WO2007043698A1

WO2007043698A1 - 肝臓保存液

Info

Publication number: WO2007043698A1
Application number: PCT/JP2006/320796
Authority: WO
Inventors: Takaaki Koshiba; Xiangdong Zhao; Hiromi Wada; Takayuki Nakamura; Koichi Tanaka
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.
Priority date: 2005-10-13
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2007-04-19
Also published as: CA2625628A1; CA2625628C; JP5274017B2; US20110311959A1; JPWO2007043698A1; US20090239206A1; US8512940B2

Abstract

本発明は、トレハロース及びジブチリルｃＡＭＰを含有する肝臓保存液を提供する。該保存液中のニトログリセリンの含有量は、好ましくは０．４４ｍＭを下回る。本発明の肝臓保存液においては、肝臓を保存する場合に生じるニトログリセリンによる毒性が改善されているので、高い生着率で肝臓移植を行うことが可能となる。

Description

明細書

肝臓保存液

技術分野

本発明は、二トロ'グリセリンによる毒性が改善された肝臓保存液に関する。

背景技術

現在、欧米の脳死肝移植では、通常、 University of Wisconsin 液（UW 液）が使用されている（Transplant proc, vol. 31, p. 2069-2070, 1999)。これは、 UW 液が他の臓器保存液に比較して、より長期間、肝臓の冷疎血保存を可能にするからである。しかし、 UW 液は極めて粘性が高いため、肝臓の冷疎血保存を開始する際にあらかじめ、粘性の低いリンゲル液等で血管内の血液を洗い流す必要がある , ばかり力 \ UW 液による権流そのものにも、長時間を要す。また、 UW 液は細胞内液型保存液（電解質が細胞内の組成と同等）であり、カリウムの濃度が高い（ 125mM)。力リゥムの濃度が高いことは血管の収縮を招くため、これも臓器の灌流に長時間を要す原因となる。そればかり力、肝を患者に移植し血流を再開する直前に肝内の UW 液を一旦、リゲル液等で置換し、患者体内に高濃度のカリウムが流入し、ないようにする必要がある。その上、化学的に不安定活性酸素消去剤（ラジカルスカベンジャー）を成分に含むため、 UW液には冷所保存でも有効期間が短く、また、単価が非常に高い。

これらの、不利益を解決するため、 UW液とはまったく組成の異なる細胞外液であって、カリウム濃度が低く、細胞膜を安定化し細胞傷害を抑制する糖類トレハロースを含有する ET- Kyoto 液及び New ET-Kyoto 液が本発明者らにより開発された（特許第 3253131号、 Yonsei Medical Journal, vol 45, No. 6, p. 1107- 11 1 4, 2004)。 New ET-Kyoto 液は ET-Kyoto 液と類似する組成を有するが、ジブチリノレ cAMP (db-cAMP)、ニトログリセリン及び Nァセチルシスティンを含有する点で、 ET-Kyoto 液とは異なる。 db- cAMP及びニトログリセリンの保存液への添加は、 ET -Kyoto 液と比して移植後における臓器機能をさらに高めることが記載されている（Yonsei Medi cal Journal, vol 45, No. 6, p. 1107-1114, 2004)。 ET-Kyoto 液はすでに、腎臓、肺、筋肉、皮膚の冷疎血保存において、 UW液と同等の効果を発揮することが動物実験のレベルで示されている。しかし、肝臓の保存に対する効果に関しては詳細な報告は未だ成されていなかった。

また、 New ET-Kyo o液に関しては、肺の保存において UW液に優る効果が示されており、、京都大学における臨床、肺移植に導入されている。，そこで、より臓器機能の維持作用に優れ、しかも安全性、操作性及び化学的安定性に優れた肝臓保存液の開発が望まれている。

