 표현형을 갖는 하나 이상의 클론원성 집단을 확인하는 단계; (e) 줄기 세포 또는 전구 세포의 하나 이상의 세포 표면 또는 내부 마커를 사용한 세포의 분류에 의해 단계 (d)에서 확인한 하나 이상의 클론원성 집단으로부터 줄기 세포 또는 전구 세포를 단리하는 단계; 및 (f) 단리된 줄기 세포 또는 전구 세포를 영양 세포(feeder cell)의 부재 하에 조절 배지에서 배양하고 이로써 줄기 세포 또는 전구 세포가 풍부한 단리된 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다.

그러나, 심장 전구 세포의 사용에 있어서의 한 가지 장애는 상기 세포의 단리 또는 확장에 효율적인 방법의 결여이다. 따라서, 평가할 손상된 심근을 위한 치료법으로서의 유효성을 위하여 심장 전구 세포의 효율적인 단리 및 확장에 대한 필요성이 여전히 남아있다.

본 발명은 인간 심장 조직으로부터 유래된 세포를 단리하고 확장시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 단리 및 확장된 세포는 텔로머라아제를 발현하지 않으며, 손상된 심근의 치료 또는 회복에 유용하다.

본 발명은 텔로머라아제를 발현하지 않는 인간 심장 조직-유래 세포의 정제된 집단을 제공한다.

본 발명은 텔로머라아제를 발현하지 않는 인간 심장 조직-유래 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 이는

a. 심장 조직을 얻는 단계,

b. 심장 조직을 해리시키는 단계,

c. 심장 조직을 소화시켜 세포를 방출시키는 단계,

d. 방출된 세포로부터 심근세포를 제거하는 단계, 및

e. 남아있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 환자에 있어서 손상된 심근을 치료하거나 회복시키는 방법을 제공하며, 이는

a. 텔로머라아제를 발현하지 않는 인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 얻는 단계, 및

b. 인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 손상된 심근을 치료하거나 회복시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 환자 치료에 사용된 인간 심장 조직-유래 세포는 냉동보존되었다.

<도 1>
도 1에는 본 발명의 세포를 단리하는 절차가 약술되어 있다. 세포 집단을 얻는 방법에 대한 상세사항이 실시예 1에 기재되어 있다.
<도 2>
도 2에는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 단리가 약술되어 있다. 세포 초기 집단을 얻는 방법에 대한 상세사항이 실시예 1에 기재되어 있다.
<도 3>
도 3에는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 다른 단리 방법이 약술되어 있다.
<도 4>
도 4에는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포(hCTC)의 형태가 예시되어 있다. 예시된 모든 이미지는 달리 나타내지 않으면 100배 배율의 것이다. 패널 a는 초기 소화물로부터 얻어진 세포를 사전 도말하여 얻은 세포 현탁물을 예시하는 이미지이다. 흑색 화살표는 밝은 위상 비-부착성 S 세포(phase-bright non-adherent S cell)를 예시하며, 패널 b에서 흑색 화살표는 밝은 위상 S 세포 클러스터(cluster)를 예시한다. 백색 화살표는 초기 도말로부터 얻어진 부착성 세포를 예시하며 (예시된 이미지는 200배 배율의 것임), 패널 c는 S 세포 배양물의 재도말에 의해 유도된 A2 세포를 예시하며, 패널 d는 A2 세포 배양물 중의 재도말된 밝은 위상 S 세포를 예시한다.
<도 5>
도 5에는 hCTC 성장 잠재력에 대한 접종 밀도의 영향이 도시되어 있다. x-축은 냉동 바이알로부터의 hCTC (S) 세포와 hCTC (A1) 세포의 혼합물의 도말 후의 배양 일수를 나타낸다. y-축은 hCTC (A3) 세포의 총 집단 누적 배가치를 나타낸다.
<도 6>
도 6에는 hCTC (A3) 세포 성장 잠재력에 대한 감소된 산소 수준의 영향이 도시되어 있다.
<도 7>
도 7에는 쥐 심장 조직-유래 rCTCA2 세포(rCTC (A2))의 성장 잠재력이 도시되어 있다. x-축은 냉동 바이알로부터의 rCTC (S) 세포의 재도말 후의 배양 일수를 나타낸다. y-축은 rCTC (A2) 세포의 총 집단 누적 배가치를 나타낸다.
<도 8>
도 8에는 냉동보존 및 잠재적 투여 장치 (30게이지 니들로 이루어짐)를 이용한 시뮬레이션된 전달 후 hCTC (A3) 세포의 회수성 및 생육가능성이 도시되어 있다. 회수된 생육가능 세포 수가 좌측 y-축에 나타내어져 있다. 세포 생육가능성이 우측 y-축에 나타내어져 있다. 채워진 마름모는 세포 생육가능성을 나타내며, 채워지지 않은(open) 정사각형은 세포 회수성을 나타낸다. 상세사항이 실시예 6에 기재되어 있다.
<도 9>
도 9에는 냉동보존 및 잠재적 투여 장치 (30게이지 니들로 이루어짐)를 이용한 시뮬레이션된 전달 후 rCTC (A2) 세포의 회수성 및 생육가능성이 도시되어 있다. 회수된 생육가능 세포 수가 좌측 y-축에 나타내어져 있다. 세포 생육가능성이 우측 y-축에 나타내어져 있다. 채워진 정사각형은 니들 통과 이전의 세포 회수성을나타내며, 채워진 삼각형은 니들 통과 이전의 세포 생육가능성을 나타내며, 채워지지 않은 정사각형은 니들 통과 후 세포 생육가능성을 나타내며, 채워지지 않은 삼각형은 니들 통과 후 세포 회수성을 나타낸다. 상세사항이 실시예 6에 기재되어 있다.
<도 10>
도 10에는 유세포 분석법에 의해 결정된 hCTC (A3) 세포 표면 마커 발현이 도시되어 있다. 각각의 히스토그램에서, 점선은 아이소타입 항체 대조군이다. 실선은 항원 염색이다. 항원을 패널에 나타냈다. x-축은 로그 스케일의 피코에리트린(phycoerythrin; PE) 강도이다. y-축은 세포 계수치이다.
<도 11>
도 11에는 hCTC (A3) 세포 (상부 패널)와 성인 인간 피부 섬유아세포-NHDF (카탈로그 번호: CC-2511, 론자(Lonza), 하부 패널) 사이의 세포 표면 마커 발현의 비교가 도시되어 있다. 각각의 히스토그램에서, x-축은 로그 스케일의 PE 강도이다. y-축은 세포 계수치이다. 점선은 항체 아이소타입 대조군을 나타낸다. 실선은 항원 염색이다. 양성 집단은 아이소타입 대조군 중 1% 양성 집단을 기준으로 하여 게이팅되었다(gated). 개개의 마커가 각각의 히스토그램에 나타내어져 있다.
<도 12>
도 12에는 유세포 분석법에 의해 결정된 rCTC (A2) 세포 표면 마커 발현이 도시되어 있다. 점선은 아이소타입 대조군을 나타낸다. 실선은 CD31 (좌측 패널), 및 CD90 (우측 패널)에 대한 항원 염색이다.
<도 13>
도 13에는 정량적 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(quantitative real-time polymerase chain reaction; qRT-PCR)에 의해 결정된 hCTC (A3) 세포에서의 심장 특이적 유전자의 유전자 발현이 도시되어 있다. 상세사항이 실시예 8에 기재되어 있다. y-축은 GAPDH의 백분율을 나타내며, 하한 및 상한 스케일로 분할된다. 하한 스케일은 0 내지 0.01%의 범위이며, 상한 스케일은 0.05% 내지 0.15%의 범위이다. 약성어는 하기 의미를 갖는다: MHC는 마이오신 중쇄(myosin heavy chain)를 의미하며, 심장 TF는 전사 인자(transcription factor)를 의미하며; NHDF는 신생아 인간 피부 섬유아세포(Neonatal human dermal fibroblast)를 의미하며; h-심장은 인간 심장을 의미한다. 데이터는 평균 ± S.D (n=3)로 표현된다.
<도 14>
도 14에는 생쥐 심장 조직-유래 (A2) 세포 (mCTC (A2))와 쥐 신생아 심근세포 (카탈로그 번호: R357-6W, 셀 어플리케이션(Cell Application), 미국 텍사스주 오스틴 소재)의 공동 배양에 있어서 생쥐 특이적 마이오신 중쇄(MHC)의 상승된 발현이 도시되어 있다. 생쥐 MHC 유전자 발현 수준은 각각의 샘플에서 생쥐 GAPDH의 백분율로 제시되었다. y-축은 생쥐 GAPDH의 백분율을 나타낸다. 약성어는 하기 의미를 갖는다: mCTC는 실시예 9에 기재된 바와 같이 분화 배지에서 배양된 mCTC (A2) 세포를 의미하며; CM은 심근세포를 의미하며; mCTC+CM은 분화 배지에서 쥐 심근세포와 공동 배양된 mCTC를 의미한다. 데이터는 평균 ± S.D (n=3)로 표현된다.
<도 15>
도 15에는 실시예 10에 기재된 방법에 따라 배양된 돼지 심장 조직-유래 (A3) 세포(pCTC (A3))에 대하여 관찰된 성장 곡선이 도시되어 있다. x-축은 도말 후 배양 시간을 나타낸다. y-축은 총 집단 누적 배가치를 나타낸다.
<도 16>
도 16에는 유세포 분석법에 의해 탐지된 pCTC (A3) 세포 표면 마커 발현이 도시되어 있다. 점선은 아이소타입 대조군을 나타낸다. 실선은 CD90 (상부 좌측 패널), CD105 (상부 우측 패널), 돼지 내피 세포 마커 (하부 좌측 패널), CD16 (하부 중간 패널), CD45 (하부 우측 패널)에 대한 항원 염색이다.
<도 17>
도 17에는 급성 심근 경색 후 심장 리모델링에 대한 카툰(cartoon)이 도시되어 있다. 상기 카툰은 문헌[Pfeffer M., Atlas of heart failure (Colucci W, editor, 1999)]으로부터 복제되었다.
<도 18>
도 18에는 심초음파 검사에 의해 측정되는 바와 같이 급성 심근 경색이 유발된 동물에 있어서 분획 단축률(fractional shortening; FS)에 대한 본 발명의 심장 조직-유래 세포의 투여의 영향이 도시되어 있다. 분획 단축률은 각각의 심장 주기에서 이완기로부터의 수축기의 변화 퍼센트(FS%)이며, 심장의 전체 기능을 반영한다. 예시된 데이터는 AMI의 유발 후 5일(D5) 또는 28일(D28)에 개개의 동물에서 기록된 분획 단축률이다. x-축에 나타낸 용량으로 rCTC (A2) 세포, 또는 hCTC (A3) 세포를 동물에게 투입하였다.
<도 19>
도 19에는 심초음파 검사에 의해 측정되는 바와 같이 급성 심근 경색이 유발된 동물에 있어서 국소 벽 운동 점수(regional wall motion score; RWMS)에 대한 본 발명의 심장 조직-유래 세포의 영향이 도시되어 있다. 수직 실선에 의해 분리된 각각의 패널은 당해 연구에 있어서 실험 아암(arm)이다. 5D 및 28D는 각각 AMI를 유발시킨지 5일 및 28일 후를 반영한다. RWMS는 5D에 기저선으로서 그리고 28D에 추적으로서 측정되었다. x-축에 나타낸 용량으로 rCTC (A2) 또는 hCTC (A3) 세포를 동물에게 투입하였다.
<도 20>
도 20에는 급성 심근 경색이 유발된 동물에 있어서 좌심실 이완 말기 내경(left ventricular end diastolic dimension; LVEDD)에 대한 본 발명의 심장 조직-유래 세포의 영향이 도시되어 있다. LVEDD는 이완기 말기에 좌심실 내경을 측정한 것이다. LEVDD는 심근 경색을 유발한 후 5일(5D) 및 28일(28D)에 측정되었다. 예시된 데이터는 개개의 동물의 상대적인 변화[(28D-5D)/5D]이다. x-축에 나타낸 용량으로 rCTC (A2) 또는 hCTC (A3) 세포를 동물에게 투입하였다.
<도 21>
도 21에는 각각의 실험 군에서 LVEDD의 상대적인 변화를 비교하는 통계 분석이 예시되어 있다. 일원 변량 분석(one-way analysis of variance; ANOVA)을 이용하여 F-검정을 데이터에 적용하였다. 군 1: 비히클; 군 2: rCTC (A2) 세포 1 × 10⁶개의 세포 (표적 용량); 군 3: hCTC (A3) 세포 1 × 10⁴개의 세포 (표적 용량); 군 4: hCTC (A3) 세포 1 × 10⁵개의 세포 (표적 용량); 군 5: hCTC (A3) 세포 1 × 10⁶개의 세포 (표적 용량).
<도 22>
도 22에는 좌심실 수축 말기 내경(left ventricular end systolic dimension; LVESD)에 대한 인간 심장 조직-유래 세포의 투여의 영향이 도시되어 있다. LVESD는 각각의 심장 주기에서 심장 수축 말기에서의 심실 내경을 측정한 것이다. 수직 실선에 의해 분리된 각각의 패널은 당해 연구에 있어서 실험 아암(arm)이었다. LVESD는 심근 경색을 유발한 후 5일(5D) 및 28일(28D)에 측정되었다. 예시된 데이터는 각각의 시점에서의 단일 동물로부터의 기록이다. x-축에 나타낸 용량으로 rCTC (A2) 또는 hCTC (A3) 세포를 동물에게 투입하였다.
<도 23>
도 23에는 심초음파 검사에 의해 측정되는 4가지 파라미터(FS, RWMS, LVESD, LVEDD)에 있어서 개개의 동물에서 인간 심장 조직-유래 세포의 투여 및 경색 후 5일 및 28일에서의 심장 기능이 도시되어 있다. 각각의 흑색 점은 X 축 상에 나타낸 시점에서의 개개의 동물 심장 기능을 나타낸다. 흑색 실선은 각각의 동물에 있어서 5D로부터 28D까지의 변화 경향을 나타낸다. 각각의 패널은 심초음파 검사에 의해 측정되는 하나의 파라미터를 나타낸다.
<도 24>
도 24에는 심장 조직-유래 세포의 용량과 분획 단축률 사이의 상관관계가 도시되어 있다. Y축은 경색 및 세포 투여 후 5일로부터의 28일에서의 절대 변화이다(28D-5D). X축은 선형 스케일에서의 hCTC (A3)의 용량이다. 데이터는 평균 ± S.D (n=35)로 표현된다.
<도 25>
도 25에는 본 발명의 인간 심장-유래 조직의 투여량과 LVEDD 변화 사이의 상관관계가 도시되어 있다. y-축은 경색 및 세포 투여 후 5일로부터의 28일에서의 절대 변화를 나타낸다(28D-5D). x-축은 선형 스케일에서의 hCTC (A3) 세포의 용량을 나타낸다. 데이터는 평균 ± S.D (n=35)로 표현된다.
<도 26>
도 26에는 심근 경색을 갖는 동물의 심장에 투여된 hCTC (A3) 세포의 유지율이 도시되어 있다. 유지율은 쥐 심장에서 검출되는 베타-미세글로불린 발현 수준으로부터 추정되었다. 패널 "a"는 x-축에 나타낸 용량으로 투여한 후 4주에서의 hCTC (A3) 세포 유지율을 나타낸다. 패널 "b"는 x-축이 쥐 MI 심장에서 세포 투여 후 일수를 나타내고 y-축이 표적 용량의 백분율을 나타낼 경우 시간대별의 hCTC (A3) 세포 유지율을 나타낸다. 패널 "c"는 검출된 세포의 평균 백분율을 이용한 시간이 지남에 따른 hCTC (A3) 세포의 유지율을 나타내며, 이는 세포를 투여한 직후 검출된 인간 세포의 양을 100%로 한다. x-축은 쥐 MI 심장에서 세포 투여 후 일수를 나타낸다.
<도 27>
도 27에는 쥐 MI에서 리모델링의 예방과 hCTC (A3) 유지율 사이의 상관관계가 도시되어 있다. 좌측 패널은 상관관계 그래프를 나타낸다. x-축은 로그 스케일의 세포수를 나타내며, y-축은 리모델링 변화를 나타낸다 (델타 LVEDD, 28D-5D). 투여 후 4주에서의 각각의 동물의 세포수 및 그에 상응하는 델타 LVEDD를 그래프로 도시하였다. 우측 패널은 통계학적 선형 회귀 분석을 나타낸다.
<도 28>
도 28에는 hCTC (A3) 세포 (1 × 10⁶개의 세포의 표적화된 용량)로 처리한 쥐 심근에서의 인간 핵 매트릭스 항원(Nuclear Matrix Antigen; NuMA)의 국소화를 나타낸다. 좌측 패널은 400배 배율에서 1 × 10⁶개의 표적 용량의 hCTC-처리된 쥐 심근은 양성 인간 NuMA 염색이 관찰됨을 나타낸다. 우측 패널은 비히클 대조 동물에서의 염색을 나타낸다.
<도 29>
도 29에는 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포의 표적화된 용량을 받은 다른 동물에서 인간 NuMA의 국소화가 예시되어 있다. 상부 좌측 패널은 NuMA 양성 세포의 2개의 클러스터를 예시하는 저출력 이미지 (100배 배율)를 예시한다. 상부 우측 패널은 NuMA 양성 세포의 클러스터의 고배율 이미지 (400배 배율)이다. 기저부 좌측 패널은 NuMA 양성 세포 클러스터의 고배율 이미지이다. 기저부 우측 패널은 근세포-유사 형태를 갖는 NuMA 양성 세포 핵을 예시하는 고배율 이미지이다.
<도 30>
도 30에는 인간 및 쥐 심근에서 관찰되는 NuMA에 대한 항체 대조군의 염색이 예시되어 있다. 상부의 2개의 이미지는 인간 심장에서 핵 특이성이 높은 NuMA 양성 염색 (좌측 패널) (아이소타입 대조군에서는 비-염색, 우측 패널)을 예시한다. 기저부의 2개의 이미지는 쥐 심장 대조군을 예시하며, 이는 인간 세포에 대한 NuMA 항체의 특이성을 입증한다.
<도 31>
도 31에는 hCTC (A3)-처리된 군 또는 비히클-처리된 군에서 심근 비대의 스코어링 평가가 예시되어 있다. 표적 용량이 y-축에 나타내어져 있다. hCTC (A3) 세포를 받는 동물은 1 × 104개, 1 × 105개, 또는 1 × 106개의 세포의 표적 용량을 받았다. 연한 회색 영역은 전체 심장에서 비-비대 섹션의 비율을 예시한다. 짙은 회색 영역은 전체 심장에서 비대 섹션의 비율을 예시한다.
<도 32>
도 32에는 경색 크기 평가가 예시되어 있다. 좌측 패널은 상대적인 경색 크기 (총 좌심실 면적 중 경색 면적의 백분율)를 예시하며, 우측 패널은 절대적인 경색 면적을 예시한다. 흑색 점은 각각의 개개의 동물을 나타낸다. 당해 군의 경색의 평균 크기는 흑색 실선으로 예시되었다.
<도 33>
도 33에는 hCTC (A3) 세포-처리된 군 또는 비히클-처리된 군에서 모세혈관 염색 밀도가 예시되어 있다. hCTC (A3) 세포를 받는 동물은 1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개 또는 1 × 10⁶개의 세포의 표적 용량을 받았다. 패널 "a"는 심근에서 더 넓은 경색 구역에서의 모세혈관 밀도를 예시하며, 이는 아이소렉틴(isolectin)-B4 염색에 의해 탐지되는 바와 같다. 패널 "b"는 더 넓은 구역에서의 모세혈관 밀도를 나타내며, 이는 CD31 염색에 의해 탐지되는 바와 같다.
<도 34>
도 34에는 비-경색 영역에서의 근세포 밀도가 예시되어 있다. 패널 "a"에는 비히클 처리된 동물 (좌측 패널) 및 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포로 처리된 동물 (우측 패널)로부터의 심근의 H&E 염색의 대표적인 이미지가 예시되어 있다. 패널 "b"는 1 ㎟ 당 근세포 수로 표현되는, 심장의 비-경색 영역에서 관찰되는 근세포 밀도를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD (n=6)로 나타내어지며; 패널 c는 Ki-67 및 마이오신 중쇄의 이중-염색에 의해 관찰된 증식 중인 근세포를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD (n=6)로 표현된다.
<도 35>
도 35에는 표적 용량의 hCTC (A3) 세포 처리에 응답하여 쥐 심근에서 차별적으로 발현되는 유전자가 예시되어 있다.
<도 36>
도 36에는 급성 MI를 앓고 있는 쥐에서 심장 조직에 대한 hCTC 및 hMSC 세포 투여의 영향의 정량화가 예시되어 있다. 패널 "a"는 좌심실 자유벽(free wall)에서 경색 영역 대 건강한 조직의 비를 나타낸다. 패널 "b"는 모든 군에서 동물로부터의 심장에서 관찰된 확장의 등급을 나타낸다. 패널 "c"는 생육가능한 심근을 나타낸다.
<도 37>
도 37에는 급성 MI를 앓고 있는 쥐에서 심장 조직에 대한 hCTC (A3) 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포 (카탈로그 번호: PT-2501, 론자, 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재) 투여의 영향이 도시되어 있다. 각각의 동물로부터의 2개의 섹션이 나란히 예시되어 있는데, 하나는 유두근과 심방 레벨 사이의 정중선으로부터 취해지며 하나는 유두근으로부터 취해진다. 좌측의 2개의 컬럼은 비히클 처리군으로부터의 것이며, 중간의 2개의 컬럼은 hMSC 처리군 (1 × 10⁶개의 표적화된 용량)으로부터의 것이며, 우측의 2개의 컬럼은 hCTC (A3) 세포 처리군 (1 × 10⁵개의 표적화된 용량)으로부터의 것이었다.
<도 38>
도 38에는 경색 및 세포 투여 후 28일에 급성 MI를 앓고 있는 쥐에서 심장 기능에 대한 hCTC (A3) 세포 투여의 영향이 도시되어 있다. 3가지 파라미터(FS, LVESD, LVEDD)를 심초음파 검사로 측정하였다. 세포 투여 및 경색 후 28일에서의 기저선 (경색 및 세포 투여 후 7일)으로부터의 상대적인 변화가 제시되어 있다. 상이한 공여체, 인간 피부 섬유아세포 및 pCTC (A3) 세포로부터의 hCTC (A3) 세포의 3개의 로트가 예시되어 있다.
<도 39>
도 39에는 경색 및 세포 투여 후 84일에 급성 MI를 앓고 있는 쥐에서 심장 기능에 대한 hCTC (A3) 세포 투여의 영향이 도시되어 있다. 3가지 파라미터(FS, LVESD, LVEDD)를 심초음파 검사로 측정하였다. 세포 투여 및 경색 후 84일에서의 기저선 (경색 및 세포 투여 후 7일)으로부터의 상대적인 변화가 제시되어 있다. 인간 피부 섬유아세포와, 상이한 공여체로부터 제조된 3가지의 상이한 hCTC (A3) 세포 로트가 조사되었다.

