KR20130129382A - 줄기 세포 현탁액 - Google Patents

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야스히로 후지모토
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가부시키가이샤 오츠까 세이야꾸 고죠
각코우호우진 지치 이카다이가쿠
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Abstract

본 발명은, 포유 동물 줄기 세포 및 트레할로스 등의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액; 트레할로스 등의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제; 포유 동물 줄기 세포를 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법; 트레할로스 등의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제; 포유 동물 줄기 세포를 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법 등을 제공한다.

Description

줄기 세포 현탁액{STEM CELL SUSPENSION}
본 발명은 포유 동물 줄기 세포 현탁액 및 그것을 포함하는 의약 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 포유 동물의 줄기 세포의 응집을 억제하기 위한 제제 및 포유 동물의 줄기 세포의 응집의 억제 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기 위한 제제, 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법에 관한 것이다.
최근 줄기 세포 연구의 진보에 따라 줄기 세포의 임상 응용은 이미 기초적인 연구 단계에서 개발 단계로 이행되고 있다. 줄기 세포에 의한 질환 치료에서는, 데미지를 받은 환자의 세포나 조직의 기능을, 줄기 세포로부터 새롭게 분화시킨 그 세포나 장기에 의해 보완한다. 여기서, 줄기 세포로부터의 체세포나 조직으로의 분화 양태에 따라, 줄기 세포에 의한 치료는 크게 두 가지로 나눌 수 있다.
그 중 하나의 양태는, 인 비트로(in vitro)에 있어서 줄기 세포를 특정한 조건 하에서 배양하여 원하는 체세포나 조직으로 분화시켜, 얻어진 체세포나 조직을 수용자의 체내에 이식하는 것이다. 예컨대, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포는 이것을 직접 생체 내에 이식하면 테라토마를 형성할 우려가 있기 때문에, 통상은 인 비트로에 있어서 특정한 체세포나 조직으로 분화시켜, 테라토마 형성 능력을 확실하게 소실시킨 뒤에, 이것을 체내에 이식한다.
또 하나의 양태는, 줄기 세포를 직접 생체 내에 이입하는 것이다. 이 방법에 의해, 근위축성 측색경화증, 재생불량성 빈혈, 파킨슨병, 다발성 경화증, 교원병, 크론병, 궤양성 대장염, 알츠하이머병, 백혈병, 생활습관병, 암 등의 질환에 효과가 있다는 것이 보고되어 있다.
간엽계 줄기 세포는 포유류의 골수 등에 존재하며, 지방 세포, 연골 세포, 뼈 세포 등으로 분화되는 줄기 세포로서 알려져 있다. 간엽계 줄기 세포는 그 다분화능 때문에, 많은 조직의 재생 의료를 위한 이식 재료로서 주목을 받고 있다. 즉, 간엽계 줄기 세포를 이용하여, 종래의 치료 방법에서는 재생하지 못한 질병이나 장해에 의해 잃은 조직을 재생하여 기능을 회복시키는 「세포 이식에 의한 재생 의료」이다. 구체적으로는, 예컨대 하지허혈(버거씨병) 환자에 대한 골수 간엽계 줄기 세포의 이식, 치주병 환부에의 골수 간엽계 줄기 세포의 이식, 변형성 관절증 환자에 대한 골수 간엽계 줄기 세포의 이식 등의 치료가 개시 또는 계획되어 있다.
한편, 트레할로스는 글루코오스가 1,1-글리코시드 결합하여 생긴 이당의 일종이다. 트레할로스는 감미를 띠며, 높은 보수력을 갖기 때문에, 여러 가지 식품이나 화장품에 이용되고 있다. 또한, 트레할로스는 세포막을 안정화하여, 세포 상해를 억제하는 성질을 갖기 때문에, 장기를 이식할 때의 장기 보호액의 유효 성분으로서 이용되고 있다. ET-Kyoto액이나 New ET-Kyoto액 등의 트레할로스를 함유하는 우수한 장기 보존액이 개발되어 있다(특허문헌 1 및 2, 비특허문헌 1).
히드록시에틸 전분은 에테르화 전분의 하나이며, 접착제, 유화제, 풀 재료 등으로서 이용된다.
덱스트란은 글루코오스로 이루어지는 다당류의 일종이며, 증점제, 보습제 등으로서 의약품, 화장품 분야에서 범용되고 있다.
특허문헌 1: 일본 특허 제3253131호 공보 특허문헌 2: 국제공개 제2007/043698호 팸플릿
비특허문헌 1: Yonsei Medical Journal, vol. 45, No.6, p.1107-1114, 2004
본 발명자들은, 줄기 세포의 생체 내에의 이식을 보다 안정적이고 또한 순조롭게 행하는 조건에 관해서 예의 검토를 했다. 줄기 세포의 생체 내에의 이입은, 많은 경우, 줄기 세포의 현탁액을 생체 내에 점적(点滴) 주입함으로써 행해지는데, 점적을 하고 있는 사이에, 수액 백 내의 현탁액 중의 줄기 세포끼리가 응집하여, 캐뉼라 중에 가득 차 막히거나, 폐정맥 등의 가는 혈관 중에 색전을 형성해 버릴 우려가 있음을 발견했다. 또한, 점적을 하고 있는 사이에, 수액 백 내의 줄기 세포의 생존율이 서서히 저하되어 버릴 우려가 있음을 본 발명자들은 알아냈다.
본 발명은, 줄기 세포를 이식할 때에, 현탁액 중의 줄기 세포끼리의 응집을 억제하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은, 현탁액 중의 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 줄기 세포의 현탁액 중에 트레할로스 등의 다당류를 첨가함으로써, 줄기 세포의 응집을 억제할 수 있음을 알아냈다. 또한, 이들 다당류가 줄기 세포의 생존율 저하를 억제할 수 있음을 함께 알아냈다. 더욱이, 이들 다당류의 몇 개인가를 조합함으로써, 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되는 것을 알아냈다. 이들 지견에 기초하여 더욱 검토를 가한 결과, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 포유 동물 줄기 세포, 및 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[2] 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 [1]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[3] 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 [1]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[4] 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 [3]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[5] 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 [1]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[6] 다당류가 트레할로스이며, 또한 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내인 [1]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[7] 다당류가 덱스트란이며, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 [1]의 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
[8] 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액의 제조 방법.
[9] 생리적 수용액이 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 [8]의 제조 방법.
[10] [1]~[7] 중 어느 하나의 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액 제제.
[11] 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
[12] 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 [11]의 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
[13] 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 [12]의 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
[14] 다당류가 트레할로스이며, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 [11]의 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
[15] 다당류가 덱스트란이며, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 [11]의 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
[16] 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[17] 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 [16]의 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[18] 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 [17]의 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[19] 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 [16]의 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[20] 다당류가 트레할로스이며, 또한 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내인 [16]의 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[21] 다당류가 덱스트란이며, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 [16]의 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
[22] 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[23] 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 [22]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[24] 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 [22]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[25] 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 [24]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[26] 다당류가 트레할로스이며, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 [22]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[27] 다당류가 덱스트란이며, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 [22]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
[28] 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[29] 상기 생리적 수용액이 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 [28]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[30] 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 [28]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[31] 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 [30]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[32] 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 [28]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[33] 다당류가 트레할로스이며, 또한 트레할로스의 농도가 15.1~362.4 mg/ml의 범위 내인 [28]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
[34] 다당류가 덱스트란이며, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 [28]의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
본 발명을 이용하면, 줄기 세포를 이식할 때에, 현탁액 중의 줄기 세포끼리의 응집을 억제할 수 있다. 따라서, 줄기 세포의 응집물이 캐뉼라 중에 가득 차 막히거나, 폐정맥 등의 가는 혈관 중에 색전을 형성해 버리는 리스크가 저감된다.
더욱이, 본 발명을 이용하면, 현탁액 중의 줄기 세포의 생존율 저하를 억제할 수 있다. 따라서, 보다 상태가 좋은 줄기 세포에 의해 치료를 실시할 수 있기 때문에, 치료 효과의 향상을 기대할 수 있다.
도 1은 각 조성액 중에서 25℃에서 1시간 정치한 후의 hBM-MSC P6의 형태 및 생존율을 도시한다.
도 2는 각 조성액 중에서 25℃에서 1시간 정치한 후의 hAT-MSC P8의 형태 및 생존율을 도시한다.
도 3은 각 조성액 중에서 25℃에서 정치한 후의 생존율을 도시한다. 6개의 바는 좌측부터 Saline, Medium, ET-K, Saviosol, HES70K 및 HES200K를 각각 나타낸다.
도 4는 각 조성액 중에서 25℃에서 정치한 후의 생존율을 도시한다. 5개의 바는 좌측부터 Saline, Medium, ET-K, Saviosol, ET-K+Saviosol을 각각 나타낸다.
도 5는 덱스트란 40을 포함하는 완충액(6.5~10 (w/v)%) 또는 생리 식염수 중에서 인간 골수 유래 간엽계 줄기 세포를 보존했을 때의 튜브의 상, 중, 하층에 있어서의 각 세포수를 나타낸다. 그래프 중의 수치는 세포 전체의 생존율을 나타낸다.
도 6은 덱스트란 40을 포함하는 완충액(6.5~10 (w/v)%) 또는 생리 식염수 중에서 인간 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포를 보존했을 때의 튜브의 상, 중, 하층에 있어서의 각 세포수를 나타낸다. 그래프 중의 수치는 세포 전체의 생존율을 나타낸다.
I. 포유 동물 줄기 세포 현탁액
본 발명은, 포유 동물 줄기 세포, 및 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 제공하는 것이다.
포유 동물로서는 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목(有蹄目), 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 붉은털원숭이, 게잡이원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 들 수 있다. 포유 동물은 바람직하게는 설치류(마우스 등), 유제목(돼지 등) 또는 영장류(인간 등)이다.
