KR20140042687A

KR20140042687A - 트레할로스 함유 세포 세정용액을 이용한 접착세포의 세정 방법

Info

Publication number: KR20140042687A
Application number: KR1020130113677A
Authority: KR
Inventors: 에이지 코바야시; 타마키 와다; 마사코 도이
Original assignee: 가부시키가이샤 오츠카 세이야쿠 고죠
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2014-04-07
Also published as: US20140093961A1; CN103710305A; EP2712920A1; EP2712920B1; KR101555568B1; US9040300B2; CA2828138A1; AU2013231187A1; AU2013231187B2; CN103710305B; JP2014068592A; TWI510626B; HK1194102A1; SG2013072392A; US20150224145A1; NZ615872A; JP5196618B1; ES2614041T3; TW201418464A; CA2828138C

Abstract

접착세포를 배양용기로부터 박리하기 위한 단백질 분해효소처리와 그 후의 세포 처리에 의한 세포사를 효과적으로 억제할 수 있는 접착세포의 세정방법과, 이러한 세정방법에 이용하는 세포 세정액과, 상기 세포 세정액을 이용한 이식용 세포 현탁액의 제조방법과, 상기 세포 세정액을 함유하는 키트를 제공하는 것이다.
생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하고, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 유효 성분으로서 함유하는 세포 세정액을 제작한다. 이러한 세포 세정액을 이용하여, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에 접착세포를 세정하면, 단백질 분해효소처리에 의한 세포사(아포토시스 등)를 억제(저해)할 수 있다. 상기 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류의 농도로서는, 단백질 분해효소처리에 의한 세포사(아포토시스 등)를 억제(저해)할 수 있는 농도이면 좋고, 통상은 0.1~20(w/v)%이며, 바람직하게는 1~15(w/v)%, 보다 바람직하게는 1.0~7.0(w/v)%, 더욱 바람직하게는 3~5.0(w/v)%이다.

Description

트레할로스 함유 세포 세정용액을 이용한 접착세포의 세정 방법{METHOD OF WASHING ADHERENT CELL USING TREHALOSE-CONTAINING CELL-WASHING SOLUTION}

본 발명은 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 세포 세정액을 이용하여, 접착세포를 세정하는 것을 특징으로 하는 접착세포의 세정방법이나, 이러한 세정방법에 이용하기 위한 상기 세포 세정액이나, 상기 세포 세정액을 이용한 이식용 세포 현탁액의 제조방법이나, 상기 세포 세정액을 함유하는 이식용 세포 현탁액을 제조하기 위한 키트 등에 관한다.

근년, 간세포 연구의 급속한 발전에 의하여 재생 의료에 대한 관심이 높아지고 있고, 그 지식이나 이해는 연구자뿐만 아니라 일반인에게도 널리 보급되고 있다. 간세포를 이용한 재생 의료는, 간세포가 가지는 자기 복제능력과 다분화 능력이나, 간세포가 분비하는 인자를 이용하여, 여러 가지 질환으로 손상을 입은 세포나 조직의 기능을 회복시키는 것을 목적으로 한 의료이다. 백혈병이나 재생 불량성 빈혈 등 혈액 난치병의 환자에게 골수 이식을 하면, 조혈계 간세포가 환자의 체내에 생착(生着)하고, 거의 일생에 걸쳐서 조혈능의 유지가 가능해진다. 또한, 최근에는 많은 연구자가 조혈간세포 이외의 간세포를 이용한 임상 응용을 목표로 하여, 중추 신경, 말초 신경, 골수, 소장 등에 있어서의 간세포를 동정하고, 외상성 질환이나 조직 변성 질환에 대한 조직간세포의 이식 치료가 실천되기 시작하고 있다(비특허문헌 1~3).

이식 치료에 이용하는 간세포는, 생체내에서 채취할 수 있는 양이 매우 적기 때문에, 채취한 간세포를 인비트로로 계대배양하여 증식시키는 방법이 일반적으로 행해지고 있다(특허문헌 1). 계대배양의 과정에서 간세포를 배양용기로부터 박리할 때, 트립신 등의 단백질 분해효소가 일반적으로 이용되지만, 단백질 분해효소처리에 의하여 세포가 데미지를 받아 세포사에 이르는 것이 일정한 비율로 발생하는 점이 문제시되고 있다. 질 높은 재생 의료를 실시하기 위해서는, 충분한 양(수)의 간세포를 제공하는 것이 필요하지만, 동시에 질 높은 세포, 즉 생세포의 비율이 높은 간세포(집단)를 제공하는 것이 중요하므로, 계대배양시의 단백질 분해효소처리에 의한 세포사를 억제할 수 있는 방법의 개발이 급선무로 되어 있었다.

한편, 트레할로스(trehalose)는 글루코오스가 1,1－글리코시드 결합하여 생긴 이당의 일종이다. 트레할로스는 단맛을 띠고 높은 보수력을 가지기 때문에, 여러 가지의 식품이나 화장품에 이용되고 있다. 또한, 트레할로스는 세포막을 안정화 시키고 세포의 상해를 억제하는 성질을 가지기 때문에, 장기를 이식할 때 장기 보호액의 유효 성분으로 이용되고 있다. ET－Kyoto액이나 New　ET－Kyoto액 등 트레할로스를 함유하는 뛰어난 장기 보존액이 개발되고 있다(특허문헌 2 및 3, 비특허문헌 4). 그러나 트립신 등의 단백질 분해효소에 의하여 세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 트레할로스를 함유하는 생리적 수용액으로 접착세포를 세정한 경우, 단백질 분해효소처리에 의하여 세포사가 억제되는지 여부는 불명하였다.

