CN105267952B

CN105267952B - 一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法

Info

Publication number: CN105267952B
Application number: CN201510550961.4A
Authority: CN
Inventors: 田丰丰; 赵蕾; 张颖裕
Original assignee: Henan Zhuofeng Biological Technology Co Ltd
Current assignee: New Hanfang Henan Life Technology Co ltd
Priority date: 2015-09-01
Filing date: 2015-09-01
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2035-09-01
Also published as: CN105267952A

Abstract

本发明属于药剂制备领域，具体公开了一种用于保护干细胞治疗的药物，由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF‑A溶于PBS缓冲液配制而成，其中各组分的质量‑体积浓度分别为羧甲基甲壳胺1.2％～2％、右旋糖苷0.5％～0.8％、VEGF‑A 0.2％～0.4％、前列腺素E1 0.1％～0.2％和白血病抑制因子1％～1.5％。本发明提供的药物可以避免在干细胞注射治疗过程中出现的肺动脉小栓塞，将干细胞注射治疗死亡率由90％降到0.05％以下，极大的扩大了干细胞治疗的应用范围，提高了治疗效果。

Description

一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法

技术领域

本发明属于药剂制备领域，具体涉及一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官乃至一个生物个体的潜在能力。正常发育过程中出现的干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)和成体干细胞(Somatic stemcell)两种类型，近年来的研究发现利用病毒载体将4个转录因子组合转入小鼠或人皮肤或成纤维细胞，经克隆筛选后获得功能类似ES细胞的细胞系，即诱导多能干细胞(Inducedpluripotent stem cells,ips细胞)。目前干细胞研究主要就集中在胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。

干细胞治疗(stem cell therapy)的机制包括：干细胞移植、旁分泌作用或者两者兼有，干细胞移植的来源为成体干细胞、ES细胞和ips细胞，通过静脉、动脉或其他注射方式，移植到受损伤的部位，以替代或补充原有的病变部位的干细胞，从而恢复病变组织或器官功能的治疗技术。

安全性是衡量与决定干细胞移植治疗能够应用于临床的最重要指标，干细胞是一种未分化成熟的细胞，其细胞表面MHC抗原表达相对较弱，受者免疫系统对这种未分化细胞的识别能力较低，因此免疫排斥反应及过敏反应等也较低，使同种异体干细胞治疗相对安全。但是，其作为一种新型治疗手段，也存在很多风险和不足，从培养体系的安全性来讲，干细胞在体外培养过程中，可能受到各种微生物和有害物质(如热原和内毒素)感染，更重要的是，传代培养是获得足够干细胞数量的常用方法，但是干细胞经多次传代后，出现老化、多分化潜能的退变甚至出现癌变。随着干细胞临床试验范围的逐步扩大，有关不良反应的报道也相应增多，Menasche报道10例心肌梗死患者，接受卫星细胞移植后，4例出现持续性心律失常，另有报道称，冠状动脉内注射造血干细胞，有加速冠状动脉粥样硬化并发血栓的可能性。

在体外，扩增干细胞是干细胞研究及应用的前提和关键，干细胞虽具有多能性，但其数量不多，只有通过扩增，才会得到大量的干细胞，常用的腔道干细胞注射疗法，经过胰酶消化制备成的干细胞悬浮液在注入体内后，干细胞会在极短的时间内重新聚集于肺部肺段及亚段动脉，由于主肺动脉、左右肺动脉直径比较粗，血流速度较快，细胞聚集不易停留，受累率低，因此注入体内的干细胞常首先在毛细血管中聚集，在肺小动脉内形成栓塞，分别向上、向下蔓延形成为弥散性栓塞，同时造成肺动脉高压，使得肺的换气功能停止，造成病人体内严重缺氧，主要表现为呼吸困难、胸闷、胸痛、咳嗽、咳血，有濒死感，在短时间内死亡，且死亡率高达90％，这一世界性难题一直没有得到解决。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法，该药物可以避免在干细胞注射治疗过程中出现的肺动脉小栓塞，将干细胞注射治疗死亡率由90％降到0.05％以下，极大的扩大了干细胞治疗的应用范围，提高了治疗效果。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