본 명세서에서 「줄기 세포」란, 자기 복제능 및 분화·증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화 능력에 따라서, 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포란, 그 자체로는 개체가 될 수 없지만, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수 종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포란, 특정 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
다능성 줄기 세포로서는 배아 줄기 세포(ES 세포), EG 세포, iPS 세포 등을 들 수 있다. ES 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포 상 또는 LIF를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다. ES 세포의 제조 방법은 예컨대 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. EG 세포는 시원 생식 세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지 중에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Cell, 70: 841-847, 1992). iPS 세포는 체세포(예컨대 선유아 세포, 피부 세포 등)에 Oct3/4, Sox2 및 Klf4(필요에 따라서 또한 c-Myc 또는 n-Myc) 등의 리프로그래밍 인자를 도입함으로써 제조할 수 있다(Cell, 126: p.663-676, 2006; Nature, 448: p.313-317, 2007; Nat Biotechnol, 26: p.101-106, 2008; Cell 131: p.861-872, 2007; Science, 318: p.1917-1920, 2007; Cell Stem Cells 1: p.55-70, 2007; Nat Biotechnol, 25: p.1177-1181, 2007; Nature, 448: p.318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p.10-12, 2008; Nature 451: p.141-146, 2008; Science, 318: p.1917-1920, 2007). 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배아를 배양함으로써 수립한 줄기 세포도 다능성 줄기 세포로서 또한 바람직하다(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999)), Rideout III 등(Nature Genetics, 24, 109(2000)).
복능성 줄기 세포로서는, 간엽계 줄기 세포, 조혈계 줄기 세포, 신경계 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 생식 줄기 세포 등의 체성(體性) 줄기 세포 등을 들 수 있다. 복능성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포이다. 간엽계 줄기 세포란, 골아 세포, 연골아 세포 및 지방아 세포의 전부 또는 몇 개로의 분화가 가능한 줄기 세포를 의미한다. 복능성 줄기 세포는 자체 공지된 방법에 의해 생체로부터 단리할 수 있다. 예컨대, 간엽계 줄기 세포는, 포유 동물의 골수, 지방 조직, 말초혈, 제대혈 등으로부터 공지된 일반적인 방법으로 채취할 수 있다. 예컨대, 골수 천자 후의 조혈 줄기 세포 등의 배양, 계대에 의해 인간 간엽계 줄기 세포를 단리할 수 있다(Journal of Autoimmunity, 30(2008) 163-171). 복능성 줄기 세포는 상기 다능성 줄기 세포를 적절한 유도 조건 하에서 배양함으로써도 얻을 수 있다.
본 발명의 현탁액 중에 포함되는 줄기 세포는 바람직하게는 부착성이다. 부착성의 줄기 세포는 현탁액 중에서 응집하기 쉽지만, 본 발명의 현탁액에는 트레할로스가 포함되므로, 이 응집이 효과적으로 억제되기 때문이다. 본 명세서에서 「부착성」 세포란, 스캐폴드에 접착함으로써 생존, 증식, 물질의 생산을 할 수 있는 스캐폴드 의존성의 세포를 의미한다. 부착성 줄기 세포로서는, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 신경계 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 생식 줄기 세포 등을 들 수 있다. 부착성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
포유 동물 줄기 세포는 생체 내에서 분리된 것이라도, 인 비트로에서 계대 배양된 것이라도 좋다.
본 발명의 현탁액에 포함되는 포유 동물 줄기 세포는 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 「단리 또는 정제」란, 목적으로 하는 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 실시되어 있음을 의미한다. 단리 또는 정제된 포유 동물 줄기 세포의 순도(전체 세포수에 대한 포유 동물 줄기 세포수의 비율)는 통상 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예컨대 100%)이다.
본 발명의 현탁액에 포함되는 포유 동물 줄기 세포는 단일 세포(싱글 셀)의 상태의 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 「단일 세포의 상태」란, 다른 세포와 모여 덩어리를 형성하지 않은 것(즉, 응집하지 않은 상태)을 의미한다. 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포는 인 비트로에서 배양한 포유 동물 줄기 세포를 트립신/EDTA 등으로 효소 처리함으로써 조제할 수 있다. 포유 동물 줄기 세포 중에 포함되는 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포의 비율은 통상 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예컨대 100%)이다. 단일 세포의 상태의 세포 비율은 포유 동물 줄기 세포를 PBS에 분산하고, 이것을 현미경 하에서 관찰하여, 무작위로 선택된 복수 개(예, 1000개)의 세포에 관해서 응집의 유무를 조사함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 현탁액에 있어서, 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 부유되어 있다. 본 명세서에서 「부유」란, 세포가 현탁액을 수용한 용기의 내벽에 접촉하지 않고, 현탁액 중에 유지되어 있음을 말한다.
본 발명의 현탁액은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함한다. 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 이들 다당류는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명의 현탁액에 있어서는 포유 동물 줄기 세포의 응집이 억제되고 있다. 본 명세서에서 「응집」이란, 2개 이상의 세포가 모여 덩어리가 되는 현상을 말한다.
특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유하고, 또한 단일 세포의 상태에서는 응집되기 쉽지만, 상기 다당류에 의해 효과적으로 응집을 억제하여, 단일 세포의 상태를 장시간 유지할 수 있다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, 줄기 세포 현탁액 중에 상기 다당류가 포함되면, 현탁액 중의 세포의 부유 상태가 비교적 장시간 유지되어, 세포의 침전이 억제되어, 세포끼리의 접촉이 억제된다. 또한, 일반적으로, 부착성 세포는 장시간 부유 상태에 노출되면, 세포에 스트레스가 걸리기 때문에, 부유 시간에 의존하여 디쉬 등에 접착하고자 돌기를 내미는 것이 알려져 있지만, 상기 다당류(특히 트레할로스)는 세포에게 주는 스트레스가 경미하기 때문에, 이 돌기의 형성이 억제된다. 이러한 작용과 더불어, 상기 다당류는 우수한 포유 동물 줄기 세포 응집의 억제 효과를 발휘한다고 생각된다.
또한, 후술하는 실시예에 나타내는 것과 같이, 상기 다당류는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과를 갖는다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 현탁액에 있어서는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하가 억제되고 있다. 특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유된 상태(특히, 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태)에서는 데미지를 받기 쉬워, 생존율이 저하되기 쉽지만, 상기 다당류의 첨가에 의해 부착성 줄기 세포의 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 현탁액에 이용할 수 있는 트레할로스에는 α,α-트레할로스, α,β-트레할로스 및 β,β-트레할로스의 3종이 존재한다. 트레할로스의 종류는 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 α,α-트레할로스가 이용된다.
본 발명의 현탁액에 이용할 수 있는 히드록시에틸 전분의 중량 평균 분자량(Mw)은 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 5×104~67×104, 바람직하게는 7×104~60×104, 보다 바람직하게는 7×104~20×104의 범위 내이다.
포유 동물 줄기 세포의 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제하는 효과를 강화한다는 관점에서는, 비교적 낮은 중량 평균 분자량(Mw)(예컨대, 5×104~9×104, 바람직하게는 6×104~8×104(예, 7×104))의 히드록시에틸 전분을 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 현탁액에 이용할 수 있는 히드록시에틸 전분의 치환도(1 글루코오스 단위당 히드록시에틸기의 수)도 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.4~0.8의 범위 내이다.
본 발명의 현탁액에 이용할 수 있는 히드록시에틸 전분의 적합한 예로서, 중량 평균 분자량(Mw)이 7×104, 치환도가 0.50~0.55인 히드록시에틸 전분, 중량 평균 분자량(Mw)이 20×104, 치환도가 0.50~0.55인 히드록시에틸 전분 등을 들 수 있다. 이들 히드록시에틸 전분은 예컨대 헤스판다(등록상표)로서 프레제니우스 카비 재팬 주식회사로부터 시판되고 있다.
본 발명의 현탁액에 이용할 수 있는 덱스트란은 D-글루코오스로 이루어지는 다당(C6H10O5)n이며, α1→6 결합을 주쇄로 하는 것이다. 덱스트란의 종류는 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 덱스트란의 중량 평균 분자량(Mw)도 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 덱스트란 40(Mw=40000), 덱스트란 70(Mw=70000) 등을 적합한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 현탁액 중의 상기 다당류의 농도는 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제하기에 충분한 농도라면, 특별히 한정되지 않는다. 상기 다당류의 농도가 높을수록 응집 및/또는 생존율 저하를 억제하는 효과는 높아지지만, 상기 다당류 농도가 너무 높으면, 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다.
예컨대, 상기 다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 본 발명의 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제하는 효과를 발휘하고, 또한 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향이 억제된 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 본 발명의 현탁액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 본 발명의 현탁액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
본 발명의 현탁액은 바람직하게는 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함한다. 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 트레할로스와 조합함으로써, 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되는 것을 기대할 수 있다. 특히, 현탁액 중에 부유된 부착성 줄기 세포(특히, 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태의 부착성 줄기 세포)의 생존율 저하를 효과적으로 억제하는 것이 기대된다.
트레할로스와, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 조합하여 이용하는 경우에 있어서의 본 발명의 현탁액 중의 각 다당류의 농도는, 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 각각 단독으로 이용한 경우보다도, 트레할로스와, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 조합하여 이용한 경우 쪽이 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되도록 설정된다.
본 발명의 현탁액에 있어서는, 포유 동물 줄기 세포가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중에 현탁되어 있다. 생리적 수용액은, 바람직하게는 생리 식염수, 인산 완충화 생리 식염수, 트리스 완충화 생리 식염수, HEPES 완충화 생리 식염수, 링거액, 5% 글루코오스 수용액, 포유 동물 배양용의 액체 배지, 등장제(포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 락토오스, 염화나트륨 등)의 수용액 등의 등장 수용액이다. 본 명세서에 있어서 「등장」이란, 침투압이 250~380 mOsm/l의 범위 내임을 의미한다.
생리적 수용액은 또한 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 완충제(예컨대, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 킬레이트제(예컨대, EDTA, EGTA, 시트르산, 살리실레이트), 용해보조제, 보존제, 산화방지제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 현탁액은, 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액(바람직하게는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 등장 수용액)에 현탁함으로써 제조할 수 있다. 상기 생리적 수용액 중의 각 다당류의 농도는 상기 본 발명의 현탁액 중의 각 다당류의 농도와 마찬가지다. 본 발명은 이러한 포유 동물 줄기 세포 현탁액의 제조 방법도 제공한다.
포유 동물 줄기 세포를 상기 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것에는, 포유 동물 줄기 세포의 현탁액에 상기 다당류를 첨가하여, 포유 동물 줄기 세포 및 상기 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 얻는 것도 포함된다.
