CN103298926A

CN103298926A - 干细胞悬浮液

Info

Publication number: CN103298926A
Application number: CN2011800645504A
Authority: CN
Inventors: 小林英司; 和田圭树; 藤田泰毅; 吉永至宏; 土居雅子; 藤本康弘; 寺谷工
Original assignee: Jichi Medical University; Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
Current assignee: Jichi Medical University; Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
Priority date: 2010-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: US20130260461A1; EP2639296B1; EP2639296A1; AU2011327239A1; NZ610556A; ES2568731T3; CA2817172C; KR20130129382A; SI2639296T1; EP2639296A4; DK2639296T3; JP5341059B2; JP2012115253A; WO2012063870A1; CN103298926B; TWI547561B; US10087421B2; AU2011327239B2; SG190169A1; CA2817172A1

Abstract

本发明提供包含哺乳动物干细胞和至少一种多糖如海藻糖等的哺乳动物干细胞悬浮液；包含多糖如海藻糖等的哺乳动物干细胞聚集抑制剂；抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，包括将哺乳动物干细胞悬浮于包含多糖的生理水溶液中；包含多糖如海藻糖等的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂；抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，包括将哺乳动物干细胞悬浮于包含多糖等的生理水溶液中。

Description

干细胞悬浮液

技术领域

本发明涉及哺乳动物干细胞悬浮液和包含它的药物制剂。此外，本发明涉及抑制哺乳动物干细胞聚集的试剂和抑制哺乳动物干细胞聚集的方法。此外，本发明涉及抑制哺乳动物干细胞存活率降低的试剂和抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法。

背景技术

随着近年来干细胞研究中的进展，干细胞的临床应用已从基础研究阶段转向发展阶段。在用干细胞治疗疾病中，受损的患者的细胞和组织功能由所述细胞和从干细胞新分化的器官来弥补。本文中，根据干细胞向体细胞或组织分化的方式，利用干细胞的治疗可以主要分为两类。

其中一种包括在特定条件下体外培养干细胞，使之向所需的体细胞或组织分化，并且将获得的体细胞或组织移植到受体体内。例如，由于将万能干细胞（pluripotent stem cells）如ES细胞、iPS细胞等直接移植到体内时会担心形成畸胎瘤，因此通常使它们在体外分化成特定的体细胞或组织以确保去除畸胎瘤形成能力，随后再移植到体内。

另一实施方式包括干细胞向体内直接转移。已报道该方法在疾病如肌萎缩性侧索硬化症、再生障碍性贫血、帕金森病、多发性硬化、胶原病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病、白血病、生活方式相关疾病、癌症等中显示出效果。

已知间充质干细胞为存在于哺乳动物的骨髓等中的干细胞，并且分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等。由于它们的多能性，间充质干细胞作为用于许多组织的再生性治疗的移植材料引起了注意。即“通过细胞移植的再生性治疗”，其通过使用间充质干细胞来再生由于疾病或病症而损失的组织并且恢复功能，所述组织无法通过常规治疗方法再生。具体而言，例如，如向患有小腿局部缺血（Buerger病）的患者移植骨髓间充质干细胞、向受牙周病影响的部分移植骨髓间充质干细胞、向患有骨关节炎的患者移植骨髓间充质干细胞等治疗已经开始或已经计划。

海藻糖是一种由葡萄糖的1,1-糖苷键产生的二糖。由于海藻糖给予甜味并且具有高度保水能力，因而将其用于多种食品和化妆品。此外，由于海藻糖稳定细胞膜并且抑制细胞损伤，因而将其作为器官保护液体的活性组分用于器官移植。已开发出含有海藻糖的优异的器官保存液如ET-Kyoto溶液、New ET-Kyoto溶液等（专利文件1和2、非专利文件1）。

羟乙基淀粉是一种醚化淀粉，并且用作粘合剂、乳化剂、糊剂等。

葡聚糖是一种由葡萄糖制成的多糖，并且在药剂和化妆品领域中广泛用作增稠剂、润湿剂等。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1：JP-B-3253131

专利文件2：WO2007/043698

[非专利文件]

非专利文件1：Yonsei Medical Journal, vol.45, No.6, 第1107-1114页, 2004。

发明概述

本发明要解决的问题

本发明人已对更稳定更顺畅地向身体进行干细胞移植的条件进行了深入研究。他们已发现干细胞向体内的转移在许多情况下是通过向体内滴注干细胞悬浮液来进行，这在滴注过程中可能会导致输液袋内悬浮液中的干细胞的聚集而堵塞插管，并且在细血管如肺静脉等中形成栓塞。此外，本发明人已发现输液袋中干细胞的存活率在滴注过程中逐渐降低。

本发明旨在提供在干细胞移植过程中抑制悬浮液中干细胞聚集的技术。

此外，本发明旨在提供抑制悬浮液中干细胞存活率降低的技术。

解决问题的方法

作为深入研究的结果，本发明人已发现可以通过向干细胞悬浮液中加入多糖如海藻糖等来抑制干细胞的聚集。而且，他们还已经发现此类多糖可以抑制干细胞存活率的降低。此外，他们还已经发现对干细胞存活率降低的抑制效果可以通过一些多糖的组合来增强。根据这些发现，他们已经进行了进一步的研究并完成了本发明。

即，本发明涉及以下内容。

[1] 哺乳动物干细胞悬浮液，其包含哺乳动物干细胞和至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

[2] [1]的哺乳动物干细胞悬浮液，其包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

[3] [1]的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述干细胞为黏着干细胞。

[4] [3]的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

[5] [1]的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述哺乳动物干细胞包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。

[6] [1]的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述多糖为具有4.53 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

[7] [1]的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。

[8] 哺乳动物干细胞悬浮液的生产方法，其包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

[9] [8]的生产方法，其中所述生理水溶液包含海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖。

[10] 哺乳动物干细胞悬浮液制剂，其包含[1]- [7]中任一项的哺乳动物干细胞悬浮液。

[11] 哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

[12] [11]的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述干细胞为黏着干细胞。

[13] [12]的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

[14] [11]的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述多糖为海藻糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中海藻糖的浓度为4.53 - 362.4 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

[15] [11]的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述多糖为葡聚糖，并且以使葡聚糖的浓度为30 - 100 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

[16] 抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

[17] [16]的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述干细胞为黏着干细胞。

[18] [17]的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

[19] [16]的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述哺乳动物干细胞包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。

[20] [16]的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述多糖为具有4.53 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

[21] [16]的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。

[22] 哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

[23] [22]的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

[24] [22]的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述干细胞为黏着干细胞。

[25] [24]的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或多能干细胞。

[26] [22]的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述多糖为海藻糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中海藻糖的浓度为4.53 - 362.4 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

[27] [22]的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述多糖为葡聚糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中葡聚糖的浓度为30 - 100 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

[28] 抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

[29] [28]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述生理水溶液包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

[30] [28]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述干细胞为黏着干细胞。

[31] [30]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

[32] [28]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述哺乳动物干细胞为单细胞状态。

[33] [28]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述多糖为具有15.1 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

[34] [28]的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。

发明效果

使用本发明，可以在干细胞移植过程中抑制悬浮液中干细胞的聚集。结果是，降低了干细胞聚集物堵塞插管或在细血管如肺静脉等中形成栓塞的风险。

而且，使用本发明，可以抑制悬浮液中干细胞存活率的降低。结果是，可以使用状态更好的干细胞进行治疗，因此可以预期治疗效果会增强。

附图说明

图1显示了25℃下hBM-MSC P6在每一种组成溶液中静置1小时后的形状和存活率。

图2显示了25℃下hAT-MSC P8在每一种组成溶液中静置1小时后的形状和存活率。

图3显示了25℃下在每一种组成溶液中静置后的存活率，其中6个条棒从左起显示盐水、培养基、ET-K、Saviosol、HES70K和HES200K。

图4显示了25℃下在每一种组成溶液中静置后的存活率，其中5个条棒从左起显示盐水、培养基、ET-K、Saviosol和ET-K + Saviosol。

图5显示了当保存于含葡聚糖40(6.5 - 10(w/v)%)的缓冲液或盐水中时，试管的上层、中层和下层中来自人骨髓的间充质干细胞的数目，其中图中间的数值显示了总细胞的存活率。

图6显示了当保存于含葡聚糖40(6.5 - 10(w/v)%)的缓冲液或盐水中时，试管的上层、中层和下层中来自人脂肪组织的间充质干细胞的数目，其中图中间的数值显示了总细胞的存活率。

具体实施方式

I. 哺乳动物干细胞悬浮液

本发明提供哺乳动物干细胞悬浮液，其包含哺乳动物干细胞和至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

哺乳动物的实例包括啮齿类如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等，兔类如兔等，有蹄类如猪、牛、山羊、马、绵羊等，食肉类如狗、猫等，灵长类如人、猴、猕猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）、狨猴、猩猩、黑猩猩等，等等。哺乳动物优选为啮齿类（小鼠等）、有蹄类（猪等）或灵长类（人等）。