上記事情に鑑み、臓器機能の維持作用に優れ、しかも安全性、使用の容易さ、化学的安定性に優れた肝臓保存液を提供することを目的とする。

発明の開示

, 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を進めた。

その結果、肺移植片等の保存において優れた効果を有することが確認済みの Ne w ET-Kyoto 液中で肝臓を保存し、肺移植時と同様に、これをリンゲル液等で灌流せずにレシピエント動物に移植したところ、意外なことに、レシピエント動物に対して肺移植時には認められない毒性を示し、当該動物の移植後生存率が低下してしまうという問題点を見出した。そこで、この毒性の原因を更に追究した結果、 New ET-Kyoto 液中に含まれる二トロクリセリンがこの毒性の原因であり、この含有量を一定値より低くすることで、該毒性を低減することが可能であることを見出した。更に、ニトログリセリンの毒性が発現しない条件下では、 ET- Kyoto 液へのジブチリル c AM Pの添加により、肝臓移植後の生存率（生着率）が飛躍的に向上すること、そしてこのジブチリル c AM P添加の効果が ET- Kyoto 液に特異的であることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下に関する。

[ 1 ] トレハロース及びジブチリル c AM Pを含有する、肝臓保存液。

[ 2 ] ニトログリセリンの含有量が 0 . 4 4 mMを下回る、 [ 1 ] 記載の保存液。

[ 3 ] ニトログリセリンの含有量が 0 . 0 0 4 4 mM以下である、 [ 1 ]記載の保存液。 [4] ニトログリセリンを実質的に含有しない、 [ 1] 記載の保存液。

[5] ジブチリル c AMPの濃度が 0. 005〜 1 OmMの範囲にある、 [ 1] 記載の保存液。 .

[6]トレハロース濃度が 50〜24 OmMの範囲にある、 [1]記載の保存液。

[7] ヒドロキシェチル澱粉を更に含有する、 [1] 記載の保存液。

[8]少なくとも下記の成分を下記の範囲内で更に含有する、 [1]記載め保存液：

N a + 0〜 1 40 mM

Κ⁺ , 4〜'l 40 mM Η₂ Ρ0₄—又は ΗΡΟ 2〜 65 mM C 1 HC O CO \ 有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 1 5〜1 50mM。

[9] 少なくとも下記の成分を下記の範囲内で含有する、肝臓保存液 .

ジブチリル c AMP 005 〜 1 0 mM トレノヽ口—ス 50〜 24 0 mM ヒドロキシェチル澱粉 1〜 8 0 g/ 1 N a + 1 0〜 1 4 0 mM K ⁺ 4〜 1 4 0 mM

Η₂ Ρ0₄—又は HP0₄_— 1 2〜 6 5 mM C 1―、 HC0₃—、 C0₃" 有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 1 5 50 mM

[1 0]ニトログリセリンの含有量が 0. 44mMを下回る、 [9]記載の保存液。

[1 1] トレハロース及びジブチリル c AMPを含有する、腎臓保存液。

本発明の肝臓保存液は以下のような利点を有する。

( 1 )本発明の肝臓保存液においては、 New ET-Kyoto 液中で肝臓を保存する場合に生じるニトログリセリンによる毒性が改善されている。更に、本発明の肝臓保存液のカリウム濃度は UW液等と比較して低い。従って、保存後に肝臓内の保存液をリンゲル液等により置換せずに、血液を再灌流することが可能である。 (2) 本発明の肝臓保存液は粘性が低いので、肝臓の冷疎血を開始する段階で最初にリンゲル液などで権流を始める必要がなレ、。

(3) 本発明の肝臓保存液は粘性が低く、且つカリウム濃度が低いので、肝臓の冷疎血を開始する段階における濯流に要する時間が短い。

(4) 本発明の肝臓保存液は組成が化学的に安定であり、室温で長期期間保存可能である。 ' '

(5) 本発明の肝臓保存液は単価が安い。

( 6 )本保存液は、既存の臓器保存液 UW液等と比して明らかに優れた肝保存能を有する。，図面の簡単な説明 .

