TWI510626B - 使用了含有海藻糖之細胞洗淨溶液的接著細胞之洗淨方法 - Google Patents

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Description

使用了含有海藻糖之細胞洗淨溶液的接著細胞之洗淨方法
本發明係關於以藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，使用了於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液來洗淨接著細胞為特徵之接著細胞之洗淨方法、使用於該洗淨方法之上述細胞洗淨液、使用了上述細胞洗淨液之移植用細胞懸浮液之製造方法、或用以製造含有上述細胞洗淨液之移植用細胞懸浮液的套組等。
近年來，因幹細胞研究之急速發展，促進對再生醫療之趨勢，不僅研究者，其知識或理解，對一般人亦逐漸廣為普及。使用了幹細胞之再生醫療，係以利用幹細胞所具有之自我複製能力與多分化能力、或幹細胞所分泌之因子，使因各種疾病而受到損傷的細胞或組織之功能回復為目的之醫療。對白血病或再生不良性貧血等血液難 治疾病之患者進行骨髓移植時，造血系幹細胞係植入於患者體內，可維持幾乎一輩子的造血能力。又，最近多數研究者係以使用了造血幹細胞以外之幹細胞的臨床應用為目標，而鑑定中樞神經、末梢神經、骨髓、小腸等之幹細胞，開始實踐對於外傷性疾病或組織退化疾病之組織幹細胞移植治療(非專利文獻1~3)。
移植治療所用之幹細胞，因為可由生體內採取之量極少，因此一般係進行將採取之幹細胞於體外(in vitro)繼代培養並使其增殖(專利文獻1)。繼代培養過程中將幹細胞由培養容器剝離時，一般係使用胰蛋白酶等之蛋白質分解酵素，但因為蛋白質分解酵素處理，會產生一定比例的細胞受到損傷，而導致細胞死亡，而成為問題。為了實施高品質的再生醫療，必須提供充分量(數目)之幹細胞，同時地，提供高品質之細胞、亦即活細胞比例高的幹細胞(集團)係為重要，因此開發可抑制繼代培養時蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的方法係為當務之急。
另一方面，海藻糖(trehalose)係葡萄糖以1,1-醣苷鍵結而成之雙糖的一種。海藻糖呈現甜味，具有高保水力，因此使用於各種食品或化粧品。又，海藻糖係具有安定化細胞膜，抑制細胞傷害之性質，因此係被使用作為臓器移植時的臓器保護液之有效成分。ET-Kyoto液或New ET-Kyoto液等含有海藻糖之優良臓器保存液已被開發(專利文獻2及3、非專利文獻4)。但是，藉由胰蛋白酶等之蛋白質分解酵素將細胞由培養容器剝離前，以含有 海藻糖之生理水溶液來洗淨接著細胞時，可否抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡，其尚不明朗。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利第5486359號
[專利文獻2]日本專利第3253131號公報
[專利文獻3]國際公開第2007/043698號小冊
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Gage, F. H. Science 287: 1433-1438(2000)
[非專利文獻2]Morrison, S. J. et al., Cell 96: 737-749(1999)
[非專利文獻3]Batle, E. et al., Cell 111: 251-263(2002)
[非專利文獻4]Chem, F. et al., Yonsei Med. J. 45: 1107-1114(2004)
本發明之課題，係提供可有效地抑制因用以將接著細胞由培養容器剝離之蛋白質分解酵素處理與其後之細胞處理所致之細胞死亡的接著細胞之洗淨方法、使用於該洗淨方法之細胞洗淨液、使用了上述細胞洗淨液之移植用細胞懸浮液之製造方法、或含有上述細胞洗淨液之套組。
本發明者等人，發現了將藉由蛋白質分解酵素處理由細胞培養容器剝離之間葉系幹細胞，以含有海藻糖之生理水溶液洗淨時，會抑制間葉系幹細胞之細胞死亡(日本特願2011-072068)。因為蛋白質分解酵素處理，細胞受到損傷時，會誘導細胞死亡(細胞凋亡等)之路徑，因此該海藻糖之效果，係認為是細胞凋亡路徑被抑制、或細胞損傷之修復功能被促進所致，在為了解決上述課題而重複努力研究之中，偶然發現在蛋白質分解酵素處理前，以含有海藻糖之乳酸林格氏液(以下略稱為「LRT」)洗淨細胞後，相較於使用了控制組之乳酸林格氏液(以下略稱為「LR」)或磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline；PBS)的情況、或於蛋白質分解酵素處理後以LRT洗淨細胞的情況等，可有效地抑制細胞死亡，而完成了本發明。
亦即，本發明係關於(1)一種接著細胞之洗淨方法，其特徵為，在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，使用於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液，來洗淨接著細胞、(2)如上述(1)記載之方法，其中接著細胞為間葉系幹細胞、(3)如上述(1)或(2)記載之方法，其中細胞洗淨液中之海藻糖或其衍生物或該等之鹽的濃度為1~15(w/v)%。