在本说明书中，“干细胞”意指具有自我复制能力和分化/增殖能力的未成熟细胞。根据分化能力，干细胞包括亚群如万能干细胞（pluripotent stem cell）、多能干细胞（multipotent stem cell）、单能干细胞（unipotent stem cell）等。万能干细胞表示自身无法成为个体生物但具有分化为构成活体生物的任何组织或细胞的能力的细胞。多能干细胞表示具有分化为多种（尽管不是所有的）组织或细胞的能力的细胞。单能干细胞表示具有分化为特定组织或细胞的能力的细胞。

万能干细胞的实例包括胚胎干细胞（ES细胞）、EG细胞、iPS细胞等。可以通过在饲养细胞上或在含LIF的培养基中培养内细胞团来产生ES细胞。ES细胞的产生方法描述于例如WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等。可以通过在含mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养原始生殖细胞来产生EG细胞 (Cell, 70: 841-847, 1992)。可以通过向体细胞（例如成纤维细胞、皮细胞等）引入重编程因子如Oct3/4、Sox2和Klf4 (而且，根据需要的c-Myc或n-Myc)等来产生iPS细胞 (Cell, 126: 第663-676页, 2006; Nature, 448: 第313-317页, 2007; Nat Biotechnol, 26: 第101-106页, 2008; Cell 131: 第861-872页, 2007; Science, 318: 第1917-1920页, 2007; Cell Stem Cells 1: 第55-70页, 2007; Nat Biotechnol, 25: 第1177-1181页, 2007; Nature, 448: 第318-324页, 2007; Cell Stem Cells 2: 第10-12页, 2008; Nature 451: 第141-146页, 2008; Science, 318: 第1917-1920页, 2007)。通过培养由体细胞细胞核的核移植产生的早期胚胎而建立的干细胞作为万能干细胞也是优选的(Nature, 385, 第810页 (1997); Science, 280, 第1256页 (1998); Nature Biotechnology, 17, 第456页 (1999); Nature, 394, 第369页 (1998); Nature Genetics, 22, 第127页 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 第14984页 (1999)), Rideout III等 (Nature Genetics, 24, 第109页 (2000))。

多能干细胞的实例包括成体干细胞如间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、髓样干细胞、生殖干细胞等，等等。多能干细胞优选为间充质干细胞。间充质干细胞表示能够分化成所有或某些成骨细胞、成软骨细胞和脂肪母细胞的干细胞。多能干细胞可以通过本身已知的方法从活体生物中分离。例如，间充质干细胞可以通过已知的常规方法从哺乳动物骨髓、脂肪组织、外周血、脐带血等中收集。例如，人间充质干细胞可以通过骨髓穿刺后的造血干细胞等的培养或传代来分离(Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 第163-171页)。多能干细胞也可以通过在合适的诱导条件下培养上述万能干细胞来获得。

本发明的悬浮液中包含的干细胞优选是黏着的。这是因为在悬浮液中易于发生的黏着干细胞的聚集由于本发明的悬浮液包含海藻糖而可以被有效地抑制。在本说明书中，“黏着”细胞表示通过粘附到壁上能够存活、生长并且产生物质的贴壁依赖性细胞。黏着干细胞的实例包括万能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、髓样干细胞、生殖干细胞等。黏着干细胞优选为间充质干细胞或万能干细胞。

哺乳动物干细胞可以从身体分离或在体外传代培养。

本发明的悬浮液中包含的哺乳动物干细胞优选是分离的或纯化的细胞。在本说明书中，“分离的或纯化的”表示已实施了用于去除目标组分外的组分的操作。分离的或纯化的哺乳动物干细胞的纯度（哺乳动物干细胞数与细胞总数的比例）通常不少于30％，优选不少于50％，更优选不少于70％，还更优选不少于90％（例如100％）。

本发明的悬浮液中包含的哺乳动物干细胞优选包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。在本说明书中，“单细胞状态”表示细胞未与其它细胞一起形成团（即，非聚集状态）。单细胞状态的哺乳动物干细胞可以通过用酶如胰蛋白酶/EDTA等处理体外培养的哺乳动物干细胞来制备。哺乳动物干细胞中包含的单细胞状态的哺乳动物干细胞的比例通常不少于70%，优选不少于90%，更优选不少于95%，还更优选不少于99%（例如100％）。单细胞状态的细胞的比例可以这样测定，将哺乳动物干细胞在PBS中分散，在显微镜下观察它们，并且在随机挑选的多个（如1000个）细胞中检查是否存在聚集。

在本发明的悬浮液中，哺乳动物干细胞优选是漂浮的。在本说明书中，“漂浮的”表示细胞处于悬浮液中，而不与包含悬浮液的容器的内壁接触。

本发明的悬浮液包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。如下文提及的实施例中显示，多糖具有抑制哺乳动物干细胞聚集的作用。因此，优选地，哺乳动物干细胞的聚集在本发明的悬浮液中受到抑制。在本说明书中，“聚集”指两个或更多个细胞聚集成团的现象。

特别是，黏着干细胞漂浮于悬浮液中并且当它们处于单细胞状态时容易聚集。然而，上述多糖有效地抑制了聚集，并且可以长时间保持单细胞状态。

尽管不受理论束缚，当干细胞悬浮液包含上述多糖时，悬浮液中细胞的漂浮状态会相对长时间保持，细胞的沉淀受到抑制，并且细胞间的接触受到抑制。此外，一般说来，当黏着细胞长时间处于漂浮状态时，细胞受到应激，并且已知根据漂浮时间，会形成突出，以粘附到皿等上。然而，由于上述多糖（尤其是海藻糖）仅对细胞产生微小应激，因此突出形成受到抑制。结合这些作用，认为上述多糖提供了优良的哺乳动物干细胞聚集抑制作用。

如下文提及的实施例中显示，上述多糖具有抑制哺乳动物干细胞存活率降低的作用。因此，优选地，哺乳动物干细胞存活率的降低在本发明的悬浮液中受到抑制。特别是，当黏着干细胞漂浮在悬浮液中时（尤其是漂浮在悬浮液中并处于单细胞状态），它们易于受到损伤，并且其存活率容易降低。然而，通过加入上述多糖，可以有效地抑制黏着干细胞的黏着存活率的降低。

可用于本发明的悬浮液的海藻糖包括α,α-海藻糖、α,β-海藻糖和β,β-海藻糖3种。虽然海藻糖的种类并无具体限定，只要它能够抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低，但优选使用α,α-海藻糖。

虽然可用于本发明的悬浮液的羟乙基淀粉的重均分子量（Mw）并无具体限定，只要它能够抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低，但它通常为5×10⁴ - 67×10⁴，优选7×10⁴ - 60×10⁴，更优选7×10⁴ - 20×10⁴的范围内。

为了加强对哺乳动物干细胞的哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率降低的抑制作用，优选使用具有相对低的重均分子量（Mw）（如，5×10⁴ - 9×10⁴, 优选6×10⁴ - 8×10⁴ (如 7×10⁴)）的羟乙基淀粉。

而且，虽然可用于本发明的悬浮液的羟乙基淀粉的取代度（每1葡萄糖单位的羟乙基基团数）并无具体限定，只要它能够抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低，但它通常为0.4 - 0.8。

可用于本发明的悬浮液的羟乙基淀粉的优选实例包括具有7×10⁴的重均分子量（Mw）和0.50 - 0.55的取代度的羟乙基淀粉、以及具有20×10⁴的重均分子量（Mw）和0.50 - 0.55的取代度的羟乙基淀粉等。此类羟乙基淀粉是市售的，例如来自Fresenius Kabi Japan K.K.的Hespander（注册商标）。

可用于本发明的悬浮液的葡聚糖是由D-葡萄糖构成的多糖(C₆H₁₀O₅)_n，其具有α1→6键作为主链。葡聚糖的种类并无具体限定，只要它能够抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低。葡聚糖的重均分子量（Mw）并无具体限定，只要它能够抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低。葡聚糖40 (Mw=40000)和葡聚糖70 (Mw=70000)等是优选实例。

本发明的悬浮液中的上述多糖的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞的聚集和/或存活率的降低。上述多糖的浓度越高，对聚集和/或存活率降低的抑制作用就越高。然而，当多糖浓度过高时，干细胞的存活率可能受到不利影响。

例如，当使用海藻糖作为上述多糖时，在本发明的悬浮液中海藻糖的浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml。为了避免对干细胞存活率的不利影响，悬浮液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，悬浮液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定这样的浓度，所述浓度具有抑制干细胞聚集和/或存活率降低的作用，并且抑制对干细胞存活率的不利影响。