개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 특정한 특성, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.

정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "손상된 심근"은 허혈 상태에 노출된 심근 세포를 말한다. 이들 허혈 상태는 심근 경색, 또는 다른 심혈관 질환 또는 관련 병에 의해 야기될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "급성 심근 경색"은 일반적으로 "심장 발작"으로 공지된 병태를 말하며, 여기서 "심장의 부분으로의 혈액 공급이 방해되어 몇몇 심장 세포가 사멸하게 된다. 이는 가장 일반적으로는 취약한 죽상경화판의 파열 이후 관상 동맥의 폐쇄 (폐색)로 인한 것인데, 상기 죽상경화판은 동맥 벽에서의 백혈구 세포 (특히 대식세포) 및 지질 (예를 들어 콜레스테롤)의 불안정한 컬렉션(collection)이다. 생성된 허혈 (혈액 공급의 제한) 및 산소 부족은, 충분한 기간 동안 처리되지 않은 채로 있을 경우, 심장 근육 조직(심근)의 손상 및/또는 사멸을 야기할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hCTC (S) 집단" 또는 "hCTC (S)"는 본 발명의 방법에 따라 인간 심장 조직을 해리시키고, 효소에 의해 소화시키고, 여과한 후 세포의 초기 배양 이후 얻어진 인간 심장 조직-유래된 세포의 비-부착성 집단을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 명세서에 사용되는 용어 "hCTC (A1) 집단" 또는 "hCTC (A1) 세포"는 본 발명의 방법에 따라 인간 심장 조직을 해리시키고, 효소에 의해 소화시키고, 여과한 후 세포의 초기 배양 이후 얻어진 인간 심장 조직-유래 세포의 부착성 집단을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hCTC (A2) 집단" 또는 "hCTC (A2) 세포"는 hCTC (S) 세포의 시험관 내 배양에서 생기는 부착성 세포의 집단을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hCTC (A3) 집단" 또는 "hCTC (A3) 세포"는 hCTC (S) 및 hCTC (A1) 세포의 혼합물의 시험관 내 배양에서 생기는 부착성 세포의 집단을 말한다.

본 발명의 세포를 유도하는 방법

a. 심장 조직을 얻는 단계,

b. 심장 조직을 해리시키는 단계,

c. 심장 조직을 소화시켜 세포를 방출시키는 단계,

d. 방출된 세포로부터 심근세포를 제거하는 단계, 및

e. 남아있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

심장 조직을 수동으로 해리시킬 수 있다. 대안적으로, 심장 조직을 기계적으로 해리시킬 수 있다.

심근세포는 방출된 세포로부터 임의의 적합한 수단에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 심근세포는 여과, 원심분리에 의해 또는 FACS에 의해 제거될 수 있다.

일 실시 형태에서, 심장 조직의 소화에 의해 방출된 세포를 여과하여 심근세포를 제거한다. 여과 단계의 목적은 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포보다 크기가 더 큰 세포를 배제시키는 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직 유래 세포는 직경이 약 5 마이크로미터 내지 약 50 마이크로미터이며, 50 마이크로미터의 기공 크기의 필터를 선택하여 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포가 필터를 통과하게 한다.

일 실시 형태에서, 필터를 통과하는 인간 심장 조직-유래 세포는 시험관 내에서 배양된다. 일 실시 형태에서, 여과 단계 후 시험관 내에서 배양된 인간 심장 조직-유래 세포는 비-부착성 세포와 부착성 세포의 혼합물이다.

본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 임의의 고형 기재에 부착될 수 있다. 일 실시 형태에서, 고형 기재는 폴리카르보네이트이다. 대안적으로, 고형 기재는 폴리스티렌일 수 있다. 대안적으로, 고형 기재는 유리일 수 있다. 또한 고형 기재는 예를 들어 콜라겐 또는 라미닌 등과 같은 세포외 매트릭스 단백질을 포함하는 흡착층으로 코팅될 수 있다.

초기 배양 단계 후 얻어진 본 발명의 부착성 세포는 본 명세서에서 인간 심장 조직-유래된 (A1) 세포 집단 또는 hCTC (A1) 세포로 칭해진다. 초기 배양 단계 후 얻어진 본 발명의 비-부착성 세포는 본 명세서에서 인간 심장 조직-유래 (S) 세포 집단 또는 hCTC (S) 세포로 칭해진다.

일 실시 형태에서, hCTC (A1) 세포가 배양에서 확장된다. 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 심장 조직-유래된 세포는 10% FBS와, 1,000 g/l의 D-글루코스, 584 ㎎/l의 L-글루타민, 및 110 ㎎/l의 피루브산나트륨이 보충된 DMEM에서 배양될 수 있다. 예를 들어 페니실린 50 U/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖과 같은 항생제가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 항생제는 심장 조직의 해리 및 효소에 의한 소화 이후 얻어진 세포의 현탁물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 조직 배양 기재 상에 약 1,000 내지 약 10,000개의 생육가능한 세포 / ㎠의 접종 밀도로 도말될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 5-20% (v/v)의 대기중 산소 하에 인큐베이션될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 일단 세포가 대략 80%의 포화도(confluence)에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 일단 세포가 대략 90%의 포화도에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A1) 세포는 매 1일 내지 7일에 계대된다.

일 실시 형태에서, hCTC (S) 세포가 배양에서 확장된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 hCTC (S) 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 심장 조직-유래 세포는 10% FBS와, 1,000 g/l의 D-글루코스, 584 ㎎/l의 L-글루타민, 및 110 ㎎/l의 피루브산나트륨이 보충된 DMEM에서 배양될 수 있다. 예를 들어 페니실린 50 U/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖과 같은 항생제가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 항생제는 심장 조직의 해리 및 효소에 의한 소화 이후 얻어진 세포의 현탁물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 hCTC (S) 세포는 5-20% (v/v)의 대기중 산소 하에 인큐베이션될 수 있다. 일 실시 형태에서, 조직 배양 배지는 매 3일에 교체된다.

일 실시 형태에서, hCTC (S) 세포는 배양에서 시간이 지남에 따라 부착성으로 된다. hCTC (S) 세포가 부착성으로 되는 배양 시간은 약 1일 내지 약 7일이다. 부착성으로 된 hCTC (S) 세포에서 생긴 부착성 세포의 집단은 본 명세서에서 인간 심장 조직-유래 (A2) 세포 집단 또는 hCTC (A2) 세포로 칭해진다.

일 실시 형태에서, hCTC (A2) 세포가 배양에서 확장된다. 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 심장 조직-유래 세포는 10% FBS와, 1,000 g/l의 D-글루코스, 584 ㎎/l의 L-글루타민, 및 110 ㎎/l의 피루브산나트륨이 보충된 DMEM에서 배양될 수 있다. 예를 들어 페니실린 50 U/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖과 같은 항생제가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 항생제는 심장 조직의 해리 및 효소에 의한 소화 이후 얻어진 세포의 현탁물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 조직 배양 기재 상에 약 1,000 내지 약 10,000개의 생육가능한 세포 / ㎠의 접종 밀도로 도말될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 5-20% (v/v)의 대기중 산소 하에 인큐베이션될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 일단 세포가 대략 80%의 포화도에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 일단 세포가 대략 90%의 포화도에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A2) 세포는 매 1일 내지 7일에 계대된다.

일 실시 형태에서, hCTC (A1) 세포와 hCTC (S) 세포의 혼합물이 배양에서 확장된다. 일 실시 형태에서, hCTC (A1) 세포와 hCTC (S) 세포의 혼합물은 배양에서 시간이 지남에 따라 부착성 세포의 집단을 형성한다. hCTC (S) 세포가 부착성으로 되는 배양 시간은 약 2일 내지 약 14일이다. 부착성으로 된 hCTC (A1) 세포와 hCTC (S) 세포의 혼합물에서 생긴 부착성 세포의 집단은 본 명세서에서 인간 심장 조직-유래 (A3) 세포 집단 또는 hCTC (A3) 세포로 칭해진다.

일 실시 형태에서, hCTC (A3) 세포가 배양에서 확장된다. 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 임의의 적합한 조직 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 심장 조직-유래 세포는 10% FBS와, 1,000 g/l의 D-글루코스, 584 ㎎/l의 L-글루타민, 및 110 ㎎/l의 피루브산나트륨이 보충된 DMEM에서 배양될 수 있다. 예를 들어 페니실린 50 U/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖과 같은 항생제가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 항생제는 심장 조직의 해리 및 효소에 의한 소화 이후 얻어진 세포의 현탁물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 조직 배양 기재 상에 약 1,000 내지 약 10,000개의 생육가능한 세포 / ㎠의 접종 밀도로 도말될 수 있다. 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 5-20% (v/v)의 대기중 산소 하에 인큐베이션될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 일단 세포가 대략 80%의 포화도에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 일단 세포가 대략 90%의 포화도에 도달하면 계대된다. 대안적으로, 본 발명의 hCTC (A3) 세포는 매 1일 내지 7일에 계대된다.

본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포를 얻는 1가지 방법이 도 1에 약술되어 있다. 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포를 얻는 다른 방법이 도 2에 약술되어 있다. 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포를 얻는 다른 방법이 도 3에 약술되어 있다.

본 발명의 세포는 전체 심장을 해리시키고, 후속적으로, 해리된 조직을 소화시킴에 의해 유도될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 세포는 심장 조직의 부분들을 해리시키고, 후속적으로, 해리된 조직을 소화시킴에 의해 유도될 수 있다. 상기 부분들은 예를 들어 심방, 또는 심실, 심첨 또는 심장의 어느 한 쪽과 같은 심장의 임의의 부분으로부터 얻어질 수 있다.

해리된 심장 조직은 예를 들어 콜라게나아제(collagenase) 및 디스파아제(dispase)와 같은 효소를 이용하여 소화시킬 수 있다. 효소는 개별적으로 또는 대안적으로는 조합되어 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 해리된 심장 조직은 콜라게나아제와 디스파아제의 혼합물을 이용하여 소화된다.

콜라게나아제는 약 0.1 U/㎖ 내지 약 10 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라게나아제는 약 0.1 U/㎖ 내지 약 5 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라게나아제는 약 5 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라게나아제는 약 1 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다.

디스파아제는 약 0.5 U/㎖ 내지 약 50 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라게나아제는 약 0.5 U/㎖ 내지 약 10 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라게나아제는 약 10 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다.10 대안적으로, 콜라게나아제는 약 5 U/㎖의 농도로 사용될 수 있다.

해리된 조직은 약 5분 내지 약 5시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 대안적으로, 해리된 조직은 약 30분 내지 약 5시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 대안적으로, 해리된 조직은 약 30분 내지 약 4시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 대안적으로, 해리된 조직은 약 30분 내지 약 3시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 대안적으로, 해리된 조직은 약 30분 내지 약 2시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 대안적으로, 해리된 조직은 약 30분 내지 약 1시간 동안 효소로 처리될 수 있다. 일 실시 형태에서, 해리된 조직은 약 2.5시간 동안 효소로 처리된다.

바람직할 경우, 본 발명의 심장 조직-유래 세포를 예를 들어 심장 조직-유래 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어 항체)에 노출시켜 심장 조직-유래 세포를 확인 및 선발하고 이로써 심장 조직-유래 세포의 사실상 순수한 집단을 얻을 수 있다.

본 발명의 세포

본 발명은 배양에서 유지 및 확장될 수 있는. 텔로머라아제를 발현하지 않는 인간 심장 조직-유래 세포 집단을 제공하며, 손상된 심근의 치료 및 회복에 유용하다. 본 발명의 심장 조직-유래 세포의 특성이 표 1에 요약되어 있다.

일 실시 형태에서, 텔로머라아제를 발현하지 않는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현한다: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 및 CD117.

일 실시 형태에서, 텔로머라아제를 발현하지 않는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하지 않는다: MDR, CD19, CD16, CD31, CD45 및 Isl-1.

일 실시 형태에서, 텔로머라아제를 발현하지 않는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 하기 마커들을 발현한다: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 및 CD117.

일 실시 형태에서, 텔로머라아제를 발현하지 않는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 하기 마커들을 발현하지 않는다: MDR, CD19, CD16, CD31, CD45 및 Isl-1.

일 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 심근세포로 추가로 분화된다. 이 분화는 환자 내로의 투여 이전 또는 대안적으로는 투여 이후일 수 있다. 분화는 원래의 세포의 것과는 상이한 하나 이상의 특징 또는 기능의 획득 또는 보유 정도를 증가시키는 작용을 말한다(즉, 세포 특이화). 이는 예를 들어 세포 표현형 변화에 대한 스크리닝에 의해 탐지될 수 있다(즉, 세포 및/또는 세포 상의 표면 마커의 형태적 변화의 확인). 본 발명의 심장 조직-유래 세포를 심근세포로 분화시킬 수 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 미국 특허 공개 제20040126879호에 개시된 방법에 따라 심근세포로 추가로 분화될 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 국제특허 공개 WO2004019767호에 개시된 방법에 따라 심근세포로 추가로 분화될 수 있다.

손상된 심근의 치료 또는 회복 방법

손상된 심근은 예를 들어 급성 심근 경색, 만성 심근 경색, 울혈성 심부전 등과 같은 다양한 심장 질환에서 생긴다. 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 손상된 심근을 회복시키는 치료법으로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 급성 심근 경색의 결과로서 손상된 심근을 회복시키는 치료법으로 사용된다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 환자에 있어서 손상된 심근을 치료하는 방법을 제공하며, 이는

b. 인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 손상된 심근을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 환자에 있어서 손상된 심근을 회복시키는 방법을 제공하며, 이는

b. 인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 손상된 심근을 회복시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시 형태에서, 인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 준비하고, 이 세포의 배양 없이 환자에게 투여한다. 다른 실시 형태에서, 심장 조직-유래 세포의 집단을 준비하고 시험관 내에서 배양한 후 환자에게 투여한다.

인간 심장 조직-유래 세포의 집단을 시험관 내에서 배양하고 확장시킬 경우, 배양 및 확장된 세포의 집단은 hCTC (A1) 세포의 집단일 수 있다. 대안적으로, 배양 및 확장된 세포의 집단은 hCTC (A2) 세포의 집단일 수 있다. 대안적으로, 배양 및 확장된 세포의 집단은 hCTC (A3) 세포의 집단일 수 있다.

본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 손상된 심근으로 고통을 겪고 있는 환자에게 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에 의해 쉽게 선택된다.

예를 들어, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포를 손상된 심근에 투여하는 것은 손상된 심근의 직접적인 주사를 통한 것일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 전신적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포가 전신적으로 전달될 경우, 상기 세포를 손상된 심근에 전달하는 효율은 예를 들어 환자를 적어도 하나의 다른 제제로 처리함으로써 또는 손상된 심근에의 세포의 전달을 향상시킬 수 있는 다른 방법에 의해 향상될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 줄기 세포 인자(stem cell factor; SCF), 과립구-콜로니 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 기질 세포-유래 인자-1, 스틸 인자(steel factor), 혈관 내피 성장 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 자극 인자 및 인터류킨(Interleukin)-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 제제와 함께 투여될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 미국 특허 공개 제20020061587호에 개시된 방법에 따라 다른 제제와 함께 투여된다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 미국 특허 공개 제2002162796호에 개시된 방법에 따라 다른 제제와 함께 투여된다.