依据本发明提出的一种用于保护干细胞治疗的药物，其中，该药物由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子和VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度(溶质质量/溶液体积)分别为羧甲基甲壳胺1.2％～2％、右旋糖苷0.5％～0.8％、VEGF-A 0.2％～0.4％、前列腺素E1 0.1％～0.2％和白血病抑制因子1％～1.5％。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。

依据本发明提出的一种用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)、取原料羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A，并配制PBS缓冲液，备用；

(2)、先加热步骤(1)得到的PBS缓冲液，然后依次加入羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1和白血病抑制因子，使各自的质量-体积浓度分别达到1.2％～2％、0.5％～0.8％、0.2％～0.4％、0.1％～0.2％和1％～1.5％，搅拌，得到混合液，备用；

(3)、向步骤(2)得到的混合液中加入药用活性碳，搅拌后趁热进行过滤脱碳，收集滤液，备用；

(4)、对步骤(3)收集的滤液进行pH调节，将PH调节为7.2～7.4之间，然后进行初级过滤，初级过滤得到的药物半成品经检验合格后进行二级过滤，二级过滤得到的滤液经后续处理即得到用于保护干细胞治疗的药物。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

前述的一种用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，其中，步骤(2)所述的PBS缓冲液的加热温度为90～100℃。

前述的一种用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，其中，按照质量-体积浓度计步骤(3)所述的加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％；步骤(3)所述的搅拌时间为10～20min。

前述的一种用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，其中，步骤(4)所述的pH调节采用1M稀盐酸或1M氢氧化钠试液；所述的初级过滤采用0.45μm微孔滤膜，所述的二级过滤采用0.22μm微孔滤膜。

前述的一种用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，其中，步骤(4)所述的后续处理依次包括灌封处理、灭菌检漏处理、灯检处理、印字包装处理、成品检验处理。

借由上述技术方案，本发明一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法可达到相当的技术进步性及实用性，并具有产业上的广泛利用价值，与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，其至少具有下列优点：

(1)、本发明提供的药物不仅能够防止经人工培养后的干细胞在经腔道注射注入体内后在肺部发生凝聚，并且不破坏干细胞自身结构，同时也不影响干细胞自身功能，经过动物实验结果，能够将干细胞注射治疗死亡率由90％降到了0.05％，极大的扩大了干细胞治疗的应用范围，提高了治疗效果。

(2)、本发明中的羧甲基甲壳胺具有广谱抗菌作用，抑菌能力较强，具有很高的粘弹性和亲水性，无毒、无抗原性，组织相容性良好，在体内可降解吸收，避免对组织产生后续损害，其氨基上暴露的正电荷能将干细胞表明的糖侧链(细菌)粘连在一起，阻止其与其他干细胞相粘连结合，阻止干细胞聚集。

(3)、本发明中的白血病抑制因子(LIF)对胚胎干细胞的分化有抑制作用，能够维持干细胞的稳定性。右旋糖苷具有扩充血容量、维持血压的功效，还能改善微循环，消除血管内红细胞聚集，防止弥散性血管内凝血，减少血栓形成及渗透利尿的作用。

(4)、本发明中的VEGF-A能够促进新血管生成，增加血管的通透性，极大降低了干细胞在肺部毛细血管的聚集。前列腺素E1具有选择性扩张肺血管作用，改善血管通透性，同时也能有效抑制K+介导的血管收缩，在减少干细胞凝聚的同时，也扩张了肺部血管，降低肺部栓塞形成的可能性。

(5)、本发明提供的用于保护干细胞治疗的药物成分明确，可直接用于临床，安全可靠，适用于各种人工培养的干细胞，应用范围极广，适用性超强，具有很高的应用价值，且制备体系安全，易于控制。

综上所述，本发明一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法在技术上有显著的进步，并具有明显的积极效果,诚为一新颖、进步、实用的新设计。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。

附图说明

无

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

一种用于保护干细胞治疗的药物，由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度(溶质质量/溶液体积)分别为羧甲基甲壳胺1.2％～2％、右旋糖苷0.5％～0.8％、VEGF-A 0.2％～0.4％、前列腺素E1 0.1％～0.2％和白血病抑制因子1％～1.5％。

