CN106029683B - 一种抑制肿瘤转移和治疗白血病的多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一组多肽及其与人血清白蛋白形成的复合物，通过与人血清白蛋白结合提高该组多肽在盐溶液中溶解性的方法，制备该组多肽与人血清白蛋白形成的复合物的方法，以及该组多肽及其与人血清白蛋白形成的复合物在制备抑制肿瘤转移和治疗白血病的药物中的应用。

Description

一种抑制肿瘤转移和治疗白血病的多肽和多肽复合物、其制 备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽和多肽复合物、其制备方法及其应用，尤其是涉及一种多肽和可以提高多肽在盐溶液中溶解性的多肽-人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)复合物的制备方法及其在抑制肿瘤转移和治疗白血病方面的应用。
背景技术
血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质，其生物学功能包括结合及运输一系列内源性和外源性的物质，维持血液正常的渗透压等等。近年来，人血清白蛋白(HSA)作为药物载体受到了广泛的关注。HSA由585个氨基酸残基组成，分子量约为66kD，具有安全无毒、生物相容性好等优点。
白蛋白的载药方式主要有两种：一是药物和白蛋白间以分子链连接形成白蛋白药物，即化学偶联白蛋白载药；二是依靠药物和白蛋白的相互作用实现包埋载药，即物理结合白蛋白载药，这种结合方式可以提高药物的溶解性和稳定性。
目前研究的HSA药物载体主要针对于抗肿瘤药物，HSA药物的物理包埋作用是通过HSA的物理作用例如疏水、静电等相互作用包埋载药，可以提高药物的稳定性和靶向性，并且具有缓释作用，因此HSA可以作为理想的药物载体用于多肽药物新型复合物中。
肿瘤是严重危害人们身体健康的一类疾病，肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，两者的主要区别是恶性肿瘤具有转移(metastasis)和复发的特征。肿瘤转移是预后不良的征兆，也是导致肿瘤病人死亡的主要原因。
趋化因子(chemokines)是一类单链小分子蛋白质，通过与G蛋白偶联受体的相互作用，引起靶细胞支架重排，牢固地黏附于内皮细胞并且定向迁移。近年来，国内外研究均指出，基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，也就是趋化因子CXCL12，及其特异性趋化因子受体CXCR4在多种肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的作用。很多实体肿瘤细胞和白血病细胞表面高表达特异的趋化因子受体CXCR4，而趋化因子CXCL12在骨髓、淋巴结和某些器官中高表达。
高表达CXCR4的实体瘤细胞和白血病细胞在CXCL12的趋化下，逆浓度梯度转移至作为趋化因子产生源的某些器官，例如肺、骨髓等，形成器官特异性转移(Balkwill F.,Semin Immunol,2003,15,49-55)。因此，使用CXCR4拮抗剂靶向抑制CXCL12/CXCL4相互作用可以阻断肿瘤细胞和白血病细胞与基质细胞黏附，增加肿瘤细胞和白血病细胞对化疗药物的敏感性，防止肿瘤细胞和白血病细胞的转移和复发。
由于多肽易于合成，在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应，因此对于抑制肿瘤转移和治疗白血病，发展特异性靶向CXCR4受体的多肽具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽和多肽复合物、其制备方法及应用，特别是一种水溶性好、盐溶性差的多肽和能提高多肽在盐溶液中溶解性的多肽-HSA复合物、其制备方法及其在抑制肿瘤转移和治疗白血病方面的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种可抑制肿瘤细胞的多肽，所述多肽具有选自SEQ IDNO：1～7任意一种所示的氨基酸序列，如表1所示。
本发明同时还提供了一种抑制肿瘤细胞转移和治疗白血病的多肽，所述多肽同样选自如SEQ ID NO：1～7任意一种所示的氨基酸序列。
本发明的多肽可通过人工化学合成制得，具有水溶性好、盐溶性差的特点。
作为优选技术方案，所述多肽为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，对应表1中的名称为E4和E5。
本发明的多肽能够抑制乳腺癌细胞的迁移，并能够杀死白血病细胞，延长移植白血病细胞小鼠的生存期。
第二方面，本发明还提供了一种提高上述本发明第一方面所述多肽在盐溶液中溶解性的方法，所述方法包括：将所述多肽与人血清白蛋白相结合。
优选地，所述多肽与人血清白蛋白的结合方式为物理结合。
第三方面，本发明还提供了一种多肽-人血清白蛋白复合物，该复合物包含上述本发明第一方面所述的多肽以及人血清白蛋白。
优选地，所述多肽与人血清白蛋白通过物理作用相结合。
优选地，所述多肽和人血清白蛋白的摩尔比为4:1-1:4，例如可以是4:1、4:2、4:3、1:1、1:2、1:3、1:4。