포유 동물 줄기 세포의 상기 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중에의 현탁은 피펫팅이나 태핑 등의 이 기술 분야에서 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명 현탁액의 온도는 통상 0~37℃, 바람직하게는 0~25℃의 범위 내이다.
본 발명 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 밀도는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의한 포유 동물 줄기 세포의 응집 및/또는 생존율 저하를 억제하는 효과가 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 103~1010 개/ml의 범위 내이다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 현탁액에서는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의해 포유 동물 줄기 세포의 응집이 억제되고 있기 때문에, 이것을 이용하여 줄기 세포 이식을 실시함으로써, 줄기 세포의 응집물이 캐뉼라 중에 가득 차 막히거나, 폐정맥 등의 가는 혈관 중에 색전을 형성해 버리는 리스크를 저감할 수 있다. 또한, 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 현탁액에서는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의해 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하가 억제되기 때문에, 본 발명의 현탁액을 이용하면, 보다 상태가 좋은 줄기 세포에 의해 줄기 세포 이식을 실시할 수 있어, 치료 효과의 향상을 기대할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 본 발명의 현탁액을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액 제제도 제공하는 것이다.
본 발명의 포유 동물 줄기 세포 현탁액 제제는 상기 본 발명의 현탁액을 적절한 멸균 용기 내에 수용함으로써 제조할 수 있다. 상기 용기로서는 병, 바이알, 시린지, 수액 백 등의 가소성의 백, 시험관 등을 들 수 있다. 이들 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 각종 재료로 형성할 수 있다. 이들 용기에는, 용기 내의 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 환자에게 점적 주입 가능하게 하도록 캐뉼라 및/또는 주사 바늘을 접속할 수 있다.
II. 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제
(1. 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제)
본 발명은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제를 제공하는 것이다. 이들 다당류에 의해, 특히 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포(즉, 부유된 포유 동물 줄기 세포)의 응집이 억제된다.
「트레할로스」, 「히드록시에틸 전분」, 「덱스트란」, 「포유 동물」, 「줄기 세포」, 「부착성」, 「단리 또는 정제」, 「단일 세포의 상태」, 「부유」, 「응집」, 「등장」, 「생리적 수용액」 등의 각 용어의 정의는 특별히 양해를 구하지 않는 한, 상기 I의 항에 기재한 것과 같다.
본 발명의 응집 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 부착성 줄기 세포이다. 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에서는(즉, 부유된 상태에서는) 보다 응집되기 쉽기 때문이다. 부착성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
포유 동물 줄기 세포는 생체 내에서 분리된 것이라도, 인 비트로에서 계대 배양된 것이라도 좋다.
본 발명의 응집 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 응집 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 단일 세포(싱글 셀)의 상태의 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 포유 동물 줄기 세포 중에 포함되는 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포의 비율은 통상 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예컨대 100%)이다.
본 발명의 응집 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 그 줄기 세포의 현탁액 중에 부유되어 있다.
특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태에서는 응집되기 쉽지만, 본 발명의 응집 억제제에 의해 효과적으로 응집을 억제할 수 있어, 단일 세포의 상태를 장시간 유지할 수 있다.
본 발명의 응집 억제제는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1, 2 또는 3종의 다당류를 포함한다. 본 발명의 응집 억제제가 이들 군에서 선택되는 2종, 3종의 다당류를 포함하는 경우에 있어서의 다당류의 조합은, 트레할로스와 히드록시에틸 전분의 조합, 트레할로스와 덱스트란의 조합, 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합 또는 트레할로스와 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합이다.
본 발명의 응집 억제제는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류 그 자체라도 좋고, 생리학적으로 허용되는 담체를 더 포함하고 있더라도 좋다. 생리학적으로 허용되는 담체로서는, 예컨대 생리적 수용액(예컨대, 생리 식염수, 인산 완충화 생리 식염수, 트리스 완충화 생리 식염수, HEPES 완충화 생리 식염수, 링거액, 5% 글루코오스 수용액, 포유 동물 배양용의 액체 배지, 등장제(포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 락토오스, 염화나트륨 등)의 수용액 등의 등장 수용액), 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 완충제(예컨대, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 킬레이트제(예컨대, EDTA, EGTA, 시트르산, 살리실레이트), 부형제, 결합제, 용해보조제, 보존제, 산화방지제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 응집 억제제는 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액(생리적 수용액 중의 상기 다당류의 용액)이며, 보다 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 등장 수용액이다.
본 발명의 응집 억제제는 포유 동물 줄기 세포의 현탁액에 첨가함으로써 이용할 수 있다. 혹은, 본 발명의 응집 억제제가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액인 경우에는, 본 발명의 응집 억제제에 의해 포유 동물 줄기 세포를 현탁하더라도 좋다. 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 상기 다당류의 농도가 달성되도록, 본 발명의 응집 억제제가 첨가되거나 또는 본 발명의 응집 억제제에 의해 포유 동물 줄기 세포가 현탁된다.
상기 다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 트레할로스 농도는 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 트레할로스 농도가 높을수록 응집의 억제 효과는 높아지지만, 트레할로스 농도가 지나치게 높으면, 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 이 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 덱스트란의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3종의 다당류를 이용하는 경우에는, 결과적으로 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 응집이 억제되도록, 본 발명의 응집 억제제가 첨가되거나 또는 본 발명의 응집 억제제에 의해 포유 동물 줄기 세포가 현탁된다.
본 발명의 응집 억제제 중에는, 상기와 같이 사용했을 때에, 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 양의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류가 함유된다. 본 발명의 응집 억제제 중의 상기 다당류의 함유량은 통상 0.001~100 (w/w)%의 범위 내이다.
본 발명의 응집 억제제가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액인 경우, 상기 수용액 중의 상기 다당류의 농도는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 다당류의 농도가 높을수록 응집을 억제하는 효과는 높아지지만, 상기 다당류 농도가 지나치게 높으면, 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다.
예컨대, 상기 다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피하기 위해서, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 트레할로스 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3종의 다당류를 이용하는 경우에도, 결과적으로 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하도록 상기 수용액에 각 다당류가 포함된다.
이러한 농도로 조제된 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 포유 동물 줄기 세포를 현탁함으로써 간편하게 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제할 수 있다.
(2. 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법)
본 발명은, 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액(바람직하게는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 등장 수용액)에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법을 제공하는 것이다. 이들 다당류에 의해, 특히 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포(즉, 부유된 포유 동물 줄기 세포)의 응집이 억제된다.
포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것에는, 포유 동물 줄기 세포의 현탁액에 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 첨가하여, 그 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중의 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 얻는 것도 포함된다.
「트레할로스」, 「히드록시에틸 전분」, 「덱스트란」, 「포유 동물」, 「줄기 세포」, 「부착성」, 「단리 또는 정제」, 「단일 세포의 상태」, 「부유」, 「응집」, 「등장」, 「생리적 수용액」 등의 각 용어의 정의는 특별히 양해를 구하지 않는 한, 상기 I의 항에 기재한 것과 같다.
본 발명의 응집의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 부착성 줄기 세포이다. 부착성의 줄기 세포는 현탁액 중에서는(즉, 부유된 상태에서는) 보다 응집되기 쉽기 때문이다. 부착성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
포유 동물 줄기 세포는 생체 내에서 분리된 것이라도, 인 비트로에서 계대 배양된 것이라도 좋다.
본 발명의 응집의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 응집의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 단일 세포(싱글셀) 상태의 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 포유 동물 줄기 세포 중에 포함되는 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포의 비율은 통상 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예컨대 100%)이다.
특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태에서는 응집되기 쉽지만, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의해 효과적으로 응집을 억제할 수 있어, 단일 세포의 상태를 장시간 유지할 수 있다.
본 발명에 이용하는 생리적 수용액에는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1, 2 또는 3종의 다당류를 포함한다. 상기 생리적 수용액이 이들 군에서 선택되는 2종 또는 3종의 다당류를 포함하는 경우에 있어서의 다당류의 조합은 트레할로스와 히드록시에틸 전분의 조합, 트레할로스와 덱스트란의 조합, 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합 또는 트레할로스와 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합이다.
본 발명에 이용하는 생리적 수용액에는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도의 상기 다당류가 포함된다.
상기 다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 상기 생리적 수용액 중의 트레할로스 농도는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는, 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피하기 위해서, 상기 생리적 수용액 중의 트레할로스 농도는 바람직하게는 362.4 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 생리적 수용액 중의 트레할로스 농도는 바람직하게는 4.53~362.4 mg/ml, 보다 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 상기 생리적 수용액 중의 히드록시에틸 전분 농도는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피하기 위해서, 상기 생리적 수용액 중의 히드록시에틸 전분 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 생리적 수용액 중의 히드록시에틸 전분 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 상기 생리적 수용액 중의 덱스트란 농도는 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는, 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피하기 위해서, 상기 생리적 수용액 중의 덱스트란 농도는 통상 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 생리적 수용액 중의 덱스트란 농도는 통상 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3종의 다당류를 이용하는 경우에도, 결과적으로 포유 동물 줄기 세포의 응집을 억제할 수 있도록 생리적 수용액 중에 각 다당류가 포함된다.
포유 동물 줄기 세포를 현탁할 때의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액의 온도는 통상 0~37℃, 바람직하게는 0~25℃의 범위 내이다.
현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 밀도는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의한 응집의 억제 효과가 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 103~1010 개/ml의 범위 내이다.
포유 동물 줄기 세포의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중에의 현탁은 피펫팅이나 태핑 등의 이 기술 분야에서 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 이러한 조작에 의해, 포유 동물 줄기 세포가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중을 부유한다.
III. 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제
(1. 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제)
본 발명은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제를 제공하는 것이다. 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제가 이들 군에서 선택되는 2종 또는 3종의 다당류를 포함하는 경우, 트레할로스와 히드록시에틸 전분의 조합, 트레할로스와 덱스트란의 조합, 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합 또는 트레할로스와 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합에 의해, 특히 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포(즉, 부유된 포유 동물 줄기 세포)의 생존율 저하가 억제된다.