예를 들어, 손상된 심근으로의 세포의 전달은 환자의 전신 순환계로부터 환자의 심장 순환계를 단리하고, 세포를 포함하는 용액을 심장 회로 내로 관류함으로써 향상될 수 있다. 이 방법의 일례가 국제특허 공개 WO2007067502호에 개시되어 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 문헌[Iwasaki, Kawamoto et al., Circulation 113: 1311-1325; 2006]에 개시된 방법에 따라 환자에게 투여된다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 문헌[Sherman, Martens et al., Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, suppl 1: S57-64; 2006]에 개시된 방법에 따라 관상 동맥 내로 삽입될 수 있는 카테터를 사용하여 환자에게 투여된다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 심근의 전기 활동도를 맵핑(mapping)할 수 있는 카테터를 사용하여 환자에게 투여된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 문헌[Perin, Dohmann et al., Circulation 107: 2294-2302; 2003] 및 문헌[Perin, Silva et al., Journal of Molecular and Cellular Cardiology 44: 486-495; 2008]에 개시된 방법에 따라 심근의 전기 활동도를 맵핑할 수 있는 카테터를 사용하여 환자에게 투여된다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 심장 조직-유래 세포는 문헌[Sherman, Martens et al., Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, suppl 1: S57-64; 2006]에 개시된 방법에 따라 환자에게 투여된다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 문헌[Hashemi, Ghods et al., European Heart Journal 29: 251-259; 2008]에 개시된 방법에 따라 심근내 주사가 가능한 카테터를 사용하여 환자에게 투여된다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예 1

인간 심장 조직-유래 세포의 단리

재료 및 방법 -소화 효소 칵테일(cocktail)의 제조: 인간 심장으로부터 심장 조직-유래 세포를 단리하기 위하여 본 발명에서 사용한 소화 효소 칵테일을 인산염 완충 염수(Phosphate Buffered Saline; PBS, 깁코(Gibco), 인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 중 2X 칵테일 원액으로 제조하였다. 농도는 0.2 U/㎖ 또는 2 U/㎖의 콜라게나아제 (독일 하이델베르크 소재의 세르바 엘렉트로포레시스 게엠베하(Serva Electrophoresis GmbH) 및 10 U/㎖의 디스파아제 II (미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))이다. 이들 효소 칵테일 원액을 -40℃에서 보관하였다. 소화 전, 효소 칵테일을 0.22 ㎛ 진공 필터 시스템 (미국 매사추세츠주 액톤 소재의 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated))을 통하여 여과하였다. 인간 심장 소화에 있어서, 2 U/㎖의 콜라게나아제 원액을 소화 절차에 사용하였다. 소화 효소의 최종 농도는 1 U/㎖의 콜라게나아제 및 5 U/㎖의 디스파아제이다. 전체 인간 심장의 소화 및 인간 심장 조직-유래 세포(hCTC)의 단리 방법이 도 1에 요약되어 있다.

재료 및 방법 - 인간 심장: 이식편-포기 전체 심장을 내셔널 디벨롭먼트 앤드 리서치 인스티튜츠(National Development and Research Institutes; NDRI, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재)로부터 획득하였다. 이식편-포기 심장의 조달 시간은 40 내지 98시간이었다. 전체 기관을 성장 배지 (DMEM+10% 소 태아 혈청) 내로 침지시키고, 세포 단리를 위하여 프로세싱할 때까지 4℃에서 보관하였다.

재료 및 방법 - 인간 심장 조직 프로세싱: 전체 심장 조직을 생물안전 작업대(biosafety cabinet)로 옮기고, 정사각형 생물분석 디쉬(square bioassay dish) (미국 매사추세츠주 액톤 소재의 코닝 인크.) 내에 넣었다. 살균 메스 (바드 파커(Bard Parker), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 미국 뉴욕주 한코크 소재)를 이용하여 여분의 지방 조직을 제거하였다. 첫 번째 전체 심장을 작은 조각 (2-3 ㎤)으로 절단하였다. 이어서 작은 조직 조각의 3/4을 미세 조각(크기: 1-2 ㎣)으로 수동으로 다졌다. 이 절차의 완료는 2시간이 걸렸다. 상기 조각의 1/4을 PRO250 균질화기 챔버 (미국 코네티컷주 옥스포드 소재의 프로 사이언티픽(Pro Scientific))로 옮겼다. 뚜껑을 챔버 상에 두고, PRO250 제너레이터(generator)를 부착시켰으며 이때 제너레이터의 속도를 3으로 설정하였다. 조직 조각은 어떠한 완충액도 첨가하지 않고서 실온에서 10초 동안 균질화하고, 조직을 시각적으로 검사하였다. 조직이 미세하게 다져졌을 때 (크기가 1 ㎣ 미만인 단편을 생성함) 균질화를 완료하였다.

재료 및 방법 - 인간 조직 소화: 수동으로 프로세싱하고 균질화한 조직 조각을 별도의 250 ㎖ 코니칼(conical) 튜브 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.)로 옮겼다. 각각의 튜브 내의 조직은 100 ㎖의 실온 PBS를 첨가하고 튜브를 5회 거꾸로 함으로써 3회 세척하였다. 이어서 상기 튜브를 똑바로 두고, 조직을 침강시켰다. 2 ㎖ 흡인 피펫 (비디 팔콘(BD falcon), 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)을 사용하여 상청액을 흡인하였다. 소화 효소 칵테일 원액 (2X)을 1:1의 효소 대 조직의 비로 250 ㎖ 튜브에 첨가하였다. 효소의 최종 농도는 1 U/㎖의 콜라게나아제 및 5 U/㎖의 디스파아제 II였다. 조직 및 효소를 포함하는 튜브를 225 rpm으로 설정한 37℃ 회전 진탕기(orbital shaker; 미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재의 반스테드 랩(Barnstead Lab))로 옮기고, 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 생물안전 작업대로 다시 옮겼다. 튜브를 실온 PBS로 충전시킴으로써 세포 현탁물을 희석시켰다. 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위하여, 세포 현탁물을 20.3 ㎝ (8 in) 직경의 250 ㎛ 표준 검사 체 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 통하여 500 ㎖ 유리 비커 내로 여과시켰다. 이 단계 후, 유리 비커 내의 세포 현탁물을 100 ㎛ 세포 여과기(strainer) (비디 팔콘)를 통하여 다수의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘) 내로 추가로 여과시켰다. 이어서 세포 현탁물은 세포를 펠렛화하기 위하여 소발 레전드(Sorvall Legend) T 원심분리기 (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 서모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.))를 사용하여 실온에서 5분 동안 338 x g에서 원심분리함으로써 세척하였다. 상청액을 흡인 제거하고, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, 각각이 수동으로 다지는 공정 및 균질화 공정을 위한 것인 별도의 50 ㎖ 튜브들 내로 풀링하였다(pooled). 세포 현탁물을 40 ㎖의 실온 PBS로 3회 더 세척하였다. 세척 후, 펠렛을 20 ㎖ ACK 용해 완충액 (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자)에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 임의의 남아있는 적혈구 세포를 용해시켰다. 인큐베이션 후, 세포 현탁물을 40 ㎖의 실온 PBS로 2회 더 세척하였다. 최종 원심분리 후, 펠렛을 20 ㎖의 실온 성장 배지 (DMEM, 1,000 ㎎/L D-글루코스, L-글루타민, 및 110 ㎎/L 피루브산나트륨, 10% 소 태아 혈청, 페니실린 50 U/㎖, 스트렙토마이신 50 ug/㎖)에 재현탁시키고 계수하였다.

재료 및 방법 - 세포 계수: 생육가능한 총 세포 밀도 및 생육가능성 분석을 Vi-셀(Cell)™ XR (미국 캘리포니아주 풀러턴 소재의 베크만 쿨터(Beckman Coulter))을 사용하여 실시하였다. Vi-셀™ 세포 생육가능성 분석기는 유동 세포 중 세포의 최대 100개의 이미지의 이미지 분석 및 비디오 포착 기술을 사용한 세포 생육가능성 평가를 위한 트립판 블루 염료 배제법을 자동화한다. Vi-셀은 계수 정확도가 ±6%이다. 제조업자의 지시 (참조 매뉴얼 PN 383674 Rev.A)에 따라 샘플을 준비하여 분석하였다. 간략하게는, RBC 용해 후 얻어진 최종 세포 현탁물의 500㎕ 분취물을 Vi-셀™ 4 ㎖ 샘플 바이알로 옮기고, Vi-셀™ XR 세포 생육가능성 분석기를 사용하여 분석하였다. 디폴트 셀 유형 프로파일을 이용하였다:

세포 밝기 85%

세포 첨예도 100

생육가능 세포 스폿(spot) 밝기 75%

생육가능 세포 스폿 영역 5%

최소 순환성 0

탈클러스터(Decluster) 정도 중간

최소 직경 5 마이크로미터

최대 직경 50 마이크로미터

이미지 50

흡인 사이클 1

트립판 블루 혼합 사이클 3

결과 - 전체 심장 소화물로부터 얻은 세포의 수율: 소화 후 첫 번째 전체 심장으로부터, 수동으로 다지는 공정으로부터의 수율은 해리 및 효소 소화 후 4300만개의 생육가능한 세포를 생성하였다. 생육가능성은 65%였다. 기계적 균질화 절차에 의해 1200만개의 생육가능한 세포가 생성되었으며, 생육가능성은 63%였다. 3배 더 많은 조직이 수동식 절차를 마쳤기 때문에 상기 2가지 절차 사이의 수율 및 생육가능성의 차이는 없었다. 상기 결과를 기반으로 하면, 후속적인 인간 심장을 기계적 균질화를 이용하여 프로세싱하였다. 소화 후, 총 수율은 전형적으로 심장 당 3400만개 내지 6400만개의 생육가능한 세포였다. 표 2에 예시된 바와 같이 생육가능성은 55 내지 81%였다.

실시예 2본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 선발 및 시험관 내 배양

인간 심장의 해리 및 효소에 의한 소화 이후 얻어진 세포 현탁물을 추가의 실험 분석을 위하여 확장시켰다.

인간 심장의 해리 및 효소에 의한 소화에 의해 얻어진 세포의 초기 도말: 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 인간 심장의 해리 및 효소에 의한 소화에 의해 얻은 세포 현탁물을 T225 조직 배양 플라스크 (코닝 인크., 미국 뉴욕주 코닝 소재) 플라스크에 첨가하였다. 10 ㎖의 세포 현탁물을 각각의 플라스크에 첨가하였는데, 상기 플라스크는 50 ㎖의 성장 배지 (DMEM, 1,000 ㎎/L의 D-글루코스, 584 ㎎/L의 L-글루타민, 및 110 ㎎/L의 피루브산나트륨, 10% 소 태아 혈청, 페니실린 50 U/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스발드 소재)를 포함하였다. 초기 배양물의 최종 부피는 60 ㎖이었다. 세포는 20% O₂ 및 5% CO₂를 포함하는 분위기에서 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 이종 세포 배양물이 관찰되었다. 비-부착성의 밝은 위상의 세포가 관찰되었으며 (본 명세서에서 hCTC (S) 세포로 칭함), 부착성 세포가 관찰되었다 (본 명세서에서 hCTC (A1) 세포로 칭함). 도 4를 참고하라.

초기 배양 단계 후 얻은 hCTC (S) 세포는 안베르사(Anversa)에 의해 심장 줄기 세포로 기재된 세포와 형태가 유사하였다 [문헌[Beltrami, Barlucchi et al. 2003; Cell 114(6): 763-76]. 도 4a를 참고하라. 게다가, 메시나(Messina) 등 (문헌[Messina, De Angelis et al. 2004; Circulation Research 95(9): 911-21])에 의해 기재된 것과 유사한 세포 클러스터가 관찰되었으며, 이는 도 4b에 예시되어 있다.

hCTC (S) 집단의 확장: 1가지 연구에서, hCTC (S) 세포는 초기 2일간의 배양 기간 후 배양 플라스크로부터 꺼냈다. hCTC (S) 세포를 50 ㎖ 코니칼 튜브로 옮겼다. hCTC (S) 세포를 실온에서 5분 동안 338 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 20 ㎖의 신선한 새로운 배지에 재현탁시켰다. hCTC (S) 세포를 재현탁 후 계수하였다. 초기 배양 단계로부터 얻은 hCTC (S) 세포의 총수는 총 약 1000만 내지 1400만개의 세포였다. 일부의 hCTC (S) 세포를 100만 내지 150만개/㎖로 보존 배지에서 냉동 보존하고 -140℃에서 보관하였다. 나머지를 배양에서 확장시켰다. hCTC (S) 세포는 5,000개의 세포/㎠의 접종 밀도로 플라스크에 재도말하였다. 배양 2일 후, hCTC (S) 세포는 부착성으로 되었으며, 균질한 부착성 세포 집단을 형성하였고, 이는 본 명세서에서 hCTC (A2) 집단 또는 hCTC (A2) 세포로 칭하였다. 일단 본 발명의 hCTC (A2) 세포가 hCTC (S) 도말 후 약 10 내지 14일에 80% 포화도에 도달하였으면, 상기 세포를 성장 배지의 흡인 제거에 의해 트립신 처리하고, 60 ㎖의 실온 PBS로 세척하고, 이어서 4 ㎖의 트립신-EDTA (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 각각의 플라스크에 첨가하였다. hCTC (A2) 세포는 세포가 탈리될 때까지 실온에서 대략 5분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 플라스크에 6 ㎖의 성장 배지를 첨가하고, 세포 현탁물을 새로운 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘, 비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)로 옮겼다. 500 ㎕ 분취물을 꺼내고, 실시예 1에 설명한 바와 같이 Vi-셀™ 세포 생육가능성 분석기를 사용하여 계수하기 위하여 Vi-셀 샘플 컵으로 옮겼다. 이들 세포를 5,000개의 세포/㎠ 또는 3,000개의 세포/㎠로 재도말하였다.

또한 냉동보존한 세포를 사용하여 hCTC (S) 세포 확장을 실시하였다. 냉동시킨 S 세포 바이알을 37℃에서 해동시키고, PBS로 1회 세척하였다. 이어서 세포를 계수하고, 배양 플라스크 중 성장 배지에 5,000개의 세포/㎠로 도말하였다. 세포 확장 및 포화도를 매일 관찰하였다.

시각적 관찰에 의하면, 비-부착성 hCTC (S) 세포는 배양 2일 후 유의하게 감소되었으며, 비-부착성 hCTC (S)의 수는 10일 내지 14일의 기간에 걸쳐 배양에서 증가하지 않았다. 배양에 있어서 hCTC (S) 세포는 배양 2일 후 플라스크에 부착하기 시작하였으며 부착성 세포로서 성장하였다. 상기 세포는 hCTC (S) 세포의 접종 후 10 내지 14일에 80% 포화도에 도달하였다. 배양에 있어서 몇몇 hCTC (S) 세포가 여전히 관찰되지만, 이러한 비-부착성 집단의 수는 배양에 있어서 증가하지 않았다. 이는 아마도 배양에 있어서 비-부착성 hCTC (S)의 부착성 hCTC (A2)로의 형태적 변화로 인한 것이었다. hCTC (S) 세포가 2일 후 플라스크에 부착되었기 때문에, 비-부착성 세포의 수는 매우 적어지게 되었고 이는 계수하지 않았다.

이와는 대조적으로, hCTC (S) 세포로부터 유래된 부착성 hCTC (A2) 세포는 도 5a에 예시된 최대 10 PDL까지 약간의 성장 잠재성을 보여주었다. 이 집단의 성장 속도는 hCTC (A2) 세포를 5,000개의 세포/㎠ 또는 3,000개의 세포/㎠로 접종하였을 때 상기 속도가 9-10 PDL에서 평탄역에 도달할 때까지 계대 당 1-3 PDL이었다. 그러나, PDL 계산은 배양물로 도말된 초기 세포수(즉, hCTC (S) 세포수)를 기반으로 하며, PDL의 추정은 전적으로 정확한 것일 수는 없다.

hCTC (A1) 집단의 확장: hCTC (S) 세포를 함유하는 배지를 초기 2일의 도말로부터의 세포를 함유하는 플라스크로부터 제거한 후, 60 ㎖의 신선한 성장 배지를 플라스크에 존재하는 남아있는 부착성 세포에 첨가하였다. hCTC (A1) 세포가 80% 포화도에 도달할 때까지 상기 세포를 배양하였다. 이 시간 후, 상기 세포는 성장 배지를 흡인 제거하고, 60 ㎖의 실온 PBS로 세척하고, 4 ㎖ 트립신-EDTA (인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 첨가함으로써 트립신 처리하였다. 세포는 세포가 탈리될 때까지 실온에서 대략 5분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 플라스크에 6 ㎖의 성장 배지를 첨가하고, 세포 현탁물을 새로운 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘, 비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)로 옮겼다. 500 ㎕ 분취물을 꺼내고, Vi-셀™ 세포 생육가능성 분석기를 사용하여 계수하기 위하여 Vi-셀 샘플 컵으로 옮겼다. 이어서 세포의 일부분을 냉동보존용 배지 (90% FBS 및 10% DMSO)로 재현탁시키고, 100만 내지 150만개의 세포/㎖로 보존하고, -140℃에서 보관하였다. 남아있는 세포는 3,000개의 세포/㎠로 냉동 바이알에 세포를 재도말함으로써 확장시켰다. 사용된 배지는 재도말 후 3일에 교체하고, 세포를 7일에 계대하였다. 이들 세포는 배지를 3일에 교체하여 트립신 처리를 이용하여 매 7일마다 계대하였다.

hCTC (A3) 집단의 확장: hCTC (A1)의 바이알 및 hCTC (S) 세포의 바이알을 세척하고, 50 ㎖ 코니칼 튜브 내로 조합하여 넣었다 (비디 팔콘, 비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재). 조합된 세포 현탁물의 5,000개의 세포/㎠ 또는 3,000개의 세포/㎠의 혼합물 중 어느 하나를 별도의 T225 플라스크 내에 첨가하였다. 각각의 플라스크를 플라스크 당 60 ㎖로 신선한 성장 배지로 충전시키고, 세포를 37℃, 20% 대기중 O₂에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 대다수의 세포는 부착성 세포 집단을 형성하였으며, 이는 본 명세서에서 hCTC (A3) 집단, 또는 hCTC (A3) 세포로 칭하였다. 일단 세포가 80% 포화도에 도달하였으면, 세포는 트립신 처리 및 5,000개의 세포/㎠ 또는 3,000개의 세포/㎠ 중 어느 하나의 접종 밀도로 재도말하여 적절한 접종 밀도를 확인함으로써 계대하고, 37℃, 20% 대기중 O₂에서 인큐베이션하였다. 전형적으로 hCTC (A3) 세포는 접종 후 7일 내에 80% 포화도에 도달하였다. 비-부착성 hCTC (S) 세포를 매일 시각적으로 관찰하였으며, 이는 배양 2일 후 유의하게 감소하여서 hCTC (A3) 세포는 균질한 세포 집단이 되었다. 이는 평균 약 2일이 걸렸다. hCTC (A3) 집단은 계대 당 1-3 PDL의 속도의 확장이 가능하였다. hCTC (A3) 세포를 5,000개의 세포/㎠의 밀도로 접종할 때, hCTC (A3)는 노화에 도달하기 전에 9-10 PDL에 도달할 수 있었다. 이와는 대조적으로, hCTC (A3) 세포를 3,000개의 세포/㎠의 밀도로 접종할 때, hCTC (A3)는 노화에 도달하기 전에 24 PDL에 도달할 수 있었다. 도 5b를 참고하라.