図 1は、肝臓移植後の 7日間生存率を示すグラフである。

図 2は、肝細胞傷害又は類洞内皮細胞傷害を反映する各血清生化学マーカーに対する保存液の効果を示すグラフである。

図 3は、肝機能に対する保存液の効果を示すグラフである。

図 4は、肝臓移植片の組織学的変化に対する保存液の効果を示す写真である。

A及び C ET-Ky o t o + d b - c AMP、 B及び D ： UW。 A vs B ：類洞の鬱血は Bの方が Aよりも著明である。 C vs D .空胞変性は、 Dの方が、 C 及び Aよりも著明である。

図 5は、肝細胞及び類洞内皮細胞の超構造に対する保存液の効果を示す写真である。 A及び B ：肝細胞、 C及び D ：類洞内皮細胞、 A及び C ： UW群、 B及び

D ：改変 N e w E T一 K群。

図 6は、 ET— K液又は d b— c AMPが添加された E T— K液中で保存された肝臓を移植されたラットの累積生存率を示すグラフである（Kaplan- Meier法）。実線は ET— K群を、点線は ET— K+ d b - c AM P群をそれぞれ示す。また、白丸は E T— K群の発生例を、黒丸は ET— K+ d b - c AMP群の発生例をそれぞれ示す。図 7は、 UW液又は d b— c AMPが添加された UW液中で保存された肝臓を移植されたラットの累積生存率を示すクラフである（Kaplan-Meier法）。実線は UW群を、点線は UW+ d b— c AMP群をそれぞれ示す。また、白丸は UW群の発生例を、黒丸は tjW+ d b - c AMP群の発生例をそれぞれ示す。発明を実施するための最良の形態 '

本発明は、トレハロース及びジブチリル c AMPを含有する、肝臓保存液を提供するものである。

本発明の保存液に用いられるトレハロースには α , α— トレハロース、 a , β 一トレハロース及び ]3 , J3— トレハロースの 3種が存在するが、好ましくは天然 ,に存在する α， α—トレハロースが用いられる。本発明の保存液中のトレハロースの含有量の範囲は、本発明の保存液の夸する肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例えば 5 0〜24 OmM、好ましくは 1 00〜2 1 0 mM、より好ましくは 1 00〜 1 4 OmM、更に好ましくは 1 1 0〜 1 3 OmM (例えば 1 20 mM) である。

- 本発明の保存液中に含まれるジブチリル c AMPの含有量の範囲は、本発明の保存液が有する肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例えば 0. 00 5〜 1 0mM、好ましくは 0. 0 5〜 5 mM、より好ましくは 0. 5〜4m M、更に好ましくは 1. 5〜3mM (例えば 2mM) である。本発明の保存液にジブチリル c AM Pが含まれることにより、肝臓移植後の生存率（生着率）が飛躍的に向上する。

本発明の保存液のニトログリセリン含有量は、好ましくは、 0. 44mMを下回る。ニトログリセリンによる毒性を考慮すると、ニトログリセリン含有量は低いほど好ましく、例えば 0. 4mM以下、好ましくは 0. 3mM以下、より好ましくは 0. 2mM以下、更に好ましくは 0. 1 mM以下（例えば、実質的に 0 m M (ニトログリセリンを実質的に含有しない））である。とりわけ、ニトログリセリンの含有量が 0. 0 044mM以下では、ニトログリセリンによる毒性がほとんど発現せず、肝臓移植後のレシピエントの生存率が向上するため、好ましい。本発明の保存液は、該保存液の浸透圧を調節するために、ヒドロキシェチル澱粉（以下、「HE S」もレヽう）を含有していてもよい。ヒドロキシェチル澱粉は、置換度が 0 4〜0 · 8の範囲のもので、平均分子量 2 0 000 0〜 9 0000 0のものが好ましく、更に好ましくは平均分子量 3 5 00 00^80 0 000のものである。ヒドロキシェチル澱粉の含有量は、本発明の保存液の肝機能維持作用を損なわない限り特に限定されないが、例ぇば1〜8 0 _§/ 1、好ましくは 2 0〜40 ₈ 1、ょり好ましくは2 5 3 5 g/ 1 (例えば 30 g/ 1 )である。本発明の保存液は、該保存液の浸透圧や p Hを調節するために、種々の電解質を含有してもよい。該電解質としては、有機酸のナトリウム塩若しくはカリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ニナトリウム、リン酸水素二力リゥム、炭酸水素ナトリゥム、炭酸水素力リゥム、炭酸ナトリゥム及び炭酸力リゥムを例示することが出来る。また有機酸としては、ダルコン酸、乳酸、 -酢酸、プロピオン酸、 ]3 _ヒドロキシ酪酸及びクェン酸等を例示することが出来る。，