「트레할로스」, 「히드록시에틸 전분」, 「덱스트란」, 「포유 동물」, 「줄기 세포」, 「부착성」, 「단리 또는 정제」, 「단일 세포의 상태」, 「부유」, 「응집」, 「등장」, 「생리적 수용액」 등의 각 용어의 정의는 특별히 양해를 구하지 않는 한, 상기 I의 항에 기재한 것과 같다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 부착성 줄기 세포이다. 부착성의 줄기 세포는 비부착성의 세포와 비교하여 현탁액 중에서는(즉, 부유된 상태에서는) 보다 생존율이 저하되기 쉽기 때문이다. 부착성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
포유 동물 줄기 세포는 생체 내에서 분리된 것이라도, 인 비트로에서 계대 배양된 것이라도 좋다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 단일 세포(싱글 셀)의 상태의 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 포유 동물 줄기 세포 중에 포함되는 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포의 비율은 통상 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예컨대 100%)이다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제의 적용 대상이 되는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 그 줄기 세포의 현탁액 중에 부유되어 있는 것이다.
특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태에서는 데미지를 받기 쉬워, 생존율이 저하되기 쉽지만, 본 발명의 생존율 저하의 억제제에 의해 생존율의 저하를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제는 바람직하게는 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함한다. 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 트레할로스와 조합함으로써, 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되는 것을 기대할 수 있다. 특히, 현탁액 중에 부유된 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유된 상태(특히, 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태의 부착성 줄기 세포)의 생존율 저하를 효과적으로 억제하는 것을 기대할 수 있다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류로 이루어지는 것이라도 좋고, 이들 구성 인자에 더하여 더욱 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있더라도 좋다. 생리학적으로 허용되는 담체로서는 예컨대 생리적 수용액(예컨대, 생리 식염수, 인산 완충화 생리 식염수, 트리스 완충화 생리 식염수, HEPES 완충화 생리 식염수, 링거액, 5% 글루코오스 수용액, 포유 동물 배양용의 액체 배지, 등장제(포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 락토오스, 염화나트륨 등)의 수용액 등의 등장 수용액), 안정제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 완충제(예컨대, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 킬레이트제(예컨대, EDTA, EGTA, 시트르산, 살리실레이트), 부형제, 결합제, 용해보조제, 보존제, 산화방지제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 생존율 저하의 억제제는 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종, 2종 또는 3종의 다당류를 포함하는 생리적 수용액(생리적 수용액 중의 상기 다당류 용액)이며, 보다 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종, 2종 또는 3종의 다당류를 포함하는 등장 수용액이다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제는 포유 동물 줄기 세포의 현탁액에 첨가함으로써 이용할 수 있다. 혹은, 본 발명의 생존율 저하의 억제제가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액인 경우에는, 본 발명의 생존율 저하의 억제제에 의해 포유 동물 줄기 세포를 현탁하더라도 좋다. 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 상기 다당류의 농도가 달성되도록, 본 발명의 생존율 저하의 억제제가 첨가되거나 또는 본 발명의 생존율 저하의 억제제에 의해 포유 동물 줄기 세포가 현탁된다.
다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 트레할로스 농도는 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 트레할로스 농도가 높을수록 생존율 저하를 억제하는 효과는 높아지지만, 트레할로스 농도가 지나치게 높으면, 반대로 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 이 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 트레할로스 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 히드록시에틸 전분 농도는 통상 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 히드록시에틸 전분 농도가 높을수록 생존율 저하를 억제하는 효과는 높아지지만, 히드록시에틸 전분 농도가 지나치게 높으면, 반대로 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 이 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분 농도는 통상 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 히드록시에틸 전분 농도는 통상 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 덱스트란 농도는 통상 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 덱스트란 농도가 높을수록 생존율 저하를 억제하는 효과는 높아지지만, 덱스트란 농도가 지나치게 높으면, 반대로 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 이 악영향을 피한다는 관점에서, 현탁액 중의 덱스트란 농도는 통상 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 현탁액 중의 덱스트란 농도는 통상 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 다당류로서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분; 트레할로스 및 덱스트란; 혹은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란을 포함하는 조합을 이용하는 경우에는, 현탁액 중의 각 다당류의 농도는 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 각각 단독으로 이용한 경우보다도 이들 조합을 이용한 경우 쪽이 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되도록 설정된다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제 중에는, 상기와 같이 사용했을 때에, 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 양의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류가 함유된다. 본 발명의 생존율 저하의 억제제 중의 상기 다당류의 함유량은 통상 0.001~100 (w/w)%의 범위 내이다.
다당류로서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 이용하는 경우에는, 본 발명의 생존율 저하의 억제제 중의 트레할로스의 함유량은 통상 0.001~99.999 (w/w)%의 범위 내이며, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란의 함유량은 통상 0.001~99.999 (w/w)%의 범위 내이다.
다당류로서, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란을 포함하는 조합을 이용하는 경우에는, 본 발명의 생존율 저하의 억제제 중의 각 다당류의 함유량은 각각 통상 0.001~99.997 (w/w)%의 범위 내이다.
본 발명의 생존율 저하의 억제제가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액인 경우, 그 수용액 중의 상기 다당류의 농도는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 다당류의 농도가 높을수록 생존율 저하를 억제하는 효과는 높아지지만, 상기 다당류 농도가 지나치게 높으면, 줄기 세포의 생존율에 악영향을 미칠 가능성이 있다.
예컨대, 다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 그 수용액 중의 트레할로스 농도는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분하도록 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 악영향을 피하기 위해서, 그 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 다당류로서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분; 트레할로스 및 덱스트란; 혹은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란을 포함하는 조합을 이용하는 경우에는, 상기 수용액 중의 각 다당류의 농도는 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 각각 단독으로 이용한 경우보다도 이들의 조합을 이용한 경우 쪽이 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되도록 설정된다.
이러한 농도로 조정된 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 포유 동물 줄기 세포를 현탁함으로써 간편하게 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제할 수 있다.
(2. 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법)
본 발명은 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종, 2종 또는 3종 다당류를 포함하는 생리적 수용액(바람직하게는, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종, 2종 또는 3종의 다당류를 포함하는 등장 수용액)에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법을 제공하는 것이다. 2종 또는 3종의 다당류를 조합하여 이용하는 경우, 트레할로스와 히드록시에틸 전분의 조합, 트레할로스와 덱스트란의 조합, 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합 또는 트레할로스와 히드록시에틸 전분과 덱스트란의 조합에 의해, 특히 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포(즉, 부유된 포유 동물 줄기 세포)의 생존율 저하가 억제된다.
포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것에는, 포유 동물 줄기 세포의 현탁액에 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 첨가하여, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중의 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 얻는 것도 포함된다.
「트레할로스」, 「히드록시에틸 전분」, 「덱스트란」, 「포유 동물」, 「줄기 세포」, 「부착성」, 「단리 또는 정제」, 「단일 세포의 상태」, 「부유」, 「응집」, 「등장」, 「생리적 수용액」 등의 각 용어의 정의는 특별히 양해를 구하지 않는 한, 상기 I의 항에 기재한 것과 같다.
본 발명의 생존율 저하의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 바람직하게는 부착성 줄기 세포이다. 부착성의 줄기 세포는 비부착성의 세포와 비교하여 현탁액 중에서는(즉, 부유된 상태에서는) 보다 생존율이 저하되기 쉽기 때문이다. 부착성 줄기 세포는 바람직하게는 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포이다.
포유 동물 줄기 세포는 생체 내로부터 분리된 것이라도, 인 비트로에서 계대 배양된 것이라도 좋다.
본 발명의 생존율 저하의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 생존율 저하의 억제 방법에 이용하는 포유 동물 줄기 세포는 단일 세포(싱글 셀)의 상태의 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 포유 동물 줄기 세포 중에 포함되는 단일 세포의 상태의 포유 동물 줄기 세포의 비율은 통상 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예컨대 100%)이다.
특히, 부착성 줄기 세포는 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태에서는 데미지를 받기 쉬워, 생존율이 저하되기 쉽지만, 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류에 의해 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 이용하는 생리적 수용액에는 바람직하게는 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합이 포함된다. 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 트레할로스와 조합함으로써, 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되는 것을 기대할 수 있다. 특히, 현탁액 중에 부유된 부착성 줄기 세포(특히, 현탁액 중에 부유되고, 또한 단일 세포의 상태의 부착성 줄기 세포)의 생존율 저하를 효과적으로 억제하는 것을 기대할 수 있다.
트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중의 상기 다당류의 농도는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 농도라면 특별히 한정되지 않는다.
다당류로서 트레할로스를 이용하는 경우, 그 수용액 중의 트레할로스 농도는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분하도록 통상 4.53 mg/ml 이상, 바람직하게는 15.1 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피하기 위해서, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 362.4 mg/ml 이하, 바람직하게는 181.2 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 트레할로스 농도는 통상 4.53~362.4 mg/ml, 바람직하게는 15.1~181.2 mg/ml이다.
트레할로스 이외의 상기 다당류를 이용하는 경우에도, 트레할로스에 준하여, 현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하기에 충분한 농도를 적절하게 설정할 수 있다.
상기 다당류로서 히드록시에틸 전분을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 히드록시에틸 전분의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~100 mg/ml이다.
상기 다당류로서 덱스트란을 이용하는 경우, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1 mg/ml 이상, 바람직하게는 10 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 30 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 65 mg/ml 이상이다. 또한, 줄기 세포의 생존율에 미치는 악영향을 피한다는 관점에서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 500 mg/ml 이하, 바람직하게는 200 mg/ml 이하, 보다 바람직하게는 125 mg/ml 이하, 더욱 바람직하게는 100 mg/ml 이하이다. 따라서, 상기 수용액 중의 덱스트란의 농도는 예컨대 1~500 mg/ml, 바람직하게는 10~200 mg/ml, 보다 바람직하게는 30~125 mg/ml, 더욱 바람직하게는 30~100 mg/ml, 더욱 보다 바람직하게는 65~100 mg/ml이다.
또한, 다당류로서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분; 트레할로스 및 덱스트란; 혹은 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란을 포함하는 조합을 이용하는 경우에는, 그 수용액 중의 각 다당류의 농도는 바람직하게는 트레할로스, 히드록시에틸 전분 또는 덱스트란을 각각 단독으로 이용한 경우보다도 이들 조합을 이용한 경우 쪽이 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과가 증강되도록 설정된다.