특허문헌 1: 미국특허 제5486359호 특허문헌 2: 특허 제3253131호 공보　 특허문헌 3: 국제공개 제2007/043698호 팜플렛

비특허문헌 1: Gage, F.H. Science 287: 1433-1438 (2000) 비특허문헌 2: Morrison, S.J. et al., Cell 96: 737-749 (1999) 비특허문헌 3: Batle, E. et al., Cell 111: 251-263 (2002) 비특허문헌 4: Chem, F. et al., Yonsei Med. J. 45: 1107-1114 (2004)

본 발명의 과제는, 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 위한 단백질 분해효소처리와 그 후 세포 처리에 의한 세포사를 효과적으로 억제할 수 있는, 접착세포의 세정방법이나, 이러한 세정방법에 이용하는 세포 세정액이나, 상기 세포 세정액을 이용한 이식용 세포 현탁액의 제조방법이나, 상기 세포 세정액을 함유하는 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 단백질 분해효소처리에 의하여 세포 배양용기로부터 박리 한 간엽계 간세포를 트레할로스를 함유하는 생리적 수용액으로 세정하면, 간엽계 간세포의 세포사가 억제되는 것을 발견하였다(특원2011－072068). 단백질 분해효소처리에 의하여 세포가 데미지를 받으면, 세포사(아포토시스 등)의 경로가 유도되는 점으로부터, 이러한 트레할로스에 의한 효과는 아포토시스 경로가 억제되거나 혹은 세포 데미지의 복원기능이 촉진됨에 따른 것이라고 생각하고 있었으나, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의연구를 거듭하던 중에, 우연히 단백질 분해효소처리 전에, 트레할로스를 함유하는 유산 링겔액(이하 'LRT'라고 약칭한다)으로 세포를 세정하였는바, 대조군인 유산 링겔액(이하'LR'라고 약칭한다)이나 인산 완충 생리 식염수(Phosphate buffered saline；PBS)를 이용한 경우나, 단백질 분해효소처리 후에 LRT로 세포를 세정했을 경우 등에 비하여 세포사를 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 (1) 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 세포 세정액을 이용하여 접착세포를 세정하는 것을 특징으로 하는 접착세포의 세정방법과, (2) 접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 상기(1)에 기재된 방법과, (3) 세포 세정액 중의 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 상기(1) 또는 (2)에 기재된 방법에 관한다.

또한, 본 발명은 (4) 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에 접착세포를 세정하기 위한 세포 세정액과, (5) 접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 상기(4)에 기재된 세포 세정액과, (6) 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 상기 (4) 또는 (5)에 기재된 세포 세정액에 관한다.

또한, 본 발명은 (7)(a) 접착세포가 접착된 배양용기에서의 배지를 제거하고, 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 세포 세정액으로 접착세포를 세정하는 공정；(b) 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리시키는 공정；(c) 배양용기로부터 박리한 접착세포를 단백질을 함유하는 생리적 수용액 중에 현탁시키고, 세포 현탁액으로 만드는 공정；(d) 세포 현탁액에서의 용액을 제거하고, 생리적 수용액으로 접착세포를 세정하는 공정；공정(a)~(d)를 갖춘 것을 특징으로 하는 이식용 세포 현탁액의 제조방법과, (8) 접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 상기 (7)에 기재된 제조방법과, (9) 공정(a)에 있어서의 세포 세정액 중의 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 상기 (7) 또는 (8)에 기재된 제조방법과, (10) 공정(b)에 있어서의 단백질 분해효소가 트립신인 것을 특징으로 하는 상기(7)~(9)의 어느 한 곳에 기재된 제조방법과, (11) 공정(c)에 있어서의 단백질을 함유하는 생리적 수용액이, 나아가서는 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 포함하는, 상기 (7)~(10)의 어느 한 곳에 기재된 제조방법과, (12) 공정(c)에 있어서의 단백질을 함유하는 생리적 수용액이 혈청을 함유하는 동물세포 배양용 기초배지인 것을 특징으로 하는 상기 (7)~(11)의 어느 한 곳에 기재된 제조방법과, (13) 공정(d)에 있어서의 생리적 수용액이, 나아가서는 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (7)~(12)의 어느 한 곳에 기재된 제조방법에 관한다.

또한, 본 발명은 (14) 상기 (4)~(6)의 어느 한 곳에 기재된 세포 세정액과, 상기 세포 세정액의 단백질 분해효소처리에 의한 세포사 억제 효과에 대하여 기재된 첨부 문서를 포함하는 것을 특징으로 하는 이식용 세포 현탁액을 제조하기 위한 키트에 관한다.

또한, 본 발명은 (15) 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포를 세정하기 위한 세포 세정액의 제조에 있어서 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 사용에 관한다.

더욱이 본 발명은 (16) 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포를 세정하기 위해서 이용하기 위한 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염에 관한다.

본 발명의 다른 실시형태로서, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포를 세정하기 위한 생리적 수용액과 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염과의 조합이나, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포를 세정하기 위하여 생리적 수용액에 첨가하여 이용하기 위한 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시형태로서 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 함유하는 생리적 수용액을 이용하여 접착세포를 세정하는 것을 특징으로 하는 접착세포의 인비트로 계대방법과, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염과 단백질 분해효소처리에 의한 세포사 억제 효과에 대해 기재된 첨부 문서를 포함하는 접착세포의 인비트로 계대를 위한 키트를 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 간엽계 간세포 등의 간세포를 포함하는 이식용 세포 현탁액에서의 사세포율을 저하시킬 수 있고, 재생 의료에 있어서 양질의 이식용 세포 현탁액을 제공할 수 있다.

도 1은, 트립신 처리 전에 LRT를 이용하여 접착세포를 세정한 경우(도면 중, '효소처리 전 세정액；LRT, 효소처리 후 세정액；PBS')의 세포사 억제 효과를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군으로서 PBS를 이용하고(도면 중, '효소처리 전 세정액；PBS, 효소처리 후 세정액；PBS'), 또한 비교예 1로서 트립신 처리 후에 LRT를 이용하였다(도면 중, '효소처리 전 세정액；PBS, 효소처리 후 세정액；LRT'). 세로축은 사세포율(死細胞率)을 나타낸다(평균치±표준편차,［n=8］). 또한, 도면 중,'***'는, 4군간의 Tukey 검정에서 통계적 유의차(P＜0.001)가 있음을 나타낸다.
도 2는, 트립신 처리 전에 LRT를 이용하여 접착세포를 0.5~10분간 세정한 경우의 세포사 억제 효과를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군으로서 LR 및 PBS를 이용하였다. 세로축은 사세포율을 나타낸다(평균치±표준편차,［n=8］). 또한, 도면 중, '***'는 각 세정 시간에 있어서 PBS 및 LR에 대하여 Tukey 검정에서 통계적 유의차(P＜0.001)가 있음을 나타낸다.
도 3은, 트립신 처리 전에 트레할로스가 각 농도(1, 3, 5, 7, 10, 12, 15［w/v］%)의 LRT를 이용하여 접착세포를 세정한 경우의 세포사 억제 효과를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군으로서 LR을 이용하였다. 세로축은 사세포율을 나타낸다(평균치±표준편차,［n=12］). 또한, 도면 중 '**' 및 '***'는 LR에 대하여 Dunnett 검정에서 통계적 유의차(각각 P＜0.005 및 P＜0.001)가 있음을 나타낸다.
도 4는, 트립신 처리, 또는 트립신 반응정지 처리시에 트레할로스를 첨가한 경우의 세포사 억제 효과를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 '트립신＋T'는 트립신 용액에 트레할로스를 첨가한 것을, 또한 도면 중 '배지＋T'는 FBS를 포함하는 사람 MSC 배지에 트레할로스를 함유한 것을 나타낸다. 세로축은 사세포율을 나타낸다(평균치±표준편차,［n=6］). 또한, 도면 중 '***'는 PBS 및 LR에 대하여 Tukey 검정에서 통계적 유의차(P＜0.001)가 있음을 나타내고, 또한 도면 중 '**'는 PBS 및 LR에 대하여 Tukey 검정에서 통계적 유의차(각각 P＜0.001 및 P＜0.005)가 있음을 나타낸다.