当使用羟乙基淀粉作为上述多糖时，在本发明的悬浮液中的羟乙基淀粉的浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，悬浮液中羟乙基淀粉的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液中的羟乙基淀粉浓度例如为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为上述多糖时，在本发明的悬浮液中葡聚糖的浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，还更优选不少于65 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，悬浮液中葡聚糖的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液中葡聚糖的浓度例如是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

本发明的悬浮液优选包含海藻糖和羟乙基淀粉、或海藻糖和葡聚糖的组合。期望海藻糖与羟乙基淀粉或葡聚糖的组合增强抑制哺乳动物干细胞存活率降低的作用。特别是，期望该组合有效地抑制漂浮于悬浮液中的黏着干细胞（尤其是，漂浮于悬浮液中并且处于单细胞状态的黏着干细胞）存活率的降低。

当将海藻糖与羟乙基淀粉或葡聚糖组合使用时，优选这样设定本发明的悬浮液中每一种多糖的浓度，从而使海藻糖与羟乙基淀粉或葡聚糖的组合使用要比海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的每一种单独使用更加增强对哺乳动物干细胞存活率降低的抑制作用。

在本发明的悬浮液中，哺乳动物干细胞悬浮于包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液。生理水溶液优选为等渗水溶液如盐水、磷酸缓冲盐溶液、tris缓冲盐溶液、HEPES缓冲盐溶液、林格溶液、5％葡萄糖水溶液、哺乳动物培养用液体培养基和等渗剂（葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化钠等）的水溶液，等等。在本说明书中，“等渗”表示渗透压在250－380 mOsm/l范围内。

生理水溶液还可以包含稳定剂（如人血清白蛋白、聚乙二醇等）、缓冲剂（如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液）、螯合剂（如EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐）、增溶剂、防腐剂、抗氧化剂等。

本发明的悬浮液可以通过在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液（优选包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的等渗水溶液）中悬浮哺乳动物干细胞来产生。生理水溶液中每一种多糖的浓度与本发明的上述悬浮液中每一种多糖的浓度相同。本发明还提供产生哺乳动物干细胞悬浮液的此类方法。

在包含上述多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞包括通过将上述多糖加入到哺乳动物干细胞悬浮液中获得包含哺乳动物干细胞和上述多糖的哺乳动物干细胞悬浮液。

在包含上述多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞可以通过本领域公知的方法如吹打（pipetting）、轻打（tapping）等来完成。

本发明的悬浮液的温度通常在0 - 37℃，优选0 - 25℃的范围内。

本发明的悬浮液中哺乳动物干细胞的密度并无具体限定，只要能够实现至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖对哺乳动物干细胞聚集和/或存活率降低的抑制作用，并且通常在10³ - 10¹⁰ 细胞/ml的范围内。

在一个优选的实施方式中，由于哺乳动物干细胞的聚集受本发明的悬浮液中至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的抑制，因此使用所述悬浮液的干细胞移植可以降低干细胞聚集物堵塞插管或在细血管如肺静脉等中形成栓塞的风险。此外，在一个优选的实施方式中，由于悬浮液中哺乳动物干细胞存活率的降低受本发明的悬浮液中至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的抑制，因此当使用本发明的悬浮液时，干细胞移植可以在更好的状态下进行，并且可以预期治疗效果会增强。因此，本发明还提供包含上述本发明的悬浮液的哺乳动物干细胞悬浮液制剂。

本发明的哺乳动物干细胞悬浮液制剂可以通过将上述本发明的悬浮液封装在合适的无菌容器中来生产。所述容器的实例包括瓶、小管、注射器、塑料袋如输液袋等、试管等。这些容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。插管和/或注射针可以与这些容器连接，以使容器中哺乳动物干细胞悬浮液能够向患者滴注。

II. 抑制哺乳动物干细胞的聚集

（1. 哺乳动物干细胞聚集抑制剂）

本发明提供哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。这些多糖尤其抑制悬浮液中哺乳动物干细胞（即，漂浮的哺乳动物干细胞）的聚集。

除非另有说明，每一术语如“海藻糖”、“羟乙基淀粉”、“葡聚糖”、“哺乳动物”、“干细胞”、“黏着”、“分离的或纯化的”、“单细胞状态”、“漂浮的”、“聚集”、“等渗”、“生理水溶液”等的定义如上述I中描述。

作为本发明的聚集抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选为黏着干细胞。这是由于悬浮液中的黏着干细胞（即，处于漂浮状态）更容易聚集。黏着干细胞优选为间充质干细胞或万能干细胞。

哺乳动物干细胞可以从身体分离或在体外传代培养。

作为本发明的聚集抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选为分离的或纯化的。

作为本发明的聚集抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。哺乳动物干细胞中包含的单细胞状态的哺乳动物干细胞的比例通常不少于70%，优选不少于90%，更优选不少于95%，还更优选不少于99%（例如100％）。

作为本发明的聚集抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选漂浮于所述干细胞的悬浮液中。

特别是，黏着干细胞漂浮于悬浮液中并且当它们处于单细胞状态时容易聚集。然而，本发明的聚集抑制剂能够有效地抑制聚集，并且可将单细胞状态长时间保持。

本发明的聚集抑制剂包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。当本发明的聚集抑制剂包含2种或3种选自它们中的多糖时，其组合为海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖、或羟乙基淀粉与葡聚糖、或海藻糖与羟乙基淀粉与葡聚糖的组合。

本发明的聚集抑制剂可以是至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖，或者还可以包含生理学可接受的载体。生理学可接受的载体的实例包括生理水溶液（如等渗水溶液，例如盐水、磷酸缓冲盐溶液、tris缓冲盐溶液、HEPES缓冲盐溶液、林格溶液、5％葡萄糖水溶液、哺乳动物培养用液体培养基、等渗剂（葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化钠等）的水溶液等）、稳定剂（如人血清白蛋白、聚乙二醇等）、缓冲剂（如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液）、螯合剂（如EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐）、赋形剂、粘合剂、增溶剂、防腐剂、抗氧化剂等。本发明的聚集抑制剂优选为包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液（在生理水溶液中的上述多糖的溶液），更优选为包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的等渗水溶液。

本发明的聚集抑制剂可以通过加入到哺乳动物干细胞悬浮液中来使用。或者，当本发明的聚集抑制剂是包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液时，可以在本发明的聚集抑制剂中悬浮哺乳动物干细胞。加入本发明的聚集抑制剂，或者在本发明的聚集抑制剂中悬浮哺乳动物干细胞，以使达到足以抑制哺乳动物干细胞聚集的多糖浓度。

当使用海藻糖作为上述多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞聚集的海藻糖浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml。海藻糖浓度越高，对聚集的抑制作用就越高。然而，当海藻糖浓度过高时，干细胞的存活率可能受到不利影响。为了避免对干细胞存活率的不利影响，因此，悬浮液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，悬浮液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定出足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞聚集的浓度。

当使用羟乙基淀粉作为上述多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞聚集的羟乙基淀粉浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，悬浮液中羟乙基淀粉的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液的羟乙基淀粉浓度例如为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为上述多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞聚集的葡聚糖浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，还更优选不少于65 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，悬浮液中葡聚糖的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液中葡聚糖的浓度例如是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

此外，当使用2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖时，加入本发明的聚集抑制剂或者在本发明的聚集抑制剂中悬浮哺乳动物干细胞，以使悬浮液中哺乳动物干细胞的聚集结果受到抑制。

本发明的聚集抑制剂以这样的量包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖，当如上所述使用时，足以抑制哺乳动物干细胞的聚集。本发明的聚集抑制剂中多糖的含量通常在0.001 - 100(w/w)%的范围内。

当本发明的聚集抑制剂是包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液时，水溶液中多糖的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞的聚集。上述多糖的浓度越高，对聚集的抑制作用就越高。然而，当多糖浓度过高时，干细胞的存活率可能受到不利影响。

例如，当使用海藻糖作为上述多糖时，水溶液中海藻糖的浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml。为了避免对干细胞存活率的不利影响，水溶液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，水溶液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定出足以抑制哺乳动物干细胞聚集的海藻糖浓度。

当使用羟乙基淀粉作为上述多糖时，水溶液中的羟乙基淀粉浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为上述多糖时，在本发明的水溶液中葡聚糖的浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，还更优选不少于65 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，水溶液中葡聚糖的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，水溶液中葡聚糖的浓度例如是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

此外，当使用2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖时，水溶液包含每一种多糖，以使哺乳动物干细胞的聚集得到抑制。

通过在已制备为这样的浓度的包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞，可以方便地抑制哺乳动物干细胞的聚集。

（2. 抑制哺乳动物干细胞聚集的方法）

本发明提供抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液（优选包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的等渗水溶液）中悬浮哺乳动物干细胞。这些多糖尤其抑制悬浮液中哺乳动物干细胞（即，漂浮的哺乳动物干细胞）的聚集。