포유 동물 줄기 세포를 현탁할 때의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액의 온도는 통상 0~37℃, 바람직하게는 0~25℃의 범위 내이다.
현탁액 중의 포유 동물 줄기 세포의 밀도는 트레할로스에 의한 응집의 억제 효과가 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 103~1010 개/ml의 범위 내이다.
포유 동물 줄기 세포의 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중에의 현탁은 피펫팅이나 태핑 등의 이 기술 분야에서 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 이러한 조작에 의해, 포유 동물 줄기 세포가 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액 중을 부유한다.
간행물, 특허문헌 등을 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 인용에 의해 이들이 개개로 구체적으로 참고로서 원용되고 또한 그 내용 전체가 구체적으로 기재되어 있는 것과 같은 정도까지 본 명세서에 원용된다.
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하에 나타내는 실시예에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
1. 돼지 피하 지방 유래 간엽계 줄기 세포(Pig AT-MSC)의 조제
(1) 돼지 조직의 조제
돼지 피하 지방을 서혜부로부터 채취한 후, 시인 가능한 혈관이나 근(筋) 등 지방 조직과 다른 조직을 마이크로 가위로 제거하고, 그 후, 세절(細切)과 HBSS(행크스 용액)에 의한 세정을 수회 반복했다. 시각적으로, 혈구(또는 혈괴)의 제거 및 근 등의 막상(膜狀) 부유 물질의 제거를 확인할 수 있을 때까지 세정 작업을 계속했다. 얻어진 돼지 피하 지방을 가위에 의해 세절했다.
세절된 조직을 동량의 HBSS와 섞었다. 혼합물을 느리게 진탕한 후, 정치함으로써 2층으로 분리시켰다. 상층만을 회수했다. 회수된 상층에 0.2% 콜라게나아제(Type I)/HBSS를 가하여, 37℃ 하에서 느리게 지방이 완전히 액상으로 될 때까지 진탕했다(최대 90분간). 반응액에 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 αMEM을 콜라게나아제 반응 액량에 대하여 등량 이상 가하여 혼합한 후, 혼합물을 원심 분리함으로써 3층으로 분리시켰다(아래부터 유핵 세포·용액·지방). 하층만을 회수하여, HBSS로 재현탁했다. 이 조작을 3회 반복하고, 마지막으로 10% FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁한 세포 현탁액을 배양 접시로 옮겨 배양했다. MSC는 배양 접시의 바닥면에 접착했다.
(2) 실험에 이용하는 세포(Pig AT-MSC P6)의 조제
(1)의 조작으로 배양 접시에 접착한 MSC는 증식을 계속하여, 5~7일 후에 배양 접시 바닥면은 꽉 세포로 메워졌다. 컨플루언트에 도달하면 MSC는 증식 정지 또는 세포사가 유도되기 때문에, 컨플루언트 도달 전에, MSC를 배양 접시로부터 박리하여, 새로운 배양 접시에 저밀도로 파종했다. 배양 접시의 바닥면에 접착되어 있는 MSC를 PBS로 3회 세정한 후, 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)을 가하고, MSC를 배양 접시로부터 박리한 후, 세포가 저밀도가 되는 양의 10%의 FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁하여, 새로운 배양 접시로 옮겼다. 이 조작을 6회 반복했다(6회 계대=P6).
(3) 각 액에 의한 세포의 현탁
(2)에서 얻은 Pig AT-MSC P6을 실험에 이용했다.
10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 각 용액{ET-kyoto(ET-K, 오츠까세이야꾸고죠사 제조), HBSS, MSCM(DMEM+10% FBS)}으로 재차 순화 세정을 1회 행했다. 한편, ET-K 중에는 45.3 mg/ml 농도의 트레할로스가 포함된다. 그 후, 각 용액을 이용하여 2.5×105 cells/50 μL가 되도록 현탁했다.
현탁액을 각 온도(0, 25, 37℃)에서 정치하고, 0, 30, 60, 120, 240분 후에 20 μL 피펫맨으로 수회 피펫팅하여, 10 μL를 디쉬로 옮겼다.
디쉬 상의 현탁액의 가장 하면에 실체 현미경의 초점을 맞춰, 관찰을 했다.
현미경 하에서 인접하는 세포 덩어리를 형성하고 있는 것을 세포 응집 덩어리로 했다. 세포 응집 덩어리는, 디쉬를 현미경의 스테이지 상에서 흔들어, 명백히 덩어리로서 움직이고 있음을 확인했다.
2. 세포 생존율의 검토
각 조건의 세포 생존율에의 영향을 검토했다.
50 μL당 생존하고 있는 세포수를 트리판블루 염색으로 산출하여, 스타트 시점에서 50 μL 중에 생존하고 있었던 세포수(2.5×105개)와 비교함으로써 세포의 생존율을 산출했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
MSCM 또는 HBSS를 이용한 경우에는 시간의 경과와 함께 현저한 세포 생존율의 저하가 확인되었지만, ET-K에서는 생존율 저하가 억제되었다.
3. 세포 응집 상태의 검토
MSCM을 이용한 경우에는, 25℃ 및 37℃에서는 시험 개시 30분 후부터 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다. 0℃에서도 시험 개시 60분 후부터 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다.
HBSS를 이용한 경우에는, 25℃ 및 37℃에서는 시험 개시 120분 후부터 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다. 0℃에서도 시험 개시 240분 후에는 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다.
한편, ET-K를 이용한 경우에는, 25℃ 및 37℃에서는 시험 개시 120분 후까지는 세포 응집 덩어리의 형성은 확인되지 않고, 시험 개시 240분 후에 약간의 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다. 0℃에서는 시험 개시 240분 후에도 세포 응집 덩어리의 형성은 확인되지 않았다. 어느 온도에 있어서도, ET-K를 이용한 경우에는 세포의 부유 상태가 시험 개시 240분 후까지 유지되고 있었다.
4. 세포 형태의 검토
MSCM을 이용한 경우에는, 돌기를 내미는 세포가 약간 확인되었다. 팽창된 세포의 출현율은 낮았다.
HBSS를 이용한 경우에는, 돌기를 내미는 세포의 비율이 시간이 경과함에 따라 증가했다. 또한, 팽창된 세포의 출현율이 높았다.
한편, ET-K를 이용한 경우에는, 돌기를 내미는 세포의 비율은 MSCM 및 HBSS와 비교하여 적었다. 팽창된 세포의 출현율도 MSCM 및 HBSS와 비교하여 낮았다.
일반적으로, 부착성 세포는 부유 시간에 따라 디쉬 등에 접착하려고 돌기를 내미는 것이 알려져 있다. 이것은 부유 상태가 세포에 스트레스를 주기 때문이다. 또한, 세포의 팽창은 세포질 내외의 침투압 조절력이 저하하고 있음을 보이고 있다고 생각된다. 이상의 세포 형태의 관찰 결과로부터, ET-K는 다른 조성액과 비교하여 세포에 주는 스트레스가 경미하다고 생각되었다.
[실시예 2]
실시예 1에서 조제한 돼지 피하 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 2회 계대하여 얻어진 세포(Pig AT-MSC P2)를 10 cm 디쉬 3장에 뿌렸다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포(1.7×106개, 생존율: 94.1%)를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 5 mL의 ET-kyoto(ET-K, 오츠까세이야꾸고죠사 제조)에 현탁했다. ET-K 중의 세포 현탁액을 10개의 15 mL 튜브에 500 μL씩 분주하여, 10분간 실온(25℃)에서 정치했다. 적량의 생리 식염수를 각 튜브에 가함으로써, ET-K 중의 세포 현탁액을 2~10배로 희석하여, 더욱 30분 정치했다. 그 후, 실시예 1과 마찬가지로 생존율을 산출하여, 세포 응집 덩어리의 유무를 관찰했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
(세포 응집성)
ET-K의 원액, 그 2배 희석액 및 3배 희석액을 이용한 경우에는, 세포 응집 덩어리는 관찰되지 않았다. ET-K를 4배 이상 희석하면, 세포가 2~3개 결합된 응집 덩어리가 약간 확인되었다. 따라서, 적어도 15.1 mg/ml 이상의 트레할로스 농도에 있어서 줄기 세포의 응집의 억제 효과가 발휘되는 것이 시사되었다.
(세포 부유성)
세포 응집성을 관찰한 후, 세포를 재차 현탁하여, 실온(25℃)에서 10분간 정치 후, 현미경 하에서 세포의 부유성을 관찰했다. ET-K의 원액, 그 2배 희석액 및 3배 희석액을 이용한 경우에는 세포는 안정적으로 부유되고 있었다. 한편, ET-K를 8배 이상 희석하면, MSCM이나 HBSS와 거의 변화 없이 세포는 침전되었다. 따라서, 적어도 15.1 mg/ml 이상의 트레할로스 농도에 있어서 줄기 세포가 안정적으로 부유되는 것이 시사되었다.
(세포 형태 및 생존율)
ET-K를 생리 식염수에 의해 희석하더라도 시험한 희석율의 범위 내에서는 세포 형태 및 생존율의 의미 있는 변화는 확인되지 않았다.
[실시예 3]
실시예 1에서 조제한 돼지 피하 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 10회 계대하여 얻어진 세포(Pig AT-MSC P10)를 10 cm 디쉬에 뿌렸다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포(3.3×108개, 생존율: 98.5%)를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심에 의해 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 5 mL의 ET-Kyoto(ET-K, 오츠까세이야꾸고죠사 제조)에 현탁했다. ET-K 중의 세포 현탁액을 4℃에서 5시간 또는 27시간 정치했다. 그 후, 실시예 1과 마찬가지로 생존율을 산출하여, 세포 응집 덩어리의 유무를 관찰했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 5시간 또는 27시간 정치 후, 더욱 세포를 24시간 배양하고, 그 후 세포의 형태를 현미경 하에서 관찰했다.
(세포 응집성)
디쉬로부터 박리 후, ET-K에 현탁한 상태에서 세포를 4℃에서 정치한 결과, 5시간 및 27시간 후의 어느 시점에서도 세포 응집의 형성은 발생하지 않고, 싱글 셀의 상태가 유지되고 있었다. 따라서, ET-K에 의한 세포 응집의 억제 효과는 4℃에 있어서도 발휘되는 것이 나타났다.