又，本發明係關於(4)一種藉由蛋白質分解酵 素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，用以洗淨接著細胞之細胞洗淨液，其特徵為，於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成、(5)如上述(4)記載之細胞洗淨液，其中接著細胞為間葉系幹細胞、(6)如上述(4)或(5)記載之細胞洗淨液，其中海藻糖或其衍生物或該等之鹽的濃度為1~15(w/v)%。
又，本發明係關於(7)一種移植用細胞懸浮液之製造方法，其特徵為，具備以下步驟(a)~(d)：(a)去除接著細胞所接著之培養容器中之培養基，以於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液來洗淨接著細胞之步驟；(b)藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之步驟；(c)將由培養容器剝離之接著細胞，懸浮於含有蛋白質之生理水溶液中，作為細胞懸浮液之步驟；(d)將細胞懸浮液中之溶液去除，以生理水溶液洗淨接著細胞之步驟、(8)如上述(7)記載之製造方法，其中接著細胞為間葉系幹細胞、(9)如上述(7)或(8)記載之製造方法，其中步驟(a)中之細胞洗淨液中之海藻糖或其衍生物或該等之鹽的濃度為1~15(w/v)%、(10)如上述(7)~(9)中任一項記載之製造方法，其中步驟(b)中之蛋白質分解酵素為胰蛋白酶、(11)如上述(7)~(10)中任一項記載之製造方法，其中步驟(c)中之含有蛋白質之生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽、(12)如上述(7)~(11)中任一項記載之製造方法，其中步驟(c)中之含有蛋白質之生理水溶液，係含有血清之動物細胞培養用 基礎培養基、(13)如上述(7)~(12)中任一項記載之製造方法，其中步驟(d)中之生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽。
又，本發明係關於(14)一種用以製造移植用細胞懸浮液之套組，其特徵為包含如上述(4)~(6)中任一項記載之細胞洗淨液、與該細胞洗淨液之關於抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的效果所記載之添附文件。
又，本發明係關於(15)一種海藻糖或其衍生物或該等之鹽之使用，其係用於製造用以在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，洗淨接著細胞之細胞洗淨液。
進一步地，本發明係關於(16)一種海藻糖或其衍生物或該等之鹽，其係用以使用於在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，洗淨接著細胞。
作為本發明之實施的其他形態，可列舉用以在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，洗淨接著細胞之生理水溶液與海藻糖或其衍生物或該等之鹽的組合、用以在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，洗淨接著細胞之用以添加於生理水溶液中使用的海藻糖或其衍生物或該等之鹽。進一步地，作為本發明之實施的其他形態，可列舉一種接著細胞之體外繼代方法，其特徵為使用含有海藻糖或其衍生物 或該等之鹽的生理水溶液來洗淨接著細胞、一種用以將接著細胞體外繼代之套組，其係包含海藻糖或其衍生物或該等之鹽；與關於抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的效果所記載之添附文件。
依照本發明，可使包含間葉系幹細胞等幹細胞之移植用細胞懸浮液中之死細胞率降低、且可提供再生醫療之良質的移植用細胞懸浮液。
[圖1]顯示解析於胰蛋白酶處理前使用LRT洗淨接著細胞時(圖中，「酵素處理前洗淨液；LRT、酵素處理後洗淨液；PBS」)之細胞死亡抑制效果的結果之圖。使用PBS作為控制組(圖中，「酵素處理前洗淨液；PBS、酵素處理後洗淨液；PBS」)，又，於胰蛋白酶處理後使用LRT作為比較例1(圖中，「酵素處理前洗淨液；PBS、酵素處理後洗淨液；LRT」)。縱軸顯示死細胞率(平均值±標準偏差、[n=8])。又，圖中，「＊＊＊」，顯示4群間之Tukey檢定中具有統計上顯著差(P<0.001)。
[圖2]顯示解析於胰蛋白酶處理前使用LRT洗淨接著細胞0.5~10分鐘時之細胞死亡抑制效果的結果之圖。使用LR及PBS作為控制組。縱軸顯示死細胞率(平 均值±標準偏差、[n=8])。又，圖中，「＊＊＊」表示各洗淨時間中對於PBS及LR於Tukey檢定中具有統計上顯著差(P<0.001)。
[圖3]顯示解析於胰蛋白酶處理前使用各濃度之海藻糖(1、3、5、7、10、12、15[w/v]%)之LRT來洗淨接著細胞時之細胞死亡抑制效果的結果之圖。使用LR作為控制組。縱軸係顯示死細胞率(平均值±標準偏差、[n=12])。又，圖中「＊＊」及「＊＊＊」表示對於LR，於Dunnett檢定具有統計上顯著差(分別P<0.005及P<0.001)。