在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞包括向哺乳动物干细胞悬浮液中加入至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖来产生在包含所述多糖的生理水溶液中的哺乳动物干细胞悬浮液。

用于本发明的抑制聚集的方法中的哺乳动物干细胞优选为黏着干细胞。这是由于悬浮液中的黏着干细胞（即，处于漂浮状态）更容易聚集。黏着干细胞优选为间充质干细胞或万能干细胞。

哺乳动物干细胞可以从身体分离或在体外传代培养。

用于本发明的聚集抑制方法中的哺乳动物干细胞优选为分离的或纯化的。

用于本发明的抑制聚集的方法中的哺乳动物干细胞优选包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。哺乳动物干细胞中包含的单细胞状态的哺乳动物干细胞的比例通常不少于70%，优选不少于90%，更优选不少于95%，还更优选不少于99%（例如100％）。

特别是，黏着干细胞漂浮于悬浮液中并且当它们处于单细胞状态时容易聚集。然而，至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖能够有效抑制聚集，并且可将单细胞状态长时间保持。

本发明中使用的生理水溶液包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。当生理水溶液包含2种或3种选自它们中的多糖时，其组合为海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖、或羟乙基淀粉与葡聚糖、或海藻糖、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合。

本发明中使用的生理水溶液以足以抑制哺乳动物干细胞聚集的浓度包含上述多糖。

当使用海藻糖作为上述多糖时，生理水溶液中海藻糖的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞的聚集。通常它不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml。为了避免对干细胞存活率的不利影响，生理水溶液中海藻糖的浓度优选不多于362.4 mg/ml，更优选不多于181.2 mg/ml。因此，生理水溶液的海藻糖浓度优选为4.53 - 362.4 mg/ml，更优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定出足以抑制哺乳动物干细胞聚集的浓度。

当使用羟乙基淀粉作为上述多糖时，生理水溶液中羟乙基淀粉的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞的聚集。例如，它不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，生理水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，生理水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为上述多糖时，生理水溶液中葡聚糖的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞的聚集。例如，它不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，还更优选不少于65 mg/ml。此外，为了避免对干细胞存活率的不利影响，生理水溶液中葡聚糖的浓度通常不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，生理水溶液中葡聚糖的浓度通常是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

此外，当使用2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖时，生理水溶液包含每一种多糖，以使哺乳动物干细胞的聚集得到抑制。

当悬浮哺乳动物干细胞时，包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液的温度通常在0 - 37℃的范围内，优选0 - 25℃。

悬浮液中哺乳动物干细胞的密度并无具体限定，只要能够实现至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的聚集抑制作用，并且通常在10³ - 10¹⁰ 细胞/ml的范围内。

在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞可以通过本技术领域熟知的方法如吹打（pipetting）、轻打（tapping）等来完成。通过这样的操作，哺乳动物干细胞漂浮于包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液。

III. 抑制哺乳动物干细胞存活率的降低

（1. 哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂）

本发明提供哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。当哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂包含2种或3种选自它们中的多糖时，海藻糖与羟乙基淀粉的组合、海藻糖与葡聚糖的组合、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合以及海藻糖与羟乙基淀粉与葡聚糖的组合尤其抑制悬浮液中哺乳动物干细胞（即，漂浮的哺乳动物干细胞）存活率的降低。

作为本发明的存活率降低的抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选为黏着干细胞。这是由于相比于非黏着细胞，黏着干细胞的存活率在悬浮液中（即，处于漂浮状态）更容易降低。黏着干细胞优选为间充质干细胞或万能干细胞。

哺乳动物干细胞可以从身体分离或在体外传代培养。

作为本发明的存活率降低的抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选为分离的或纯化的。

用于本发明的存活率降低的抑制剂的哺乳动物干细胞优选包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。哺乳动物干细胞中包含的单细胞状态的哺乳动物干细胞的比例通常不少于70%，优选不少于90%，更优选不少于95%，还更优选不少于99%（例如100％）。

作为本发明的存活率降低的抑制剂施用目标的哺乳动物干细胞优选漂浮于所述干细胞的悬浮液中。

特别是，当黏着干细胞漂浮在悬浮液中并处于单细胞状态时，它们易于受到损伤，并且其存活率容易降低。然而，通过本发明的存活率降低的抑制剂可以有效地抑制黏着干细胞存活率的降低。

本发明的存活率降低的抑制剂优选包含海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。期望海藻糖与羟乙基淀粉或葡聚糖的组合增强抑制哺乳动物干细胞存活率降低的作用。特别是，可以期望该组合有效地抑制悬浮液中漂浮状态（尤其是，处于漂浮于悬浮液中的状态，并且处于单细胞状态的黏着干细胞）的黏着干细胞存活率的降低。

本发明的存活率降低的抑制剂可以由至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖组成，或者还可以包含除这些组分之外的生理学可接受的载体。生理学可接受的载体的实例包括生理水溶液（如等渗水溶液，例如盐水、磷酸缓冲盐溶液、tris缓冲盐溶液、HEPES缓冲盐溶液、林格溶液、5％葡萄糖水溶液、哺乳动物培养的液体培养基、等渗剂（葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化钠等）的水溶液等）、稳定剂（如人血清白蛋白、聚乙二醇等）、缓冲剂（如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液）、螯合剂（如EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐）、赋形剂、粘合剂、增溶剂、防腐剂、抗氧化剂等。本发明的存活率降低的抑制剂优选为包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液（在生理水溶液中的上述多糖的溶液），更优选为包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的等渗水溶液。

本发明的存活率降低的抑制剂可以通过加入到哺乳动物干细胞悬浮液中来使用。或者，当本发明的存活率降低的抑制剂是包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液时，可以在本发明的存活率降低的抑制剂中悬浮哺乳动物干细胞。加入本发明的存活率降低的抑制剂，或者在本发明的存活率降低的抑制剂中悬浮哺乳动物干细胞，以使达到足以抑制哺乳动物干细胞存活率降低的上述多糖的浓度。

当使用海藻糖作为多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞存活率降低的海藻糖浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml。海藻糖的浓度越高，对存活率降低的抑制作用就越高。然而，当海藻糖浓度过高时，相反，干细胞的存活率可能受到不利影响。因此，为了避免不利影响，悬浮液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，悬浮液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定出足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞存活率降低的海藻糖浓度。

当使用羟乙基淀粉作为多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞存活率降低的羟乙基淀粉浓度通常不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。羟乙基淀粉的浓度越高，对存活率降低的抑制作用就越高。然而，当羟乙基淀粉浓度过高时，相反，干细胞的存活率可能受到不利影响。因此，为了避免不利影响，悬浮液中羟乙基淀粉的浓度通常不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液的羟乙基淀粉浓度通常为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为多糖时，足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞存活率降低的葡聚糖浓度通常不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，更优选不少于65 mg/ml。葡聚糖的浓度越高，对存活率降低的抑制作用就越高。然而，当葡聚糖浓度过高时，相反，干细胞的存活率可能受到不利影响。因此，为了避免不利影响，悬浮液中葡聚糖的浓度通常不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，悬浮液的葡聚糖浓度通常是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

当使用包含海藻糖与羟乙基淀粉；海藻糖与葡聚糖；或海藻糖、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合作为多糖时，优选这样设定悬浮液中每一种多糖的浓度，从而使这些组合的使用要比海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖每一种的单独使用更加增强对哺乳动物干细胞存活率降低的抑制作用。

本发明的存活率降低的抑制剂以这样的量包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖，当如上所述使用时，足以抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。本发明的存活率降低的抑制剂中多糖的含量通常在0.001 - 100(w/w)%的范围内。

当使用包含海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合作为多糖时，在本发明的存活率降低的抑制剂中，海藻糖的含量通常在0.001 - 99.999(w/w)%的范围内，并且羟乙基淀粉或葡聚糖的含量通常在0.001 - 99.999(w/w)%的范围内。

当使用包含海藻糖、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合作为多糖时，本发明的存活率降低的抑制剂中每一种多糖的含量通常在0.001 - 99.997(w/w)%的范围内。

当本发明的存活率降低的抑制剂是包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液时，水溶液中多糖的浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。上述多糖的浓度越高，对存活率降低的抑制作用就越高。然而，当多糖浓度过高时，干细胞的存活率可能受到不利影响。

例如，当使用海藻糖作为多糖时，水溶液中海藻糖的浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml，从而它足以抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。此外，为了避免不利影响，水溶液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，水溶液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

即使使用了海藻糖之外的上述多糖时，也可以根据海藻糖合适地决定出足以抑制悬浮液中哺乳动物干细胞存活率降低的浓度。

当使用羟乙基淀粉作为上述多糖时，水溶液中的羟乙基淀粉浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml。此外，为了避免不利影响，水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于100 mg/ml。因此，水溶液中羟乙基淀粉的浓度例如为1 - 500 mg/ml，优选10 - 100 mg/ml。