第四方面，本发明还提供了如本发明第三方面所述多肽-人血清白蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)配制溶液：将所述多肽分子配制成1-5mg/mL溶液，将人血清白蛋白分子配制成125-250mg/mL溶液；
2)混匀：将人血清白蛋白分子溶液加入到多肽分子溶液中，充分混匀即可。
本发明中可以将所述多肽分子配制成1-5mg/mL溶液，例如浓度为1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL，优选为2.2-4mg/mL；可以将人血清白蛋白分子配制成125-250mg/mL溶液，例如浓度为125mg/mL、130mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、200mg/mL、210mg/mL、220mg/mL、230mg/mL、240mg/mL、250mg/mL，优选为130-240mg/mL。
优选地，在步骤1)中，所述多肽溶液和人血清白蛋白的溶剂均为无菌超纯水。
优选地，在步骤2)中，所述溶液中多肽分子与人血清白蛋白分子的摩尔比为4:1-1:4，例如可以是4:1、4:2、4:3、1:1、1:2、1:3、1:4。
第五方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述多肽或第三方面所述多肽-人血清白蛋白复合物在制备用于抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤转移相关疾病或治疗白血病药物中的应用。
作为优选技术方案，所述多肽或多肽-人血清白蛋白复合物在制备用于抑制肿瘤细胞或白血病细胞的横向迁移和/或纵向迁移药物中的应用。
作为优选技术方案，所述肿瘤转移相关疾病为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤。
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤为乳腺癌、白血病、淋巴瘤或膀胱癌中的任意一种，优选但不限于此。
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤为乳腺癌和白血病。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述的多肽-HSA复合物具有提高多肽在盐溶液中溶解性的能力，本发明的多肽分子在磷酸缓冲液(PBS)溶液中0h的粒径均在300nm以上，而多肽-HSA复合物在PBS溶液中得到了很好的分散，0h的粒径均在100nm左右，并且在72h内粒径没有发生很大的改变；同时所得到的多肽和多肽-HSA复合物具有抑制肿瘤转移和治疗白血病的作用，该多肽序列及多肽-HSA复合物可以为抑制肿瘤转移和治疗白血病提供可行的方法和技术。
附图说明
图1a-1g为多肽分子和多肽-HSA复合物在PBS溶液中动态光散射实验结果图。
图2为E4-HSA、E5-HSA复合物对SK-BR-3细胞活力影响的实验结果图。
图3为E4-HSA、E5-HSA复合物对MDA-MB-231细胞活力影响的实验结果图。
图4a-4b为E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12分子诱导SK-BR-3细胞横向迁移的抑制作用结果图。
图5a-5d为E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12分子诱导SK-BR-3细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图6a-6b为E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12分子诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用结果图。
图7a-7d为E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12分子诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图8为E5对CXCL12分子诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图9为E5对CXCL12分子诱导U937细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图10a-10b为E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12分子诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图11a-11b为E5影响HL-60、U937细胞凋亡的检测实验结果图。
图12a-12b为E5延长移植白血病细胞小鼠生存期的体内实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