[圖4]係顯示解析於胰蛋白酶處理、或胰蛋白酶反應停止處理時添加海藻糖時的細胞死亡抑制效果之結果的圖。圖中「胰蛋白酶+T」表示於胰蛋白酶溶液中添加海藻糖者、又，圖中「培養基+T」表示於含有FBS之人類MSC培養基中含有海藻糖者。縱軸係顯示死細胞率(平均值±標準偏差、[n=6])。又，圖中「＊＊＊」表示對於PBS及LR於Tukey檢定具有統計上顯著差(P<0.001)、又，圖中「＊＊」表示對於PBS及LR於Tukey檢定具有統計上顯著差(分別為P<0.001及P<0.005)。
本發明之洗淨方法，係使用在藉由蛋白質分解酵素處理將哺乳動物細胞等之接著細胞由培養容器剝離之前，於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽(以下稱為「海藻糖類」)而成之本發明之細胞洗淨液，亦 即，使用含有海藻糖類之生理水溶液，來洗淨由吸引器等預先將培養基去除之培養容器中之接著細胞之方法，此處，本發明之細胞洗淨液，係限定為藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前之作為接著細胞洗淨用細胞洗淨液的用途。本發明中，接著細胞，意指藉由於固著處接著而可進行生存、增殖、物質生產之固著依賴性細胞。作為接著細胞，具體而言可列舉多能性幹細胞(胚胎幹細胞[ES細胞]、EG細胞、iPS細胞等)、間葉系幹細胞、神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等，該等之中尤以間葉系幹細胞較佳。上述哺乳動物，可舉例小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等囓齒類；兔等之兔形目；豬、牛、山羊、馬、羊等有蹄目；狗、貓等之食肉目、人、猴子、恆河猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等之靈長類等，其中尤適合列舉小鼠、豬、人類，又，上述哺乳動物細胞，除了可舉例再生醫療等中經由血管投與之哺乳動物幹細胞以外，可列舉對I型糖尿病患者經靜脈投與之哺乳動物之胰島細胞、對癌患者經靜脈投與之哺乳動物之樹突細胞、自然殺手細胞、阿爾發．貝他(α β)T細胞、珈瑪．代爾他(γδ)T細胞、細胞毒殺性T細胞(cytotoxic T lymphocyte；CTL)等。
本發明之細胞洗淨液所適用之生理水溶液，只要係與體液或細胞液之滲透壓成為大致相同的方式藉由鈉或鉀等來調整鹽或糖濃度等之等張水溶液，則無特殊限制，具體而言可列舉生理食鹽水、或具有緩衝效果之生理 食鹽水(磷酸緩衝生理食鹽水[Phosphate buffered saline；PBS]、TRIS緩衝生理食鹽水[Tris Buffered Saline；TBS]、HEPES緩衝生理食鹽水等)、林格氏液(乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等)、5%葡萄糖水溶液、動物細胞培養用基礎培養基(DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等)、等張劑(葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉等)等，該等之中尤以具有緩衝效果之生理食鹽水或林格氏液較佳、更佳為PBS或乳酸林格氏液。生理水溶液可為市售者、亦可為自己調製者。市售者可列舉D-PBS(-)(Invitrogen公司製)、生理食鹽液(大塚製藥工廠公司製「大塚生食注」)、乳酸林格氏溶液(大塚製藥工廠公司製「Lactec注」)、人類間葉系幹細胞專用培養基套組(Lonza公司)。本說明書中之「等張」，意指滲透壓為250~380mOsm/l之範圍內。生理水溶液，可進一步含有安定劑(例如人類血清白蛋白、聚乙二醇等)、緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液)、螯合劑(例如EDTA、EGTA、檸檬酸、水楊酸鹽)、溶解輔助劑、保存劑、抗氧化劑等。
本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖類中之海藻糖，除了可列舉2個α-葡萄糖以1,1-醣苷鍵結之雙糖類的α,α-海藻糖以外，可列舉α-葡萄糖與β-葡萄糖以1,1-醣苷鍵結之雙糖類的α,β-海藻糖、或2個β-葡萄糖以1,1-醣苷鍵結之雙糖類的β,β-海藻糖，該等之中尤以α,α-海藻糖較佳。該等海藻糖可藉由化學合成、微生物生產、 酵素生產等任何公知方法製造，但亦可使用市售品。例如可列舉α,α-海藻糖(林原股份有限公司製)、α,α-海藻糖(和光純藥公司製)等市售品。
本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖類中之海藻糖衍生物，只要係1個或複數個糖單位鍵結於雙糖類之海藻糖而得之醣苷基海藻糖類，則無特殊限制，醣苷基海藻糖類，係包含葡糖基海藻糖、麥芽糖基海藻糖、麥芽三碳糖基海藻糖等。
本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖類中之海藻糖或其衍生物之鹽，可列舉例如鹽酸、鹽氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、甲苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、乙醇酸鹽、甲烷磺酸鹽、丁酸鹽、吉草酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽等之酸加成鹽，或鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等之金屬鹽，銨鹽、烷基銨鹽等。再者，該等鹽係於使用時作為溶液來使用，較佳為其作用係與海藻糖的情況時為等效者。該等之鹽類，可形成水合物或溶劑合物，又，可將任一著單獨，或適當組合2種以上使用。