当使用葡聚糖作为上述多糖时，在本发明的水溶液中葡聚糖的浓度例如不少于1 mg/ml，优选不少于10 mg/ml，更优选不少于30 mg/ml，还更优选不少于65 mg/ml。此外，为了避免不利影响，水溶液中葡聚糖的浓度例如不多于500 mg/ml，优选不多于200 mg/ml，更优选不多于125 mg/ml，还更优选不多于100 mg/ml。因此，水溶液中葡聚糖的浓度例如是1 - 500 mg/ml，优选10 - 200 mg/ml，更优选30 - 125 mg/ml，还更优选30 - 100 mg/ml，进一步更优选65 - 100 mg/ml。

当使用包含海藻糖与羟乙基淀粉；海藻糖与葡聚糖；或海藻糖、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合作为多糖时，优选这样设定水溶液中每一种多糖的浓度，从而使这些组合的使用要比海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖每一种的单独使用更加增强对哺乳动物干细胞存活率降低的抑制作用。

通过在已调整为这样的浓度的包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞，可以方便地抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。

（2. 抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法）

本发明提供抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其包括在包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液（优选为包含1种、2种或3种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的等渗水溶液）中悬浮哺乳动物干细胞。当组合使用2种或3种多糖时，海藻糖与羟乙基淀粉的组合、海藻糖与葡聚糖的组合、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合以及海藻糖、羟乙基淀粉与葡聚糖的组合尤其抑制悬浮液中哺乳动物干细胞（即，漂浮的哺乳动物干细胞）存活率的降低。

在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞还包括向哺乳动物干细胞悬浮液中加入至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖来产生在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中的哺乳动物干细胞悬浮液。

用于本发明的抑制存活率降低的方法的哺乳动物干细胞优选为黏着干细胞。这是由于相比于非黏着细胞，黏着干细胞的存活率更容易在悬浮液中（即，处于漂浮状态）降低。黏着干细胞优选为间充质干细胞或万能干细胞。

哺乳动物干细胞可以从身体分离或在体外传代培养。

用于本发明的抑制存活率降低的方法的哺乳动物干细胞优选为分离的或纯化的。

用于本发明的抑制存活率降低的方法的哺乳动物干细胞优选包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。哺乳动物干细胞中包含的单细胞状态的哺乳动物干细胞的比例通常不少于70%，优选不少于90%，更优选不少于95%，还更优选不少于99%（例如100％）。

特别是，当黏着干细胞漂浮在悬浮液中并处于单细胞状态时，它们易于受到损伤，并且其存活率容易降低。然而，黏着干细胞存活率的降低可以被至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖有效抑制。

本发明中使用的生理水溶液优选包含海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。期望海藻糖与羟乙基淀粉或葡聚糖的组合增强抑制哺乳动物干细胞存活率降低的作用。特别是，可以期望该组合有效地抑制悬浮液中漂浮状态（尤其是，黏着干细胞处于漂浮于悬浮液中的状态，并且处于单细胞状态）的黏着干细胞存活率的降低。

包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中的多糖浓度并无具体限定，只要它足以抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。

例如，当使用海藻糖作为上述多糖时，水溶液中海藻糖的浓度通常不少于4.53 mg/ml，优选不少于15.1 mg/ml，从而它将足以抑制哺乳动物干细胞存活率的降低。为了避免对干细胞存活率的不利影响，水溶液中海藻糖的浓度通常不多于362.4 mg/ml，优选不多于181.2 mg/ml。因此，水溶液的海藻糖浓度通常为4.53 - 362.4 mg/ml，优选15.1 - 181.2 mg/ml。

当悬浮哺乳动物干细胞时，包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液的温度通常在0℃ - 37℃的范围内，优选0℃ - 25℃。

悬浮液中哺乳动物干细胞的密度并无具体限定，只要实现海藻糖的聚集抑制作用，并且通常在10³ - 10¹⁰ 细胞/ml的范围内。

在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞可以通过本领域熟知的方法如吹打（pipetting）、轻打（tapping）等来完成。通过这样的操作，哺乳动物干细胞漂浮于包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液。

本说明书中引用的所有参考文献包括出版物、专利文件等均以其整体已明确地公开于本文的程度单独地并明确地通过引用并入本文。

尽管本发明在下文中通过参考实施例得到更明确的解释，但它不以任何方式受下文显示的实施例的限定。

实施例

[实施例1]

1. 猪皮下脂肪组织来源的间充质干细胞（猪AT-MSCs）的制备

（1）猪组织的制备

从腹股沟区收集猪皮下脂肪组织，用微型剪刀去除不同于脂肪组织的可见组织如血管、肌肉等，随后，重复切碎和HBSS（Hanks溶液）洗涤数次。持续洗涤直至可以肉眼确认去除血细胞（或血块）和去除膜漂浮物如肌肉等。用剪刀剪碎获得的猪皮下脂肪组织。

将剪碎的组织与等量的HBSS混合。轻柔摇晃混合物并静置来分为2层。仅回收上层。将0.2%胶原酶(I型)/HBSS加入到回收的上层中并且在37℃下轻柔摇晃混合物直到脂肪组织完全变成液体（最多90分钟）。向反应混合物中加入与胶原酶反应混合物的量相等或更多的量的含10％胎牛血清（FBS）的αMEM。混合后，通过离心将混合物分为3层（从下向上为有核细胞、溶液和脂肪）。仅回收底层并在HBSS中重悬。该操作重复三次。最后，将含10% FBS的αMEM中的细胞悬浮液转移到培养皿中并培养。MSCs黏着在培养皿底部。

（2）用于实验中的细胞（猪AT-MSCs P6）的制备

在（1）的操作中，黏着在培养皿的MSCs持续生长，并且5－7天后，培养皿底部密集地布满细胞。一旦达到汇合，MSCs中则会诱导生长中止或细胞死亡。因此，达到汇合前，将MSCs从培养皿分离并以低密度铺于新的培养皿上。用PBS洗涤黏着于培养皿底部的MSCs三次，并且加入胰蛋白酶-EDTA (0.25%胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)。将MSCs从培养皿分离，以提供低密度的细胞的量悬浮于含10% FBS的αMEM中，并且转移至新的培养皿。该操作重复6次（6次传代＝P6）。

（3）在每一种溶液中悬浮细胞

将（2）中获得的猪AT-MSCs P6用于实验中。

每个10 cm皿用5 ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1 ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将获得的细胞转移至15 ml Falcon管中并且通过离心回收。用PBS(-)洗涤两次后，用每一种溶液[ET-kyoto (ET-K,由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.生产)、HBSS、MSCM (DMEM+10% FBS)]再次洗涤细胞，使其适应。ET-K包含浓度为45.3 mg/ml的海藻糖。因此，将细胞在每一种溶液中悬浮至2.5x10⁵ 细胞/50 μL。

用20 μL PIPETMAN吹打数次后，在每一温度（0、25和37℃）下保持静置0、30、60、120和240分钟后，将其10 μL转移至皿中。

将立体显微镜对焦于皿中悬浮液的最底层，并进行观察。

将显微镜下与邻近细胞形成团的细胞作为细胞聚集团。通过在显微镜阶段晃动皿，细胞聚集团被确认为以团块形式明显移动。

2. 检测细胞存活率

检测了每一条件对细胞存活率的影响。

通过锥虫蓝染色来计算每50 μL中存活细胞的数目，并且通过将该数目与起始时50 μL中存活细胞的数目(2.5x10⁵个细胞)比较来计算细胞的存活率。结果显示于表1中。

表1

多种细胞悬浮液中MSCs的存活率

Figure 2011800645504100002DEST_PATH_IMAGE001

当使用MSCM或HBSS时，细胞存活率随时间经过而显著降低。然而，存活率降低受ET-K的抑制。

3. 检测细胞聚集状态

当使用MSCM时，在25℃和37℃下在试验开始后30分钟观察到细胞聚集团的形成。甚至在0℃，在试验开始后60分钟也观察到细胞聚集团的形成。

当使用HBSS时，在25℃和37℃下在试验开始后120分钟观察到细胞聚集团的形成。甚至在0℃，在试验开始后240分钟也观察到细胞聚集团的形成。

另一方面，当使用ET-K时，在25℃和37℃下直到试验开始120分钟后才观察到细胞聚集团的形成，并且细胞聚集团的形成甚至到试验开始240分钟后才观察到。在0℃，即使在试验开始240分钟后也未观察到细胞聚集团的形成。当使用ET-K时，在任何温度下细胞的漂浮状态均保持到试验开始240分钟。