(생존율)
5시간 후의 생존율은 78.7%이고, 27시간 후의 생존율은 65.9%였다. 0시간부터 5시간까지는 3.96%/hr, 5시간~27시간까지는 0.58%/hr의 생존율 저하가 확인되었다.
(세포의 형태)
5시간 또는 27시간 정치 후, 더욱 세포를 24시간 배양하면, 생존율에 일치하여 플레이트에 접착된 세포가 확인되었다. 그러나, 27시간 보존 세포에서는 이형태의 세포가 약 10% 확인되었다. 5시간 보존한 세포에서는 이형태 세포의 비율은 1% 이하였다.
[실시예 4]
(1) 인간 골수 유래 MSC(hBM-MSC)의 조제
20~30 mL의 골수 세포를 6000 Unit 헤파린을 포함하는 시린지에 의해 인간 장골(腸骨)로부터 채취했다. 골수 세포는 PBS(-)로 1회 세정하여, 900 g, 20분간의 원심에 의해 세포를 회수하고, 또 한번 반복했다. 10% FBS를 포함하는 αMEM에 현탁하고, 배양 접시로 옮겨 접착 배양을 했다.
(2) 실험에 이용하는 세포(hBM-MSC P3)의 조제
(1)의 조작으로 배양 접시에 접착된 MSC는 증식을 계속하여, 5~7일 후에 배양 접시 바닥면은 꽉 세포로 메워졌다. 컨플루언트에 도달하면 MSC는 증식 정지 또는 세포사가 유도되기 때문에, 컨플루언트 도달 전에, MSC를 배양 접시로부터 박리하여, 새로운 배양 접시에 저밀도로 파종했다. 배양 접시의 바닥면에 접착되어 있는 MSC를 PBS로 3회 세정 후, 트립신-EDTA(0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA·4 Na)를 가하여, MSC를 배양 접시로부터 박리한 후, 세포가 저밀도가 되는 양의 10%의 FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁하여, 새로운 배양 접시로 옮겼다. 이 조작을 3회 반복했다(3회 계대=P3).
인간 골수 세포 유래 MSC를 10 cm 디쉬에 뿌려 배양했다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)으로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 이하의 조성액에 현탁하여, 240분 및 480분 정치 후, 세포의 응집 유무를 관찰했다.
NS: 생리 식염수(오츠까세이야꾸고죠)
H: 헤스판다(교린세이야쿠)
1×T&NS: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠)를 함유하는 생리 식염수
1×T&H: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠)를 함유하는 헤스판다(교린세이야쿠)
1×T&H&TRase: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠) 및 트레할라아제(SIGMA)(2 Unit/mL)를 함유하는 헤스판다(교린세이야쿠)
또한, 트레할로스는 ET-K의 주요한 성분이며, 45.3 mg/mL는 ET-K에 포함되는 트레할로스의 농도이다. 또한, 헤스판다는 히드록시에틸 전분(중량 평균 분자량(Mw) 약 70000, 치환도 0.50~0.55)을 6 (w/v)% 함유하는 히드록시에틸 전분 제제이다.
그 결과, NS 및 H를 이용한 경우에는, 시험 개시 240분 후부터 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다. 한편, 1×T&NS 및 1×T&H를 이용한 경우에는, 시험 개시 240분 후 및 480분 후의 어느 것에서나 세포 응집 덩어리의 형성은 확인되지 않았다. 그러나, 트레할라아제에 의해 트레할로스를 분해하면, 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다.
이상의 결과로부터 ET-K의 세포 응집의 억제 효과는 트레할로스에 의한 것임이 나타났다.
[실시예 5]
(1) 인간 지방 유래 MSC(hBM-MSC)의 조제
인간 피하 지방을 채취한 후, 시인 가능한 혈관이나 근 등 지방 조직과 다른 조직을 마이크로 가위로 제거하고, 그 후, 세절과 HBSS(행크스 용액)에 의한 세정을 수회 반복했다. 시각적으로 혈구(또는 혈괴)의 제거 및 근 등의 막상 부유 물질의 제거를 확인할 수 있을 때까지 세정 작업을 계속했다. 얻어진 인간 피하 지방을 가위에 의해 세절했다.
세절된 조직을 동량의 HBSS와 섞었다. 혼합물을 느리게 진탕한 후, 정치함으로써 2층으로 분리시켰다. 상층만을 회수했다. 회수된 상층에 0.05% 콜라게나아제(Type I)/HBSS를 가하여, 37℃ 하에서 느리게 지방이 완전히 액상으로 될 때까지 진탕했다. 반응액에 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 αMEM을 혼합한 후, 혼합물을 원심 분리함으로써 2층으로 분리시켰다. 하층만을 회수하여, HBSS로 재현탁했다. 이 조작을 3회 반복하고, 마지막으로 10% FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁한 세포 현탁액을 배양 접시로 옮겨 배양했다. MSC는 배양 접시의 바닥면에 접착했다.
(2) 실험에 이용하는 세포(hAT-MSC P3)의 조제
(1)의 조작으로 배양 접시에 접착된 MSC는 증식을 계속하여, 5~7일 후에 배양 접시 바닥면은 꽉 세포로 메워졌다. 컨플루언트에 도달하면 MSC는 증식 정지 또는 세포사가 유도되기 때문에, 컨플루언트 도달 전에, MSC를 배양 접시로부터 박리하여, 새로운 배양 접시에 저밀도로 파종했다. 배양 접시의 바닥면에 접착되어 있는 MSC를 PBS로 3회 세정한 후, 트립신-EDTA(0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA·4 Na)를 가하여, MSC를 배양 접시로부터 박리한 후, 세포가 저밀도가 되는 양의 10%의 FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁하여, 새로운 배양 접시로 옮겼다. 이 조작을 3회 반복했다(3회 계대=P3).
hAT-MSC 및 hBM-MSC를 3회 계대하여 얻어진 세포(hAT-MSC P3 및 hBM-MSC P3)를 10 cm 디쉬에 뿌렸다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정한 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포(hAT-MSC P3: 1.0×105개, 생존율: 98.4%/hBM-MSC P3: 1.25×105개, 생존율: 96.8%)를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 이하의 조성액 100 μL에 현탁하고, 실온(약 25℃)에서 240분 또는 24시간 정치한 후, 세포의 생존율을 측정하여, 세포의 응집 및 형태를 관찰했다. 또한, 240분 또는 24시간 정치 후, 더욱 세포를 12시간 배양하여, 세포의 형태를 관찰했다.
0.1×T&H: 4.53 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠)를 함유하는 헤스판다(교린세이야쿠)
0.1×T&NS: 4.53 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 생리 식염수(오츠까세이야꾸고죠)
1×T&H: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
1×T&NS: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 생리 식염수
2×T&H: 90.6 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
2×T&NS: 90.6 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 생리 식염수
ET-K: ET-Kyoto(오츠까세이야꾸고죠)
H: 헤스판다
NS: 생리 식염수
MSCM: 10% FBS를 함유하는 αMEM
(세포 생존율)
결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
트레할로스 또는 히드록시에틸 전분(헤스판다)을 각각 단독으로 첨가함으로써 세포 생존율의 상승이 확인되었다. 트레할로스 및 히드록시에틸 전분(헤스판다) 양쪽을 첨가함으로써 세포 생존율은 대폭 상승했다.
(세포의 응집 및 형태)
0.1×T&NS에서는, 시험 개시부터 240분 후에 세포 응집 덩어리의 형성이 AT 및 BM 양쪽은 약간 확인되었지만, 조성액 중에 트레할로스를 포함하는 그 밖의 군(0.1×T&H, 1×T&H, 1×T&NS, 2×T&H, 2×T&NS 및 ET-K)에 있어서는 세포 응집 덩어리의 형성은 확인되지 않았다. 조성액 중에 트레할로스를 포함하는 군에 있어서는 세포의 변형은 확인되지 않았다.
조성액 중에 트레할로스도 히드록시에틸 전분도 포함하지 않는 군(NS, MSCM)에 있어서는 현저하게 세포 응집 덩어리 및 세포 변형이 확인되었다. 히드록시에틸 전분만을 포함하는 군(H)에 있어서는 세포 응집 덩어리가 확인되었지만, 세포 변형은 근소했다.
(정치 후의 배양)
트레할로스 첨가의 유무에 관계없이, 생존율에 일치한 접착 세포수의 증감이 확인되었다. 0.1×T를 포함하는 군 및 트레할로스 무첨가군의 일부에서는 세포 형태의 이상이 확인되었다. 한편, NS와 비교하여 H에서는 세포 형태가 양호하고, 생존율에 일치한 세포 접착수의 증감이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 트레할로스는 세포의 응집을 억제하고, 세포의 생존율을 높여, 세포 형태나 기능을 유지할 수 있음이 나타났다. 또한, 히드록시에틸 전분은 세포의 생존율을 높이고, 세포 형태나 기능을 유지할 수 있음이 나타났다. 더욱이, 트레할로스와 히드록시에틸 전분을 조합함으로써 세포의 생존율이 현저히 상승하는 것이 나타났다.
[실시예 6]
hAT-MSC 및 hBM-MSC를 3회 계대하여 얻어진 세포(hAT-MSC P3 및 hBM-MSC P3)를 10 cm 디쉬에 뿌렸다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)으로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포(hAT-MSC P3: 4.25×105개, 생존율: 97.5%/hBM-MSC P3: 5.0×105개, 생존율: 98.2%)를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 이하의 조성액 100 μL에 현탁하고, 실온(약 25℃)에서 8시간 또는 36시간 정치한 후, 세포의 생존율을 측정하여, 세포의 응집을 관찰했다.
1×T&H: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠)를 함유하는 헤스판다(교린세이야쿠)
2×T&H: 90.6 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
4×T&H: 181.2 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
8×T&H: 362.4 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
ET-K: ET-Kyoto(오츠까세이야꾸고죠)
H: 헤스판다
1×T&H&TRase: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스 및 트레할라아제(SIGMA)(2 Unit/mL)를 함유하는 헤스판다
(세포의 응집)
조성액 중에 트레할로스를 포함하는 군(1×T&H, 2×T&H, 4×T&H, 8×T&H 및 ET-K)에 있어서는 hAT-MSC 및 hBM-MSC 양쪽은 시험 개시부터 8시간 후의 세포 응집 덩어리의 형성은 확인되지 않았다. 한편, 트레할로스를 포함하지 않는 헤스판다(H)를 이용한 경우에는, hAT-MSC 및 hBM-MSC 양쪽은 시험 개시부터 8시간 후에 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다. 또한, 트레할라아제에 의해 트레할로스를 분해하면, 세포 응집 덩어리의 형성이 확인되었다(1×T&H&TRase). 이상의 결과로부터, 트레할로스가 세포 응집의 억제 효과를 갖는 것이 나타났다.