본 발명의 세정방법은, 단백질 분해효소처리에 의하여 포유동물의 세포 등의 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염(이하 '트레할로스류'라고 한다)을 첨가하여 이루어지는 본 발명의 세포 세정액, 즉 트레할로스류를 포함하는 생리적 수용액을 이용하여, 흡인기(Aspirator) 등으로 미리 배지를 제거한 배양용기에서의 접착세포를 세정하는 방법이고, 여기에서 본 발명의 세포 세정액은, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전의 접착세포 세정용 세포 세정액으로서의 용도로 한정되는 것이다. 본 발명에 있어서 접착세포란, 고정적으로 접착함으로써 생존, 증식, 물질 생산을 행할 수 있는 부착의존성 세포를 의미한다. 접착세포로서는, 구체적으로 다능성 간세포(배성간세포［ES세포］, EG세포, iPS세포 등), 간엽계 간세포, 신경계 간세포, 골수간세포, 생식간세포 등을 들 수가 있고, 이들 중에서도 간엽계 간세포가 바람직하다. 상기 포유동물로서는, 생쥐, 쥐, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목(目), 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 고양이목, 사람, 원숭이, 벵골원숭이, 필리핀원숭이, 마머세트, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 예시하지만, 그 중에서도, 생쥐, 돼지, 사람을 적합하게 예시할 수가 있고, 또한 상기 포유동물의 세포로서는, 재생 의료 등에 혈관 경유로 투여되는 포유동물 간세포 외에, I형 당뇨병 환자에게 경정맥 투여되는 포유동물의 랑게르한스섬 세포, 암환자에게 경정맥 투여되는 포유동물의 수지상 세포, 자연살해세포, 알파·베타(αβ) T세포, 감마·델타(γδ) T세포, 세포 장해성 T세포(cytotoxic T lymphocyte；CTL) 등을 예시할 수가 있다.

본 발명의 세포 세정액에 적용되는 생리적 수용액으로서는, 체액이나 세포액의 침투압과 거의 동일하게 되도록 나트륨이나 칼륨 등에 의하여 염이나 당농도 등을 조정한 등장수용액이면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 생리 식염수나 완충 효과가 있는 생리 식염수(인산 완충 생리 식염수［Phosphate buffered saline；PBS］, 트리스 완충 생리 식염수［Tris Buffered Saline；TBS］, HEPES 완충 생리 식염수 등), 링겔액(유산 링겔액, 초산 링겔액, 중탄산 링겔액 등), 5%글루코오스 수용액, 동물세포 배양용 기초배지(DMEM, EMEM, RPMI－1640,α－MEM, F－12, F－10, M－199 등), 등장제(포도당, D－소르비톨, D－마니톨, 락토오스, 염화 나트륨 등)등을 들 수 있고, 이들 중에서도 완충효과가 있는 생리 식염수나 링겔액이 바람직하고, PBS나 유산 링겔액이 보다 바람직하다. 생리적 수용액은 시판하는 것이어도 좋고 스스로 조제한 것이어도 좋다. 시판하는 것으로서는, D－PBS(－)(Invitrogen사제), 생리 식염액(오오츠카 제약공장사제 '오오츠카생식주'), 유산 링겔 용액(오오츠카 제약공장사제 '라크텍크주'), 사람 간엽계 간세포 전용 배지 키트(Lonza사)을 들 수 있다. 본 명세서 있어서 '등장'이란, 침투압이 250~380mOsm/l의 범위 내인 것을 의미한다. 게다가 생리적 수용액은 안정제(예를 들면, 사람 혈청알부민, 폴리에틸렌 글리콜 등), 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 킬레이트제(예를 들면, EDTA, EGTA, 구연산, 살리실레이트), 용해보조제, 보존제, 산화 방지제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류에 있어서의 트레할로스로서는, 2개의α-글루코오스가 1,1－글리코시드 결합한 이당류인 α,α－트레할로스 외에, α-글루코오스와 β－글루코오스가 1,1－글리코시드 결합한 이당류인 α,β－트레할로스나, 2개의 β－글루코오스가 1,1－글리코시드 결합한 이당류인 β,β－트레할로스를 들 수 있지만, 이들 중에서도 α,α－트레할로스가 바람직하다. 이들 트레할로스는 화학합성, 미생물에 의한 생산, 효소에 의한 생산 등의 어떠한 공지된 방법에 따라서도 제조할 수 있지만, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들면, α,α－트레할로스(주식회사 하야시바라사제), α,α－트레할로스(와코우준약사제) 등의 시판품을 들 수 있다.

본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류에 있어서의 트레할로스 유도체로서는, 이당류인 트레할로스에 1 또는 복수의 당단위가 결합한 글리코실 트레할로스류이면 특별히 제한되지 않고, 글리코실 트레할로스류에는 글루코실 트레할로스, 말토실 트레할로스, 말토트리오실 트레할로스 등이 포함된다.

본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류에 있어서의 트레할로스 또는 그 유도체의 염으로서는, 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 인산염, 질산염, 황산염, 초산염, 프로피온산염, 톨루엔술폰산염, 호박산염, 옥살산염, 유산염, 주석산염, 글리콜산염, 메탄술폰산염, 낙산염, 길초산염, 구연산염, 푸마르산염, 말레산염, 사과산염 등의 산부가염과, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 금속염과, 암모늄염, 알킬암모늄염 등을 들 수 있다. 또한, 이들 염은 사용시에 용액으로서 이용되고, 그 작용은 트레할로스의 경우와 같은 효과인 것이 바람직하다. 이들 염류는 수화물 또는 용매화물을 형성하여도 좋고, 또한 어느 하나를 단독으로 또는 2종 이상을 적절하게 조합하여 이용할 수 있다.