본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 특성화: hCTC (A2) 및 hCTC (A3) 세포는 각각의 계대에서 1-3 PDL의 유사한 성장 속도를 보여주었다. 상기 세포 둘 모두는 계대에 있어서 세포가 80-90% 포화도에 도달하기 위하여 약 7일을 필요로 하였다. 두 세포 집단 사이에 관찰된 총 PDL에서의 차이는 아마도 hCTC (A2) 세포가 hCTC (S) 세포 집단으로부터 유래될 때 hCTC (A2) 세포의 초기의 과소평가된 PDL로 인한 것일 수 있다.

본 발명의 방법으로 단리한 인간 심장 조직-유래 세포의 모든 집단에서 세포 표면 메이커 또는 유전자의 발현에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. hCTC (A1), hCTC (S), hCTC (A2) 및 hCTC (A3) 세포는 텔로머라아제를 발현하지 않았다. 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포, 및 당업계의 심장 전구 세포에서 발현되는 유전자의 목록에 대해서는 표 1을 참고하라. 본 발명의 방법에 따라 단리된 모든 세포 집단은 GATA4 및 Nkx2.5에 대하여 양성 유전자 발현을 보여주었다. 마이오신 중쇄의 발현은 관찰되지 않았다. 줄기 세포 마커 c-kit를 본 발명의 모든 세포 집단에서의 유전자 발현에 의해 탐지하였다. 표 8을 참고하라. 유세포 분석법에 의하면, 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포는 CD105 및 CD90에 대하여 양성이었다. 본 발명의 세포는 CD31, CD45 및 CD16을 발현하지 않았다. 표 8을 참고하라.

본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 집단의 특징에서 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. hCTC (A3) 집단을 추가의 특성화용으로 선발하였다.

실시예 3

인간 심장 조직-유래 세포의 시험관 내 세포 배양

세포 밀도 및 저산소 상태는 세포 성장에 영향을 준다 (문헌[Tavaluc R et al, Cell Cycle 6:20, 2554-2562, 15 October 2007]). 세포-세포 접촉은 세포 성장 잠재성을 감소시킬 수 있으며, 낮은 접종 밀도는 세포 접촉 기회를 감소시켜 성장 잠재성을 향상시킨다. 저산소 상태 또는 낮은 O₂ 분압은 세포 성장의 접촉성 저해를 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Nonomura Y. et al; The Journal of Rheumatology April 1, 2009 vol. 36 no. 4 698-705]). 본 발명에서, 3,000개의 세포/㎠의 접종 밀도는 5,000개의 세포/㎠에 비하여 더욱 큰 성장 잠재성을 보여주었다.

세포 성장에 대한 O₂ 수준의 영향을 비교하기 위하여, hCTC (A3) 세포는 T225 플라스크에서의 각각의 계대 후 3,000개의 세포/㎠로 접종하였다. 상기 세포를 20% O₂ 또는 5% O₂의 분위기에서 인큐베이션하였다. 3일에, 사용한 배지를 60 ㎖의 신선한 성장 배지로 교체하였다. 7일에, hCTC (A3) 세포를 실시예 2에 설명한 방법에 따라 수확하였다. 노화가 관찰될 때까지 총 누적 PDL을 조사함으로써 성장 속도론적 특징을 결정하였다. 실험의 전체 지속 기간은 100일보다 더 길었으며, 그 동안 상기 세포를 16 내지 17회 계대하였다. hCTC (A3) 세포를 정상 산소 조건 (20% O₂)에서 배양하였으며, 성장 곡선은 PDL 24에서 평탄역에 도달하였다. 그러나, PDL 12의 hCTC (A3) 세포를 낮은 산소 조건 (5% O₂)에서 배양하였을 때, 성장 곡선은 PDL 28에서 평탄역에 도달하였으며, 이는 도 6에 도시된 바와 같다.

실시예 4

쥐 심장 조직-유래 세포의 단리

8 내지 12주령의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐를 아이소플루오란으로 마취시키고, 복강을 개방하였다. 장을 옮겨 놓고, 대동맥을 절단하였다. 27게이지 니들을 흉부 대정맥 내로 삽입하고, 심장을 5 U/㎖의 헤파린을 함유하는 10 ㎖의 PBS로 관류하였다. 이어서, 흉부 대동맥을 통하여 5 U/㎖의 헤파린을 함유하는 10 ㎖의 PBS를 주입함으로써 심장의 역행성 관류를 실시하였다. 이 절차 전체에 걸쳐 심장이 여전히 박동하는 것을 보장하도록 주의하였다. 이어서, 전체 심장을 흉강으로부터 꺼내고, 빙냉 행크 완충액(Hank's buffer) 내에 넣었다. 5개의 단리된 쥐 심장을 해리 및 효소에 의한 소화용으로 함께 합하였다.

이어서 단리한 쥐 심장을 20 ㎖의 실온 PBS로 2회 세척하고, 상청액을 버렸다. 이어서 심장을 외과용 메스를 이용하여 실온에서 수동으로 다지고, 쵸핑된 조직을 3개의 50 ㎖ 튜브로 옮겼다. 이어서 쵸핑된 조직을 25 ㎖ PBS로 3회 세척하고, 튜브를 5회 거꾸로 하였다.

조직 조각을 별도의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.)로 옮겼다. 각각의 튜브 내의 조직은 30 ㎖의 실온 PBS를 첨가하고 튜브를 5회 거꾸로 함으로써 3회 세척하였다. 이어서 상기 튜브를 똑바로 두고, 조직을 침강시켰다. 2 ㎖ 흡인 피펫 (비디 팔콘, 비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)을 사용하여 상청액을 흡인하였다. 소화 효소 칵테일 원액 (2X)을 1:1의 효소 대 조직의 비로 50 ㎖ 튜브에 첨가하였다. 혼합된 효소의 최종 농도는 1 U/㎖의 콜라게나아제 및 5 U/㎖의 디스파아제 II였다. 조직 및 효소를 포함하는 튜브를 225 rpm으로 설정한 37℃ 회전 진탕기 (미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재의 반스테드 랩)로 옮기고, 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 생물안전 작업대로 다시 옮겼다. 튜브를 실온 PBS로 충전시킴으로써 세포 현탁물을 희석시켰다. 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위하여, 세포 현탁물을 20.3 ㎝(8 in) 직경의 100 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘), 그리고 이어서 40 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘)를 통하여 6개의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘) 내로 여과시켰다. 쥐 CTC에 대한 필터 크기는 쥐와 인간 사이의 근세포 크기 차이 때문에 인간 세포용으로 사용한 것보다 더 작았다. 이어서 세포 현탁물은 세포를 펠렛화하기 위하여 소발 레전드 T 원심분리기 (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 서모 피셔 사이언티픽, 인크.)를 사용하여 실온에서 5분 동안 338 x g에서 원심분리함으로써 세척하였다. 상청액을 흡인 제거하고, 세포 펠렛을 성장 배지에 재현탁시키고, 하나의 50 ㎖ 튜브 내로 20 ㎖ 성장 배지 내에 풀링하고, 샘플을 꺼내어 세포 수율을 측정하였다. 얻어진 전형적인 수율은 심장 당 1000만개의 세포였으며, 이때 생육가능성은 70%였다.

쥐 심장 조직-유래 세포의 제조에 있어서, 0.1 U/㎖ 또는 1 U/㎖의 콜라게나아제 원액을 이용하여 심장 조직을 소화시켰다. 3시간의 인큐베이션 후, 20 ㎖의 성장 배지를 각각의 튜브에 첨가하였으며, 이는 실시예 1에 설명한 바와 같았다. 그러나, 0.1 U/㎖의 콜라게나아제로 소화시킨 쥐 심장 조직은 어떠한 세포도 생성하지 못하였다.

상기 심장 조직의 해리 및 효소에 의한 소화에 의해 얻어진 세포 현탁물은 각각의 T225 조직 배양 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.) 내로 10 ㎖을 옮김으로써 상기 플라스크 내에 접종하였다. 각각의 플라스크에, 35 ㎖의 성장 배지 (DMEM, 1,000 ㎎/L의 D-글루코스, 584 ㎎/L의 L-글루타민, 및 110 ㎎/L의 피루브산나트륨, 10% 소 태아 혈청, 페니실린 50 U/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스발드 소재)를 첨가하여 각각의 플라스크 내부의 최종 부피가 45 ㎖이 되게 하였다. 초기 세포 배양은 20% O₂ 및 5% CO₂의 분위기에서 37℃에서 2일간이었다. 초기의 2일간의 배양 후, 비-부착성 rCTC (S) 세포를 꺼내어 50 ㎖ 코니칼 튜브 내로 옮기고, 338 x g에서 실온에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 20 ㎖ 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 5,000개의 세포/㎠의 접종 밀도로 T225 플라스크 내로 재접종하였다. rCTC (S) 세포를 성장 배지에서 배양하였다. 추가의 2일간의 배양 후, rCTC (s) 세포는 부착성으로 되었음이 나타났다. 부착성으로 된 rCTC (S) 세포로부터 형성된 부착성 세포 집단은 rCTC (A2) 세포 집단 또는 rCTC (A2) 세포로 칭하였다.

rCTC (A2) 세포를 수확하고, 트립신 처리에 의해 7일에 계대하였는데, 이는 실시예 2에 설명한 방법에 따른 것이었다. rCTC (A2) 세포는 각각의 플라스크에 45 ㎖의 성장 배지를 포함하는 T225 플라스크에 5,000개의 세포/㎠의 밀도로 도말하였다. 세포가 대략 80%에 도달하였을 때 세포를 계대하였다. 관찰된 rCTC (A2) 세포의 성장 곡선이 도 7에 도시되어 있다.

실시예 5

GFP를 발현하는 생쥐 심장 조직-유래 세포의 단리

8 내지 12주령의 5마리의 FVB.Cg-Tg(ACTB-EGFP)B5Nagy/J 생쥐 (GFP 생쥐, 미국 메인주 바 하버 소재의 잭슨 랩(Jackson Lab))를 아이소플루오란으로 마취시키고, 복강을 개방하였다. 장을 옮겨 놓고, 대동맥을 절단하였다. 27게이지 니들을 흉부 대정맥 내로 삽입하고, 심장을 5 U/㎖의 헤파린을 함유하는 10 ㎖의 PBS로 관류하였다. 이어서, 흉부 대동맥을 통하여 5 U/㎖의 헤파린을 함유하는 10 ㎖의 PBS를 주입함으로써 심장의 역행성 관류를 실시하였다. 이 절차 전체에 걸쳐 심장이 여전히 박동하는 것을 보장하도록 주의하였다. 이어서, 전체 심장을 흉강으로부터 꺼내고, 빙냉 행크 완충액 내에 넣었다.

5개의 단리된 GFP 생쥐 심장을 해리 및 효소에 의한 소화용으로 합하였다. 이어서 단리한 생쥐 심장을 20 ㎖의 실온 PBS로 2회 세척하고, 상청액을 버렸다. 이어서 심장을 외과용 메스를 이용하여 실온에서 수동으로 다지고, 쵸핑된 조직을 3개의 50 ㎖ 튜브로 옮겼다. 이어서 쵸핑된 조직을 25 ㎖ PBS로 3회 세척하고, 튜브를 5회 거꾸로 하였다. 조직 조각을 별도의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.)로 옮겼다. 각각의 튜브 내의 조직은 30 ㎖의 실온 PBS를 첨가하고 튜브를 5회 거꾸로 함으로써 3회 세척하였다. 이어서 상기 튜브를 똑바로 두고, 조직을 침강시켰다. 2 ㎖ 흡인 피펫 (비디 팔콘, 비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이 소재)을 사용하여 상청액을 흡인하였다. 소화 효소 칵테일 원액 (2X)을 1:1의 효소 대 조직의 비로 50 ㎖ 튜브에 첨가하였다. 혼합된 효소의 최종 농도는 1 U/㎖의 콜라게나아제 및 5 U/㎖의 디스파아제 II였다. 조직 및 효소를 포함하는 튜브를 225 rpm으로 설정한 37℃ 회전 진탕기(미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재의 반스테드 랩)로 옮기고, 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 튜브를 생물안전 작업대로 다시 옮겼다. 튜브를 실온 PBS로 충전시킴으로써 세포 현탁물을 희석시켰다. 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위하여, 세포 현탁물을 20.3 ㎝(8 in) 직경의 100 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘), 그리고 이어서 40 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘)를 통하여 6개의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘) 내로 여과시켰다. 쥐 CTC에 대한 필터 크기는 쥐와 인간 사이의 근세포 크기 차이 때문에 인간 세포용으로 사용한 것보다 더 작았다. 이어서 세포 현탁물은 세포를 펠렛화하기 위하여 소발 레전드 T 원심분리기 (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 서모 피셔 사이언티픽, 인크.)를 사용하여 실온에서 5분 동안 338 x g에서 원심분리함으로써 세척하였다. 상청액을 흡인 제거하고, 세포 펠렛을 성장 배지에 재현탁시키고, 하나의 50 ㎖ 튜브 내로 20 ㎖ 성장 배지 내에 풀링하고, 샘플을 꺼내어 세포 수율을 측정하였다. 얻어진 전형적인 수율은 심장 당 1000만개의 세포였으며, 이때 생육가능성은 70%였다.

3시간의 인큐베이션 후, 실시예 4에 설명한 바와 같이 20 ㎖의 성장 배지를 각각의 튜브에 첨가하였다. 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위하여, 세포 현탁물을 20.3 ㎝(8 in) 직경의 100 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘), 그리고 이어서 40 ㎛ 세포 여과기 (비디 팔콘)를 통하여 6개의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘) 내로 여과시켰다. 세포 현탁물은 세포를 펠렛화하기 위하여 소발 레전드 T 원심분리기 (미국 매사추세츠주 월탐 소재의 서모 피셔 사이언티픽, 인크.)를 사용하여 실온에서 5분 동안 338 x g에서 원심분리함으로써 세척하였다. 상청액을 흡인 제거하고, 세포 펠렛을 성장 배지에 재현탁시키고, 하나의 50 ㎖ 튜브 내로 20 ㎖ 성장 배지 내에 풀링하고, 샘플을 꺼내어 세포 수율을 측정하였다. 2가지의 단리물을 기반으로 하면, 얻어진 전형적인 수율은 심장 당 1000만개의 세포였으며, 이때 생육가능성은 70%였다. mCTC (A2) 집단을 후속 연구에서 사용하였다. 세포를 2회 계대물을 얻기 위하여 확장시킨 후 연구하였다.

실시예 6

세포의 냉동보존, 생육가능성 및 회수성

본 발명의 쥐 및 인간 심장 조직-유래 세포를 냉동보존용으로 준비하였다. 간략하게는, hCTC (A3), 또는 rCTC (A2) 집단 중 어느 하나로부터의 세포는 더욱 빠른 계대의 냉동보존된 hCTC (A3) 및 rCTC (A2) 세포를 확장시킴으로써 얻었다. 세포를 3,000개의 세포/ ㎠로 접종하고, 20%의 대기중 O₂ 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 배양한지 7일 후 계대하였으며, 이때 배지를 배양 3일에 교체하였다. 상기 세포를 12-14 PDL에서 수집하였다.

세포를 트립신 처리하고, 2% DMSO를 함유하는 크리오스터 D-라이트(Cryostor D-Lite)™ (미국 워싱턴주 보델 소재의 바이오라이프 솔루션즈, 인크.(Biolife Solutions, Inc))에서의 냉동보존용으로 재현탁시키고, 이는 델타 T(DeltaT) 소프트웨어를 갖춘 인테그라 750 플러스(Integra 750 Plus) 프로그램가능 냉각기 (영국 미들섹스 소재의 플래너(Planer).)를 사용하여, 날진(Nalgene) 2 ㎖ 냉동바이알 (미국 뉴욕주 로체스터 소재의 날진 넝크(Nalgne Nunc)) - 폴리프로필렌제, 살균 상태, 내부 나사산 및 나사식 뚜껑을 갖춤 - 내에 냉동보존하였다. 세포 및 용액을 실온으로 한 후 프로그램가능 냉각기 내로 로딩하였는데, 상기 냉각기는 15℃에서 유지하였다. 샘플 온도 탐침자를 냉동 완충액의 바이알 내에 넣었다. 하기 프로그램을 냉동보존에 사용하였다:

온도가 -140℃에 도달하였을 때, 샘플은 보관을 위하여 액체 질소 탱크로 옮겼다.

냉동보존 후 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 생육가능성 및 회수성: 액체 질소 탱크 (-140℃)에서의 1개월간의 보관 후, 바이알 당 100만개의 세포의 크리오스터 D-라이트™ 내의 hCTC (A3) 세포의 하나의 바이알을 실온에서 해동시켰다. 이어서 상기 바이알을 생물안전 작업대로 옮겼다. 50㎕ (50만개의 세포를 함유함)의 샘플을 50㎕의 트립판 블루 용액을 포함하는 1.8 ㎖ 마이크로퓨지(microfuge) 튜브로 옮겼다. 10㎕를 혈구 계산판으로 옮겨 계수함으로써 이 세포 제제로부터 이중 계수치를 취하였다. 이들 계수치에 의해 t₀ 니들-전 회수성 및 생육가능성을 결정하였다. 실온 인큐베이션을 하지 않은 니들-후 계대물 (t₀니들-후)의 세포 생육가능성 및 회수성을 결정하기 위하여, 100㎕의 세포 현탁물을 30게이지 니들 (비디 카탈로그 번호: 305106)을 통하여 1 ㎖ 투베르쿨린 시린지 (비디 카탈로그 번호: 309602) 내로 뽑아냈다. 이어서 샘플은 다시 니들에 통과시켜 1.8 ㎖ 마이크로퓨지 튜브 내에 넣었다. 이 튜브에 100㎕의 트립판 블루를 첨가하고, 이중 계수를 수행하였으며, 이는 상기에 설명한 바와 같았다. 이 절차는 실온에서 10분, 20분, 30분 인큐베이션한 후 실시하였으며, 또한 니들을 통과시키지 않고서 30분에 실시하였다.

1개월간 보관한 후, hCTC (A3) 세포의 생육가능성은 해동 후 94%인 것으로 결정되었다. 표 3 및 도 8에 예시된 바와 같이 54만개의 세포가 회수되었으며, 이는 냉동보존 전 원래 세포수와 유사하였다.