(세포 생존율)
시험 개시 36시간 후의 세포 생존율을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4에 나타나는 것과 같이, 어느 농도의 트레할로스를 첨가하더라도 세포의 생존율은 헤스판다 단독(H)과 비교하여 상승했다. 181.2 mg/mL(4×T) 농도의 트레할로스의 첨가까지는 세포 생존율의 현저한 상승을 보였지만, 362.4 mg/mL(8×T)까지 트레할로스 첨가 농도를 높이면, 그 효과는 반대로 감약했다. 따라서, 세포 생존율을 상승시킨다는 관점에서는, 트레할로스 농도는 181.2 mg/mL(4×T) 이하가 바람직하다는 것이 시사되었다.
[실시예 7]
hAT-MSC 및 hBM-MSC를 6 또는 8회 계대하여 얻어진 세포(hAT-MSC P8 및 hBM-MSC P6)를 10 cm 디쉬에 뿌렸다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 헤스판다(교린세이야쿠)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)으로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포(hAT-MSC P8: 2.4×106개/hBM-MSC P6: 2.3×106개)를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, 이하의 조성액에 현탁하여 실온(약 25℃)에서 1시간 정치한 후, 세포의 생존율을 측정하여, 세포의 응집을 관찰했다.
1×T&H: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스(와코쥰야쿠)를 함유하는 헤스판다
0.5×T&H: 22.65 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
0.1×T&H: 4.53 mg/mL D-(+)-트레할로스를 함유하는 헤스판다
1×T&F&H: 45.3 mg/mL D-(+)-트레할로스 및 10 μg/ml 푸코이단(야이즈수이산가가쿠고교)을 함유하는 헤스판다
0.5×T&F&H: 22.65 mg/mL D-(+)-트레할로스 및 10 μg/ml 푸코이단을 함유하는 헤스판다
0.1×T&F&H: 4.53 mg/mL D-(+)-트레할로스 및 10 μg/ml 푸코이단을 함유하는 헤스판다
F&H: 10 μg/ml 푸코이단을 함유하는 헤스판다
ET-K: ET-Kyoto(오츠까세이야꾸고죠)
H: 헤스판다
MSCM: 10% FBS를 함유하는 αMEM
시험 결과를 도 1 및 도 2에 도시한다.
(세포 생존율)
어느 농도의 트레할로스를 첨가하더라도 세포의 생존율은 헤스판다 단독(H)과 비교하여 상승했다. 한편, 푸코이단을 첨가하면, 세포 생존율이 저하하므로, 푸코이단은 세포 독성을 갖는다는 것이 시사되었다. 트레할로스는 푸코이단의 세포 독성을 억제하는 경향을 보였다.
(세포의 응집)
hAT-MSC 및 hBM-MSC 양쪽은 트레할로스의 첨가에 의해 세포 부유 효과 및 세포 응집의 억제 효과가 관찰되었다. 한편, 푸코이단은 세포 부유를 저해하는 경향이 확인되고, 세포 응집의 억제 효과는 확인되지 않았다. 헤스판다만보다도 트레할로스를 첨가한 쪽이 세포의 돌기 형성이 억제되어, 세포의 형태가 좋았다. 0.5×T&H에 의한 세포 응집의 억제 효과는 ET-K와 같은 정도였다. 세포 부유 효과는 ET-K 쪽이 0.5×T&H보다도 약간 우수했다. 0.1×T&H에서는 약간 세포 표면에 돌기가 관찰되었다.
[실시예 8]
실시예 1에서 조제한 돼지 피하 지방 유래 간엽계 줄기 세포를 7회 계대하여 얻어진 세포(Pig AT-MSC P7)를 10 cm 디쉬 상에서 배양했다. 10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정한 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)으로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 하여, ET-K액에 현탁했다. 얻어진 세포 현탁액을 이하의 시험에 이용했다.
(수액 백 내벽에의 접착성 평가)
솔뎀 3AG 수액 백(TERUMO)을 세단하여, 단편을 50 ml 튜브의 벽면에 설치했다. 세포 현탁액으로 튜브를 채우고, 튜브를 눕혀 클린 벤치 내에서 실온(25℃)에서 30분 정치했다. 그 후, 수액 백 단편을 PBS에 의해 세정하여, 수액 백 내벽에의 세포의 접착 유무를 현미경 관찰에 의해 평가했다.
PBS에 의한 세정 전에 있어서는, MSCs의 일부(눈어림으로 10% 이하)의 수액 백 내벽에의 접착이 확인되었지만, PBS 세정에 의해, 접착된 MSCs의 대부분(눈어림으로 90% 이상)이 제거되었다. 따라서, 트레할로스에 의해, 수액 백 내벽에의 세포 접착을 피할 수 있을 가능성이 나타났다.
(카테터 통과 시험)
CV 카테터 키트(닛폰샤우드)를 이용했다. 18G 주사 바늘을 카테터 선단에 접속했다. 5 mL 시린지로 세포 현탁액을 흡입했다. 카테터에 시린지를 셋트하여, 세포 현탁액을 압출했다. 이 조작을 규정 횟수 반복한 후에 세포 생존율을 측정하고, 또한 현미경 하에서 관찰했다. 현미경 관찰 전에 5 mL의 PBS로 카테터를 세정했다.
결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
적어도 10회까지는 통과 횟수에 관계없이, 세포 생존율은 불변이었다. 카테터의 내벽에 매우 근소한 MSCs와 ET-K액의 잔존이 관찰되었지만, 카테터 통과 후의 세포수가 불변이며, PBS 세정 후에는 접착 세포는 확인되지 않았다. 따라서, 트레할로스에 의해, 카테터 내벽에의 세포의 접착을 피할 수 있을 가능성이 나타났다.
[실시예 9]
돼지 간엽계 줄기 세포를 10 cm 디쉬 상에서 배양했다. 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포를 이하의 조성액에 현탁하고, 실온(약 25℃)에서 360분간 정치한 후, 세포의 생존율을 측정하여, 세포의 응집을 관찰했다.
NS: 생리 식염수
MSCM: 10% FBS를 함유하는 αMEM
ET-K: ET-Kyoto(오츠까세이야꾸고죠)
Saviosol: 사비오졸(오츠까세이야꾸고죠)
Dextran: 저분자 덱스트란 L주(注)(오츠까세이야꾸고죠)
또한, 사비오졸은 중량 평균 분자량이 40000인 덱스트란(덱스트란 40)을 30 mg/ml의 농도로 함유하는 젖산 링거액이다. 저분자 덱스트란 L주는 중량 평균 분자량이 40000인 덱스트란(덱스트란 40)을 100 mg/ml의 농도로 함유하는 젖산 링거액이다.
(세포 생존율)
시험 개시 30분 후 및 360분 후의 세포 생존율을 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
표 6에 나타나는 것과 같이, 어느 조성물을 사용한 경우라도 세포의 생존율은 생리 식염수를 사용한 경우와 비교하여 현저히 높았다.
(세포의 응집)
시험 개시부터 360분 후에 현미경 하에서 세포 응집의 유무를 관찰했다. 생리 식염수 또는 MSCM 중에서 보존한 경우에는, 큰 세포 응집 덩어리의 형성이 관찰되었지만, ET-K, Saviosol 또는 Dextran에서는 세포 응집 덩어리의 형성이 억제되어, 세포의 분산 상태가 유지되어 있었다.
[실시예 10]
(1) 래트 조직의 조제
래트 피하 지방을 서혜부로부터 채취한 후, 시인 가능한 혈관이나 근 등 지방 조직과 다른 조직을 마이크로 가위로 제거하고, 그 후, 세절과 HBSS(행크스 용액)에 의한 세정을 수회 반복했다. 시각적으로 혈구(또는 혈괴)의 제거 및 근 등의 막상 부유 물질의 제거를 확인할 수 있을 때까지 세정 작업을 계속했다. 얻어진 래트 피하 지방을 가위에 의해 세절했다.
세절된 조직을 동량의 HBSS와 섞었다. 혼합물을 느리게 진탕한 후, 정치함으로써 2층으로 분리시켰다. 상층만을 회수했다. 회수된 상층에 0.2% 콜라게나아제(Type I)/HBSS를 가하여, 37℃ 하에서 느리게 지방이 완전히 액상으로 될 때까지 진탕했다(최대 90분간). 반응액에 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 αMEM을 콜라게나아제 반응 액량에 대하여 등량 이상 가하여 혼합한 후, 혼합물을 원심 분리함으로써 3층으로 분리시켰다(아래부터 유핵 세포·용액·지방). 하층만을 회수하여, HBSS로 재현탁했다. 이 조작을 3회 반복하고, 마지막으로 10% FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁한 세포 현탁액을 배양 접시로 옮겨 배양했다. MSC는 배양 접시의 바닥면에 접착했다.
(2) 실험에 이용하는 세포(Rat AT-MSC P6)의 조제
(1)의 조작으로 배양 접시에 접착된 MSC는 증식을 계속하여, 5~7일 후에 배양 접시 바닥면은 꽉 세포로 메워졌다. 컨플루언트에 도달하면 MSC는 증식 정지 또는 세포사가 유도되기 때문에, 컨플루언트 도달 전에, MSC를 배양 접시로부터 박리하여, 새로운 배양 접시에 저밀도로 파종했다. 배양 접시의 바닥면에 접착되어 있는 MSC를 PBS로 3회 세정 후, 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)를 가하여, MSC를 배양 접시로부터 박리한 후, 세포가 저밀도가 되는 양의 10%의 FBS를 포함하는 αMEM으로 현탁하여, 새로운 배양 접시로 옮겼다. 이 조작을 6회 반복했다(6회 계대=P6).