본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류의 농도로서는, 단백질 분해효소처리에 의한 세포사(아포토시스나 네크로시스 등)를 억제(저해)할 수 있는 농도이면 좋고, 세포의 종류나 배양용기에 있어서의 세포수, 세포농도 등에 따라서 최적의 조건을 적절하게 선택할 수 있다. 트레할로스류의 농도가 높을수록 단백질 분해효소처리에 의한 세포사를 억제할 수 있는 효과는 높아지지만, 트레할로스류의 농도가 너무 높으면 세포의 생존에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 예를 들면, 본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스류의 농도는 통상 0.1(w/v)% 이상, 바람직하게는 1.0(w/v)% 이상, 보다 바람직하게는 3.0(w/v)% 이상이며, 또한, 세포의 생존률에 대한 악영향을 회피하는 관점에서, 통상 20(w/v)% 이하, 바람직하게는 15(w/v)% 이하, 보다 바람직하게는 7.0(w/v)% 이하, 더욱 바람직하게는 5.0(w/v)% 이하이다. 따라서, 세포 세정액 중의 트레할로스류의 농도로서는 0.1~20(w/v)%, 바람직하게는 1.0~15(w/v)%, 보다 바람직하게는 1.0~7.0(w/v)%, 더욱 바람직하게는 3.0~5.0(w/v)%이다. 본 발명의 세포 세정액에 의하여 세포사를 억제할 수 있는 점은, 트리판블루(Trypan Blue) 염색법, TUNEL법, Nexin법, FLICA법 등 세포사를 검출할 수 있는 공지의 방법을 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명의 단백질 분해효소처리에 이용되는 단백질 분해효소로서는, 트립신, 리실엔드펩티다아제, 프로나제, 펩신, 엘라스타아제, 콜라게나제 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 트립신을 적합하게 예시할 수 있다.

본 발명의 세정방법에 있어서의 접착세포 세정시의 온도나 시간 등의 조건은, 본 발명의 트레할로스류에 의한 효과가 확인됨과 함께 세포에 데미지를 주지 않는 조건이면 좋고, 온도는 통상 20~37℃의 범위 내이며, 처리 시간은 통상 1초~20분의 범위 내이지만, 처리 시간이 적어도 30초~10분의 범위 내에서 본 발명의 트레할로스류에 의한 효과가 동일한 정도로 확인되므로, 상기 처리 시간으로서는 30초~10분의 범위 내가 바람직하다. 또한, 세정 조작의 회수로서는, 적어도 1회이면 좋고, 여러 차례(2, 3, 4회 등)여도 좋지만, 시간 대비 효과 및 비용 대비 효과를 고려하면 1회가 바람직하다.

본 발명의 세포 세정액을 이용하여 이하와 같이 이식용 세포 현탁액을 제조할 수 있다.

우선, 세포 접착 분자(파이브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 니도겐 등)나 고분자(폴리-L－오르니틴, 폴리리신 등) 등으로 코팅 처리한 접착세포용 배양용기(멀티 웰 플레이트, 배양접시［샬레, 디쉬］, 플라스크 등)나, 표면 가공 처리한 접착세포용 배양용기에 상술한 접착세포를 인비트로로 계대배양한 것을 얻는다. 배지 중에는, 프로테아제 억제인자 등 단백질 분해효소의 활성을 저해하는 인자가 포함되어 있을 가능성이나, 배지 중에 존재하는 과잉량의 단백질에 의하여 단백질 분해효소의 기능이 경합적으로 저해될 가능성이 있기 때문에, 다음의 공정에서 단백질 분해효소처리를 행하기 전에, 미리 접착세포가 접착된 배양용기에 있어서의 배지를 흡인기 등으로 제거하고, 단백질을 거의 또는 전혀 포함하지 않는 본 발명의 세포 세정액으로 세포를 세정하고, 잔존하는 배지를 제거한다. 세정 처리시의 온도나 시간 등의 조건은, 상술한 본 발명의 세정방법에 있어서의 접착세포 세정시의 조건을 들 수 있다.

다음으로, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리시킨다. 이때, 통상 세포가 데미지를 받음으로써 세포 집단에 있어서의 세포 생존률이 저하하지만, 본 발명의 트레할로스류에 의한 효과에 의하여, 세포 생존률 저하를 억제(저해)할 수 있다.

단백질 분해효소처리는, 상술한 단백질 분해효소를 함유하는 수용액에 세포를 접촉시킴으로써 실시한다. 단백질 분해효소를 함유하는 수용액으로서는, Gibco사제 등이 시판하는 단백질 분해효소의 분말을 상술한 생리적 수용액에 용해한 것이어도, Lonza사제 등이 시판하는 단백질 분해효소의 용액을 상술한 생리적 수용액으로 희석한 것이어도 좋다. 단백질 분해효소를 함유하는 수용액에 있어서의 단백질 분해효소의 농도는, 단백질 분해효소의 종류에 따라서 세포를 박리하는데 충분한 농도이면 좋고, 통상 0.05~0.25(w/v)%의 범위 내이다.

단백질 분해효소처리에 있어서의 온도나 시간 등의 조건은, 대부분(70~100% 등)의 세포를 배양용기로부터 박리할 수 있는 조건이면 좋고, 온도는 통상 20~37℃의 범위 내이며, 처리 시간은 통상 15초~15분의 범위 내이다. 통상 장시간에 걸쳐서 세포를 단백질 분해효소처리하면, 세포가 데미지를 받아 생존률이 더욱 저하할 우려가 있지만, 본 발명의 트레할로스류에 의한 효과에 의하여 세포의 생존률 저하를 억제할 수 있기 때문에, 배양용기로부터 박리하는데 통상의 처리 시간으로는 곤란한 세포를 장시간(10~30분 등) 처리할 수도 있다.