所述的用于保护干细胞治疗的药物的制备方法，包括以下步骤：

为了使本发明具有更好的实施效果，本发明步骤(1)所述的PBS缓冲液的制备方法如下：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g,KH₂PO₄ 0.24g，溶于900ml双蒸水中，然后用盐酸调pH值至7.4，并加水定容至1L，最后于121℃高压灭菌30min，即得到PBS缓冲液。

本发明步骤(2)所述的PBS缓冲液的加热温度为90～100℃。

本发明步骤(3)所述的加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％，所述的搅拌时间为10～20min。

本发明步骤(4)所述的pH调节采用1M稀盐酸或1M氢氧化钠试液；所述的初级过滤采用0.45μm微孔滤膜，二级过滤采用0.22μm微孔滤膜。所述的后续处理依次包括灌封处理、灭菌检漏处理、灯检处理、印字包装处理、成品检验处理；

a.灌封处理：将干细胞治疗保护新药封于曲颈玻璃安剖瓶中(10mL/支)；

b.灭菌检漏处理：将灌封的干细胞治疗保护新药置灭菌柜内，用饱和蒸汽115℃灭菌30min；再用胭脂红使用色素配制的红色溶液，真空度-80kpa以上条件下检漏，纯化水清洗，50℃以下烘干后检出漏支；

c.灯检处理：接收灭菌检漏后的干细胞治疗保护新药，检出瓶身有裂纹、漏气、破损、装量不合格药等废品；

d.印字包装处理：将灯检后的干细胞治疗量保护液进行印字包装；

e.成品检验处理：将印字包装后的干细胞治疗保护新药由质检部门对药品质量进行质检，并由质检部门对本批药品生产过程按规定进行评估，合格后即得成品，入库。

本发明所述的干细胞治疗的干细胞包括人工培养干细胞和来源活体干细胞移植。干细胞治疗为经过静脉、动脉腔道注射的同时也可应用于直接原位移植干细胞治疗。

实施例1：

一种用于保护干细胞治疗的药物，由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度分别为羧甲基甲壳胺2％、右旋糖苷0.5％、VEGF-A 0.2％、前列腺素E1 0.1％和白血病抑制因子1％。

(1)、取原料羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A和PBS缓冲液，备用；

(2)、先加热步骤(1)得到的PBS缓冲液至90℃，然后依次加入羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1和白血病抑制因子，使各自的质量-体积浓度分别达到配方量，得到混合液，备用；

(3)、向步骤(2)得到的混合液中加入药用活性碳，加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％，搅拌10min后趁热进行过滤脱碳，收集滤液，备用；

(4)、对步骤(3)收集的滤液采用的1M稀盐酸或1M氢氧化钠试液进行pH调节，然后采用的0.45μm微孔滤膜进行初级过滤，初级过滤得到的药物半成品经检验合格后采用0.22μm微孔滤膜进行二级过滤，二级过滤得到的滤液经后续处理即得到用于保护干细胞治疗的药物。

实施例2：

一种用于保护干细胞治疗的药物，由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度分别为羧甲基甲壳胺1.2％、右旋糖苷0.8％、VEGF-A 0.4％、前列腺素E1 0.2％和白血病抑制因子1.5％。

步骤(1)、取原料羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A和PBS缓冲液，备用；

步骤(2)、先加热步骤(1)得到的PBS缓冲液至100℃，然后依次加入羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1和白血病抑制因子，使各自的质量-体积浓度分别达到配方量，得到混合液，备用；

步骤(3)、向步骤(2)得到的混合液中加入药用活性碳，加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％，搅拌20min后趁热进行过滤脱碳，收集滤液，备用；

步骤(4)、对步骤(3)收集的滤液采用的1M稀盐酸或1M氢氧化钠试液进行pH调节，然后采用的0.45μm微孔滤膜进行初级过滤，初级过滤得到的药物半成品经检验合格后采用0.22μm微孔滤膜进行二级过滤，二级过滤得到的滤液经后续处理即得到用于保护干细胞治疗的药物。