除非特别指明，以下实施例中所用的乳腺癌细胞系SK-BR-3、MDA-MB-231和白血病细胞系HL-60、U937均购自中国医学科学院。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
实施例1：多肽的合成
按照表1所示的序列合成多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)，实验前配制成合适浓度的母液。
表1
Figure BDA0001079087440000051
其中，N8、E4、E5、Pep11、Pep12、Pep15、Pep16多肽的氨基酸序列分别对应于发明内容中SEQ ID NO：1～7。
生物素(Biotin)的作用是与链霉亲和素(SA)结合，属于常用的技术手段，对本发明多肽的作用没有实质性影响。
实施例2：多肽分子在PBS溶液中的聚集和多肽-HSA复合物的溶解性
10×PBS溶液的配制：NaCl 80.00g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 35.8g或Na2HPO414.2g，KH2PO4 2.7g，用超纯水定容至1000mL，调节其pH值为7.2～7.4，高压灭菌。1×PBS溶液的配制：将10×PBS溶液用无菌超纯水稀释10倍。
将多肽分子用无菌超纯水配制成1mg/mL溶液，将HSA分子用无菌超纯水配制成125mg/mL溶液，取一定量的HSA水溶液加入多肽分子水溶液中，使溶液中多肽分子与HSA分子的摩尔比为4:1-1:4之间。在溶液充分混匀后，加入1/9溶液体积的10×PBS溶液，使之稀释为多肽-HSA复合物的1×PBS溶液。将配制好的溶液置于4℃冰箱中。以仅含多肽分子的1×PBS溶液作为对照。
在0h，将配制好的测试溶液摇匀后取1mL，用1mL的移液枪将其转移在测试用标配的1cm×1cm塑料样品池内，进行动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZS，Malvern，英国)测试。24h，将溶液摇匀后进行DLS测试。测试完将溶液置于离心机(TGL-16B，Anke，中国)以5000rpm的速度离心3min，取上清液置于离心管，将离心管中溶液摇匀后进行DLS测试。测试后将溶液置于4℃冰箱中。48h，将溶液摇匀后进行DLS测试。测试完将溶液离心取上清液置于离心管，将离心管中溶液摇匀后进行DLS测试。测试后将溶液置于4℃冰箱中。72h，将溶液摇匀后进行DLS测试。测试完将溶液离心取上清液置于离心管，将离心管中溶液摇匀后进行DLS测试。
动态光散射反映了溶液中分子的粒径随时间的变化，如图1a～1g所示，多肽分子在PBS溶液中0h的粒径均在300nm以上，并且每24h内多肽在PBS溶液中的粒径会有明显的增加，离心后粒径会明显的降低，说明多肽在PBS溶液中具有聚集的趋势。而多肽-HSA复合物在PBS溶液中得到了很好的分散，并且在72h内粒径没有发生很大的改变，在72h后趋于稳定。说明HSA分子能够显著地增加多肽在盐溶液中的溶解性。
实施例3：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对SK-BR-3细胞增殖-毒性的检测实验
以SK-BR-3作为研究乳腺癌细胞系的模型体系。在Corning 96孔板中，每孔使用100μL RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，向培养板中加入10μL不同浓度多肽-HSA复合物的PBS溶液，使多肽的最终浓度为10nM、100nM、200nM、400nM、1μM、2μM、4μM。空白对照为只加入10μL PBS溶液。将培养板在孵箱中孵育48h，向每孔加入10μL CCK溶液(北京泛博生物化学有限公司)。将培养板在孵箱中孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪(Tecan infiniteM200，TECAN，瑞士)测定在450nm波长下的吸光度值(OD值)，计算细胞存活率(细胞存活率＝OD450nm(多肽-HSA复合物)/(OD450nm(空白对照)×100％)。
预实验中，在SK-BR-3细胞中加入4μM的HSA分子的细胞存活率与单独的SK-BR-3细胞相比，没有显著性差异。如图2所示，在SK-BR-3细胞中加入10nM-4μM的多肽-HSA复合物，其细胞存活率与单独的SK-BR-3细胞相比，没有显著性差异。在该浓度范围内，加入的多肽-HSA复合物既不会促进细胞的增殖，也不会影响细胞存活率。
实施例4：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对MDA-MB-231细胞增殖-毒性的检测实验
以MDA-MB-231作为研究乳腺癌细胞系的模型体系。在Corning 96孔板中，每孔使用100μL高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，向培养板中加入10μL不同浓度多肽-HSA复合物的PBS溶液，使多肽的最终浓度为10nM、100nM、400nM、1μM、4μM。空白对照为只加入10μL PBS溶液。将培养板在孵箱中孵育48h，向每孔加入10μL CCK溶液。将培养板在孵箱中孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪测定在450nm波长下的OD值，计算细胞存活率。