本発明の保存液は、電解質として、少なくとも下記の成分を、好適には下記の範囲内で更に含有することが好ましい。

N a +は、通常 1 0〜： I 4 0 mM 好ましくは 2 0〜 1 2 0 mM、より好ましくは 9 0〜 1 1 0 mM (例えば 1 00 mM) 含有される。

K +は、通常 4〜 1 4 OmM、好ましくは 20〜1 3 0 mM、より好ましくは 4 0— 5 0 mM (例えば 44mM) 含有される。

H₂ P0₄ ^_又は HP0₄——は、通常 1 2〜6 5mM、好ましくは 2 0〜6 OmM、より好ましくは 20〜 3 OmM (例えば 2 5mM) 含有される。 C l -、 HC0₃—、 C0₃一一、有機酸及び有機酸ァニオンから選ばれる少なくとも 1種は各々、通常 1 5〜： I 5 0 mM、好ましくは 2 0〜 1 2 0 mM、より好ましくは 9 0〜1 1 OmM (例えば 1 0 OmM) 含有される。

本発明の保存液が含有し得る電解質の好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。、

N a ⁺ 1 〜 1 40 mM

K⁺ 4〜 1 40 mM

H₂ P0₄—又は HP0₄—― 1 2〜 6 5mM

C 1—、 HC0₃—、 C0₃_ 、有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 1 5〜： 1 5 OmM 本発明の保存液が含有し得る電解質のより好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。

N a ⁺ 2 0〜： 1 20 mM ,

K+ 2 0〜： I 30 mM H₂ P0₄—又は HP0₄—— 2 0〜 6 0 mM

C 1—、 HC0₃-、 C0₃一一、有機酸及び有機酸ァ二すンから

選ばれる少なくとも 1種 ' 2 0〜 1 20 mM 本発明の保存液が含有し得る電解質の更に好ましい濃度範囲の組み合わせは次の通りである。

N a ⁺ 9 0〜： L 1 0 mM (例えば 1 0 0 mM)

K+ 4 0〜 5 OmM (例えば 44mM)

H₂ P0₄ 又は HP0₄ ^__ 2 0〜 3 0 mM (例えば 2 5 mM)

C I一、 HC0₃一、 C0₃ 一、有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 9 0〜： L I OmM (例えば 1 0 OmM) 本発明の保存液は、細胞又は組織が保存中に膨張又は収縮するのを防ぐために、浸透圧が 2 7 0〜4 5 OmO s m/ 1の範囲にあることが好ましく、 2 7 0〜 3 8 OmO sm/ 1の範囲にあることがより好ましい。また、細胞の酸性分解を防止するために、 p Hが 7〜8の範囲にあることが好ましい。

本発明の保存液の好ましい組成は次の通りである。

ジプチリル c AMP' 0. 005〜 1 0 mM トレノヽロース ' 50〜 2 40 mM ヒドロキシェチル澱粉 1 8 O'g/ 1

N a ⁺ 1 0〜 1 40 mM

K + 4〜 1 40 mM

H₂P0₄—又は ΗΡ0₄_— , 1 2〜 6 5 mM

C 1—、 HC0₃—、 C0₃ 、有機酸又は有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 1 5〜 1 50 mM 本発明の保存液のより好ましい組成は次の通りである。

ジブチリル c AMP 0. 05 〜 5 mM トレノヽ口一ス 100〜 2 1 0 mM ヒドロキシェチル澱粉 20〜4 0 g/ 1 N a ⁺ ' 20〜 1 20 mM

K ⁺ 20〜 1 30 mM

Η₂ Ρ0₄_又は HP0₄ ^__ 20〜 60 mM

C 1 HCO CO _、有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 20〜 1 20 mM 本発明の保存液の更に好ましい組成は次の通りである。

ジブチリル cAMP 1. 5〜 3 mM (例えば 2 mM) トレハロース 1 10〜 1 30 mM (例えば 1 20 mM) ヒドロキシェチル澱粉 25〜35 gZ 1 (例えば 30 g/ 1 )

N a ⁺ 90〜： L 1 0 mM (例えば 1 00 mM)