4. 检测细胞形态

当使用MSCM时，观察到某些细胞已形成突出。膨胀细胞的出现比例低。

当使用HBSS时，具有突出的细胞比例随时间升高。此外，膨胀细胞的出现比例高。

另一方面，当使用ET-K时，具有突出的细胞比例相比于MSCM和HBSS低。相比于MSCM和HBSS，膨胀细胞的出现比例低。

通常，已知黏着细胞根据漂浮时间会形成突出，倾向于粘附到皿等上。这是由于漂浮状态对细胞产生了应激。此外，认为细胞膨胀表明细胞质内部和外部降低的渗透压控制效能。从上面的细胞形态观察结果中，认为ET-K相比于其它组成溶液对细胞产生轻度应激。

[实施例2]

将实施例1中制备的猪皮下脂肪组织来源的间充质干细胞传代两次并将所获细胞（猪AT-MSCs P2）铺于三个10 cm皿上。每个10 cm皿用5 ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1 ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞(1.7x10⁶个细胞; 存活率, 94.1%)转移至15 ml Falcon管中，通过离心回收，用PBS(-)洗涤两次，并在5 mL的ET-kyoto (由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.生产的ET-K)中悬浮。将ET-K中的细胞悬浮液按500 μL分配至十个15 mL管中，并且在室温(25℃)静置10分钟。向每一管中加入合适量的盐水，将ET-K中的细胞悬浮液稀释2－10倍，并且将混合物进一步静置30分钟。随后，以实施例1中相同的方式，计算存活率并且观察细胞聚集团是否存在。结果显示于表2中。

表2

（细胞可聚集力）

当使用ET-K的贮存液、其2倍稀释的溶液和其3倍稀释的溶液时，未观察到细胞聚集团。当ET-K稀释4倍或更多倍时，轻度观察到2－3个粘合的细胞的聚集团。因此，暗示在海藻糖浓度至少不少于15.1 mg/ml时显示出干细胞聚集抑制作用。

（细胞漂浮特性）

观察细胞可聚集力之后，重悬细胞，在室温(25℃)静置10分钟，并且在显微镜下观察细胞漂浮特性。当使用ET-K的贮存液、其2倍稀释的溶液和其3倍稀释的溶液时，细胞稳定地漂浮。另一方面，当ET-K稀释8倍或更多倍时，细胞大部分以与使用MSCM和HBSS时相同的方式沉淀。因此，暗示干细胞在至少15.1 mg/ml或更高的海藻糖浓度下稳定地漂浮。

（细胞形态和存活率）

即使用盐水稀释ET-K时，在稀释比例的检测范围内也没有观察到细胞形态或存活率的显著变化。

[实施例3]

将实施例1中制备的猪皮下脂肪组织来源的间充质干细胞传代十次，并将所获细胞（猪AT-MSCs P10）铺于10 cm皿上。每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞(3.3x10⁸个细胞; 存活率, 98.5%)转移至15-ml Falcon管中，通过离心回收，用PBS(-)洗涤两次，并在5 mL的ET-kyoto (由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.生产的ET-K)中悬浮。在4℃下将ET-K中的细胞悬浮液静置5小时或27小时。随后，以实施例1中相同的方式，计算存活率并且观察细胞聚集团是否存在。结果显示于表2中。静置5小时或27小时后，将细胞再培养24小时，随后在显微镜下观察细胞形态。

（细胞可聚集力）

从皿上分离后，将细胞在ET-K中悬浮并在4℃静置。结果是，在5小时和27小时后的任何时间点都未产生细胞聚集，并且保持了单细胞状态。因此，显示出即使在4℃下也表现出的ET-K的细胞聚集抑制作用。

（存活率）

5小时后的存活率为78.7%，并且27小时后的存活率为65.9%。观察到存活率从0小时到5小时以3.96%/小时降低，并且从5小时到27小时以0.58%/小时降低。

（细胞形态）

静置5小时或27小时后，将细胞进一步培养24小时。结果是，观察到黏着到平板上的细胞与存活率是一致的。然而，观察到约10％的保存27小时的细胞具有不规则形态。具有不规则形态的细胞比例不超过保存5小时的细胞的1％。

[实施例4]

（1）人骨髓来源的MSCs (hBM-MSCs)的制备

用含6000单位肝素的注射器从人髂骨中收集骨髓细胞(20 - 30 mL)。用PBS(-)洗涤骨髓细胞一次，并通过在900 g离心20分钟回收，重复一次。将细胞悬浮于含10% FBS的αMEM中，转移至培养皿中并且进行黏着培养。

（2）用于实验中的细胞（hBM-MSCs P3）的制备

通过（1）的操作，黏着在培养皿的MSCs持续生长，并且5－7天后，培养皿底部密集地布满细胞。一旦达到汇合，MSC中则会诱导生长中止或细胞死亡。因此，达到汇合前，将MSC从培养皿分离并以低密度铺于新的培养皿上。用PBS洗涤黏着于培养皿底部的MSCs三次，并且加入胰蛋白酶-EDTA (0.05%胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA?4Na)。将MSCs从培养皿分离，以提供低密度的细胞的量悬浮于含10% FBS的αMEM中，并且转移至新的培养皿。该操作重复3次（3次传代＝P3）。

将人骨髓细胞来源的MSCs铺至10-cm皿上并培养。每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞转移至15-ml Falcon管中，通过离心回收，用PBS(-)洗涤两次，并且悬浮于具有以下组成的溶液中。静置240分钟和480分钟后，观察是否存在细胞聚集。

NS: 盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

H: Hespander (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.)

1×T&NS: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的盐水

1×T&H: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的Hespander (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.)

1×T&H&TRase: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)和2单位/mL海藻糖酶(SIGMA)的Hespander (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.)。

海藻糖是ET-K的主要组分，并且ET-K中包含的海藻糖的浓度是45.3 mg/mL。Hespander是包含6(w/v)%的羟乙基淀粉(重均分子量(Mw)约为70000; 取代度0.50 - 0.55)的羟乙基淀粉制剂。

结果是，当使用NS和H时，试验开始240分钟后观察到细胞聚集团的形成。另一方面，当使用1×T&NS和1×T&H时，在试验开始240分钟和480分钟均未观察到细胞聚集团的形成。然而，当海藻糖被海藻糖酶分解后，观察到细胞聚集团的形成。

从上述结果中，显示出由海藻糖产生的ET-K的细胞聚集抑制作用。

[实施例5]

（1）人脂肪组织来源的MSCs (hBM―MSCs)的制备

收集人皮下脂肪组织，用微型剪刀去除不同于脂肪组织的可见组织如血管、肌肉等，随后，重复切碎和HBSS（Hanks溶液）洗涤数次。持续洗涤直至可以肉眼确认去除血细胞（或血块）和去除膜漂浮物如肌肉等。用剪刀剪碎获得的人皮下脂肪组织。

将剪碎的组织与等量的HBSS混合。轻柔摇晃混合物并静置来分为2层。仅回收上层。将0.05%胶原酶(I型)/HBSS加入到回收的上层中并且在37℃下轻柔摇晃混合物直到脂肪组织完全变成液体。向反应混合物加入含10％胎牛血清(FBS)的αMEM。混合后，通过离心将混合物分为2层。仅回收底层并在HBSS中重悬。该操作重复三次。最后，将含10% FBS的αMEM中的细胞悬浮液转移到培养皿中并培养。MSCs黏着在培养皿底部。

（2）用于实验中的细胞(hAT-MSCs P3)的制备

通过（1）的操作，黏着在培养皿的MSCs持续生长，并且5－7天后，培养皿底部密集地布满细胞。一旦达到汇合，MSC中则会诱导生长中止或细胞死亡。因此，达到汇合前，将MSCs从培养皿分离并以低密度铺于新的培养皿上。用PBS洗涤黏着于培养皿底部的MSCs三次，并且加入胰蛋白酶-EDTA (0.05%胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA?4Na)。将MSCs从培养皿分离，以提供低密度的细胞的量悬浮于含10% FBS的αMEM中，并且转移至新的培养皿。该操作重复3次（3次传代＝P3）。

将通过传代hAT-MSCs和hBM-MSCs三次获得的细胞(hAT-MSC P3和hBM-MSC P3)铺至10-cm皿上。每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞(hAT-MSCs P3, 1.0x10⁵个细胞；存活率 98.4%；hBM-MSCs P3, 1.25x10⁵个细胞; 存活率 96.8%)转移至15-ml Falcon管中，通过离心回收，用PBS(-)洗涤两次，并且悬浮于以下组成溶液（100 μL）中。室温(约25℃)下静置240分钟或24小时后，测定细胞的存活率，并且观察细胞聚集和形态。此外，静置240分钟或24小时后，将细胞再培养12小时，并且观察细胞形态。

0.1×T&H: 含4.53 mg/mL D-(+)-海藻糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的Hespander (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.)