预实验中，在MDA-MB-231细胞中加入4μM的HSA分子的细胞存活率与单独的MDA-MB-231细胞相比，没有显著性差异。如图3所示，在MDA-MB-231细胞中加入10nM-4μM的多肽-HSA复合物，其细胞存活率与单独的MDA-MB-231细胞相比，没有显著性差异。在该浓度范围内，加入的多肽-HSA复合物既不会促进细胞的增殖，也不会影响细胞存活率。
实施例5：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12诱导SK-BR-3细胞横向迁移的抑制作用
在Corning六孔板中，每孔使用2mL RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养40×104个SK-BR-3细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，SK-BR-3细胞生长至临近90％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，后每孔加入含5％FBS的RPMI-1640培养基，同时加入CXCL12水溶液诱导，使每孔的CXCL12分子浓度为100ng/mL，并加入多肽-HSA复合物的PBS溶液，使多肽分子的最终浓度为10nM、100nM、1000nM，空白对照加入PBS溶液。划痕后的0h、24h用10×镜头的显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)观察细胞移动情况以及划痕宽度L的变化，计算细胞迁移率(细胞迁移率＝多肽-HSA复合物细胞迁移率(L0h-L24h/L0h)/空白对照细胞迁移率(L0h-L24h/L0h)×100％)。
预实验中，加入了1000nM的HSA分子的SK-BR-3细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图4a-4b所示，在加入了10nM、100nM、1000nM的E4-HSA复合物与细胞孵育后，SK-BR-3细胞的迁移能力被依次降低了31.38％、54.39％、47.70％，在加入了10nM、100nM、1000nM的E5-HSA复合物与细胞孵育后，SK-BR-3细胞的迁移能力被依次降低了44.25％、55.75％、47.7％，即多肽-HSA复合物可以有效地抑制肿瘤细胞被趋化因子CXCL12诱导的横向迁移作用。
实施例6：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12诱导SK-BR-3细胞纵向迁移的抑制作用
收获对数生长期的SK-BR-3细胞，用含有5％FBS的RPMI-1640培养基悬浮细胞，将200μL含有15×104个细胞的悬液以及不同浓度多肽-HSA复合物的PBS溶液加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜)的上室，使多肽分子的最终浓度为10nM、100nM、1000nM，空白对照加入PBS溶液。下室(Corning 24孔板)加入800μL含有5％FBS的RPMI-1640培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液(A液为2g结晶紫溶解至20mL 95％酒精中，B液为0.8g草酸铵溶解至80mL蒸馏水中，A、B液混合过滤后使用)固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜(DMI3000B，LEICA，德国)观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数N，取平均值后计算细胞迁移率(细胞迁移率＝N多肽-HSA复合物/N空白对照×100％)。间接地，染色后的小室膜用800μL 33％乙酸溶液洗脱结晶紫，取100μL洗脱液用酶标仪测定在570nm波长下的OD值。
预实验中，加入了1000nM的HSA分子的SK-BR-3细胞与空白对照的迁移率后，通过小室膜下表面的细胞计数计算得SK-BR-3细胞的迁移能力相比没有显著性差异。如图5a-5d所示，在加入了10nM、100nM、1000nM的E4-HSA复合物与细胞孵育被依次降低了52.50％、85.00％、60.00％，通过洗脱染色后的结晶紫间接得出洗脱液的OD值由对照组的0.37依次降低到0.25、0.11、0.21；在加入了10nM、100nM、1000nM的E5-HSA复合物与细胞孵育后，通过小室膜下表面的细胞计数计算得SK-BR-3细胞的迁移能力被依次降低了65.79％、76.32％、52.63％；通过洗脱染色后的结晶紫间接得出洗脱液的OD值由对照组的0.48依次降低到0.24、0.18、0.33。即多肽-HSA复合物可以有效地抑制肿瘤细胞被趋化因子CXCL12诱导的纵向迁移作用。