K+ 40〜 50mM (例えば 44mM)

H₂P0₄—又は HPO 20 30 mM (例えば 25 mM) C I—、 HCO₃一、 C0₃一一、有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 9 0〜： 1 1 0 mM (例えば 1 0 0 mM) 本発明の保存液は、上記以外にも、例えば Mg^{+ +}及び又は C a ^{+ +}を, 1〜 1 0 mMの範囲で含むことができる。更に、本発明の保存液は他の添加物、例えば N ァセチルシスティン等の活性酸素消去剤、 AT P等の細胞賦活剤、抗生物質等を含むことが出来る。， '

本発明の保存液は、自体公知の輸液剤の製造方法に準拠して容易に製造することができる。，

本発明の保存液の使用方法については、特に限定はされないが、例えば生体から摘出された肝臓組織中の血液を本発明の保存液で置換し、これを本発明の保存液中に浸漬して、そのまま低温（例えば 0〜1 0°C、好ましくは 1〜6°C) にて保存する。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

,

実施例 .

[実施例 1 ] ,

〔1〕材料及び方法

(動物）

8週齢の近交系雄 L e w i sラット（S L C) 力チップを敷いたケージ中で室温にて、 1 2時間明暗サイクル下で飼育され、手術前に、標準的な食餌及び水が自由に摂取された。

(保存液）

約 5 0。Cの蒸留水 8 0 0m lに α， α—トレハロース 4 1 g ( 1 2 Omm o 1 )、ヒドロキシェチル澱粉（平均分子量 4 2 9 0 00、置換度 0. 5 5) 3 0 g、クルコン酸ナトリウム 2 1. 8 1 g ( 1 00 mm o 1 )_N リン酸二水素カリウム 0. 8 8 5 g (6. 5mmo 1 )、及びリン酸水素二カリウム 3. 2 2 2 g ( 1 8. 5 mmo 1 ) を溶解した後、蒸留水を加えて全量を 1 000 m 1 とした。これを直ちに濾過し、ガラス瓶に充填、密栓後、蒸気滅菌して、.浸透圧 366mO s m 1、 p H 7. 3 5の ET— Ky o t o液（以下、 ET— K液）を得た。

上記 ET— K液に'、 d b - c AMP (第一製薬社製）、ニトログリセリン（三菱ゥエルファーマ社製）、及び Nァセチルシスティンを添加し、 N e w ET— Ky o t o液（以下、 N e w ET_K液）を得た。 , '

更に、上記 ET— K液に、 d b— c AMP ' (第一製薬社製）を添加し、改変 N e w ET— Ky o t o液（以下、改変 N e w ET— K液）を得た。

UW液は藤沢薬品工業株式会社より購入した。

ET— I 、 N e w ET— K液及び改変 Ne w ET— K液の組成は以下の通りである。 .

表 1

(実験群）

グループ I : UW液群（n = 8)、グループ I I : N e w £丁ー液群（₁1 = 6)、グループ I I I 改変 N e w ET— K液群（n = 8)。各保存液中で肝臓を 24時間冷却保存した後、同種同系肝臓移植が行われた。ラットは、無作為に各群に割り当てられた。

(移植手順） ' UW群においてはく最初に 1 Om 1のリンゲル液でドナー肝臓門脈血管内の血液が置換され、引き続き 1 0 m 1の UW液により血管内が権流された。 N e w E T一 K群及び改変 N e w ET— K群においては、ドナー肝臓門脈血管内の血液が直接 2 Om 1の各保存液により置換された。全ての群において保存液の灌流は、 1 5 c mH₂0の圧力で行われた。次に肝臓移植片がそれぞれの保存液中で 4 °C にて 24時間保存された。 UW群においては、移植前に、移植片の門脈血管内が最後に 1 Om 1のリンゲル液でリンスされ、 UW液が置換された。 Ne w ET 一 K群及び改変 N e w ET— K群においては、肝臓は最終リンス無しで移植された。保存後に、肝移植片が、同所的に（orthotopically) レシピエントラット中へ移植された。肝上大静脈及び肝下大静脈の両方が、手術用縫合糸により縫合された。門脈はポリエチレン ' カフ（微小チューブ）を用いた半自動吻合法により連結された。全ての移植において、麻酔時間は 1 4分を下回り、大静脈を遮断する時間は 25分を下回った。