(3) 각 액에 의한 세포의 현탁
(2)에서 얻은 Rat AT-MSC P6을 실험에 이용했다.
10 cm 디쉬당 5 ml의 PBS(-)로 3회 세정 후, 1 ml의 트립신-EDTA(0.25% 트립신, 1 mM EDTA·4 Na)로 20초 처리함으로써 세포를 박리하여, 싱글 셀의 상태로 했다. 얻어진 세포를 15 ml 용량의 팔콘 튜브로 옮겨 원심함으로써 세포를 회수하고, PBS(-)로 2회 세정 후, 이하의 각 용액으로 재차 순화 세정을 1회 행했다.
Saline: 생리 식염수
Medium: 10% FBS를 함유하는 αMEM
ET-K: ET-Kyoto(오츠까세이야꾸고죠)
Saviosol: 사비오졸(오츠까세이야꾸고죠)
HES70K: 6 (w/v)% 히드록시에틸 전분(중량 평균 분자량 70000)+0.9 (w/v)% NaCl(독일·브라운사)
HES200K: 6 (w/v)% 히드록시에틸 전분(중량 평균 분자량 200000)+0.9 (w/v)% NaCl(독일·프레제니우스 카비사)
ET-K+ Saviosol: ET-K와 Saviosol의 혼합액(체적비로 1:1)
그 후, 각 용액을 이용하여 2.5×105 cells/50 μL가 되도록 현탁했다.
현탁액을 각 온도(0, 25, 37℃)에서 정치하여, 30~360분 후에 20 μL 피펫맨으로 수회 피펫팅하여, 10 μL을 디쉬로 옮겼다.
디쉬 상의 현탁액의 가장 하면에 실체 현미경의 초점을 맞춰, 관찰을 했다.
현미경 하에서 인접하는 세포 덩어리를 형성하고 있는 것을 세포 응집 덩어리로 했다. 세포 응집 덩어리는, 디쉬를 현미경의 스테이지 상에서 흔들어, 명백히 덩어리로서 움직이고 있음을 확인했다.
(세포 생존율)
시험 개시 30~360분 후의 세포 생존율을 도 3 및 도 4에 도시한다. 이들 도면에 도시되는 것과 같이, 어느 조성물을 사용한 경우라도, 세포의 생존율은 생리 식염수를 사용한 경우와 비교하여 현저히 높았다. 세포의 생존율 저하를 억제하는 효과는 HES200K보다도 HES70K 쪽이 높았다.
(세포의 응집)
시험 개시부터 360분 후에 현미경 하에서 세포의 응집성을 관찰했다. 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
배지 중에서 보존한 경우와 비교하여, 그 밖의 조건에서는 세포 응집 덩어리의 형성이 억제되었다. 세포 응집을 억제하는 효과는 HES200K보다도 HES70K 쪽이 높았다. ET-K, Saviosol, HES70K 및 ET-K+ Saviosol에서는 세포 응집의 형성이 확인되지 않고, 세포의 분산이 잘 유지되고 있었다.
[실시예 11]
인간으로부터 분리 정제된 골수 유래 간엽계 줄기 세포(계대 횟수 8회째)와 지방 조직 유래 간엽계 줄기 세포(계대 횟수 8회째)의 각 세포를 Nunc사 제조의 세포 접시의 바닥면을 약 90% 덮을 때까지 배양했다. TaKaRa사 제조의 PBS(-)로 배양 접시를 3회 세정하고, GIBCO사 제조의 트립신 용액으로 각 간엽계 줄기 세포를 배양 접시로부터 박리하여, 어시스트사 제조의 15 mL 원심 튜브에 세포를 회수했다. 1000 rpm, 5분간의 원심 조작에 의해 원심 튜브의 바닥에 세포 덩어리를 형성시켜, 아스피레이터로 상청액을 파기했다. 손가락으로 쳐서 세포 덩어리를 해체하고, TaKaRa사 제조의 PBS(-)를 가하여, 수회 피펫 조작으로 더욱 세포를 풀어, 1000 rpm, 5분간 원심했다. 원심 튜브의 바닥에 세포 덩어리가 형성된 것을 확인하여, 아스피레이터로 상청액을 파기했다. 이 PBS(-)에 의한 세정 조작을 후에 2회 반복했다. 혈구 계산반으로 세포수를 측정하고, 어시스트사 제조의 1.5 mL 튜브에 1.0×106개/튜브의 조건으로 세포를 옮겼다. 1000 rpm, 5분간의 원심 조작에 의해, 튜브의 바닥에 세포 덩어리를 형성시키고, 상청액을 마이크로 피펫으로 제거했다. 각 튜브에
(1) 생리 식염수(오츠까세이야꾸고죠사 제조) 1 mL
(2) 사비오졸(오츠까세이야꾸고죠사 제조) 500 μL와 덱스트란 L주(오츠까세이야꾸고죠사 제조) 500 μL의 혼합액(덱스트란 40 6.5 (w/v)%)
(3) 사비오졸(오츠까세이야꾸고죠사 제조) 250 μL와 덱스트란 L주(오츠까세이야꾸고죠사 제조) 750 μL의 혼합액(덱스트란 40 8.25 (w/v)%)
(4) 덱스트란 L주(오츠까세이야꾸고죠사 제조)(덱스트란 40 10 (w/v)%) 1 mL
의 계 4 종류의 액을 각각 가하여, 보르텍스 믹서로 수초 동안 혼합했다. 데루모 제조의 30G 주사 바늘과 1 mL의 시린지를 이용하여, 세포의 싱글화 조작을 하고, 실온(약 25℃)에서 튜브 세우기를 이용하여 정치했다. 정치 30분 후와 60분 후에 각 튜브로부터 10 μL의 액을 취하여, GIBCO 제조의 트리판블루액과 등량 혼합한 액을 혈구 계산반으로 세포수와 생존율을 측정했다. 또한, 평가한 액은 각 튜브의 액면 중심(상), 액 중간 중심(중) 및 튜브의 바닥 중심(하)의 3곳에서 살짝 분취했다. 상, 중, 하의 각 세포수의 합계치를 100%로 하여, 각각의 세포수를 분자로, 합계 세포수를 분모로 하여 비율로 세포의 분포 상황을 산출했다. 또한, 세포 전체의 생존율을 별도 산출했다.
결과를 도 5 및 도 6에 도시한다. 덱스트란을 포함하는 완충액(6.5~10 (w/v)%) 중에서 간엽계 줄기 세포를 보존한 경우에는, 간엽계 줄기 세포의 유래에 상관없이, 튜브의 상, 중, 하에 있어서의 세포수에 큰 차는 확인되지 않고, 세포의 균일한 분산이 유지되고 있음이 나타났다. 또한, 이 경우, 세포의 생존율은 100%로 불변이었다. 한편, 생리 식염수를 이용한 경우에는, 세포는 튜브 밑으로 가라앉아, 60분간 보존 후의 세포의 생존율은 80%에까지 저하되었다.
본 발명을 이용하면, 줄기 세포를 이식할 때에, 현탁액 중의 줄기 세포끼리의 응집을 억제할 수 있다. 따라서, 줄기 세포의 응집물이 캐뉼라 중에 가득 차 막히거나, 폐정맥 등의 가는 혈관 중에 색전을 형성하여 버리는 리스크가 저감된다.
더욱이, 본 발명을 이용하면, 현탁액 중의 줄기 세포의 생존율 저하를 억제할 수 있다. 따라서, 보다 상태가 좋은 줄기 세포에 의해 치료를 실시할 수 있기 때문에, 치료 효과의 향상을 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명은 줄기 세포를 이용한 이식 의료 분야에서 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 일본 특허 출원 2010-251273(출원일: 2010년 11월 9일) 및 특허 출원 2010-293908(출원일: 2010년 12월 28일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims (34)

  1. 포유 동물 줄기 세포, 및 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  2. 제1항에 있어서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  3. 제1항에 있어서, 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  4. 제3항에 있어서, 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  5. 제1항에 있어서, 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  6. 제1항에 있어서, 다당류가 트레할로스이고, 또한 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  7. 제1항에 있어서, 다당류가 덱스트란이고, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포 현탁액.
  8. 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 생리적 수용액이 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 포유 동물 줄기 세포 현탁액을 포함하는 포유 동물 줄기 세포 현탁액 제제.
  11. 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
  12. 제11항에 있어서, 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
  13. 제12항에 있어서, 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
  14. 제11항에 있어서, 다당류가 트레할로스이고, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
  15. 제11항에 있어서, 다당류가 덱스트란이고, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 포유 동물 줄기 세포 응집 억제제.
  16. 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  17. 제16항에 있어서, 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  18. 제17항에 있어서, 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  19. 제16항에 있어서, 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 포유 동물 줄기 세포를 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  20. 제16항에 있어서, 다당류가 트레할로스이고, 또한 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  21. 제16항에 있어서, 다당류가 덱스트란이고, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포의 응집의 억제 방법.
  22. 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  23. 제22항에 있어서, 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  24. 제22항에 있어서, 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  25. 제24항에 있어서, 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  26. 제22항에 있어서, 다당류가 트레할로스이고, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 트레할로스의 농도가 4.53~362.4 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  27. 제22항에 있어서, 다당류가 덱스트란이고, 또한 포유 동물 줄기 세포 현탁액 중의 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내가 되도록 사용되는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제제.
  28. 포유 동물 줄기 세포를 트레할로스, 히드록시에틸 전분 및 덱스트란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다당류를 포함하는 생리적 수용액에 현탁하는 것을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 생리적 수용액이 트레할로스 및 히드록시에틸 전분, 혹은 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 조합을 포함하는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  30. 제28항에 있어서, 줄기 세포가 부착성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  31. 제30항에 있어서, 부착성 줄기 세포가 간엽계 줄기 세포 또는 다능성 줄기 세포인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  32. 제28항에 있어서, 포유 동물 줄기 세포가 단일 세포의 상태에 있는 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  33. 제28항에 있어서, 다당류가 트레할로스이고, 또한 트레할로스의 농도가 15.1~362.4 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
  34. 제28항에 있어서, 다당류가 덱스트란이고, 또한 덱스트란의 농도가 30~100 mg/ml의 범위 내인 포유 동물 줄기 세포의 생존율 저하의 억제 방법.
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