实施例7：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用
在Corning六孔板中，每孔使用2mL高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养20×104个细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，MDA-MB-231细胞生长至临近80％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，后每孔加入无血清高糖DMEM培养基，同时加入CXCL12水溶液诱导，使每孔的CXCL12分子浓度为100ng/mL，并加入多肽-HSA复合物的PBS溶液，使多肽分子的最终浓度为10nM、100nM、1000nM，空白对照加入PBS溶液。划痕后的0h、24h用显微镜观察细胞移动情况以及划痕宽度的变化，计算细胞迁移率。
预实验中，加入了1000nM的HSA分子的MDA-MB-231细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图6a-6b所示，在加入了10nM、100nM、1000nM的E4-HSA复合物与细胞孵育后，MDA-MB-231细胞的迁移能力被依次降低了18.54％、40.49％、30.73％，在加入了10nM、100nM、1000nM的E5-HSA复合物与细胞孵育后，MDA-MB-231细胞的迁移能力被依次降低了50.87％、59.09％、51.52％，即多肽-HSA复合物可以有效地抑制肿瘤细胞被趋化因子CXCL12诱导的横向迁移作用。
实施例8：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用
收获对数生长期的MDA-MB-231细胞，用无血清高糖DMEM培养基悬浮细胞，将200μL含有10×104个细胞的悬液以及不同浓度多肽-HSA复合物的PBS溶液加入transwell小室的上室，使多肽分子的最终浓度为10nM、100nM、1000nM，空白对照加入PBS溶液。下室加入800μL无血清高糖DMEM培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色，清水冲洗后用显微镜观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数，取平均值后计算细胞迁移率。间接地，染色后的小室膜用800μL 33％乙酸溶液洗脱结晶紫，取100μL洗脱液用酶标仪测定在570nm波长下的OD值。
预实验中，加入了1000nM的HSA分子的MDA-MB-231细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图7a-7d所示，在加入了10nM、100nM、1000nM的E4-HSA复合物与细胞孵育后，通过小室膜下表面的细胞计数计算得MDA-MB-231细胞的迁移能力被依次降低了46.15％、88.46％、80.77％，通过洗脱染色后的结晶紫间接得出洗脱液的OD值由对照组的0.52依次降低到0.37、0.16、0.19；在加入了10nM、100nM、1000nM的E5-HSA复合物与细胞孵育后，通过小室膜下表面的细胞计数计算得MDA-MB-231细胞的迁移能力被依次降低了71.43％、89.29％、82.14％，通过洗脱染色后的结晶紫间接得出洗脱液的OD值由对照组的0.55依次降低到0.28、0.17、0.23。即多肽-HSA复合物可以有效地抑制肿瘤细胞被趋化因子CXCL12诱导的纵向迁移作用。
实施例9：E5对CXCL12诱导白血病细胞HL-60和U937细胞纵向迁移的抑制作用
收获对数生长期的HL-60和U937细胞，用不含FBS的RPMI-1640培养基悬浮细胞，将200μL含有20×104个细胞的悬液以及不同浓度E5的水溶液加入transwell小室(HL-60用直径为80μm的PET微孔滤膜，U937用直径为5μm的PET微孔滤膜)的上室，使多肽分子的最终浓度为0.1μM、1.0μM、10μM，空白对照加入水溶液。下室加入800μL不含FBS的RPMI-1640培养基，同时含有浓度分别为200ng/mL和50ng/mL的CXCL12水溶液诱导HL-60和U937细胞。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，计算下室中迁移细胞的数量。
如图8所示，在加入了0.1μM、1.0μM、10μM的E5与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得HL-60细胞的迁移能力被依次降低了35.00％、39.00％、64.00％。即E5可以有效地抑制白血病细胞HL-60细胞被趋化因子CXCL12诱导的纵向迁移作用。如图9所示，在加入了0.1μM、1.0μM、10μM的E5与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得U937细胞的迁移能力被依次降低了17.00％、23.00％、20.00％。即E5可以有效地抑制白血病细胞U937细胞被趋化因子CXCL12诱导的纵向迁移作用。图8和图9的结果表明，该多肽能够有效抑制白血病细胞的迁移。