本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖類濃度，只要係可抑制(阻礙)蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡(細胞凋亡或壞死等)的濃度即可，可依照細胞種類或培養容器中之細胞數、細胞濃度等適當選擇最佳之條件。海藻糖類之濃度越高，則可抑制蛋白質分解酵素處理所致 之細胞死亡的效果越變高，但海藻糖類濃度過高時，可能對細胞生存有不良影響。例如、本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖類之濃度，通常為0.1(w/v)%以上、較佳為1.0(w/v)%以上、更佳為3.0(w/v)%以上，又，就迴避對細胞生存率之不良影響的觀點而言，通常20(w/v)%以下、較佳為15(w/v)%以下、更佳為7.0(w/v)%以下、又更佳為5.0(w/v)%以下。因此，細胞洗淨液中之海藻糖類的濃度，係0.1~20(w/v)%、較佳為1.0~15(w/v)%、更佳為1.0~7.0(w/v)%、又更佳為3.0~5.0(w/v)%。藉由本發明之細胞洗淨液可抑制細胞死亡，可使用台盼藍(Trypan Blue)染色法、TUNEL法、Nexin法、FLICA法等之可檢測細胞死亡之公知方法來確認。
本發明之蛋白質分解酵素處理所用之蛋白質分解酵素，可列舉胰蛋白酶、離胺酸肽鏈內切酶、鏈黴蛋白酶、胃蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶等，該等之中尤適合舉例胰蛋白酶。
本發明之洗淨方法中之接著細胞洗淨時之溫度或時間等條件，只要可觀察到本發明之海藻糖類所致效果、且對細胞不帶來損傷之條件即可，溫度通常為20~37℃之範圍內、處理時間通常為1秒~20分鐘之範圍內，但處理時間至少30秒~10分鐘之範圍內可觀察到與本發明之海藻糖類同樣程度之效果，因此上述處理時間較佳係30秒~10分鐘之範圍內。又，洗淨操作之次數，至少1次即可、複數次(2、3、4次等)亦可，然考慮到時間對效 果及費用對效果時，較佳為1次。
使用本發明之細胞洗淨液，可由以下方式來製造移植用細胞懸浮液。
首先，於以細胞接著分子(纖維黏附蛋白、玻璃黏附蛋白(vitronectin)、基膜素、巢蛋白等)或高分子(聚-L-鳥胺酸、聚-離胺酸等)等被覆處理之接著細胞用培養容器(多孔盤、培養皿[schale、dish]、燒瓶等)、或經表面加工處理之接著細胞用培養容器中，得到將上述接著細胞於體外繼代培養者。培養基中係有含有蛋白酶抑制劑等會阻礙蛋白質分解酵素之活性的因子之可能性、或有因培養基中所存在之過量蛋白質，而競爭性地阻礙蛋白質分解酵素之功能的可能性，因此在以下述步驟進行蛋白質分解酵素處理之前，預先將接著有接著細胞之培養容器中的培養基以吸引器等去除，以幾乎或完全不含蛋白質之本發明之細胞洗淨液將細胞洗淨，去除殘存的培養基。洗淨處理時之溫度或時間等條件，可列舉上述本發明之洗淨方法中接著細胞洗淨時之條件。
接著，藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離。此時，通常細胞因為受到損傷，細胞集團中的細胞生存率會降低，但藉由本發明之海藻糖類所致之效果，可抑制(阻礙)細胞生存率之降低。
蛋白質分解酵素處理，係藉由使細胞接觸含有上述之蛋白質分解酵素的水溶液而進行。含有蛋白質分解酵素之水溶液，可為將Gibco公司製等市售蛋白質 分解酵素之粉末溶解於上述生理水溶液者、亦可為將Lonza公司製等市售蛋白質分解酵素之溶液以上述生理水溶液稀釋者。含有蛋白質分解酵素之水溶液中之蛋白質分解酵素之濃度，只要係依照蛋白質分解酵素之種類，為剝離細胞所充分的濃度即可，通常係0.05~0.25(w/v)%之範圍內。
蛋白質分解酵素處理中之溫度或時間等條件，只要可將幾乎全部(70~100%等)之細胞由培養容器剝離的條件即可，溫度通常為20~37℃之範圍內，處理時間通常為15秒~15分鐘之範圍內。通常持續長時間對細胞進行蛋白質分解酵素處理時，細胞會受到損傷，生存率有更降低之虞，藉由本發明之海藻糖類所致之效果，可抑制細胞生存率降低，因此，亦可長時間(10~30分鐘等)處理以由培養容器剝離通常之處理時間所難以處理的細胞。
接著，為了停止蛋白質分解酵素之處理，係將由培養容器剝離之接著細胞，懸浮於含有蛋白質之生理水溶液中。懸浮可藉由吸量管吸放或輕拍等該技術領域周知之方法來實施。含有蛋白質之生理水溶液，只要係含有用於抑制蛋白質分解酵素活性之充分量之蛋白質的生理水溶液即可，具體而言可列舉含有0.1~30(v/v)%之血清(胎牛血清[Fetal bovine serum；FBS]、仔牛血清[Calf bovine serum；CS]等)之上述生理水溶液，含有FBS之上述動物細胞培養用基礎培養基較佳。又，作為含有蛋白質之生理 水溶液，因可觀察到本發明之海藻糖類所致之相加或相乘效果，故較佳為進一步含有上述海藻糖類者。