30게이지 니들 투여 니들에 통과시킨 후 시험한 인간 심장 조직-유래 세포의 생육가능성은 실온에서의 30분간의 인큐베이션 후 90%보다 컸는데, 상기 30분은 쥐 경색 과정 동안 세포 투여에 필요한 시간이다. 표 3 및 도 8에 예시된 바와 같이, 회수성은 니들 통과 전 세포수와 유사하였다.

hCTC (A3) 세포를 PDL 12까지 확장시켰으며, 미래의 생체 내 연구용으로 은행에 보관하였다. 은행에 보관한 세포의 샘플을 임의의 핵형 이상에 대하여 조사하였다. 결과를 표 4에 요약한다.

쥐 CTC 생체 적합성: 바이알 당 200만개의 세포의 크리오스터 D-라이트™ 내의 rCTC (A2) 세포의 하나의 바이알을 상기에 설명한 바와 같이 해동시켰다. 이어서 상기 바이알을 생물안전 작업대로 옮겼다. 50㎕의 샘플을 50㎕의 트립판 블루 용액을 포함하는 1.8 ㎖ 마이크로퓨지 튜브로 옮겼다. 10㎕를 혈구 계산판으로 옮겨 계수함으로써 이 세포 제제로부터 삼중 계수치를 취하였다. 니들-후 세포 수율 및 생육가능성의 기저선을 결정하기 위하여, 인큐베이션 시간을 0분, 10분, 20분, 30분으로 하여 니들 통과 전 및 니들 통과 후 둘 모두에서 세포 계수를 행하였다. 각각의 시점에, 100㎕의 세포 현탁물을 30게이지 니들 (비디 카탈로그 번호: 305106)을 통하여 1 ㎖ 투베르쿨린 시린지 (비디 카탈로그 번호: 309602) 내로 뽑아냈다. 이어서 샘플은 다시 니들에 통과시켜 1.8 ㎖ 마이크로퓨지 튜브 내에 넣었다. 이 튜브에 100㎕의 트립판 블루를 첨가하고, 삼중 계수를 수행하였으며, 이는 상기에 설명한 바와 같았다. 이 절차를 실온에서의 10분, 20분, 및 30분의 인큐베이션 시간 후 실시하여 쥐 급성 심근 경색 모델에서의 잠재적인 세포 투여 절차를 시뮬레이션하였다.

액체 질소에서의 1개월간의 보관 후, 해동 후 rCTC (A2) 세포 생육가능성은 94%였다. 세포의 회수성은 140만개/㎖이었으며, 이는 원래 세포 농도 (200만개/㎖)의 약 70%였다. 주사 니들의 통과 후 rCTC (A2) 세포의 생육가능성은 실온에서의 30분 인큐베이션 후 90%보다 컸는데, 상기 30분은 쥐 경색 과정 동안 주사에 필요한 시간틀이다. 표 5 및 도 9에 예시된 바와 같이, 회수성은 니들 통과 전과 유사하였다.

실시예 7

본 발명의 심장 조직-유래 세포의 특성화

쥐 및 인간 심장 조직으로부터 본 발명의 방법에 의해 얻은 심장 조직-유래 세포의 집단에서 세포 표면 단백질의 발현을 측정하였다. 검사한 세포 표면 마커가 표 6에 예시되어 있다. 인간 피부 섬유아세포의 집단을 대조군으로서 포함시켰다.

hCTC (A3) 세포 집단의 90% 초과가 CD59, CD105, CD54 및 CD90 (별도로 분석함)을 발현하였다. hCTC (A3) 세포 집단의 대략 30%는 내피 전구 세포의 줄기 세포 마커인 CD34를 발현하였다. 또한 약 30%의 hCTC (A3)는 c-Kit에 대하여 양성을 나타냈다. 이와는 대조적으로, hCTC (A3) 세포 집단의 5% 미만은 CD31, CD45 또는 CD16 중 어느 하나를 발현하였다. 도 10, 도 11 및 표 7을 참고하라. hCTC (A1), hCTC (A1) 및 hCTC (S) 세포의 집단은 또한 유사한 세포 표면 마커 발현을 나타냈다. 표 8을 참고하라. 더욱이, 유사한 결과를 rCTC (A3) 세포 집단에서 관찰하였다. 도 12를 참고하라. CD54, 세포내 부착 분자-1(Intercellular Adhesion Molecule-1; ICAM)은 백혈구 상의 인테그린에 결합하며, 혈관 장벽을 통한 백혈구의 조직 내로의 이동을 매개한다 (문헌[Yang L et al, Blood 106 (2): 584-92, July, 2005]). 따라서, 이 분자의 세포 표면 발현은 관상 동맥 내로 투여될 때 hCTC (A3)가 혈관계로부터 심근 내로 전좌되는 것을 용이하게 할 수 있다.

실시예 8

심장 조직-유래 세포의 유전자 발현의 분석

하기 심장 조직-유래 세포 집단으로부터의 RNA 샘플을 수집하였다: hCTC (A1), hCTC (A2), hCTC (A3), rCTC (A2), 및 mCTC (A2) (RNA를 각각의 세포 집단의 100만개의 세포로부터 수집함).

유전자의 패널의 발현을 수집한 샘플에서 실시간 PCR을 통하여 결정하였다. 표 9에 규정된 반응 믹스에 따라 실시간 PCR 반응을 개시하였으며, 시험한 유전자의 프라이머는 표 10에 예시되어 있다. 유전자의 두 카테고리, 즉 심장-특이적 유전자 및 줄기 세포 유전자를 조사하였다. 심장 특이적 유전자를 분화된 마커, 예를 들어 마이오신 중쇄(MyHC) 및 미분화된 심장 마커, 예를 들어 GATA-4 및 Nkx2.5로 추가로 분리하였다. 줄기 세포 유전자를 줄기 세포 마커, c-kit; 배아 심장 마커 islet-1, 및 세포 분열 마커, 텔로머라아제로 추가로 분류하였다. 항존 유전자(housekeeping gene)- 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나아제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 기준물로 사용하여 각각의 샘플에서의 발현 수준을 정규화하였다.

시험한 유전자의 발현은 hCTC (A1), hCTC (A2), 및 hCTC (A3) 집단에서 유사한 것으로 밝혀졌다. 표 10을 참고하라. 줄기 세포 마커 c-kit가 발현된 반면 (Ct: 27-29), 텔로머라아제 및 islet-1의 발현은 hCTC (A1), hCTC (A2), 및 hCTC (A3) 집단에서 검출가능하지 않았고, 상기 유전자의 메시지는 40의 Ct 값에서 전혀 검출되지 않았다. 심장 마커 GATA 4 및 Nkx2.5는 hCTC (A1), hCTC (A2), 및 hCTC (A3) 집단에서 각각 25 및 32-34의 CT 값에서 발현된 반면, 마이오신 중쇄 또는 심장 액틴 어느 것의 발현도 임의의 hCTC (A1), hCTC (A2), 및 hCTC (A3) 집단에서 관찰되지 않았다. 표 10을 참고하라.

이들 데이터는 본 발명의 심장 조직-유래 세포가 "전구체-유사" 세포이며, 즉, 전구 세포 마커 대 분화된 세포 마커의 발현 비가 심근세포 (1%) 및 인간 섬유아세포(12%)와 비교하여 hCTC (A1), hCTC (A2), 및 hCTC (A3) 집단에서 50,000 초과였음을 시사한다. 표 10, 표 11 및 도 13을 참고하라.

rCTC (A2) 세포는 심장 계통 유전자, 예를 들어 GATA-4 (Ct: 28) 및 Nkx2.5 (Ct: 27)를 또한 발현하였다. 그러나, 인간 심장 조직-유래 세포와는 달리, Nkx2.5의 발현은 인간 심장 조직-유래 세포에서 관찰된 것보다 쥐 심장 조직-유래 세포에서 더 높은 수준이었다. 마커인 c-kit, Islet-1 및 텔로머라아제가 rCTC (A2) 세포에서 또한 발현되었다. 표 12를 참고하라. 쥐 심장으로부터 얻은 심장 조직-유래 세포와 유사하게, 생쥐 심장 조직-유래 세포도 Nkx2.5, c-kit, Islet-1 및 텔로머라아제를 발현하였다. 표 13을 참고하라.

실시예 9

심장 조직-유래 세포는 심근세포로 분화될 수 있다

실시예 5에 설명한 방법에 따라 얻은 mCTC (A2) 세포 (200K)를 먼저 성장 배지에서 2일 동안 배양하고, 이어서 트립신 처리에 의해 수집하고, 계수한 후 1:5의 비로 쥐 심장 근세포 (100만개, 카탈로그 번호: R357, 미국 텍사스주 오스틴 소재의 셀 어플리케이션, 인크.(Cell Application, Inc.))와 혼합하였다. 쥐 심장 근세포를 5일 동안 배양한 후, 트립신 처리하여 계수하고, 이어서 mCTC (A2) 세포와 혼합하였다. 세포의 혼합물을 라미닌-처리한 6-웰 플레이트 (카탈로그 번호: 354595, 미국 뉴저지주 소재의 비디 바이오사이언시즈) 상에 5일 동안 도말하였다. mCTC (A2) 세포가 분화하는 능력은 이하에서 분화 배지로 칭하는, DMEM-F12(1:1) +10% 말 혈청 (시그마(Sigma))을 포함하는 조직 배양 배지에서 세포 혼합물을 인큐베이션함으로써 시험하였다. 세포를 20% O₂의 분위기에서 37℃에서 5일 동안 분화 배지에서 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 세포를 수확하고, RNA를 추출하였다. mCTC (A2) 세포와 쥐 심근세포의 공동 배양물 유래의 그리고 mCTC (A2) 세포의 대응 배양물 유래의 전체 RNA를 쥐과 마이오신 중쇄 유전자 발현에 대하여 시험하였다. 하기 쥐과 마이오신 중쇄 프라이머를 사용하였다:

mCTC (A2) 세포와 쥐 심근세포의 공동 배양물은 mCTC (A2) 세포 단독의 대응 배양물에 비하여 쥐과 마이오신 중쇄의 발현이 9배 증가하였다. 도 14를 참고하라. 이들 데이터는 본 발명의 상기 심장-유래 세포가 심근세포로 분화될 수 있으며, 본 발명의 세포의 심근세포와의 공동 배양은 상기 분화를 향상시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 10

돼지 심장 조직-유래 세포의 단리, 확장 및 특성화

8 내지 12주령의 괴팅겐(

) 미니 돼지 유래의 단일한 심장을 마샬 바이오리소시즈(Marshall Bioresources; 미국 뉴욕주 노스로즈 소재)로부터 각각의 단리체로 획득하였다. 심장을 관류하여 방혈한 후 수집하고, 상기 전체 기관을 탁송 동안 얼음 상의 DMEM + 10% FBS 중에서 드러나게 하였다. 조달로부터 조직 소화까지의 시간은 48 내지 96시간이었다. 하기에 설명한 절차에 따라 4가지의 별도의 단리를 실시하였다.

심장들을 작은 조각 (크기가 대략 2 내지 3 ㎤임)으로 절단하였다. 실시예 1에 설명한 바와 같이 기계적 균질화를 통하여 이들 조직 조각을 균질화하여 크기가 1 ㎣ 미만인 심장 조직 단편을 생성하고, 이어서 하나의 250 ㎖ 코니칼 튜브 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.)로 옮기고, 3회 세척하였다. 소화 효소 칵테일 원액 (2X)을 1:1의 효소 대 조직의 비로 250 ㎖ 튜브에 첨가하였다. 효소의 최종 농도는 1 U/㎖의 콜라게나아제 및 5 U/㎖의 디스파아제 II였다. 조직 및 효소를 포함하는 튜브를 225 rpm으로 설정한 37℃ 회전 진탕기(미국 일리노이주 멜로즈 파크 소재의 반스테드 랩)로 옮기고, 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 임의의 남아있는 소화되지 않은 조직을 제거하기 위하여, 세포 현탁물을 20.3 ㎝ (8 in) 직경의 250 ㎛ 표준 검사 체를 통하여 여과시켜 소화되지 않은 결합 조직 및 지방 조직 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)을 제거하고, 이어서 100 ㎛ 세포 여과기를 통하여 추가로 여과시켜 심근세포를 제거하였다 (비디 팔콘). 필터를 통과한 세포를 함유하는 배지를 다수의 50 ㎖ 코니칼 튜브 (비디 팔콘) 내로 옮겼다. 이어서 세포 현탁물을 세척하였다. 세척 후, 펠렛을 20 ㎖ ACK 용해 완충액 (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 론자)에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 임의의 남아있는 적혈구 세포를 용해시켰다. 인큐베이션 후, 세포 현탁물을 40 ㎖의 실온 PBS로 2회 더 세척하였다. 최종 원심분리 후, 펠렛을 20 ㎖의 실온 성장 배지에 재현탁시키고 계수하였다. 해리 및 효소에 의한 소화 후, 세포의 수율은 전형적으로 20 ㎖의 부피 중 2700만개의 세포였다. 전형적으로 생육가능성은 80%였다.

해리 및 효소에 의한 소화에 의해 얻어진 세포 현탁물을 T225 조직 배양 플라스크 (미국 뉴욕주 코닝 소재의 코닝 인크.) 플라스크에 첨가하였다. 10 ㎖의 세포 현탁물을 각각의 플라스크에 첨가하였는데, 상기 플라스크는 50 ㎖의 성장 배지 (DMEM, 1,000 ㎎/L의 D-글루코스, 584 ㎎/L의 L-글루타민, 및 110 ㎎/L의 피루브산나트륨, 10% 소 태아 혈청, 페니실린 50 U/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스발드 소재)를 포함하였다. 초기 배양물의 최종 부피는 60 ㎖이었다. 세포는 20% O₂ 및 5% CO₂를 포함하는 분위기에서 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 이종 세포 배양물이 관찰되었다. 비-부착성의 밝은 위상의 세포가 관찰되었으며 (본 명세서에서 pCTC (S) 세포로 칭함), 부착성 세포가 관찰되었다 (본 명세서에서 pCTC (A1) 세포로 칭함).

본 발명의 방법에 따른 돼지 심장의 해리 및 효소에 의한 소화와, 세포의 후속적인 확장에 의해 하기 세포 집단을 생성하였다: pCTC (S), pCTC (A1), pCTC (A2), 및 pCTC (A3) 세포. 본 발명의 돼지 심장 조직-유래 세포의 형태는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포와 유사하였다. pCTC (A3) 집단을 추가의 특성화 및 후속적인 생체 내 연구용으로 선발하였다.

pCTC (S) 세포 및 pCTC (A1) 세포를 처음에 T225 플라스크에서 혼합물로서 배양하여 확장시켰다. 각각의 플라스크를 플라스크 당 60 ㎖로 신선한 성장 배지로 충전시키고, 세포를 37℃, 20% O₂에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후, 대다수의 세포는 부착성 세포 집단을 형성하였으며, 이는 본 명세서에서 pCTC (A3) 집단, 또는 pCTC (A3) 세포로 칭하였다. 배양 2일 후, 시각적인 관찰에 의하면 비-부착성 세포의 수가 감소하여서 pCTC (A3) 세포가 균질한 세포 집단이 되었다. 평균적으로 이것은 2일이 걸렸다. 일단 pCTC (A3) 세포가 90-100% 포화도에 도달하면 상기 세포를 계대하고, 3000개의 세포/㎠로 재접종하였다. 배양에서의 pCTC (A3) 세포의 확장은 인간 심장 조직-유래 세포의 성장을 능가하였다. pCTC (A3) 세포는 3-4일 후에 90% 초과의 포화도로 성장한다. 본 발명의 pCTC (A3) 세포에 대하여 관찰된 성장 곡선에 대해서는 도 15를 참고하라.

실시간 PCR에 의해 결정되는 바와 같이 pCTC (A3) 세포는 텔로머라아제 또는 마이오신 중쇄를 발현하지 않았다. 그러나, pCTC (A3) 세포는 GATA-4를 발현하였다. Nkx2.5의 발현은 본 발명의 돼지 심장 조직-유래 세포에서 조사하지 않았다. 세포 표면 마커의 단일 염색에 의하면, pCTC (A3) 세포 집단의 90% 초과가 CD105 및 CD90의 발현에 대하여 양성임이 입증되었다. pCTC (A3) 세포의 5% 미만이 CD45, CD16, 또는 돼지 내피 세포 마커 (카탈로그 번호: MCA1752, 세로테크(Serotec))를 발현하였다. 이 마커는 문헌[Wilson et al., Immunology. 1996 May; 88(1):98-103)]에 예시된, 매우 광범위한 조직에서의 모세혈관 내피 상에서 확인된 조직적합성 복합체 클래스(histocompatibility complex class) II 분자이다. 도 16 및 표 14를 참고하라. 다른 세포 집단, 예를 들어 pCTC (A1), 또는 pCTC (A2) 세포는 조사하지 않았다.

실시예 11

본 발명의 심장 조직-유래 세포를 이용한 급성 심근 경색의 처리

쥐 급성 심근 경색 모델: 성공적으로 쥐 심근 경색 모델을 사용하여 ACEI 및 베타-차단제와 같은 에이전트(agent)의, 인간 AMI에 대한 치료제로서의 효능을 시험하였다. 상기 실험의 모든 단계에서, 동물을 현지 기관 지침에 따라 처리하였다.

쥐 심근 경색 모델은 심근 경색 후 인간의 병리생리학 및 경색 후 심장 기능의 추가의 열화를 시뮬레이션하도록 잘 확립되어 있다 (문헌[Pfeffer M. A. et al, Circ Res 1979; 44: 503-12]; 문헌[Litwin S. E. et al, Circulation 1994; 89: 345-54]; 문헌[Hodsman G. P. et al Circulation 1988; 78: 376-81]).

암컷 누드 쥐(중량: 250 내지 300 g; 일본 시즈오까 소재의 시즈오까 농업 협동 조합(Shizuoka Agricultural Cooperation Association))를 케타민 및 자일라진 (각각 60 및 10 ㎎/kg의 IP)으로 마취시키고, 양압 호흡을 기관내 튜브를 통하여 적용하였다. 흉부를 네 번째 좌측 늑간극에서 개방하고, 심장을 몸 밖으로 노출시키고, 심낭을 절개하였다. 그 후, 심장을 겸자로 잡고, 6-0 프롤린(Proline) 봉합사를 좌전하행 관상 동맥 아래에서 - 그의 기원으로부터 대략 2 ㎜ - 고리 모양으로 묶었다. AMI는 결찰사를 당겨서 동맥을 영구적으로 폐색시킴으로써 심장에서 유발하였다. 경색된 심근의 변색이 시각적으로 관찰되었다. 심장 조직-유래 세포의 현탁물, 또는 비히클을 경색을 유발한지 약 20분 후 변색된 영역의 가장자리 영역에 주사하였으며, 이는 세포 투여에서 하기에 설명한 바와 같다. 주사 후, 흉부를 닫고, 쥐를 그의 케이지로 되돌려보냈다. 수술 후 각각의 특정 시점에서, 마취 하에 심장의 적출에 의해 쥐를 희생시켰다.