계속해서, 단백질 분해효소의 처리를 정지하기 위하여, 배양용기로부터 박리한 접착세포를 단백질을 함유하는 생리적 수용액 중에 현탁시킨다. 현탁은 피펫팅이나 태핑 등 해당 기술 분야에 있어서의 주지의 방법에 의하여 실시할 수가 있다. 단백질을 함유하는 생리적 수용액으로서는, 단백질 분해효소의 활성을 억제하는데 충분한 양의 단백질을 함유하는 생리적 수용액이면 좋고, 구체적으로는 0.1~30(ｖ／ｖ)%의 혈청(소 태아 혈청［Fetal bovine serum；FBS］, 송아지 혈청［Calf bovine serum；CS］등)을 함유하는 상술한 생리적 수용액을 들 수 있고, FBS를 함유하는 상술한 동물세포 배양용 기초배지가 바람직하다. 또한, 단백질을 함유하는 생리적 수용액으로서는, 본 발명의 트레할로스류에 의한 상가 또는 상승효과가 인정되기 때문에, 상술한 트레할로스류를 포함하는 것이 바람직하다.

이어서, 세포 현탁액 중의 단백질 분해효소를 제거하고, 접착세포를 세정하기 위해서 세포 현탁액에 있어서의 용액을 제거하고, 단백질 분해효소처리 후 세정액으로서 상술한 생리적 수용액을 이용하여 접착세포를 세정한다. 세포 현탁액에 있어서의 용액의 제거는, 세포 현탁액을 원심분리기를 이용하여 상청(용액)과 침전물(세포)로 분리하고, 흡인기 등을 이용하여 상청을 제거함으로써 실시할 수가 있다. 또한, 세정 효과를 높이기 위해서, 침전물은 피펫팅이나 태핑 등에 의하여 현탁하는 것이 바람직하다. 또한, 세포 현탁액 중의 세포를 세정하는 회수로서는, 적어도 1회이면 좋고, 여러 차례(2, 3, 4회 등)여도 좋지만, 시간대비 효과 및 비용대비 효과를 고려하면 1회가 바람직하다. 또한, 단백질 분해효소처리 후 세정액으로서 이용하는 상술한 생리적 수용액으로서는, 본 발명의 트레할로스류에 의한 상가 또는 상승효과가 인정되므로, 상술한 트레할로스류를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 세정 후 세포는 원심분리기를 이용하여 상청(용액)과 침전물(세포)로 분리하고, 흡인기 등을 이용하여 상청을 제거한 후, 경동맥 또는 경정맥 혹은 경피적 등의 수단에 의한 이식에 적합한 이식용 수용액에 현탁시킨다. 이식용 수용액으로서는, 구체적으로 상술한 생리적 수용액을 들 수 있고 링겔액이 바람직하며, 유산 링겔액, 초산 링겔액 또는 중탄산 링겔액이 보다 바람직하고, 유산 링겔액이 더욱 바람직하다.

상기 다른 형태의 접착세포의 인비트로 계대방법으로서는, (a＇) 상술한 접착세포가 접착한 배양용기에 있어서의 배지를 제거하고, 본 발명의 세포 세정액으로 접착세포를 세정하는 공정；(b＇) 상술한 단백질 분해효소를 이용한 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리시키는 공정；(c＇) 박리한 접착세포를 상술한 단백질을 함유하는 생리적 수용액 중에 현탁하는 공정；(d＇) 세포 현탁액의 일부(50［ｖ／ｖ］%, 25［ｖ／ｖ］%, 12［ｖ／ｖ］% 등)를 새로운 배양용기를 이용하여 계대배양시키는 공정；을 차례대로 포함하는 방법을 들 수 있고, 공정(c＇)와 공정(d＇) 사이에, 세포 현탁액에 있어서의 용액을 제거하고, 상술한 생리적 수용액이나 단백질을 함유하는 생리적 수용액으로 접착세포를 세정하는 공정(p)을 더 갖춘 것이 바람직하다.

계대배양에 적용되는 배양 온도는, 통상 약 30~40℃의 범위이고, 바람직하게는 37℃이다. 배양시의 CO₂ 농도는 통상 약 1~10%의 범위이고, 바람직하게는 약 5%이다. 배양시의 습도는 통상 약 70~100%의 범위이고, 바람직하게는 약 95~100%이다.

계대배양에 적용되는 배지로서는, 0.1~30(ｖ／ｖ)%의 범위 내에서 혈청(FBS, CS 등)을 함유하는 상술한 동물세포 배양용 기초배지나, 혈청 대신에 세포 증식에 필요한 첨가물을 함유하는 상술한 동물세포 배양용 기초배지를 들 수 있다. 이러한 첨가물로서는, 철원(트랜스페린 등), 성장인자(인슐린, EGF, Basic FGF, 신경교세포 유래 신경영양인자［GDNF；Glial cell line-derived neurotrophicfactor］, 간세포 인자［SCF；Stem Cell Factor］등), 폴리아민류(푸트레신 등), 스테로이드(프로게스테론,β-에스트라디올 등), 미네랄(셀레노우스산［Selenous acid］또는 그 염), 접착인자(예를 들면, 헤파린(Heparin), 헤파란황산, 콜라겐, 파이브로넥틴 등), 환원제(N－아세틸시스테인［N-acetylcysteine］, 2－메르캅토에탄올, 카탈라아제 등)등을 들 수 있다. 또한, 이들 배지에는 간세포의 미분화 유지에 필요한 간세포의 분화 억제제(LIF, Wnt, TGF-β 등) 외에, 글루코오스 등의 당류나, 스트렙토마이신, 페니실린, 젠타마이신 등의 항생 물질이나, Hepes 등의 완충제 등을 첨가하여도 좋다.

본 발명의 이식용 세포 현탁액의 제조방법이나 상기 다른 형태의 접착세포의 인비트로 계대방법에 있어서의 각 공정은, 먼지나 세균 등의 혼입(오염)을 피하기 위하여, 클린벤치 등을 이용하여 무균적으로 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이식용 세포 현탁액을 제조하기 위한 키트나, 상기 다른 형태의 접착세포의 인비트로 계대를 위한 키트로서는 본 발명의 세포 세정액과 단백질 분해효소처리에 의한 세포사 억제 효과에 대해서 기재된 첨부 문서를 함유하는 이식용 세포 현탁액의 제조용 키트로서 용도가 한정되는 것이나, 접착세포의 인비트로 계대용 키트로서 용도가 한정되는 것이면 특별히 제한되지 않고, 더욱이 상술한 단백질 분해효소와 피펫트, 원심관 등을 포함하는 것이어도 좋고, 특히 상술한 단백질 분해효소를 포함하는 것을 적합하게 예시할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시로 한정되는 것은 아니다.