实施例3：

一种用于保护干细胞治疗的药物，由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子、VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度分别为羧甲基甲壳胺1.6％、右旋糖苷0.7％、VEGF-A 0.3％、前列腺素E1 0.15％和白血病抑制因子1.3％。

步骤(2)、先加热步骤(1)得到的PBS缓冲液至95℃，然后依次加入羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1和白血病抑制因子，使各自的质量-体积浓度分别达到上述配方量，得到混合液，备用；

步骤(3)、向步骤(2)得到的混合液中加入药用活性碳，加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％，搅拌15min后趁热进行过滤脱碳，收集滤液，备用；

动物实验数据

实验分组：设三组实验组，每组取480只C57小鼠，鼠龄在4～5周(雌雄各半)：

A组：收集培养3～5代的胚胎干细胞A1、诱导多能干细胞A2、骨髓间充质干细胞A3、神经干细胞A4，分别溶于PBS缓冲液中，制成细胞浓度为1×105个/ml、1×106个/ml、1×107个/ml的细胞悬浮液；

B组：收集培养3～5代的胚胎干细胞B1、诱导多能干细胞B2、骨髓间充质干细胞B3、神经干细胞，分别溶于本发明制备的干细胞治疗保护药物中，制成细胞浓度为1×105个/ml、1×106个/ml、1×107个/ml的细胞悬浮液；

C组：以PBS缓冲液为空白对照。

处理方法：取每只小鼠尾静脉注射对应组别的细胞悬浮液0.5μL，注射后观察死亡情况及后续生存情况，C组仅注射PBS缓冲液。

实验结果：A组：以1×105个/ml浓度的各种干细胞悬浮液，10min内死亡率为90％，注射以1×106个/ml、1×107个/ml浓度的各种干细胞悬浮液10min内死亡率为100％。

B组：注射以1×105个/ml、1×106个/ml、1×107个/ml浓度的各种干细胞治疗保护新药悬浮液，注射完观察18个月，死亡率为0％。

C组：仅注射PBS缓冲液0.5μL，结果同B组。

由以上试验可知，本发明提供的药物不仅能够防止经人工培养后的干细胞在经腔道注射注入体内后在肺部发生凝聚，并且不破坏干细胞自身结构，同时也不影响干细胞自身功能，经过动物实验结果，能够将干细胞注射治疗死亡率由90％降到了0.05％，极大的扩大了干细胞治疗的应用范围，提高了治疗效果。

上述本发明一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法的技术创新，对于现今同行业的技术人员来说均具有许多可取之处，而确实具有技术进步性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：该药物由羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、前列腺素E1、白血病抑制因子和VEGF-A溶于PBS缓冲液配制而成，其中羧甲基甲壳胺、右旋糖苷、VEGF-A、前列腺素E1、白血病抑制因子的质量-体积浓度分别为羧甲基甲壳胺1.2％～2％、右旋糖苷0.5％～0.8％、VEGF-A 0.2％～0.4％、前列腺素E1 0.1％～0.2％和白血病抑制因子1％～1.5％；

所述用于保护干细胞治疗的药物按照以下方法制备：

(4)、对步骤(3)收集的滤液进行pH调节，将PH调节为7.2～7.4之间，然后进行初级过滤，初级过滤得到的药物半成品经检验合格后进行二级过滤，二级过滤得到的滤液依次经灌封处理、灭菌检漏处理、灯检处理、印字包装处理、成品检验处理，即得到用于保护干细胞治疗的药物。

2.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：其制备方法步骤(2)所述的PBS缓冲液的加热温度为90～100℃。

3.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：按照质量-体积浓度计，其制备方法步骤(3)所述的加入药用活性碳的重量为混合液体积的0.3％。

4.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：其制备方法步骤(3)所述的搅拌时间为10～20mi n。

5.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：其制备方法步骤(4)所述的pH调节采用1M稀盐酸或1M氢氧化钠试液。

6.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：其制备方法步骤(4)所述的初级过滤采用0.45μm微孔滤膜。

7.如权利要求1所述的一种用于保护干细胞治疗的药物，其特征在于：其制备方法步骤(4)所述的二级过滤采用0.22μm微孔滤膜。