0.1×T&NS: 含4.53 mg/mL D-(+)-海藻糖的盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

1×T&H: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

1×T&NS: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖的盐水

2×T&H: 含90.6 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

2×T&NS: 含90.6 mg/mL D-(+)-海藻糖的盐水

ET-K: ET-Kyoto (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

H: Hespander

NS: 盐水

MSCM: 含10% FBS的αMEM。

（细胞存活率）

结果显示于表3中。

表3

Figure 2011800645504100002DEST_PATH_IMAGE003

通过海藻糖或羟乙基淀粉(Hespander)的单独添加，细胞存活率得到提高。通过海藻糖和羟乙基淀粉(Hespander)两者的添加，细胞存活率得到显著提高。

（细胞聚集和形态）

在0.1×T&NS中，对于AT和BM两者，在试验开始后240分钟轻度观察到细胞聚集团的形成。另一方面，在组成溶液中包含海藻糖的其它组（0.1×T&H、1×T&H、1×T&NS、2×T&H、2×T&NS和ET-K）中，未观察到细胞聚集团的形成。在组成溶液中包含海藻糖的组中，未观察到细胞变形。

在组成溶液中无海藻糖和羟乙基淀粉的组（NS、MSCM）中，明显观察到细胞聚集团和细胞变形。在仅包含羟乙基淀粉（H）的组中，观察到细胞聚集团，但细胞变形小。

（静置后培养）

无论是否加入海藻糖，确定了与存活率一致的黏着细胞数目的升高或降低。在一部分含0.1×T的组和无海藻糖的组中，确定了异常的细胞形态。另一方面，相比于NS，H显示出良好的细胞形态，并且观察到取决于存活率的黏着细胞数目的升高或降低。

从上面的结果中，显示出海藻糖可以抑制细胞聚集，提高细胞存活率，并且保持细胞形态和功能。此外，显示出羟乙基淀粉可以提高细胞存活率，并且保持细胞形态和功能。此外，显示出海藻糖与羟乙基淀粉的组合显著提高了细胞存活率。

[实施例6]

将hAT-MSCs和hBM-MSCs传代三次，并且将所获细胞(hAT-MSCs P3和hBM-MSCs P3)铺至10 cm皿上。每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞(hAT-MSCs P3, 4.25x10⁵个细胞；存活率 97.5%；hBM-MSCs P3, 5.0x10⁵个细胞; 存活率 98.2%)转移至15-ml Falcon管中，通过离心回收，用PBS(-)洗涤两次，并且悬浮于以下组成溶液（100 μL）中。室温(约25℃)下静置8小时或36小时后，测定细胞的存活率，并且观察细胞聚集。

2×T&H: 含90.6 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

4×T&H: 含181.2 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

8×T&H: 含362.4 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

ET-K: ET-Kyoto (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

H: Hespander

1×T&H&TRase: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖和海藻糖酶(SIGMA) (2单位/mL)的Hespander。

（细胞聚集）

在组成溶液中包含海藻糖的组（1×T&H、2×T&H、4×T&H、8×T&H和ET-K）中，对于hAT-MSCs和hBM-MSCs两者，在试验开始后8小时均未观察到细胞聚集团的形成。另一方面，当使用无海藻糖的Hespander (H)时，对于hAT-MSCs和hBM-MSCs两者，在试验开始后8小时均观察到细胞聚集团的形成。此外，当海藻糖被海藻糖酶分解后，观察到细胞聚集团的形成（1×T&H&TRase）。从以上结果中，显示出海藻糖具有细胞聚集抑制作用。

（细胞存活率）

试验开始后36小时的细胞存活率显示于表4中。

表4

如表4中显示，加入任意浓度的海藻糖的细胞存活率高于单独加入Hespander (H)的。虽然直到加入浓度为181.2 mg/mL的海藻糖(4×T)为止细胞存活率显著提高，但当海藻糖浓度提高至362.4 mg/mL (8×T)时，作用却反而减弱。因此，为了提高细胞存活率，建议海藻糖浓度优选不多于181.2 mg/mL (4×T)。

[实施例7]

将hAT-MSCs和hBM-MSCs传代6次或8次并且将所获细胞(hAT-MSCs P8和hBM-MSCs P6)铺至10 cm皿上。每个10-cm皿用5-ml Hespander (KYORIN Pharmaceutical Co., Ltd.)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将所获细胞(hAT-MSCs P8, 2.4x10⁶个细胞; hBM-MSCs P6, 2.3x10⁶个细胞)转移至15-ml Falcon管中，通过离心回收，并悬浮于以下组成溶液中。室温(约25℃)下静置1小时后，测定细胞的存活率，并且观察细胞聚集。

1×T&H: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)的Hespander

0.5×T&H: 含22.65 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

0.1×T&H: 含4.53 mg/mL D-(+)-海藻糖的Hespander

1×T&F&H: 含45.3 mg/mL D-(+)-海藻糖和10 μg/ml岩藻多糖(Yaizu Suisankagaku Industry)的Hespander

0.5×T&F&H: 含22.65 mg/mL D-(+)-海藻糖和10 μg/ml岩藻多糖的Hespander

0.1×T&F&H: 含4.53 mg/mL D-(+)-海藻糖和10 μg/ml岩藻多糖的Hespander

F&H: 含10 μg/ml岩藻多糖的Hespander

ET-K: ET-Kyoto (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

H: Hespander

MSCM: 含10% FBS的αMEM。

试验结果显示于图1和2中。

（细胞存活率）

加入任意浓度的海藻糖的细胞存活率高于单独加入Hespander (H)的。由于加入岩藻多糖导致细胞存活率的降低，因此暗示岩藻多糖具有细胞毒性。海藻糖显示出抑制岩藻多糖的细胞毒性的趋势。

（细胞聚集）

对于hAT-MSCs和hBM-MSCs两者而言，通过加入海藻糖观察到细胞漂浮作用和细胞聚集抑制作用。另一方面，岩藻多糖显示出抑制细胞漂浮的趋势，并且未显示出细胞聚集抑制作用。当加入海藻糖而非单独加入Hespander时，细胞的突出形成受到抑制并且细胞形态良好。0.5×T&H的细胞聚集抑制作用与ET-K的类似。ET-K的细胞漂浮作用略微优于0.5×T&H的细胞漂浮作用。在0.1×T&H中，轻度观察到细胞表面的突出。

[实施例8]

将实施例1中制备的猪皮下脂肪组织来源的间充质干细胞传代七次并将所获细胞（猪AT-MSCs P7）在10 cm皿上培养。每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态，并且悬浮于ET-K溶液中。将所获的细胞悬浮液用于以下试验。

（与输液袋内壁黏着的评价）

将Soldem 3AG输液袋(TERUMO)精细切开，并且将其一片置于50-ml管的壁上。用细胞悬浮液将管装满，放置并在洁净台中室温(25℃)下静置30分钟。随后，用PBS洗涤输液袋碎片，并且通过显微镜观察评价输液袋内壁是否存在细胞黏着。

在用PBS洗涤之前，发现一部分MSCs（估计不多于10％）已黏着在输液袋内壁上。然而，通过用PBS洗涤，黏着的MSCs大部分被去除（估计不少于90％）。因此，显示了海藻糖避免细胞向输液袋内壁黏着的可能性。

（导管通过试验）

使用CV导管试剂盒(Japan Sherwood Medical Industries Ltd.)。将18G注射针与导管端连接。将细胞悬浮液抽入5-mL注射器中。将注射器安装到导管上并推出细胞悬浮液。将该操作重复规定次数，测定细胞存活率，并且用显微镜观察细胞。在显微镜观察前，用5-mL PBS洗涤导管。

结果显示于表5中。

[表5]

Figure 2011800645504100002DEST_PATH_IMAGE005

尽管通过数至少高至10次，但细胞存活率没有变化。虽然在导管内壁上观察到少量MSCs和残留的ET-K溶液，但通过导管后细胞数目没有变化，并且用PBS洗涤后没有观察到黏着细胞。因此，显示了海藻糖避免细胞向导管内壁黏着的可能性。

[实施例9]

在10 cm皿上培养猪间充质干细胞。通过用胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理将细胞分离为单细胞状态。在以下组成溶液中悬浮所获细胞，并且在室温(约25℃)下静置360分钟。测定细胞的存活率并且观察细胞聚集。

NS: 盐水

MSCM: 含10% FBS的αMEM

ET-K: ET-Kyoto (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

Saviosol: Saviosol (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

葡聚糖：低分子葡聚糖L注射液(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)。

Saviosol是包含浓度为30 mg/ml的具有40000的重均分子量的葡聚糖（葡聚糖40）的乳酸化林格溶液。低分子葡聚糖L注射液是包含浓度为100 mg/ml的具有40000的重均分子量的葡聚糖（葡聚糖40）的乳酸化林格溶液。

（细胞存活率）

试验开始后30分钟和360分钟的细胞存活率显示于表6中。

[表6]