1. 본 발명의 세포 세정액을 단백질 분해효소처리 전의 세포 세정액으로서 이용하면 세포사가 억제되는 것의 확인

1－1　재료

1－1－1　3(w/v)% 트레할로스 함유 유산 링겔액

　3g 트레할로스(주식회사 하야시바라사제)를 90mL 유산 링겔액(오오츠카 제약공장사제 '라크텍크주')과 혼합하고 교반기를 이용하여 용해하였다. 유산 링겔액으로 100mL로 용량을 조정한 후에, 안전 캐비넷 내에서 0.22μm 필터로 멸균을 실시하고, 10mL씩 분배하였다.

1－1－2　사람 골수 간엽계 간세포(Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow

［hMSC-BM］)

　hMSC-BM(Lonza사제)를 이하의〔1〕~〔9〕에 나타내는 순서에 따라 조제하고 본 실험에 이용하였다.

〔1〕hMSC-BM를 75cm² 플라스크를 이용하여 사람 간엽계 간세포 전용 배지 키트(Lonza사제)(이하, 'MSC 배지'라고 한다)의 존재하에서 37℃, 5%의 CO₂ 인큐베이터에서 배양을 실시하였다. 현미경으로 세포 상태를 관찰하고, 90% 정도 융합될 때까지 배양하였다.

〔2〕MSC 배지를 흡인기로 제거하고, 플라스크당 8mL의 둘베코 인산 완충식염수(D－PBS［－］)(이하 간단하게'PBS'라고 한다.)(Invitrogen사제)로 세포를 린스하였다.

〔3〕PBS를 흡인기로 제거하고, 플라스크당 3.75mL의 트립신-EDTA(Lonza사제)를 더하여 실온에서 5분간 가만히 두었다.

〔4〕세포가 90%정도 박리할 때까지 현미경으로 관찰하면서 천천히 흔들었다.

〔5〕플라스크당 3.75mL의 MSC 배지를 더하여 트립신 반응을 정지시키고, 피펫팅에 의하여 세포를 회수하여 50mL 원심 튜브로 옮겼다.

〔6〕600×g, 5분간, 22℃에서 원심분리하였다.

〔7〕상청인 MSC 배지를 흡인기로 제거하고, 1 플라스크당 5mL의 MSC

배지를 더하여 세포 펠렛(침전물)을 현탁시켰다.

〔8〕10μL의 세포 현탁액을 채취하여 10μL의 0.4% 트리판블루(Gibco사제)와 혼합하고, 세포계수반으로 살아있는 세포수를 계측하였다.

〔9〕6웰 디쉬에 1×10⁵세포/2mL/웰이 되도록 세포를 파종한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양을 실시하였다. 3~4일 간격으로 MSC 배지를 전량 새로운 배지로 교환하였다.

1－2　방법

본 발명의 세포 세정액을 단백질 분해효소처리 전의 세포 세정액으로서 이용하면 세포사가 억제되는 것을 확인하기 위하여, 이하의〔1〕~〔5〕에 나타내는 순서에 따라 실험하였다.

〔1〕hMSC-BM이 접착된 6웰 디쉬로부터 MSC 배지를 흡인·제거하고, 25℃의 3(w/v)% 트레할로스 함유 유산 링겔액(3% LRT)을 1웰 당 2mL씩 첨가하고, 25℃에서 1분간 보온하였다(효소처리 전 세정 처리). 또한, 대조군으로서 PBS를 이용하였다.

〔2〕3% LRT를 흡인·제거한 후, 25℃로 보온한 트립신-EDTA(Lonza사제)를 1웰 당 1mL씩 첨가하고, 25℃에서 15분간 인큐베이트하였다(효소처리).

〔3〕25℃의 MSC 배지를 1mL씩 더하여 세포를 현탁시킨 후(효소 반응 정지처리), 세포 현탁액을 15mL 코니칼 원심 튜브(conical centrifuge tube)로 옮겼다.

〔4〕600×g, 5분간, 25℃에서 원심분리하여 상청을 흡인·제거한 후, 1웰에 대하여 100μL의 빙랭PBS에 현탁시켰다(효소처리 후 세정처리).

〔5〕10μL 세포 현탁액을 채취하고, 10μL 트리판블루와 섞은 후, 현미경으로 세포계수반을 이용하여 세포수를 측정하고, 사세포율의 평가를 실시하였다.

1－3　결과

트립신 처리 전에 PBS를 이용하여 세포를 세정한 경우, 트립신 처리 후의 사세포율은 34.7% 인데 대하여(도 1, 왼쪽으로부터 첫 번째 막대), 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정한 경우, 트립신 처리 후의 사세포율은 16.3%이고(도 1, 오른쪽으로부터 두 번째 막대), 또한, 양자 사이에 통계학적 유의차가 확인되었다(P＜0.001). 이 결과는, 트립신 처리 전에 LRT 등 트레할로스를 함유하는 생리적 수용액을 이용하여 세포를 세정하면, 트레할로스를 함유하지 않는 생리적 수용액을 이용한 경우와 비교하여, 트립신 처리 후의 사세포율이 저하하는 것을 나타내고 있다. 또한, 비교예 1로서 트립신 처리 전에 PBS를 이용하여 세포를 세정하고(상기 실시예 1의 '1－2　방법'의〔1〕스텝［효소처리 전 세정처리］), 또한, 트립신 처리 후에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정한 경우(상기 실시예 1의 '1－2　방법'의〔4〕스텝［효소처리 후 세정처리］), 사세포율은 32.8%이며(도 1, 왼쪽으로부터 두 번째 막대), 대조군인 PBS를 이용한 경우와 비교하여(도 1, 왼쪽으로부터 첫 번째, 사세포율 34.7%) 유의차는 없으나 사세포율이 저하하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 그 효과는, 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정한 경우가 훨씬 뛰어났다(P＜0.001, 도 1, 왼쪽으로부터 두 번째와 세 번째 막대의 비교). 또한, 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정하고, 또한 트립신 처리 후에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정한 경우, 트립신 처리 후의 사세포율은 13.8%이며(도 1, 오른쪽으로부터 첫 번째 막대), 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용한 경우와 비교하여(도 1, 오른쪽으로부터 두 번째 막대, 사세포율 16.3%) 유의차는 없지만 사세포율이 저하하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 단백질 분해효소처리 후의 세포 세정시에 트레할로스를 이용하면, 본 발명의 세포 세정액과의 상가 또는 상승효과에 의하여 사세포율을 더욱 저하시킬 수 있음을 나타내고 있다.