-80℃에서 보관한 hCTC (A3) 및 rCTC (A2) 세포의 냉동보존된 집단을 얼음 상에서 해동시키고, 시험 동물에의 투여 전에 그의 생육가능성을 결정하였다. 이 조사에서 이용한 모든 세포 집단에서 세포 생육가능성은 95%보다 컸다.

좌전하행 관상 동맥을 결찰한지 20분 후 세포를 시험 동물에 투여하였다. hCTC (A3) 세포의 냉동보존된 집단을 변색된 영역의 가장자리 구역에 주사하였다. 시험 동물은 120 ㎕의 크리오스터 D-라이트 중 하기의 표적 용량들 (표적 용량 당 15마리의 동물) 중 하나를 받았다: 1 × 10⁴개의 세포 (낮은 용량), 1 × 10⁵개의 세포 (중간 용량), 또는 1 × 10⁶개의 세포 (높은 용량). 이와 병행하여, rCTC (A2) 세포의 냉동보존된 집단을 변색된 영역의 가장자리 구역에 주사하였다. 시험 동물은 120 ㎕의 크리오스터 D-라이트 중 하기의 표적 용량 (표적 용량 당 15마리의 동물) 중 하나를 받았다: 1 × 10⁶개의 세포.

모든 시험 동물에서, 냉동보존된 세포는 120㎕의 총 부피의 냉동보존용 배지 중에 있었다. 하나의 표적 용량의 세포를 심장의 변색된 영역 주위의 5군데의 별도의 부위 내로 주사하였다. 냉동보존용 배지 (120㎕)의 주사를 받은 대조군을 또한 이 연구에 포함시켰다.

AMI 유발 후 5일 및 28일에 좌심실(LV) 기능을 평가하기 위하여 경흉부 심초음파 검사 (소노스(SONOS) 5500, 필립스 메디칼 시스템즈(Philips MedicalSystems))를 실시하였다. 심초음파 검사를 실시한 동안 쥐를 케타민 및 자일라진으로 마취시켰다. LV 이완기말 및 수축기말 내경(각각 LVEDD및 LVESD)과, 분획 단축률(FS)을 중간 유두근 수준에서 측정하였다. FS는 수축기 내경 (수축 말기) 및 이완기 내경 (충만 말기) 사이의 퍼센트 차이를 측정함으로써 심장의 펌핑 효과를 반영한다. 국소 벽 운동 스코어(Regional wall motionscore; RWMS)를 공개된 기준에 따라 평가하였다: 스코어 1: 정상적인 벽 운동 및 비후; 스코어 2: 감소된 벽 운동 및 비후; 스코어 3: 벽 운동 및 비후의 부재; 스코어 4: 외향 운동 또는 벌징(bulging). (예를 들어, 문헌[Schiller, Shah et al. (Journal of American Society of Echocardiography vol 2: 358-367; 1989)] 참고).

간략하게는, 17개의 연속 섹션 이미지를 초음파 심전도로부터 얻고, 표 15에서의 정의를 기반으로 하여 각각의 섹션에 벽 운동 스코어를 제공하였다. 모든 17개의 세그먼트의 스코어의 총계를 벽 수축성의 표시로서 사용하였다. RWMS는 수축의 직접적인 측정치이다. RWMS의 감소는 수축 향상을 나타내며, 심장 근육의 개선된 기능을 반영한다. 표 15에는 각각의 스코어에 대한 기준이 기재되어 있다.

이 연구에서 관찰된 사망률은 16%였다. 표 16에 예시한 바와 같이 군들 사이의 사망률에 있어서의 유의한 차이는 없었다.

결과

도 17은 문헌[Atlas of Heart Failure by Pffeffer et al (1999)]으로부터 복제된 것으로서, 경색 후 심장에서 관찰된 병리학적 변화를 보여준다. 인간 환자에 있어서의 AMI 및 만성 심부전을 시뮬레이션하도록 쥐 급성 심근 경색 모델을 확립하였다. 인간에서와 같이, 경색 후 심실은 경색 영역에서 심근이 섬유 조직으로 교체되는 것을 시작으로 하여 일련의 병리생리학적 변경을 겪는다. 심실에서의 압력 및 수축은 경색의 확장, 점진적으로는 심실의 확장을 야기하며, 궁극적으로는 좌심실의 리모델링으로 이어지는데, 이는 타원형으로부터 구형으로의 심실의 기하학적 변화, 및 근세포 비대로서의 세포 변화에 의해 입증된다.

hCTC (A3) 세포의 냉동보존된 집단은 각각 분획 단축률(FS) 및 국소 벽 운동 스코어(RWMS)에 의해 측정되는 바와 같이, 전반적인 심장 기능 및 심장 수축성을 개선시켰다. 전반적인 심장 기능 및 심장 수축성의 개선은 hCTC (A3) 세포의 모든 표적 용량에서 관찰되었다. 도 18 및 도 19를 참고하라.

투여 후 5일에, rCTC (A2) 세포, 또는 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포의 표적 용량을 투입한 동물은 비히클 처리된 동물보다 3.3% 더 작은 (hCTC (A3)) 그리고 3.8% 더 작은 (rCTC (A2)) FS를 보여주었다. 세포 투여 후 4주에, 분획 단축률의 절대값 (28일에 관찰된 FS 값으로부터 5일에 관찰된 FS 값을 차감함으로써 계산)이 개선되었다. 도 18과 표 17 및 표 18을 참고하라. 1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 FS의 절대값은 9.687±1.329% (n= 12, P<0.001)였다. 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 FS의 절대값은 10.9±1.6% (n=11, P<0.001)였다. 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 FS의 절대값은 12.9±1.8% (n=10, P <0.001)였다. 몇몇 가능한 이유가 본 발명에서 사용한 실험 모델에서의 rCTC 세포의 무효능을 설명할 수 있다. 누드 쥐가 면역-손상된 것이지만, 외래 세포에 대한 그의 거부는 완전히 제거되지 않았다. 현재의 연구에서, rCTC는 인간 세포보다 누드 쥐에 의한 면역 거부에 더 민감할 수 있다. 그의 심근 유지는 면역 거부 때문에 손상되었으며, 따라서 심근에 대한 그의 효과가 영향을 받을 수 있다.

세포 투여 후 4주에 RWMS의 감소가 hCTC (A3) 세포로 처리된 동물에서 또한 관찰되었다. 1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 RWMS 스코어는 경색 및 세포 투여 후 5일에 24.42±1.4였지만, 경색 및 세포 투여 후 4주에 21.08±1.7 (n= 12, P⁵개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 RWMS 스코어는 경색 및 세포 투여 후 5일에 25.58±1.4였으며, 21.08±1.9 (n=11, P⁶개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서의 RWMS 스코어는 경색 및 세포 투여 후 5일에 25.91±1.6이었으며, 경색 및 세포 투여 후 4주에 20±1.7 (n=10, P⁶개의 rCTC (A2) 세포로 처리한 동물에서의 RWMS 스코어는 경색 및 세포 투여 후 5일에 25.29±1.9였으며, 세포 투여 후 4주에 23.86±2.3 (n=12, P=0.09)으로 감소하였다. 도 19와 표 17 및 표 19를 참고하라. rCTC (A2) 처리된 동물에서 관찰된 데이터는 rCTC (A2) 세포가 전반적인 기능을 개선시키지 못하였지만 상기 세포가 RWMS에 의해 예시되는 바와 같이 심장 수축성을 개선시켰음을 시사한다.

반면에, hCTC (A3) 세포로 처리된 동물에서 관찰된 데이터는 인간 심장 조직-유래 세포가 전반적인 심장 기능 및 심장 수축성을 개선시켰음을 시사한다.

hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서 심장 리모델링이 또한 방지되었다. 심장 리모델링은 예를 들어 심근 경색과 같은 허혈성 상해 후 관찰되는 심장의 크기, 형상 및 기능의 변화를 말한다. 관찰된 변화는 경색 구역에서의 심실 벽의 불균형한 박화 및 심근 세포 사멸을 포함한다. 얇은 심실 벽은 심장에서의 압력 및 부피 로드를 견딜 수 없다. 그 결과, 경색 영역에서 생겨서 보상 비-경색 심장 근육으로 퍼지는 심실 확장이 있다. 시간이 지남에 따라, 심장이 진행 중인 확장을 겪을 때, 심실은 크기가 확대되고, 형상이 덜 타원형으로 되고 더 구형으로 되며, 이는 심초음파 검사에서 증가된 치수에 의해 입증되는 바와 같다. 심실 질량 및 부피의 증가는 심장 기능에 더욱 더 악영향을 준다. 이완기 말기에서의 증가된 부피는 심장이 수축들 사이에 이완하는 능력을 결국 손상시켜 기능을 추가로 감소시킨다. 심실 확대의 중증도는 환자의 예후를 결정한다. 심실 확대는 심부전 환자에 있어서 단축된 기대 수명과 상관 관계가 있었다.

급성 심근 경색 유발 후 동물의 좌심실에서의 심장 리모델링 정도는 심초음파 검사를 통하여 이완기 말기의 좌심실의 치수 (좌심실 이완기 말기 치수, LVEDD) 및 수축기 말기의 좌심실의 치수 (좌심실 수축기 말기 치수, LVESD)를 측정함으로써 결정하였다. LVEDD 및 LVESD의 증가는 심장 리모델링의 중증도의 증가를 나타낸다. 역으로, LVEDD 및 LVESD의 관찰된 값의 감소는 심장 리모델링의 반전, 또는 심장 기능 개선을 나타냈다.

비히클 처리한 동물에서, LVEDD는 세포 투여 후 5일에 0.74±0.020 ㎜로부터 세포 투여 후 4주에 0.83±0.019 ㎜로 증가하였다. 이는 좌심실에서의 12%의 상대적인 증가 [100%(D28-D5)/D5]에 상응하였다. rCTC (A2) 세포로 처리한 동물에서, LVEDD는 세포 투여 후 5일에 0.69±0.022 ㎜로부터 세포 투여 후 4주에 0.80±0.018 ㎜로 증가하였다. 1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포로 처리된 동물에서, LVEDD는 세포 투여 후 5일에 0.70±0.012 ㎜로부터 세포 투여 후 4주에 0.77±0.022 ㎜로 증가하였다.

1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서, LVEDD는 유의하게 변화하지 않는 것으로 보였으며, 여기서 LVEDD는 세포 투여 후 5일에 0.73±0.012 ㎜였고 세포 투여 후 4주에 0.74±0.023 ㎜였으며, 상대적인 변화는 1.4%였다 (p⁶개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서 LVEDD가 또한 유의하게 변화하지 않는 것으로 보였으며, 여기서 LVEDD는 세포 투여 후 5일에 0.76±0.011 ㎜였고 세포 투여 후 4주에 0.71±0.028 ㎜였으며, 6.6%의 상대적인 변화가 세포 투여 후 5일로부터 감소하였다 (P⁵개의 hCTC (A3)의 용량 및 1 × 10⁶개의 hCTC (A3)의 용량이 심장 리모델링을 방지하였음을 시사한다. 도 23, 표 17 및 표 20을 참고하라. LVEDD의 상대적인 변화 (100%(28D-5D)/5D)가 표 21과 도 20 내지 도 21에 예시되어 있다.

1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서, LVEDD는 5일에 0.71±0.045 ㎜였고, 28일에 0.78±0.079 ㎜였다. 1 × 10⁶개의 rCTC (A2) 세포로 처리한 동물에서, LVEDD는 5일에 0.70±0.083 ㎜였고, 28일에 0.80±0.071 ㎜였다. LVEDD에 있어서 비히클 처리한 동물들로부터의 유의한 차이는 없었으며, 이는 비히클 군과 비교하여 리모델링이 전혀 개선되지 않았음을 시사한다. 표 17 및 도 23을 참고하라.

또한 인간 심장 조직-유래 세포로 처리한 동물은 좌심실 수축 말기 치수(LVESD)의 감소를 보여주었다. LVESD는 수축 말기의 심실의 크기를 측정한다. 이 파라미터는 리모델링을 나타낼 뿐만 아니라 심장 근육의 수축성도 나타낸다. LVESD의 감소는 수축 강도 증가에 상응한다.

LVESD는 비히클 처리한 동물에서 5일로부터 28일까지 증가하였다. LVESD는 1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서 동일한 수준을 유지하였다 (5일에 0.56±0.05 ㎝, 그리고 28일에 0.54±0.08 ㎝). LVESD는 1 × 10⁵개 (5일에 0.58±0.04 ㎝, 그리고 28일에 0.51±0.08 ㎝) 및 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포 (5일에 0.62±0.05 ㎝, 그리고 28일에 0.48±0.09 ㎝)로 처리한 동물에서 감소하였다. 도 22 및 표 22를 참고하라. 각각의 시점에서 각각의 동물로부터 심초음파 검사에 의해 측정한 모든 4개의 파라미터에 의한 기능에 대한 데이터를 도 23에 도시하였다. 5일과 28일 사이의 경향 변화는 각각의 군 내에서 일관적이다.

분획 단축률(FS)에 의해 측정된 전반적인 기능에 의해 결정되는 바와 같이, 심장 기능 및 hCTC (A3) 세포 투여의 표적화된 용량의 분석은 세포 용량과 기능 개선 사이의 상관관계를 보여주었다 (p=0.001, n=35). 도 24를 참고하라.

이와 유사하게, 5일로부터 28일까지의(28D-5D) LVEDD의 절대 변화에 의해 결정되는 바와 같이, 심장 리모델링 및 hCTC (A3) 세포 투여의 표적화된 용량의 분석을 관찰하였다 (p=0.0002, n=35). 도 25를 참고하라. 상관관계가 확립되었으며, 이는 선형인 대신에 기하급수적인 것으로 보인다.

실시예 12

급성 심근 경색의 쥐 모델에서의 인간 심장 조직-유래 세포의 보유

손상된 심근의 치료제로서의 인간 심장 조직-유래 세포의 기작 및 생물학적 효과를 추가로 이해하기 위하여, 이전의 실시예에서의 인간 심장 세포로 처리한 동물의 심장으로부터 조직 샘플을 취하여, 투여한지 4주 후 동물에서 인간 심장 조직-유래 세포의 보유성을 결정하였다.

세포를 투여한지 4주 후에 이전의 실시예에서의 인간 심장 조직-유래 세포로 처리한 동물로부터 심장을 꺼내어 수집하였다. 세포 보유성을 조직학 (세포 용량 당 n=6), 및 정량적 실시간 PCR (세포 용량 당 n=4)로 결정하였다.

기저선 세포 보유 값을 확립하기 위하여, 좌전하행 관상 동맥을 결찰한지 20분 후 hCTC (A3) 세포를 시험 동물에 투여하였다. 동물 당 5개의 별도의 주사 부위에서 변색된 영역의 가장자리 구역에 hCTC (A3) 세포의 냉동보존된 집단을 주사하였다. 동물에게 1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개 또는 1 × 10⁶개의 세포 중 어느 하나의 표적 용량을 투여하였다. 동물을 0일, 1일, 3일 및 7일에 희생시키고, 정량적 실시간 PCR (처리군 당 n=3)에 의한 세포 보유성 분석용으로 심장을 꺼냈다.

샘플을 정량적 실시간 PCR용으로 취한 경우, 심장 조직을 프로세싱하여 전체 RNA를 얻었다. 심장 샘플에서 검출된 인간 RNA의 양을 기반으로 하여 인간 세포의 보유성을 추정하였다.

인간 심장 조직-유래 세포로부터의 RNA는 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물에서 세포 투여 후 4주에 검출하였다. 세포 보유성은 용량-의존적인 것으로 보였으며, 이때 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물은 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물보다 더 큰 세포 보유성을 보여주었다. 1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서, 세포 보유성은 샘플에서 검출된 인간 RNA의 양을 기반으로 하면 배경 수준인 것으로 추정되었다.

세포 투여 후 0일, 1일, 3일 및 7일에 희생시킨 동물로부터의 심장에서 인간 RNA를 검출하였다. 세포 보유성은 투여 직후 급속하게 강하되었으며, 세포 투여 후 24시간에 더욱 더 감소하였다. 도 26, 패널 c 및 패널 d에 도시된 바와 같이, 세포 투여 직후 표적 용량의 단지 약 8%가 남아있었으며, 이는 심장 샘플에서 검출된 인간 RNA의 양에 의해 추정한 바와 같다. 0의 시점을 기저선으로 사용하면, 세포 투여 후 24시간에 결정할 때 세포 보유 수준은 0의 시점의 대략 10%로 더욱 더 감소하였다. 세포 보유 수준은 세포 투여 후 7일에 동일 수준으로 남아있었다.

인간 심장 조직-유래 세포 보유성과 심장 리모델링 방지 사이에 상관관계가 관찰되었다. 인간 심장 조직-유래 세포를 받은 동물에서, LVEDD (D28-D5)의 변화는 인간 심장 조직-유래 세포의 보유성과 상관관계가 있었다. 도 27에서 알 수 있는 바와 같이, 상관관계의 경향은 유의하며, 이때 p 값은 0.023이고 r ² 값은 41%이다. 고혈압용으로 잘 처방되는 의약인 에날라프릴(Enalapril)의 약리학적 임상 연구에서 (문헌[Lilian Murray et al., Br J Clin Pharmacol. 1998; 45(6): 559-566]), 에날라프릴과 혈압 저하의 유의한 상관관계가 당해 연구에서 관찰되었다 (p<0.01) 그러나, "모델의 예측력은 증가하였지만 (r ² = 23.6%, p<0.01) 응답에 있어서의 대다수의 가변성은 여전히 설명되지 않은 채로 있었다."

면역조직화학용으로 샘플을 취한 경우, 심장을 OCT 매질에 매립시키고, 액체 질소에서 순간 냉동시켰다 (군 당 n=6). 섹션들을 심장의 기저부, 중간 및 심첨 레벨에서 절단하였다. 추가의 조직학적 평가를 위하여 매립 냉동 조직을 퀄텍 테크놀로지(QualTek Technology; 미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재)로 보냈다. 조직을 실온에서 해동시키고, 포르말린에서 재고정시키고, 파라핀 내에 매립시키고, 5㎛ 섹션으로 섹션화하였다. 인간 핵 매트릭스 항원(hu NuMA)에 대한 항체로 섹션들을 염색하여 쥐 심근 내에서 인간 심장 조직-유래 세포를 식별하였다.

면역조직화학 결과는 qPCR로부터의 결과와 일치하였다. 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포의 표적 용량을 받은 동물 유래의 심근에서 양성 인간 NuMA 염색을 확인하였다. 도 28, 패널 a, 및 도 29를 참고하라. 짙은 갈색으로 염색된 그리고 인간 조직 대조군에서 관찰된 염색 특징과 유사한 NuMA 양성 세포가 본 명세서에서 2개의 타원형 원으로 그리고 배경 염색은 존재하지 않게 예시되어 있다. 세포수 추정치는 섹션 당 대략 100개의 인간 세포였다. 고배율 하에서, 도 29, 패널 d에 예시된 바와 같이 단구-유사 인간 세포가 또한 확인되었다. 비히클 처리한 동물에서는 인간 NuMA에 대한 염색이 관찰되지 않았다. 도 28, 패널 a 및 패널 b, 도 29 및 도 30을 참고하라.