如表6中显示，不论所用的组成如何，细胞存活率相比于使用盐水的明显高。

（细胞聚集）

试验开始后360分钟，在显微镜下观察是否存在细胞聚集。当细胞保存在盐水或MSCM中时，观察到大量细胞聚集团的形成；然而，在ET-K、Saviosol和葡聚糖中，细胞聚集团的形成受到抑制，并且保持了细胞的分散状态。

[实施例10]

（1）大鼠组织的制备

从腹股沟区收集大鼠皮下脂肪组织，用微型剪刀去除不同于脂肪组织的可见组织如血管、肌肉等，随后，重复切碎和HBSS（Hanks溶液）洗涤数次。持续洗涤直至可以肉眼确认去除血细胞（或血块）和去除膜漂浮物如肌肉等。用剪刀剪碎获得的大鼠皮下脂肪组织。

（2）用于实验中的细胞（大鼠AT-MSCs P6）的制备

（3）在每一种溶液中悬浮细胞

将（2）中获得的大鼠AT-MSCs P6用于实验中。

每个10-cm皿用5-ml PBS(-)洗涤细胞三次，并且通过用1-ml胰蛋白酶-EDTA (0.25% 胰蛋白酶, 1 mM EDTA?4Na)处理20秒钟分离为单细胞状态。将获得的细胞转移至15-ml Falcon管中并且通过离心回收。用PBS(-)洗涤两次后，再次用每一种以下溶液对细胞进行适应洗涤。

盐水：盐水

培养基: 含10% FBS的αMEM

ET-K: ET-Kyoto (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

Saviosol: Saviosol (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)

HES70K: 6(w/v)% 羟乙基淀粉(重均分子量70000)+0.9(w/v)% NaCl (Braun GmbH, Germany)

HES200K: 6(w/v)% 羟乙基淀粉(重均分子量200000)+0.9(w/v)% NaCl (Fresenius Kabi AG, Germany)

ET-K+Saviosol: ET-K和Saviosol的混合物 (体积比1:1)。

随后，用每一种溶液将细胞悬浮至2.5x10⁵ 细胞/50 μL。

用20 μL PIPETMAN吹打数次后，在每一温度（0、25、37℃）下保持静置30－360分钟后，并且将10 μL转移至皿中。

将立体显微镜对焦于皿中悬浮液的最底层，并进行观察。

（细胞存活率）

试验开始后30 - 360分钟的细胞存活率显示于图3和4中。如这些图中显示，不论所用的组成如何，细胞存活率相比于使用盐水的明显高。HES70K中对细胞存活率降低的抑制作用要高于HES200K中。

（细胞聚集）

试验开始后360分钟在显微镜下观察细胞可聚集力。结果显示于表7中。

[表7]

Figure 2011800645504100002DEST_PATH_IMAGE007

与在培养基中保存相比，在其它条件下细胞聚集团的形成受到抑制。HES70K中抑制细胞聚集的作用高于HES200K中。在ET-K、Saviosol、HES70K和ET-K+Saviosol中，未观察到细胞聚集的形成，并且良好保持了细胞分散。

[实施例11]

培养从人分离并纯化的每一种骨髓来源的间充质干细胞（传代数8）和脂肪组织来源的间充质干细胞（传代数8），直到它们覆盖了由Nunc制造的培养皿底部的约90％。用PBS(-)(由TaKaRa Bio, Inc.制造)洗涤培养皿三次。用胰蛋白酶溶液(由Gobco制造, US)将每一种间充质干细胞从培养皿上分离，并且在由Assist制造的15 mL离心管中回收。通过以1000 rpm 5分钟的离心操作，细胞聚集物在离心管底部形成，并且通过吸气器去除上清液。用手指轻打来打散细胞聚集物，并加入PBS(-) (由TaKaRa制造)。通过吹打数次进一步打散细胞，并以1000 rpm离心5分钟。确认离心管底部细胞聚合物的形成，并且通过吸气器去除上清液。用PBS(-)的洗涤操作再重复两次。用血细胞计数器测定细胞数，并且以1.0x10⁶细胞/管的条件将细胞转移至由Assist制造的1.5-mL管中。通过以1000 rpm 5分钟的离心操作，细胞聚集物在管底部形成，并且通过微量移液器去除上清液。向每一管中加入以下共计4种溶液的每一种

（1）盐水（由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造，1 mL），

（2）Saviosol (由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造, 500 μL)和葡聚糖L注射液(由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造, 500 μL)的混合物(葡聚糖40 6.5(w/v)%)，

（3）Saviosol (由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造, 250 μL)和葡聚糖L注射液(由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造, 750 μL)的混合物(葡聚糖40 8.25(w/v)%)，和

（4）葡聚糖L注射液(由Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.制造，葡聚糖40 10(w/v)%，1 mL)，

并且将混合物用涡旋混合器混合数秒。使用30G注射器针和1-mL注射器（由TERUMO Corporation制造），将细胞处理成单细胞状态，并且在室温（约25℃）下在管中静置。30分钟和60分钟静置后，从每一管中取出溶液(10 μL)，与等量的由GIBCO制造的锥虫蓝溶液混合，并且通过血细胞计数器对溶液进行细胞数目和存活率的测定。从每一管的三部分：液体表面中心（上部）、液体中间中心（中部）和管底部中心（下部）轻柔分离出评估的溶液。将上部、中部和下部的总细胞数作为100％，细胞的分布状态计算为每一部分细胞数作为分子与总细胞数作为分母的比例。此外，分别计算全部细胞的存活率。

结果显示于图5和6中。当间充质干细胞保存在含葡聚糖的缓冲液(6.5 - 10(w/v)%)中时，无论间充质干细胞的来源如何，管上部、中部和下部的细胞数都没有显示出较大差异，并且显示出保持细胞均匀分散。此外，在这种情况下，细胞的存活率保持相同并且是100％。另一方面，当使用盐水时，细胞沉淀于管底部，并且保存60分钟后细胞的存活率降至80％。

工业实用性

而且，使用本发明，可以抑制悬浮液中干细胞存活率的降低。结果是，可以使用状态更好的干细胞进行治疗，并且因此可以预期治疗效果会增强。

因此，本发明有助于使用干细胞的移植治疗领域。

本申请基于在日本提交的专利申请号2010-251273 (提交日: 2010年11月9日)和专利申请号2010-293908 (提交日: 2010年12月28日)，其内容完整地并入本文。

Claims

1.哺乳动物干细胞悬浮液，其包含哺乳动物干细胞和至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

2.权利要求1的哺乳动物干细胞悬浮液，其包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

3.权利要求1的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述干细胞为黏着干细胞。

4.权利要求3的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

5.权利要求1的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述哺乳动物干细胞包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。

6.权利要求1的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述多糖为具有4.53 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

7.权利要求1的哺乳动物干细胞悬浮液，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。

8.哺乳动物干细胞悬浮液的生产方法，包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

9.权利要求8的生产方法，其中所述生理水溶液包含海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖。

10.哺乳动物干细胞悬浮液制剂，其包含权利要求1－7中任一项的哺乳动物干细胞悬浮液。

11.哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

12.权利要求11的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述干细胞为黏着干细胞。

13.权利要求12的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

14.权利要求11的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述多糖为海藻糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中海藻糖的浓度为4.53 - 362.4 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

15.权利要求11的哺乳动物干细胞聚集抑制剂，其中所述多糖为葡聚糖，并且以使葡聚糖的浓度为30 - 100 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

16.抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

17.权利要求16的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述干细胞为黏着干细胞。

18.权利要求17的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

19.权利要求16的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述哺乳动物干细胞包含单细胞状态的哺乳动物干细胞。

20.权利要求16的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述多糖为具有4.53 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

21.权利要求16的抑制哺乳动物干细胞聚集的方法，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。

22.哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖。

23.权利要求22的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

24.权利要求22的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述干细胞为黏着干细胞。

25.权利要求24的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

26.权利要求22的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述多糖为海藻糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中海藻糖的浓度为4.53 - 362.4 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

27.权利要求22的哺乳动物干细胞存活率降低的抑制剂，其中所述多糖为葡聚糖，并且以使哺乳动物干细胞悬浮液中葡聚糖的浓度为30 - 100 mg/ml范围内的方式使用所述抑制剂。

28.抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其包括在包含至少一种选自海藻糖、羟乙基淀粉和葡聚糖的多糖的生理水溶液中悬浮哺乳动物干细胞。

29.权利要求28的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述生理水溶液包含含有海藻糖与羟乙基淀粉、或海藻糖与葡聚糖的组合。

30.权利要求28的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述干细胞为黏着干细胞。

31.权利要求30的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述黏着干细胞为间充质干细胞或万能干细胞。

32.权利要求28的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述哺乳动物干细胞为单细胞状态。

33.权利要求28的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述多糖为具有15.1 - 362.4 mg/ml范围内浓度的海藻糖。

34.权利要求28的抑制哺乳动物干细胞存活率降低的方法，其中所述多糖为具有30 - 100 mg/ml范围内浓度的葡聚糖。