2. 본 발명의 세포 세정액에 의한 세포사 억제 효과가 트레할로스에 의한 것이라는 점의 확인과 본 발명의 세포 세정액에 의한 처리 시간의 검토

2－1　방법

나아가서, LRT에 의한 세포사 억제 효과가 LR에 의한 것이 아니고 트레할로스에 의한 것임을 확인하기 위하여, 트립신 처리 전 세정액의 대조군으로서 LR을 이용한 경우의 실험을 행하였다. 또한, 트립신 처리 전에 있어서의 세포 세정 처리 시간에 대해서도 함께 검토하기 위하여, 이하의〔1〕~〔5〕에 나타내는 순서에 따라 실험을 행하였다.

〔1〕hMSC-BM가 접착된 6웰 디쉬로부터 MSC 배지를 흡인·제거하고, 25℃의 3(w/v)% 트레할로스 함유 유산 링겔액(3% LRT)을 1웰 당 2mL씩 첨가하여, 25℃에서 0.5, 1, 3, 5, 7, 10분간 보온하였다(효소처리 전 세정 처리). 또한, 대조군으로서 LR, 및 세정액으로서 일반적으로 사용되고 있는 PBS를 이용하였다.

〔2〕3% LRT를 흡인·제거한 후, 25℃로 보온한 PBS와 같은 양으로 섞은 트립신-EDTA(Lonza사제) 희석액을 1웰 당 1mL씩 첨가하여, 25℃에서 20분간 인큐베이트하였다(효소처리).

〔3〕25℃의 MSC 배지를 1mL씩 더하여 세포를 현탁시킨 후(효소 반응 정지 처리), 세포 현탁액을 15mL 코니칼 원심 튜브(conical centrifuge tube)로 옮겼다.

〔4〕600×g, 5분간, 25℃에서 원심분리하고, 상청을 흡인·제거한 후, 1웰에 대하여 100μL의 빙랭PBS에 현탁시켰다(효소처리 후 세정 처리).

〔5〕10μL 세포 현탁액을 채취하고, 10μL 트리판블루와 섞은 후, 현미경 으로 세포계수반을 이용하여 세포수를 측정하고, 사세포율의 평가를 실시하였다.

2－2　결과

결과를 도 2에 나타낸다. 예를 들면, 트립신 처리 전 세정 처리 시간이 10 분인 경우, 트립신 처리 전에 LR를 이용하여 세포를 세정하였을 때, 트립신 처리 후의 사세포율은 42.1%였던 것에 대하여, 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정했을 때, 트립신 처리 후의 사세포율은 14.8%까지 저하하고(도 2), 이러한 저하는 통계학적 유의차가 확인되었다(P＜0.001). 또한, PBS와 LR의 사이에 통계학적 유의차가 확인되지 않았다. 이 결과는, 본 발명의 세포 세정액에 의한 세포사 억제 효과가 LR에 의한 것이 아니고, 트레할로스에 의한 것임을 나타내고 있다. 게다가 트립신 처리 전, LRT에 의한 세포 세정 처리 시간이 0.5~7분인 경우에 있어서도 마찬가지로, 세포사 억제 효과가 동일한 정도가 확인되었다(도 2). 이 결과는, 트립신 처리 전에 본 발명의 세포 세정액을 이용하여 적어도 0.5~10분의 범위 내에서 처리했을 경우, 동일한 정도의 세포사 억제 효과가 확인되는 것을 나타내고 있다.

3. 본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스 농도의 검토

3－1　방법

다음으로, 본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스 농도에 대해 검토하기 위하여, 이하의〔1〕~〔5〕에 나타내는 순서에 따라 실험을 실시하였다.

〔1〕hMSC-BM이 접착된 6웰 디쉬로부터 MSC 배지를 흡인·제거하고, 25℃의 각종 농도(1, 3, 5, 7, 10, 12, 15［w/v］%)의 트레할로스 함유 유산 링겔액을 1웰 당 2mL씩 첨가하여, 25℃에서 1분간 보온하였다(효소처리 전 세정 처리). 또한, 대조군으로서 LR를 이용하였다.

〔2〕〔1〕의 효소처리 전 세정액을 흡인·제거한 후, 25℃로 보온한 트립신-EDTA(Lonza사제)를 1웰 당 1mL씩 첨가하여 25℃에서 15분간 인큐베이트하였다(효소처리).

〔4〕600×g, 5분간, 25℃에서 원심분리하고 상청을 흡인·제거한 후, 1웰에 대하여 100μL의 빙랭PBS에 현탁시켰다(효소처리 후 세정 처리).

〔5〕10μL세포 현탁액을 채취하여 10μL 트리판블루와 섞은 후, 현미경으로 세포계수반을 이용하여 세포수를 측정하고 사세포율의 평가를 실시하였다.

3－2　결과

결과를 도 3에 나타낸다. 트레할로스 농도가 1~15(w/v)%인 LRT를 이용하여 트립신 처리 전의 세포를 세정한 경우, 어떤 농도에 있어서도 트레할로스를 함유하지 않는 LR를 이용한 경우와 비교하여 사세포율은 저하하고 있고(도 3), 이러한 저하는 통계학적 유의차가 확인되었다. 또한, 트레할로스 농도가 3(w/v)%인 세포 세정액을 이용한 경우, 세포사 억제 효과가 가장 뛰어난 것이 분명해졌다. 이들 결과는, 본 발명의 세포 세정액에 적용되는 트레할로스 농도가 적어도 1~15(w/v)%의 범위 내인 경우, 세포사 억제 효과가 확인되는 것을 나타냄과 함께, 이러한 트레할로스 농도가 1~7(w/v)%, 특히 3~5(w/v)%인 경우, 특히 뛰어난 세포사 억제 효과가 확인되는 것을 나타내고 있다.

4. 트립신 처리 또는 트립신 반응 정지 처리시에 트레할로스를 첨가한 경우의 세포사 억제 효과의 해석

4－1　방법

다음으로, 트립신 처리 또는 트립신 반응 정지 처리시에 트레할로스를 첨가한 경우의 세포사 억제 효과에 대해 해석하기 위해서, 이하의〔1〕~〔5〕에 나타내는 순서에 따라 실험을 실시하였다.