接著，為了去除細胞懸浮液中之蛋白質分解酵素，洗淨接著細胞，係將細胞懸浮液中之溶液去除，使用上述生理水溶液作為蛋白質分解酵素處理後洗淨液來洗淨接著細胞。細胞懸浮液中之溶液的去除，可藉由將細胞懸浮液使用離心分離機分離為上清(溶液)與沈澱物(細胞)，使用吸引器等去除上清來實施。又，為了提高洗淨效果，沈澱物較佳為藉由吸量管吸放或輕拍等來懸浮。又，作為洗淨細胞懸浮液中之細胞的次數，至少1次即可，雖亦可為複數次(2、3、4次等)，但考慮時間對效果及費用對效果時，較佳為1次。又，作為蛋白質分解酵素處理後洗淨液而使用之上述生理水溶液，因為可觀察到本發明之海藻糖類所致之相加或相乘效果，較佳為進一步含有上述之海藻糖類者。
上述洗淨後之細胞，係使用離心分離機分離為上清(溶液)與沈澱物(細胞)，使用吸引器等去除上清後，懸浮於適合於經動脈或經靜脈或經皮等手段之移植的移植用水溶液。移植用水溶液，具體而言可列舉上述生理水溶液，較佳為林格氏液；更佳為乳酸林格氏液、乙酸林格氏液或重碳酸林格氏液；又更佳為乳酸林格氏液。
上述其他態樣之接著細胞之體外繼代方法，可列舉依次含有：(a’)將上述接著細胞所接著之培養容器 中之培養基去除，以本發明之細胞洗淨液洗淨接著細胞之步驟；(b’)藉由使用上述蛋白質分解酵素之蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之步驟；(c’)將經剝離之接著細胞懸浮於含有上述之蛋白質的生理水溶液中之步驟；(d’)將細胞懸浮液之一部分(50[v/v]%、25[v/v]%、12[v/v]%等)，使用新的培養容器進行繼代培養之步驟的方法，較佳為於步驟(c’)與步驟(d’)之間，進一步具備將細胞懸浮液中之溶液去除，以上述生理水溶液或含有蛋白質之生理水溶液洗淨接著細胞之步驟(p)者。
繼代培養所適用之培養溫度，通常約30~40℃之範圍、較佳為37℃。培養時之CO2 濃度，通常約1~10%之範圍、較佳為約5%。培養時之濕度，通常約70~100%之範圍、較佳為約95~100%。
繼代培養所適用之培養基，可列舉於0.1~30(v/v)%範圍內含有血清(FBS、CS等)之上述動物細胞培養用基礎培養基、或含有細胞增殖所必要之添加物以取代血清之上述動物細胞培養用基礎培養基。該添加物可列舉鐵源(運鐵蛋白等)、成長因子(胰島素、EGF、Basic FGF、神經膠細胞衍生之神經營養因子[GDNF；Glial cell line-derived neurotrophicfactor]、幹細胞因子[SCF；Stem Cell Factor]等)、多胺類(丁二胺等)、類固醇(孕酮、β-雌二醇等)、礦物質(亞硒酸[Selenous acid]或其鹽)、接著因子(例如、肝素(Heparin)、硫酸乙醯肝素、膠原蛋白、纖維黏附蛋白等)、還原劑(N-乙醯半胱胺酸[N-acetylcysteine]、2- 巰基乙醇、催化酶等)等。又，該等培養基中亦可添加維持幹細胞未分化所必要之幹細胞分化抑制劑(LIF、Wnt、TGF-β等)之外，亦可添加葡萄糖等糖類，鏈黴素、盤尼西林、健他黴素等抗生素，或Hepes等緩衝劑等。
本發明之移植用細胞懸浮液之製造方法或上述其他態樣之接著細胞之體外繼代方法中的各步驟，為了避免灰塵或細菌等之混入(污染)，較佳為使用清潔台(clean bench)等在無菌下進行。
用以製造本發明之移植用細胞懸浮液之套組、或用於上述其他態樣之接著細胞之體外繼代的套組，係作為含有本發明之細胞洗淨液、與關於抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的效果所記載之添附文件之移植用細胞懸浮液之製造用套組而限定用途者；或只要係作為接著細胞之體外繼代用套組而限定用途者則無特殊限制，亦可為進一步含有上述蛋白質分解酵素或吸量管、離心管等者，特別地可適合舉例進一步含有上述之蛋白質分解酵素者。
以下，藉由實施例以更具體地說明本發明，但本發明之技術範圍不受該等例示所限定。
[實施例1]
1. 將本發明之細胞洗淨液作為蛋白質分解酵素處理前之細胞洗淨液使用時，抑制細胞死亡之確認
1-1 材料
1-1-1 含有3(w/v)%海藻糖之乳酸林格氏液
將3g海藻糖(林原股份有限公司製)與90mL乳酸林格氏液(大塚製藥工廠公司製「Lactec注」)混合，使用攪拌子溶解。以乳酸林格氏液將容量調整為100mL後，於安全櫃內藉由0.22μm濾膜進行滅菌，每10mL進行分注。
1-1-2 人類骨髓間葉系幹細胞(Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow[hMSC-BM])
遵照以下[1]~[9]所示順序，調製hMSC-BM(Lonza公司製)，使用於本實驗。
[1]使用75cm2 燒瓶，於人類間葉系幹細胞專用培養基套組(Lonza公司製)(以下稱為「MSC培養基」)存在下，將hMSC-BM於37℃、5% CO2 培養箱中進行培養。觀察顯微鏡下細胞的狀態，培養至90%左右密集(confluent)為止。
[2]將MSC培養基以吸引器去除，每個燒瓶以8mL之杜氏磷酸緩衝食鹽水(D-PBS[-])(以下僅稱為「PBS」)(Invitrogen公司製)潤洗細胞。
[3]將PBS以吸引器去除，每個燒瓶添加3.75mL之胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製)，於室溫靜置5分鐘。