실시예 13

인간 심장 조직-유래 세포는 급성 심근 경색의 동물 모델에서 비대를 감소시켰다.

손상된 심근의 치료제로서의 인간 심장 조직-유래 세포의 기작 및 생물학적 효과를 추가로 이해하기 위하여, 실시예 11에서의 인간 심장 세포로 처리한 동물의 심장으로부터 조직 샘플을 취하여, 심장의 경색 크기의 일반적인 병리학적 특성에 대한 인간 심장 조직-유래 세포의 투여의 영향을 결정하였다.

퀄텍 (미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재)의 병리학자가 조직병리학적 특성을 평가하였다. 병리학자는 연구 처리에 대하여 알지 못하였다. 심장 조직을 파라핀 블록 내에 매립시켰다. 전체 기관을 통하여 매 5㎛에서 섹션들을 얻었으며, 이를 일반적인 병리학적 특성에 대하여 평가하였다. 비대 평가를 스코어링 시스템에 의해 실시하였다. 즉 비대 심근 (스코어 1)에서 확대된 세포질 및 이상한 핵을 갖는 심근 세포가 일반적으로 발견되었다. 다르게는, 심근은 0으로 스코어링되었다. 비대를 갖는 그리고 비대를 갖지 않는 섹션의 수를 계수하고, 전체 섹션의 비율로서 도 31에 제시하여 전체 심장에서의 비대의 비율을 나타냈다.

심근 비대가 비히클 처리 동물의 심장에서 관찰되었으며, 여기서 심근의 대략 70%는 비대를 나타냈다 (스코어 1). 도 31을 참고하라. 인간 심장 조직-유래 세포를 이용한 처리는 비히클 처리 동물과 비교할 때 심장에서 관찰된 비대를 유의하게 감소시켰다. 1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개 또는 1 × 10⁶개의 표적 용량의 hCTC (A3) 세포를 받은 심장에서, 비대 심근이 30%-50%로 감소하였다. 도 31을 참고하라.

심근 경색의 중증도를 밝히기 위하여, 메이슨(Masson) 3색 염색을 각각의 심장으로부터의, 유두근 레벨의 섹션에서 실시하였다. 경색 크기는 경색 면적 및 비-경색 면적의 직접적인 측정에 의해 결정하였다. 상대적인 경색 크기를 100%로 추정하였다 [경색 면적/(경색 면적 + 비-경색 면적)]. 모든 형태측정 연구를 문헌[Iwasaki et al., Circulation. 2006; 113:1311-1325]에 기재된 방법에 따라 실시하였다.

비히클 군 (24.1±2.9%)과 비교하여 1 × 10⁵개 (16.5±7.3%, p=0.02), 또는 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포 (14.8±8.6%, p=0.01) 중 어느 하나를 받은 동물에서 상대적인 경색 크기의 감소 경향이 관찰되었다. 도 32, 패널 a를 참고하라. 이와 유사하게, 비히클 처리군 (748±191)과 비교하여 1 × 10⁵개 (557±221, p=0.09), 또는 1 × 10⁶개 (537±261, p=0.08)의 hCTC (A3) 세포 중 어느 하나를 받은 동물에서 실제 경색 면적에 의한 경색 크기 감소 경향이 또한 관찰되었다. 도 32, 패널 b를 참고하라.

심근 비대가 비히클 처리 동물의 심장에서 관찰되었으며, 여기서 심근의 대략 70%는 비대를 나타냈다 (스코어 1). 도 31을 참고하라. 인간 심장 조직-유래 세포를 이용한 처리는 비히클 처리 동물과 비교할 때 심장에서 관찰된 비대를 유의하게 감소시켰다. 1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개 또는 1 × 10^{6개의 표적} 용량의 hCTC (A3) 세포를 받은 심장에서, 비대 심근이 30%-50%로 감소하였다. 도 31을 참고하라. hCTC에 의해 성취된 비대의 감소는 표 24에 예시된 바와 같이 직접적으로 영양 또는 측분비 효과를 통한 것, 즉 hCTC에 의해 분비되는 사이토카인을 통한 것 및/또는 하기 실시예 14에 논의된 바와 같이 증가된 드노보식 근세포 생성의 이차 효과로 인한 것에 기인할 수 있다.

실시예 14

인간 심장 조직-유래 세포는 급성 심근 경색의 동물 모델에서 모세혈관 밀도를 증가시켰다.

손상된 심근의 치료제로서의 인간 심장 조직-유래 세포의 기작 및 생물학적 효과를 추가로 이해하기 위하여, 실시예 11에서의 인간 심장 세포로 처리한 동물의 심장으로부터 조직 샘플을 취하여, 경색된 영역의 가장자리 구역에서의 모세혈관 밀도에 대한 인간 심장 조직-유래 세포의 투여의 영향을 결정하였다.

경색된 영역의 가장자리 구역에서 취한 각각의 심장으로부터의 좌심실의 5개의 조직 섹션을 랜덤하게 선택하고, 모세혈관 밀도를 조직학적 조사에 의해 형태 측정에 의해 평가하였으며, 여기서 모세혈관은 CD31 또는 아이소렉틴 B4 (미국 캘리포니아주 벌린게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))에 대한 항체를 이용하여 가시화하였다. 아이소렉틴 B4는 내피 세포 표면 당 잔기에 대하여 특이적이며, 다수의 세팅에서 내피 세포를 인식하는 것으로 문서에 기록되어 있으며, 이는 문헌[Vasudevan et al., Nature Neuroscience 11: 429-439 (2008)] 및 문헌[Schmidt et al., Development 134, 2913-2923 (2007)]에 기재된 바와 같다. 혈소판 내피 세포 부착 분자(platelet endothelial cell adhesion molecule; PECAM)로도 공지된 CD31은 내피 세포, 그리고 그에 따라 심장을 포함하는 다양한 조직에서의 혈관계의 확인을 위하여 광범하게 적용되었다 (문헌[Tabibiazar and Rockson Eur Heart J 2001vol 22; 903-918]).

아이소렉틴 B4, 또는 CD31 중 어느 하나에 의한 모세혈관의 가시화에 의하면, 인간 심장 조직-유래 세포의 투여가 경색된 영역의 가장자리 구역에서 모세혈관 밀도를 증가시킴이 입증되었다. 모든 용량의 hCTC (A3) 세포의 투여는 세포를 투여한지 4주 후 비히클 처리군과 비교하여 모세혈관 밀도를 증가시켰다. 도 33, 패널 a 및 패널 b를 참고하라. (아이소렉틴-B4 염색의 경우 p=0.0068, 그리고 CD31 염색의 경우 p=0.0005).

모세혈관 밀도의 증가는 부분적으로는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포로부터의 인자들의 분비로 인한 것이었을 수 있다. 이들 영양 인자는 예를 들어 측분비식으로 심장 세포에 작용할 수 있다. 영양 인자는 직접적으로 또는 간접적으로 혈관 형성, 혈관 기능 및 혈류역학적 특성, 심장 근육 리모델링 및 기능, 근세포 증식 (예를 들어, 근육발생), 근세포 비대, 섬유증 또는 심장 세포 생존성 증가에 영향을 줄 수 있다. 또한 영양 인자는 수령체의 면역 반응을 조절할 수 있다. 인간 심장 조직-유래 세포가 영양 인자를 분비하는지를 결정하기 위하여, 7일 동안 시험관 내에서 배양한 hCTC (A3) 세포의 집단으로부터 배양 배지를 수집하였다. 배지의 샘플을 -80℃에서 보관한 후, 분비된 사이토카인의 존재에 대하여 분석하였다.

hCTC (A3) 세포에 의해 분비된 사이토카인은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 안지오포이에틴 2(angiopoietin 2; ANG2)를 포함하였다. 표 24를 참고하라. 이들 사이토카인은 혈관신생에서 중요한 역할을 한다. 더 중요하게는, VEGF와 ANG2의 조합은 문헌[Maisonpierre et al., Science 277:55-60 (1997)에 문서로 기록된 바와 같이 그리고 문헌[Ramsauer et al., Journal of Clinical Investigation 110: 1615-1617 (2002)]에 개관된 바와 같이 모세혈관 스프라우팅(capillary sprouting) 과정을 상승작용식으로 개시하고 향상시킬 수 있다.

실시예 15

인간 심장 조직-유래 세포는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포를 받은 동물에서 비-경색 영역에서 근세포 밀도를 증가시켰다.

손상된 심근의 치료제로서의 인간 심장 조직-유래 세포의 기작 및 생물학적 효과를 추가로 이해하기 위하여, 실시예 11에서의 인간 심장 세포로 처리한 동물의 심장으로부터 조직 샘플을 취하여, 경색된 영역의 가장자리 구역에서의 쥐 근세포의 증식, 및 심장의 비-경색된 영역에서의 근세포의 밀도에 대한 인간 심장 조직-유래 세포의 투여의 영향을 결정하였다.

포르말린-고정, 파라핀-매립 조직 샘플을 4㎛로 섹션화하였다. 대략 17번째 섹션의 하나의 슬라이드를 각각의 동물로부터 선발하였다. 섹션들을 Ki-67에 대한 항체(MIB-5)와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션하고, PBS에서 세척하고, 마이크로중합체(micropolymer) 표지된 친화성 생쥐 IgG 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드들을 PBS에서 세척하고, 이어서 벡터(Vector) SG 기질로 발색시켰는데, 이는 짙은 감색/회색 반응 생성물을 생성한다. 슬라이드들을 PBS에서 헹구고, DAPI (미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 케이피엘(KPL))를 사용하여 대조염색하였다. 양성 및 음성 대조군을 각각의 염색 프로토콜에 포함시켰다.

대응 포르말린-고정 섹션들을 심장 마이오신에 대한 항체와 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고, PBS에서 세척하고, 바이오티닐화 생쥐 IgG 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이차 인큐베이션의 완료 후, 벡타스테인(Vectastain) ABC-AP 시약 (벡타스테인 범용 ABC-AP 키트, 미국 캘리포니아주 벌린게임 소재의 벡터 래보러토리즈)을 30분 동안 적용하였다. 슬라이드들을 PBS에서 세척하고, 이어서 액체 영구 적색 발색체(Liquid Permanent Red Chromogen; 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코(Dako))를 사용하여 발색시켰으며, 이는 짙은 분홍색 내지 적색의 반응 생성물을 생성한다. 슬라이드들을 PBS에서 헹구고, DAPI (미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 케이피엘)를 사용하여 대조염색하였다. 양성 및 음성 대조군을 각각의 염색 프로토콜에 포함시켰다.

증식 중인 근세포를 Ki-67 및 마이오신 중쇄(MHC)의 이중 염색에 의해 측정하였다. MHC 염색에 의해 인식된 전체 근세포를 계수하였다. 하나의 고배율 시야에서의 전체 근세포의 수는 모든 용량에서 비히클 처리군과 세포 처리군 사이에서 유사하였다. 전체 근세포 중 증식 중인 근세포의 비는 비히클 처리 (2.3±0.01%) 동물, 또는 1 × 10⁶개 (1.2±0.01%)의 세포를 받은 동물과 비교하여 1 × 10⁴개 (3.8±0.02%) 또는 1 × 10⁵개 (3.7±0.02%)의 hCTC (A3) 세포 중 어느 하나를 받은 동물에서 더 높았다. 표 25 및 도 34를 참고하라.

1 × 10⁶개의 세포를 받은 동물에서 전체 근세포 중 증식 중인 근세포의 비가 더 낮은 것에 대한 한 가지 가능한 설명은 hCTC (A3) 처리에 응답하여 G0으로 진입하는 근세포로 인한 것일 수 있다. Ki-67은 세포 주기 동안 모든 시기에 존재하는 세포 증식 마커이다. 그러나, 세포주기 세포가 G0 시기 내로 빠져나올 때, Ki-67은 더 이상 존재하지 않는다. 예를 들어, 문헌[Thomas Scholzen 2000; Journal of Cellular Physiology; 182 (3), 311-322]을 참고하라.

H&E 염색: 슬라이드는 슬라이드 당 10분간 자일렌의 2회 교환에 의해 파라핀을 제거하고, 이어서 각각 5분간 무수 알코올의 2회 교환, 이어서 2분 동안 95% 알코올 및 2분 동안 70% 알코올에서 재수화시켰다. 슬라이드들을 증류수에서 짧게 세척하고, 이어서 헤마톡실린 용액에서 8분 동안 염색시키고, 흐르는 수돗물에서 5분 동안 세척하고, 1% 산 알코올에서 30초 동안 차별화하고, 흐르는 수돗물에서 1분 동안 세척하고, 0.2% 암모니아수에서 30초 내지 1분 동안 염색시켰다. 이어서 슬라이드들을 흐르는 수돗물에서 5분 동안 세척하고, 95% 알코올에서 헹구고 (10회 침지), 이어서 에오신-플록신 B 용액에서 30초 내지 1분 동안 대조염색하고, 95% 알코올, 무수 알코올의 2회 교환 - 각각 5분간 - 에 의해 탈수시키고, 각각 5분간 자일렌의 2회 교환에 의해 세척하고, 자일렌 기반 장착 매질을 이용하여 장착시켰다.

H&E 염색된 슬라이드에 있어서, 하나의 레벨을 각각의 동물에서 샘플링하였다. 각각의 레벨에서, 경색으로부터 멀리 떨어진 좌심실 벽 내의, 대부분은 횡단면화된 모세혈관을 포함하는, 가로로 절단된 근원섬유를 포함하는 5개의 400X 시야 (시야 당 67,500 ㎛²)를 선택하였다. 근섬유 밀도를 5개의 시야의 평균으로서 각각의 레벨에 대하여 보고하였으며, 이를 ㎟으로 표현하였다. 평균, 표준 편차, 및 평균의 표준 오차를 각각의 처리군에 대하여 계산하였다.

일반적으로 개개의 근섬유는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 조직에서 400X 배율에서 보였다. 도 35에는 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포를 받은 심장의 샘플로부터 얻어진 대표적인 이미지가 비히클 처리 동물로부터 얻어진 샘플과 함께 예시되어 있다. 표 26에서, 비히클 군에 있어서의 평균 (1813±84/㎟)은 처리군 (1 × 10⁴개의 hCTC (A3) 세포: 2210±227, 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포: 2220±186, 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포: 2113±186) 중 임의의 것에 있어서의 평균보다 더 낮았다. 증가된 근섬유 밀도는 증가된 증식 중 근섬유 (근육발생) 및/또는 감소된 근섬유 비대, 예를 들어 실시예 13에 기재된 것에 기인할 수 있다.

실시예 16

인간 심장 조직-유래 세포 처리는 쥐 심근에서 차별적 유전자 발현을 유발하였다.

인간 심장 조직-유래 세포 투여에 의해 유발된 분자적 변경을 이해하기 위하여, 유전자 프로파일링 연구를 행하여 비히클 및 인간 심장 조직-유래 세포 처리 군에서의 유전자 발현 수준을 비교하였다. 쥐 심장은 세포를 투여한지 4주 후 1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개, 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 세포 또는 비히클을 받은 동물로부터, 실시예 11에 기재된 연구에서 사용한 동물로부터 수집하였다. 전체 RNA를 샘플로부터 수집하였다.

어피메트릭스(Affymetrix)로부터의 HG-U133_플러스_2 유전자 칩을 사용하여 샘플에서의 유전자 발현의 분석을 실시하였다. 스폿파이어 디시젼사이트(Spotfire DecisionSite)를 이용하여, "평균에 의한 정규화" 기능에 의해 마이크로어레이(microarray) 칩을 가로질러서 마이크로어레이 데이터 세트를 정규화하였다. 개개의 칩을 비교를 위하여 군으로 구성하였다 (1 × 10⁴개, 1 × 10⁵개 및 1 × 10⁶개의 hCTC (A3) 표적 용량, 및 비히클). 스폿파이어 디시젼사이트를 이용하여, 군들 사이의 변화 배수 및 p-값을 확립하였다. 3개 이상의 컬럼에서 데이터의 프레전트 콜(Present Call) 컬럼에서 P를 갖지 않으며, 군 비교 p-값이 2개 이상의 컬럼에서 0.05 이하이고, 2개 이상의 컬럼에서 2.0 이상 또는 0.5 이하인 변화 배수를 갖지 않는 임의의 유전자를 갖는 유전자를 필터링하였다. 필터링된 세트는 관심있는 45가지의 유전자를 포함하였다. 이어서, 45가지의 유전자를 스폿파이어 디시젼사이트의 주 성분 분석(Principle Component Analysis; PCA) 프로그램에 넣어서 이 하위세트의 유전자를 사용한 군 분리를 시각적으로 보여주었다. 차별적으로 발현된 유전자가 확인 및 열거된 표 27을 참고하라.

확인된 유전자 중, 변형 성장 인자-베타 수용체(transforming growth factor-beta receptor; TGFβR)는 임의의 용량의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서 하향조절되었다. 도 35를 참고하라. 이전에 TGFβR 경로는 향상된 비대 (예를 들어, 문헌[Watkins, Jonker et al. Cardiovasc Res. 2006 Feb 1; 69 (2):432-9]) 및 리모델링 - 심근 경색 후 - (문헌[Ellmers, Scott et al. Endocrinology. 2008 Nov;149(11):5828-34.])에 연루되었다. TGFβ 및 TGFβR의 차단은 비대 후 섬유증 및 리모델링을 감소시키는 것으로 보고되었다 (예를 들어 문헌[Ellmers, Scott et al. Endocrinology. 2008 Nov; 149(11): 5828-34] 참고). 게다가, 경색 후 TGFβ 및 TGFβR 경로의 활성화는 근세포 및 심실 비대와 리모델링을 증가시키는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌[Matsumoto-Ida, Takimoto et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006 Feb; 290(2): H709-15] 참고).

차별적 유전자 발현 분석에 의해 확인한 다른 유전자는 뉴런성 산화질소 신타아제(neuronal nitric oxide synthase; NOS1)였다. 경색 후, 심장에서의 NOS1의 발현은 증가하였다. NOS1의 과발현은 심근의 수축성을 감소시키는 것으로 보고되었다 (예를 들어, 문헌[Burkard, Rokita et al. Circ Res. 2007 Feb 16; 100(3): e32-44] 참고). 인간 심부전에서, mRNA 및 단백질 수준에서의 NOS1 발현은 유의하게 증가하는 것으로 보고되었으며, 이는 심장 기능 장애의 병인에서의 NOS1의 역할을 나타낸다 (예를 들어, 문헌[Damy, Ratajczak et al. Lancet. 2004 Apr 24; 363 (9418):1365-7] 참고). hCTC (A3) 세포-처리된 심근에서, 모든 용량에서 NOS1 발현은 비히클-처리된 심근에 비하여 10배보다 많이 감소하였다.