实施例10：E4-HSA复合物、E5-HSA复合物对CXCL12诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用
收获对数生长期的HL-60细胞，用不含FBS的RPMI-1640培养基悬浮细胞，将200μL含有20×104个细胞的悬液以及不同浓度多肽-HSA复合物的PBS溶液加入transwell小室的上室，使多肽分子的最终浓度为10nM、100nM、1000nM，空白对照加入PBS溶液。下室加入800μL不含FBS的RPMI-1640培养基，同时含有CXCL12水溶液(200ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，计算下室中迁移细胞的数量。
预实验中，加入了1000nM的HSA分子的HL-60细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图10a-10b所示，在加入了10nM、100nM、1000nM的E4-HSA复合物与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得HL-60细胞的迁移能力被依次降低了33.78％、41.89％、51.35％。在加入了10nM、100nM、1000nM的E5-HSA复合物与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得HL-60细胞的迁移能力被依次降低了45.46％、51.95％、58.44％。即多肽-HSA复合物可以更有效地抑制白血病细胞被趋化因子CXCL12诱导的纵向迁移作用。
实施例12：E5对CXCL12诱导白血病细胞HL-60和U937细胞凋亡的影响
用FITC-Annexin V/PI(eBioscience,澳大利亚)双染色法检测E5多肽对白血病细胞HL-60和U937细胞凋亡的影响。收获对数生长期的HL-60和U937细胞，将细胞悬液以及不同浓度E5的水溶液加入24孔板，孵育24h后收集细胞并用PBS溶液洗涤。用结合缓冲液(10mMHepes/NaOH，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)重悬细胞后加入FITC-Annexin V和PI，在室温下孵育10min，用流式细胞仪(Accuri C6，BD公司，美国)分析1.5×104个细胞。
如图11a-11b所示，当E5浓度低于20μM时，对于白血病细胞HL-60和U937细胞凋亡的影响可以忽略，但是E5浓度高于20μM时，白血病细胞的凋亡率迅速上升，当为50μM时，白血病细胞凋亡率提高到10％，当E5浓度达到80μM时，白血病细胞凋亡率提高到22％。即E5在高浓度时可以引起白血病细胞的凋亡，杀死白血病细胞。
实施例13：E5延长移植白血病细胞小鼠生存期的体内实验
所采用的小鼠是在特殊的无菌环境下培养的五周大的雌性NOD/SCID鼠(来自中国医学科学院基础医学科学学院的动物实验中心)。实验前，动物应在实验室环境下适应1周时间。用100μL乙二胺四乙酸钠盐(EDTA)/PBS悬浮1×106个HL-60细胞，通过静脉注射到经亚致死辐照(250cGy)的NOD/SCID小鼠体内。移植细胞18天后，与空白对照组小鼠相比，移植小鼠表现出很明显的白血病症状，如后肢麻痹、毛皮起皱凌乱、弓背姿势等。从移植后的第20天开始，分别用E5(30mg/kg,n＝9)、环磷酰胺(CTX，36mg/kg,n＝9)或者无菌水(n＝8)注射小鼠，E5和无菌水通过皮下注射，环磷酰胺通过腹腔内注射入小鼠体内，每周两次，观察小鼠的状态和体重变化。
如图12a所示，E5药物组的小鼠比环磷酰胺组和对照组小鼠的生存期更长，与环磷酰胺药物相比，E5显示了对白血病更好的治疗效果；如图12b所示，在移植细胞后，E5药物组的小鼠体重也要远远高于环磷酰胺组和对照组，说明E5可以在抑制体重下降的同时，延长移植白血病细胞小鼠的生存期。
上述实验显示：本发明的多肽-人血清白蛋白(HSA)复合物与多肽相比在盐溶液中具有较好的溶解性，并且该多肽和多肽-HSA复合物均具有抑制肿瘤转移和治疗白血病的功能，可以为抑制肿瘤转移和白血病治疗提供可行的方法。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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Claims (2)

1.一种多肽在制备用于抑制肿瘤细胞转移或治疗白血病药物中的应用，其特征在于，所述多肽为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；
所述肿瘤为乳腺癌、淋巴瘤或膀胱癌中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽用于抑制肿瘤细胞或白血病细胞横向迁移和/或纵向迁移。
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