[4]一邊於顯微鏡下觀察，同時慢慢搖動，至細胞90%左右剝離為止。
[5]每個燒瓶添加3.75mL之MSC培養基，停止胰蛋白酶反應，藉由吸量管吸取，將細胞回收，移至50mL離心管。
[6]以600×g、5分鐘、22℃進行離心分離。
[7]以吸引器去除上清之MSC培養基，每1個燒瓶添加5mL之MSC培養基，使細胞沈澱塊(pellet)(沈澱物)懸浮。
[8]採取10μL之細胞懸浮液，與10μL之0.4%台盼藍(Gibco公司製)混合，以細胞計數盤計算活細胞數。
[9]於6孔盤中以成為1×105 細胞/2mL/孔的方式播種細胞後，於37℃、5% CO2 培養箱進行培養。每隔3~4日，將MSC培養基全量交換為新培養基。
1-2 方法
為了確認將本發明之細胞洗淨液作為蛋白質分解酵素處理前之細胞洗淨液使用時，會抑制細胞死亡，遵照以下[1]~[5]所示順序進行實驗。
[1]由接著有hMSC-BM之6孔盤中將MSC培養基吸引．去除，每1孔各添加25℃之含有3(w/v)%海藻糖之乳酸林格氏液(3% LRT)2mL，於25℃保溫1分鐘(酵素處理前洗淨處理)。再者，使用PBS作為控制組。
[2]將3% LRT吸引．去除後，每1孔各添加保溫於25℃之胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製)1mL，於25℃培養15分鐘(酵素處理)。
[3]各添加25℃之MSC培養基1mL，使細胞懸浮後(酵素反應停止處理)，將細胞懸浮液移至15mL錐形離心管(conical centrifuge tube)。
[4]以600×g、5分鐘、25℃離心分離，吸引．去除上清後，每1孔懸浮於100μL之冰冷PBS(酵素處理後洗淨處理)。
[5]採取10μL細胞懸浮液，與10μL台盼藍混合後，於顯微鏡下使用細胞計數盤(onecell counter)進行細胞數測定，進行死細胞率之評估。
1-3 結果
於胰蛋白酶處理前使用PBS洗淨細胞時，胰蛋白酶處理後之死細胞率為34.7%(圖1、左起第1長條)，相對於此，胰蛋白酶處理前使用3%LRT洗淨細胞時，胰蛋白酶處理後之死細胞率為16.3%(圖1、右起第2長條)、又，兩者間觀察到統計學上的顯著差(P<0.001)。此結果顯示，於胰蛋白酶處理前使用含有LRT等海藻糖之生理水溶液洗淨細胞時，相較於不含有海藻糖之生理水溶液時，胰蛋白酶處理後之死細胞率降低。又，作為比較例1，於胰蛋白酶處理前使用PBS洗淨細胞(上述實施例1之「1-2方法」之[1]步驟[酵素處理前洗淨處理])、且於胰蛋白酶處理後使用3%LRT洗淨細胞時(上述實施例1之「1-2方法」之[4]步驟[酵素處理後洗淨處理])，死細胞率為32.8%(圖1、左起第2長條)，相較於使用控制組之PBS時(圖1、左起第1條，死細胞率34.7%)，雖無顯著差，但可確 認死細胞率降低，但就效果而言，於胰蛋白酶處理前使用3%LRT洗淨細胞的情況係大為優越(P<0.001、圖1，左起第2長條與第3長條之比較)。又，於胰蛋白酶處理前使用3%LRT洗淨細胞，且進一步於胰蛋白酶處理後使用3%LRT洗淨細胞時，胰蛋白酶處理後之死細胞率為13.8%(圖1、右起第1長條)，相較於胰蛋白酶處理前使用3%LRT時(圖1、右起第2長條，死細胞率16.3%)，雖無顯著差，但可確認死細胞率降低。此結果顯示，於蛋白質分解酵素處理後之細胞洗淨時使用海藻糖時，藉由與本發明之細胞洗淨液的相加或相乘效果，死細胞率可進一步降低。
[實施例2]
2. 確認本發明之細胞洗淨液所致之細胞死亡抑制效果，係來自海藻糖、與本發明之細胞洗淨液之處理時間的探討
2-1 方法
為了進一步確認LRT所致之細胞死亡抑制效果，並非來自LR，而係來自海藻糖，進行使用了LR作為胰蛋白酶處理前洗淨液之控制組時之實驗。又，為了一併探討胰蛋白酶處理前之細胞洗淨處理時間，遵照以下[1]~[5]所示之順序進行實驗。
[1]由接著有hMSC-BM之6孔盤中將MSC培養基吸引．去除，每1孔各添加25℃之含有3(w/v)%海藻糖之乳酸林格 氏液(3% LRT)2mL，於25℃保溫0.5、1、3、5、7、10分鐘(酵素處理前洗淨處理)。再者，作為控制組，係使用LR、及通常作為洗淨液使用之PBS。
[2]將3% LRT吸引．去除後，每1孔各添加與保溫於25℃之PBS等量混合之胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製)稀釋液1mL，於25℃培養20分鐘(酵素處理)。
[3]各添加25℃之MSC培養基1mL，使細胞懸浮後(酵素反應停止處理)，將細胞懸浮液移至15mL錐形離心管(conical centrifuge tube)。
[4]以600×g、5分鐘、25℃離心分離，吸引．去除上清後，每1孔懸浮於100μL之冰冷PBS(酵素處理後洗淨處理)。
[5]採取10μL細胞懸浮液，與10μL台盼藍混合後，於顯微鏡下使用細胞計數盤進行細胞數測定，進行死細胞率之評估。
2-2 結果
結果如圖2所示。例如，胰蛋白酶處理前洗淨處理時間為10分鐘時，於胰蛋白酶處理前使用LR洗淨細胞時，胰蛋白酶處理後之死細胞率為42.1%，相對於此，於胰蛋白酶處理前使用3% LRT洗淨細胞時，胰蛋白酶處理後之死細胞率降低至14.8%(圖2)，該降低係觀察到統計學上的顯著差(P<0.001)。又，PBS與LR之間未觀察到統計學上的顯著差。此結果顯示，本發明之細胞洗淨液所致之細胞死亡抑制效果，並非來自LR，而係來自海藻糖。 進一步地，胰蛋白酶處理前之以LRT細胞洗淨處理時間為0.5~7分鐘的情況時亦同樣地觀察到相同程度的細胞死亡抑制效果(圖2)。此結果顯示，於胰蛋白酶處理前使用本發明之細胞洗淨液，至少於0.5~10分鐘的範圍內處理時，可觀察到同程度之細胞死亡抑制效果。