실시예 17

인간 심장 조직-유래 세포 처리는 급성 심근 경색의 쥐 모델에서 비대를 방지하고 경색 크기를 감소시켰다.

급성 심근 경색의 설치류 모델에서 인간 심장 조직-유래 세포가 손상된 심근을 치료하는 효능을 골수-유래 중간엽 줄기 세포와 비교하였다. 8 내지 10주령의 96마리의 암컷 누드 쥐 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))를 이 연구에 사용하였다. 외과적 절차를 실시예 11에 설명한 바와 같이 실시하였다. 100 ㎕ 부피의 크리오스터 D-라이트 중 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포 (로트 1)를 투여하였다. 이와 병행하여, 100 ㎕ 부피의 크리오스터 D-라이트 중 1 × 10⁶개의 인간 중간엽 줄기 세포 (카탈로그 번호: PT-2501, 론자)를 투여하였다. 실시예 11에 설명한 것과 유사한 절차를, 외과의사의 선호도를 기반으로 하여 하기와 같이 변경하여 사용하였다: 경색 영역의 변색이 명백하게 관찰되었을 때 LAD-결찰 후 대략 10분에, 29게이지 니들을 갖춘 0.3 ㎖ 인슐린 시린지를 사용하여 경색의 가장자리 구역에 세포를 각각 50 ㎕로 두 부위 내에 주사하였다. 세포 투여 후 28일에 동물을 희생시키고, 심장을 후속 분석을 위하여 꺼냈다.

심방을 트리밍하고(trimmed), 심실을 염수로 플러싱하였다(flushed). 심장을 10% 중성 완충 포르말린 (neutral buffered formalin; NBF)에 24시간 동안 함침시킨 후 4개의 2 ㎜ 슬라이스로 절단하였다. 각각의 슬라이스를 현미경 조사용으로 프로세싱하고, 파라핀 내에 매립시키고, 5 ㎛로 섹션화하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및/또는 메이슨 3색 염색을 하였다. 2개의 섹션이 각각의 동물로부터 나란히 예시되어 있는데, 하나는 유두근과 기저 수준 사이의 정중선으로부터 취하고, 하나는 유두근으로부터 취한다.

모든 군 및 시점으로부터의 조직 섹션을 맹검화하고, 질환 (대상 부전/확장 및 비대)의 중증도에 따라 최악인 것으로부터 제일 적은 것까지 순위를 매겼다. 가장 큰 수가 가장 큰 중증도의 질환에 상응하도록 각각의 서수를 할당하였다. 이어서 맹검을 깨뜨리고, 각각의 군으로부터의 모든 순위 값을 컴파일링하였다(compiled).

경색을 포함하는 좌심실 자유벽 전체에 걸쳐 모든 이미지를 수집하였다. 각각의 동물로부터의, 3색 염색된 2개의 조직 슬라이스로부터 저배율 (2X) 이미지를 수집하고, 경색 크기에 대하여 분석하였다. 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus) v 5.1 소프트웨어 (미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 메디아 사이버네틱스, 인크.(Media Cybernetics, Inc.))를 사용하여, 수집된 이미지에서 경색 크기의 자동 형태 측정 분석을 실시하였다. 좌심실 자유벽의 둘레를 긋고, 관심있는 영역(area of interest; AOI)으로 표기하였다. 경색을 나타내는 청색 염색이 점유한 퍼센트, 및 기능성 심근을 나타내는 적색 염색에 의한 퍼센트는 각각의 이미지로부터 수집한 2가지의 측정치였다.

H&E 및/또는 메이슨 3색 염색된 심장 조직 섹션을 경색 후 28일에 조사하였다. 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포로 처리한 동물과, 1 × 10⁶개의 인간 중간엽 줄기 세포로 처리한 동물은 비히클 처리한 동물에 비하여 감소된 경색 영역을 나타냈다. 좌심실 및 우심실 둘 모두의 확장의 감소가 또한 관찰되었다. 도 36, 패널 a 및 패널 b를 참고하라. 부가적으로, 1 × 10⁵개의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물과, 1 × 10⁶개의 인간 중간엽 줄기 세포로 처리한 동물에서 좌심실 자유벽에서 기능성 심근이 보존되었다. 도 36, 패널 c를 참고하라.

흥미롭게도, hCTC (A3) 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포는 심실 중격( interventricular septum; IVS)에 대하여 차별적인 영향을 나타냈으며 - 이때 hMSC는 IVS의 비대 확대를 나타냄 - , 한편 그러한 변화는 hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서는 관찰되지 않았다. 도 37을 참고하라. 심근세포의 비대 변화의 증거가 둘 모두의 군의 심실 중격에 존재하였지만, hMSC를 받은 동물에서 더욱 현저하였다. 비대 근세포 및 IVS는 심장에서의 궁극적인 리모델링에 기여하며, 이는 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포가 인간 중간엽 줄기 세포보다 더 유익한 영향을 심장 기능에 미칠 수 있음을 시사한다.

실시예 18

급성 심근 경색의 동물 모델에서 본 발명의 인간 심장 조직-유래 세포의 장기간 효능 및 다수의 로트

인간 심장 조직-유래 세포의 다수의 로트를 3명의 공여자로부터 제조하였다. 공여자 정보가 표 28에 설명되어 있다. 간략하게는, 로트 1은 이식편-등급 심장 기관 유래의 것이고; 로트 2는 건강한 심장 유래의 것이지만 공여자는 이식에 대한 연령 기준에 미치지 못하였고, 로트 3은 심부전 상태인 확장성 심근병증으로 진단된 공여자 유래의 것이다.

암컷 누드 쥐 (중량: 250 내지 300 g)를 케타민 및 자일라진 (각각 60 및 10 ㎎/kg IP)으로 마취시켰다. 흉부를 네 번째 좌측 늑간극에서 개방하고, 심장을 몸 밖으로 노출시키고, 심낭을 절개하였다. 그 후, 심장을 겸자로 잡고, 6-0 프롤린(Proline) 봉합사를 좌전하행 관상 동맥 아래에서 - 그의 기원으로부터 대략 2 ㎜ - 고리 모양으로 묶었다. AMI는 결찰사를 당겨서 동맥을 폐색시킴으로써 심장에서 유발하였다. 경색된 심근의 변색이 시각적으로 관찰되었다.

MI를 유발한지 20분 후, 쥐는 로트 1, 2 또는 3의 hCTC (A3)로부터의 1 ×10⁶개의 hCTC (A3) 세포의 심근내 이식을 받았다. 이와 병행하여, 동물은 1 × 10⁶개의 pCTC (A3) 세포 또는 인간 신생아 피부 섬유아 세포 (카탈로그 번호: CC-2509, 론자) 또는 비히클을 받았다. 모든 세포 집단은 냉동보존한 후 투여하였으며, 크리오스터 D-라이트 중 120 ㎕의 최종 부피로 심장 내로 주사하였다. 세포를 2군데의 부위에 투여하였으며, 50 ㎕의 세포 현탁물 또는 크리오스터 D-라이트를 각각의 부위에 주사하였다. 주사의 완료 후, 흉부를 닫았다. 10마리의 동물을 각각의 군에 등록하였다. 이 연구에서 관찰된 사망률은 32%였다. 표 29에 예시한 바와 같이 군들 사이의 사망률에 있어서의 유의한 차이는 없었다. 심장 기능의 절대 값이 표 30에 예시되어 있다.

세포 투여 후 1주, 4주 및 12주에 LV 기능을 평가하기 위하여 경흉부 심초음파 검사 (소노스 5500, 필립스메디칼 시스템즈)를 실시하였다. 하기 파라미터를 측정하였다: 좌심실(LV) 이완기 말기 치수(LVEDD), LV 수축기 말기 치수(LVESD), 분획 단축률(FS), 국소 벽 운동 스코어(RWMS).

로트 1로부터의 hCTC (A3) 세포의 투여는 세포 투여 후 28일 및 84일에 검사한 모든 파라미터에서 심장 기능을 개선시켰다. 도 38 및 도 39를 참고하라. 국소 벽 운동 스코어 RWMS 및 FS에 의해 측정되는 바와 같이, 로트 2로부터의 hCTC (A3) 세포의 투여는 경색 후 84일에 심장 수축성 및 전반적인 심장 기능을 개선시킬 수 있었다.

세포 투여 후 7일에서의 FS는 비히클 처리 군과 세포 처리 군 사이에서 유사하였다. 그러나, 세포 투여 후 84일에, FS에 의해 측정한 심장 기능은 각각 로트 2의 hCTC (A3) 세포 및 1로부터의 hCTC (A3) 세포를 처리한 군에서 9.5±6.0% (n= 8, p<0.01), 8.9±4.1% (n=8, p<0.001)만큼 개선되었다. 도 39 및 표 30을 참고하라. 비히클 처리 군 (-1.0±3.3%), hCTC 로트 3 (-0.4±3.0%) 및 인간 섬유아세포 (4.1±2.1%) 군에서 FS의 최소 변화 내지 무변화가 관찰되었다. 도 39 및 표 30을 참고하라. 전반적인 기능과 일치하여, hCTC (A3) 로트 1을 받은 동물 - 7일에 24.83±1.64로부터 22.13±1.5로 (N=8, p<0.05) - 또는 로트 2 세포를 받은 동물에서 - 25.44±1.0으로부터 23.13±2.2로 (N=8, p<0.05) - , 비히클 처리된 동물에 비하여 RWMS가 또한 감소하였다. 표 30을 참고하라.

현재의 연구에서, 로트 1 또는 로트 2 중 어느 하나로부터의 hCTC (A3) 세포는 경색 후 28일 및 84일에 리모델링을 방지하였으며, 이는 LVESD에 의해 입증되었다. 세포 투여 후 28일에, 로트 1로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서 LVESD가 감소하였다 (-8.9±4.1%). 로트 2로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물에서의 LVESD는 기저선에서 유지되었다 (-0.5±4.3%). 역으로, 비히클 처리된 동물에서, 세포 투여 후 28일에 LVESD는 16.4±5.2%만큼 증가하였다. 로트 3으로부터의 hCTC (A3) 세포 또는 인간 섬유아세포를 받은 동물에서, LVESD는 각각 9.1±2.3% 및 5.4±3.6%만큼 증가하였다. 도 38 및 표 30을 참고하라.

세포 투여 후 84일에, 비히클 군에서 LVESD는 16.3±2.8%만큼 증가하였다. 이와 유사하게, 로트 3으로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물 또는 인간 섬유아세포 처리된 동물은 또한 84일에 좌심실 확대를 나타냈다. LVESD는 각각 12.5±3.7% 및 7.6±3.7%만큼 증가하였다. 이와는 대조적으로, 로트 1로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물 (-3.9±5.2%), 또는 로트 2로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물 (-1.8±4.2%)에서 심장 리모델링은 일어나지 않았다. 도 39및 표 30을 참고하라.

이완기 말기에서 LVEDD에 의해 측정되는 바와 같이 좌심실의 확장의 증가는 로트 1로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물 (7일: 0.80±0.10 ㎝; 84일: 0.84±0.07 ㎝, 5% 증가) 및 로트 2로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물 (7일: 0.74±0.07 ㎝; 84일: 0.82±0.06 ㎝; 6.7% 증가)에서 방지되었다. 역으로, LVEDD는 비히클 처리된 동물 (7일: 0.75±0.03 ㎝; 84일: 0.86±0.06 ㎝; 14.6% 증가), 및 인간 섬유아세포 (7일: 0.73±0.034 ㎝; 84일: 0.83±0.06 ㎝; 13.7% 증가)를 받은 동물에서 증가하였다. 또한 로트 3으로부터의 hCTC (A3) 세포를 받은 동물은 LVEDD 증가를 나타냈다 (7일: 0.73±0.04 ㎝; 84일: 0.82±0.06 ㎝; 12.3% 증가). 도 39및 표 30을 참고하라.

실시예 19

심장 조직-유래 세포의 크기

재료 및 방법: 본 발명의 방법에 따라 인간, 생쥐, 돼지 및 쥐 심장으로부터 얻은 심장 조직-유래 세포의 세포 크기를 세포 계수 동안 분석하였다. Vi-셀™ XR (미국 캘리포니아주 풀러턴 소재의 베크만 쿨터)을 이용하여 세포 집단의 재도말 이전에 그리고 소화 후 전체 생육가능 세포 계수를 실시하였다. Vi-셀™ 세포 생육가능성 분석기는 유동 세포 중 세포의 최대 100개의 이미지의 이미지 분석 및 비디오 포착 기술을 사용한 세포 생육가능성 평가를 위한 트립판 블루 염료 배제법을 자동화한다.

제조업자의 지시 (참조 매뉴얼 PN 383674 Rev.A)에 따라 샘플을 준비하여 분석하였다. 간략하게는, RBC 용해 후 얻어진 최종 세포 현탁물의 500㎕ 분취물을 Vi-셀™ 4 ㎖ 샘플 바이알로 옮기고, Vi-셀™ XR 세포 생육가능성 분석기를 사용하여 분석하였다. 계수한 세포의 평균의 직경에 의해 세포 크기를 결정하였다.

hCTC (A3) 세포의 직경의 평균은 16.7±2.13㎛였다. rCTC (A2) 세포의 직경은 18.4±1.02㎛였고, pCTC(A3) 세포의 직경은 17.2±0.42㎛였다. 이들 데이터를 기반으로 하면, 20㎛ 이하의 필터 크기는 본 발명의 심장 조직-유래 세포가 필터를 통과하여 수집되게 하고 다른 세포 유형은 배제하도록 할 것이다.

실시예 20

본 발명의 심장 조직-유래 세포의 냉동보존

진료소에서 추가의 프로세싱 없이 직접적으로 투여될 수 있는 제품을 생성하는 것이 유리하다. 그러한 제품의 생성을 위하여, 인간 심장 조직-유래 세포의 냉동보존성을 임상 승인 냉동보존 용액을 사용하여 시험하였다. 게다가, 심근에서의 냉동보존 용액의 독성을 또한 시험하였다.

냉동보존을 위하여, hCTC (A3) 세포를 트립신 처리에 의해 플라스크로부터 수집하였다. 세포 은행은 2% (v/v) DMSO를 함유하는 크리오스터 D-라이트™ (미국 워싱턴주 보델 소재의 바이오라이프 솔루션즈, 인크.) 중에 냉동보존하였다. 크리오스터 D-라이트는 문헌[Advances in Biopreservation edited by J.G. Baust and J.M. Baust]에 기재된 원리에 따라 초저온 환경 (-80℃ 내지 -196℃)에서 세포를 준비하여 보존하도록 의도된, 동물 기원의 것이 없는 냉동보존액이다. 예를 들어 저온 보관에 필요한 전해질, 삼투 및 완충 조건을 제공하는 기타 용액을 또한 사용할 수 있다.

세포 현탁물을 델타 T 소프트웨어를 갖춘 인테그라 750 플러스 프로그램가능 냉각기 (영국 미들섹스 소재의 플래너)를 사용하여 날진 2 ㎖ 냉동바이알 (미국 뉴욕주 로체스터 소재의 날진 넝크)- 폴리프로필렌제, 살균 상태, 내부 나사산 및 나사식 뚜껑을 갖춤 - 내에 냉동보존하였다. 세포 및 용액을 실온으로 한 후 프로그램가능 냉각기 내로 로딩하였는데, 상기 냉각기는 15℃에서 유지하였다. 샘플 온도 탐침자를 냉동 완충액의 바이알 내에 넣었다. 하기 프로그램을 이용하여 세포를 냉동보존하였다:

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 측면은 실시예 및 바람직한 실시 양태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 특허청구범위에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.

Claims

a. 인간 심장 조직을 해리시키는 단계,
b. 인간 심장 조직을 소화시켜 세포를 방출시키는 단계,
c. 방출된 세포를 여과하여 심근세포를 제거하는 단계, 및
d. 나머지 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
텔로머라아제(telomerase), ISL-1, CD16, CD31, CD45 및 MyHC를 발현하지 않고 CD90, CD105, CD117, GATA4 및 Nkx2.5를 발현하는 인간 심장 조직-유래 세포를 생성하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 심장 조직을 수동으로 해리시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 심장 조직을 기계적으로 해리시키는 방법.
제1항에 있어서, 심장 조직을 콜라게나아제(collagenase) 및 디스파아제(dispase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 소화시키는 방법.
제1항에 있어서, 전체 심장을 심장 조직의 공급원으로서 사용하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 인간 심장 조직-유래 세포가 CD49e, CD59, CD81 및 CD34 중 적어도 하나의 마커를 더 발현하는 방법.
제1항에 있어서, 세포 집단을 냉동보존하는 것을 더 포함하는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 심장 조직을 콜라게나아제 및 디스파아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 5 분 내지 5 시간 동안 소화시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 심장 조직을 콜라게나아제 및 디스파아제(dispase)로 소화시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 심장 조직을 적어도 콜라게나아제로 소화시키는 방법.
제10항에 있어서, 상기 심장 조직을 적어도 0.1 U/ml 내지 10 U/ml의 콜라게나아제로 소화시키는 방법.
제4항에 있어서, 상기 심장 조직을 적어도 디스파아제로 소화시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 심장 조직을 적어도 0.5 U/ml 내지 50 U/ml의 디스파아제로 소화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 인간 심장 조직-유래 세포가 MDR, CD19, CD46 및 CD106 중 적어도 하나의 마커를 더 발현하지 않는 방법.
제1항에 있어서, 방출된 세포를 50 마이크로미터의 기공 크기의 필터를 통해 여과하여 심근세포를 제거하는 것인, 방법.
제1항의 방법에 의해 수득되는, 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
텔로머라아제, ISL-1, CD16, CD31, CD45 및 MyHC를 발현하지 않고, CD90, CD105, CD117, GATA4 및 Nkx2.5를 발현하며, CD49e, CD59, CD81 및 CD34 중 적어도 하나의 마커를 더 발현하는, 제1항의 방법에 의해 수득될 수 있는 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
제1항의 방법에 의해 수득된, 균질한 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
텔로머라아제, ISL-1, CD16, CD31, CD45 및 MyHC를 발현하지 않고, CD90, CD105, CD117, GATA4 및 Nkx2.5를 발현하고, MDR, CD19, CD46 및 CD106 중 적어도 하나의 마커를 발현하지 않으며, 제1항의 방법에 의해 수득될 수 있는, 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
제17항 또는 제19항에 있어서, 균질한 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
텔로머라아제, ISL-1, CD16, CD31, CD45 및 MyHC를 발현하지 않고, CD117, GATA4, Nkx2.5, CD105 및 CD90을 발현하는, 제1항의 방법에 의해 수득될 수 있는 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
제21항에 있어서, MDR를 더 발현하지 않고, CD49e 및 CD59를 더 발현하는, 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단.
제16항, 제17항, 제19항 또는 제21항의 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단을 포함하는, 환자에 투여하여 손상된 심근을 치료하기 위한 약학적 조성물.
제16항, 제17항, 제19항 또는 제21항의 인간 심장 조직-유래 세포의 단리된 집단을 포함하는, 환자에 투여하여 손상된 심근을 회복시키기 위한 약학적 조성물.