〔1〕hMSC-BM이 접착된 6웰 디쉬로부터 MSC 배지를 흡인·제거하고, 25℃의 3(w/v)% 트레할로스 함유 유산 링겔액을 1웰 당 2mL씩 첨가하여, 25℃에서 1분간 보온하였다(효소처리 전 세정 처리). 또한, 대조군으로서 LR를 이용하였다.

〔2〕〔1〕의 효소처리 전 세정액을 흡인·제거한 후, 트립신-EDTA(Lonza사제)에 트레할로스의 최종 농도가 3(w/v)%가 되도록 첨가한 25℃ 보온의 트레할로스 함유 트립신 용액을 1웰 당 1mL씩 첨가하여, 25℃에서 15분간 인큐베이트하였다(효소처리).

〔3〕MSC 배지에 트레할로스의 최종 농도가 3(w/v)%가 되도록 첨가한 25℃보온의 트레할로스 함유 MSC 배지를 1mL씩 더하여 세포를 현탁시킨 후(효소 반응 정지 처리), 세포 현탁액을 15mL 코니칼 원심 튜브(conical centrifuge tube)로 옮겼다.

〔4〕600×g, 5분간, 25℃에서 원심분리하고, 상청을 흡인·제거한 후, 1웰에 대해 100μL의 빙랭 PBS에 현탁시켰다(효소처리 후 세정 처리).

〔5〕10μL세포 현탁액을 채취하고, 10μL 트리판블루와 섞은 후, 현미경으로 세포계수반을 이용하여 세포수를 측정하고, 사세포율의 평가를 실시하였다.

4－2　결과

결과를 도 4에 나타낸다. 비교예 2로서 트립신 처리 전에 PBS를 이용하여 세포를 세정하고, 또한 트레할로스 함유 트립신 용액을 이용하여 효소처리를 실시했을 경우(상기 실시예 1의 '1－2　방법'의〔1〕스텝［효소처리 전 세정 처리］), 트레할로스를 함유하지 않는 트립신 용액을 이용했을 경우와 비교하여, 사세포율에 변화는 확인되지 않았다(도 4의 '트립신＋T'와'트립신'의 비교). 이 결과는, 단백질 분해효소처리시에 트레할로스를 첨가해도 사세포율을 억제할 수 없음을 나타내고 있다. 또한, 비교예 3으로서 트립신 처리 전에 PBS를 이용하여 세포를 세정하고, 또한 트립신 반응 정지 처리시에 트레할로스 함유의 MSC 배지(도 4의 '배지＋T')를 이용했을 경우(상기 실시예 1의 '1－2　방법'의〔3〕스텝(효소 반응 정지 처리)), 트레할로스를 함유하지 않는 MSC 배지를 이용했을 경우(도 4의 '배지')와 비교하여 사세포율이 저하하고 있었다(도 4의 왼쪽으로부터 첫 번째 막대［사세포율 37.9%］와 도 4의 왼쪽으로부터 두 번째 막대［사세포율 33.9%］의 비교). 이 결과는, 단백질 분해효소처리 후의 효소 반응 정지 처리시에, MSC 배지 등의 단백질을 함유하는 생리적 수용액에 트레할로스를 첨가한 것을 이용하여 세포를 현탁시키면, 본 발명의 세포 세정액과 비교하여 효과는 낮지만, 사세포율을 저하할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 또한, 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용하여 세포를 세정하고, 나아가서 트립신 반응 정지 처리시에 트레할로스 함유 MSC 배지를 이용했을 경우, 트립신 처리 후의 사세포율은 13.0%이고(도 4, 오른쪽으로부터 세 번째 막대), 트립신 처리 전에 3% LRT를 이용한 경우와 비교하여(도 4, 오른쪽으로부터 네 번째 막대, 사세포율 16.8%), 유의차는 없지만 사세포율이 저하하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는, 단백질 분해효소 반응 정지 처리시에 트레할로스를 이용하면, 본 발명의 세포 세정액과의 상가 또는 상승효과에 의하여 사세포율을 더욱 저하시킬 수 있음을 나타내고 있다.

본 발명에 의하면, MSC 등 간세포를 포함하는 세포 현탁액 중의 사세포의 비율을 저하시키고, 양질의 세포 현탁액을 제공할 수 있으므로, 재생 의료 등에 있어서의 이식 의료 분야나 암치료 분야에서 유용하다.

Claims

단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 세포 세정액을 이용하여 접착세포를 세정하는 것을 특징으로 하는 접착세포의 세정방법.
제1항에 있어서,
접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
세포 세정액 중의 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 방법.
생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에 접착세포를 세정하기 위한 세포 세정액.
제4항에 있어서,
접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 세포 세정액.
제4항 또는 제5항에 있어서,
트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 세포 세정액.
이하의 공정 (a)~(d)를 구비하는 것을 특징으로 하는 이식용 세포 현탁액의 제조방법:
(a) 접착세포가 접착된 배양용기의 배지를 제거하고, 생리적 수용액에 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 첨가하여 이루어지는 세포 세정액으로 접착세포를 세정하는 공정；
(b) 단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리시키는 공정；
(c) 배양용기로부터 박리한 접착세포를 단백질을 함유하는 생리적 수용액 중에 현탁시켜서 세포 현탁액으로 하는 공정；
(d) 세포 현탁액의 용액을 제거하고, 생리적 수용액으로 접착세포를 세정하는 공정.
제7항에 있어서,
접착세포가 간엽계 간세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
공정(a)에 있어서의 세포 세정액 중의 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 1~15(w/v)%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
공정(b)에 있어서의 단백질 분해효소가 트립신인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
공정(c)에 있어서의 단백질을 함유하는 생리적 수용액이, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 더 포함하는 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
공정(c)에 있어서의 단백질을 함유하는 생리적 수용액이 혈청을 함유하는 동물세포 배양용 기초배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
공정(d)에 있어서의 생리적 수용액이, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 세포 세정액과, 상기 세포 세정액의 단백질 분해효소처리에 의한 세포사 억제 효과에 대하여 기재된 첨부 문서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이식용 세포 현탁액을 제조하기 위한 키트.
단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포를 세정하기 위한 세포 세정액의 제조에 있어서의, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 용도.
단백질 분해효소처리에 의하여 접착세포를 배양용기로부터 박리하기 전에, 접착세포의 세정에 사용하기 위한, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염.