[實施例3]
3. 本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖濃度的探討
3-1 方法
接著，為了探討本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖濃度，遵照以下[1]~[5]所示之順序進行實驗。
[1]由接著有hMSC-BM之6孔盤中將MSC培養基吸引．去除，每1孔各添加25℃之各種濃度(1、3、5、7、10、12、15[w/v]%)之含有海藻糖之乳酸林格氏液2mL，於25℃保溫1分鐘(酵素處理前洗淨處理)。再者，使用LR作為控制組。
[2]將[1]之酵素處理前洗淨液吸引．去除後，每1孔各添加保溫於25℃之胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製)1mL，於25℃培養15分鐘(酵素處理)。
[3]各添加25℃之MSC培養基1mL，使細胞懸浮後(酵素反應停止處理)，將細胞懸浮液移至15mL錐形離心管(conical centrifuge tube)。
[4]以600×g、5分鐘、25℃離心分離，吸引．去除上清 後，每1孔懸浮於100μL之冰冷PBS(酵素處理後洗淨處理)。
[5]採取10μL細胞懸浮液，與10μL台盼藍混合後，於顯微鏡下使用細胞計數盤進行細胞數測定，進行死細胞率之評估。
3-2 結果
結果如圖3所示。使用海藻糖濃度為1~15(w/v)%之LRT洗淨胰蛋白酶處理前之細胞時，不管在其何種濃度，相較於使用不含海藻糖之LR時，死細胞率降低(圖3)，該降低係觀察到統計學上的顯著差。又，使用海藻糖濃度為3(w/v)%之細胞洗淨液時，可知細胞死亡抑制效果最優良。該等結果顯示，本發明之細胞洗淨液所適用之海藻糖濃度，至少為1~15(w/v)%之範圍內時，觀察到細胞死亡抑制效果，而且顯示該海藻糖濃度為1~7(w/v)%、特別是3~5(w/v)%時，觀察到特別優良的細胞死亡抑制效果。
[實施例4]
4. 胰蛋白酶處理、或胰蛋白酶反應停止處理時添加海藻糖時的細胞死亡抑制效果之解析
4-1 方法
接著為了解析胰蛋白酶處理、或胰蛋白酶反應停止處 理時添加海藻糖時的細胞死亡抑制效果，遵照以下[1]~[5]所示順序進行實驗。
[1]由接著有hMSC-BM之6孔盤中將MSC培養基吸引．去除，每1孔各添加25℃之含有3(w/v)%海藻糖之乳酸林格氏液2mL，於25℃保溫1分鐘(酵素處理前洗淨處理)。再者，使用LR作為控制組。
[2]將[1]之酵素處理前洗淨液吸引．去除後，每1孔各添加於胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司製)中添加海藻糖，使最終濃度成為3(w/v)%之25℃保溫的含有海藻糖之胰蛋白酶溶液1mL，於25℃培養15分鐘(酵素處理)。
[3]於MSC培養基中各添加添加有海藻糖，使最終濃度成為3(w/v)%之25℃保溫的含有海藻糖之MSC培養基1mL，使細胞懸浮後(酵素反應停止處理)，將細胞懸浮液移至15mL錐形離心管(conical centrifuge tube)。
[4]以600×g、5分鐘、25℃離心分離，吸引．去除上清後，每1孔懸浮於100μL之冰冷PBS(酵素處理後洗淨處理)。
[5]採取10μL細胞懸浮液，與10μL台盼藍混合後，於顯微鏡下使用細胞計數盤進行細胞數測定，進行死細胞率之評估。
4-2 結果
結果如圖4所示。作為比較例2，於胰蛋白酶處理前使用PBS洗淨細胞、且使用含有海藻糖之胰蛋白酶溶液 進行酵素處理時(上述實施例1之「1-2方法」之[1]步驟[酵素處理前洗淨處理])，相較於使用不含海藻糖之胰蛋白酶溶液時，死細胞率未觀察到變化(圖4之「胰蛋白酶+T」與「胰蛋白酶」之比較)。此結果顯示，即使於蛋白質分解酵素處理時添加海藻糖，亦無法抑制死細胞率。又，作為比較例3，於胰蛋白酶處理前使用PBS洗淨細胞、且於胰蛋白酶反應停止處理時使用含有海藻糖之MSC培養基(圖4之「培養基+T」)時(上述實施例1之「1-2方法」之[3]步驟(酵素反應停止處理))，相較於使用不含海藻糖之MSC培養基時(圖4之「培養基」)，死細胞率降低(圖4之左起第1長條[死細胞率37.9%]與圖4之左起第2長條[死細胞率33.9%]之比較)。此結果顯示，於蛋白質分解酵素處理後之酵素反應停止處理時，使用於MSC培養基等含有蛋白質之生理水溶液中添加了海藻糖者來使細胞懸浮時，相較於本發明之細胞洗淨液時，效果雖低，但仍可使死細胞率降低。又，於胰蛋白酶處理前使用3%LRT洗淨細胞，且進一步於胰蛋白酶反應停止處理時使用含有海藻糖之MSC培養基時，胰蛋白酶處理後之死細胞率為13.0%(圖4、右起第3長條)，相較於胰蛋白酶處理前使用3%LRT時(圖4、右起第4長條，死細胞率16.8%)，雖無顯著差，但可確認死細胞率有降低。此結果顯示，於蛋白質分解酵素反應停止處理時使用海藻糖時，藉由與本發明之細胞洗淨液之相加或相乘效果，可使死細胞率進一步降低。
[產業上之可利用性]
依照本發明，可使含有MSC等幹細胞之細胞懸浮液中死細胞的比例降低，提供良質之細胞懸浮液，因此有用於再生醫療等中之移植醫療領域或癌治療領域。

Claims (24)

  1. 一種接著細胞之洗淨方法，其特徵為，在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，使用於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液，來洗淨接著細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中接著細胞為間葉系幹細胞。
  3. 如請求項1或2之方法，其中細胞洗淨液中之海藻糖或其衍生物或該等之鹽之濃度為1~15(w/v)%。
  4. 一種細胞洗淨液，其係在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，用以洗淨接著細胞之細胞洗淨液，其特徵為，於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成。
  5. 如請求項4之細胞洗淨液，其中接著細胞為間葉系幹細胞。
  6. 如請求項4或5之細胞洗淨液，其中海藻糖或其衍生物或該等之鹽之濃度為1~15(w/v)%。
  7. 一種移植用細胞懸浮液之製造方法，其特徵為具備以下之步驟(a)~(d)：(a)去除接著細胞所接著之培養容器中之培養基，以於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液來洗淨接著細胞之步驟；(b)藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之步驟； (c)將由培養容器剝離之接著細胞，懸浮於含有蛋白質之生理水溶液中，作為細胞懸浮液之步驟；(d)將細胞懸浮液中之溶液去除，以生理水溶液洗淨接著細胞之步驟。
  8. 如請求項7之製造方法，其中接著細胞為間葉系幹細胞。
  9. 如請求項7或8之製造方法，其中步驟(a)中之細胞洗淨液中之海藻糖或其衍生物或該等之鹽之濃度為1~15(w/v)%。
  10. 如請求項7或8之製造方法，其中步驟(b)中之蛋白質分解酵素為胰蛋白酶。
  11. 如請求項7或8之製造方法，其中步驟(c)中之含有蛋白質之生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽。
  12. 如請求項7或8之製造方法，其中步驟(c)中之含有蛋白質之生理水溶液，係含有血清之動物細胞培養用基礎培養基。
  13. 如請求項7或8之製造方法，其中步驟(d)中之生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽。
  14. 一種用以製造移植用細胞懸浮液之套組，其特徵為包含如請求項4~6中任一項之細胞洗淨液、與該細胞洗淨液之關於抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的效果所記載之添附文件。
  15. 一種海藻糖或其衍生物或該等之鹽之使用，其係 用於製造用以在藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，洗淨接著細胞之細胞洗淨液。
  16. 一種接著細胞之體外繼代方法，其特徵係依序具備以下步驟(a)~(d)：(a)去除接著細胞所接著之培養容器中之培養基，以於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成之細胞洗淨液來洗淨接著細胞之步驟；(b)藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之步驟；(c)為了停止蛋白質分解酵素之處理，將由培養容器剝離之接著細胞，懸浮於含有蛋白質之生理水溶液中之步驟；(d)使用新的培養容器，將細胞懸浮液之一部分繼代培養之步驟。
  17. 如請求項16之體外繼代方法，其中接著細胞為間葉系幹細胞。
  18. 如請求項16或17之體外繼代方法，其中步驟(a)中細胞洗淨液中之海藻糖或其衍生物或該等之鹽之濃度為1~15(w/v)%。
  19. 如請求項16或17之體外繼代方法，其中步驟(b)中之蛋白質分解酵素為胰蛋白酶。
  20. 如請求項16或17之體外繼代方法，其中步驟(c)中之含有蛋白質之生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽。
  21. 如請求項16或17之體外繼代方法，其中步驟(c) 中之含有蛋白質之生理水溶液，係含有血清之動物細胞培養用基礎培養基。
  22. 如請求項16或17之體外繼代方法，其中於步驟(c)與步驟(d)之間，進一步具備去除細胞懸浮液中之溶液，以生理水溶液或含有蛋白質的生理水溶液來洗淨接著細胞之步驟(p)。
  23. 如請求項22之體外繼代方法，其中步驟(p)中之生理水溶液或含有蛋白質的生理水溶液，係進一步含有海藻糖或其衍生物或該等之鹽。
  24. 一種用於接著細胞之體外繼代的套組，其特徵在於，含有細胞洗淨液與添附文件；該細胞洗淨液係於藉由蛋白質分解酵素處理，將接著細胞由培養容器剝離之前，用以洗淨接著細胞，且該細胞洗淨液係於生理水溶液中添加海藻糖或其衍生物或該等之鹽而成；該添附文件係記載關於抑制蛋白質分解酵素處理所致之細胞死亡的效果。
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