(術後評価）

移植後 4時間で、移植を施されたレシピエントラットが、ケタミンの腹腔内注入により再麻酔された。胆汁が 1 5分間に亘り採集され、胆汁排泄速度及び胆汁量が測定された。血液試料が、血清アンモニア、 AST、 ALT、 LDH (いずれも最も一般的な肝機能評価指標）及びヒアルロン酸（HA) (肝血管内皮細胞の機能の指標）の測定のために、下大静脈から採取された。最後に、移植片が 20 m lのリンゲル液により、 1 Om lノ分の速度で、門脈経由で灌流された。電子顕微鏡検査（TEM) のための標本は、 20m lの 1. 44%グルタルアルデヒド（GLA) 液により灌流された。残りは、 1 0%ホルムアルデヒド中に浸漬され、パラフィンワックス中に包埋された。切片を、通常のへマトキシリン 'ェォジン染色に処した。 T EMが超構造の変化の解析のために行われた。〔2〕結果

(生存率）

24時間保存された肝臓移植片の移植後、 7日間生存率は、改変 N e w ' ET —K群において 86'% (7/8) であり、 UW群において 25% (2/8) であつた。改¾Ne w ET— K群において、生存率は有意によかった（フイツシャ一正確検定： P< 0. 05 ;図 l)。 N ew E T— K群におい'て 7日間生存率は 0 % ( 0 / 6 )であり、 N e w ET— K液は 7日間生存率を向上させなかった。以上の結果より、改変 Ne w ET— K液を用いれば、 UW液又は N e w E T— K液を用いた場合と比較して肝臓移植後の生存率が大きく上昇することが示された。また、ニトログリセリンを含有する N e w ET— K液を用いると、極 , めて生存率が低いことから、保存液中のニトログリセリンの含有量を減じることにより、肝臓移植後の生存率が大きく上昇することが示された。

(血清生化学）

血清 AST (GOT), ALT (GPT)、 L D H及び HAが移植後 4時間において測定された。 A T、 A S Τ及び LDHレベルにより評価された肝細胞障害、は、改変 N e w ET— K群において、 UW群のそれよりも有意に低かった（改変 NewET - K I UW: ALT, 527 ±88/ 1728±380 IU/1, p < 0.01, AST, 681 ±90/ 1652 ±292 IU/1, p < 0.01, LDH, 1105±352/ 4796±1059 IU/1, p < 0 01, 図 2 A、 B及び C)。 HAレベルは類洞内皮細胞（S EC) の傷害を反映した。 HAレベルは、改変 N e w ET— K群において、 UW群と比較して有意に低かった（1⁹⁸8 ±791/2809±673 ng/ml, p く 0 05，図 2D)。

以上の結果から、改変 N e w ET— K液は UW液と比較して、肝細胞及び類洞内皮細胞の保存効果が優れていることが示された。

(血液アンモニア及び胆汁産生）

アンモニア及び胆汁排泄が肝機能の指標として評価された。この時点においてアンモニアについては、 2群間で有意差はなかったが（255±20/252±22 μ g/dl, p 〉 0.05,図 3 A)、胆汁排泄は改変 N e w E T— K群において有意に高かった (改変 New ET-K I UW: 702±125/ 489 ±108 μ 1/kg/mm, p く 0.05, 図 3 B)。以上の結果から、改変 Ne w E T— K液は UW液と比較して、肝機能の維持効果が高いことが示された。

(HE染 fe)

組織学的には、 UW液中で保存された肝臓移植片は、 ET— K液中でのそれよりも、より再灌流障害を受けやすかつた。 UW群と比較して、改変 N e w ET 一 K群 ίこおレヽて、空月包変性 (vacuolar degeneration), 類洞戀血 (sinusoidal congestion) 及び出血が少なかった（図 4)。

以上の結果から、改変 N e w E T— K液は UW液と比較して、より強力に肝 ,臓を再灌流障害から保護することが示された。 - (電子顕微鏡所見）

S EC及び肝細胞の形態学的変化の更なる評価のために、移植 4時間後における、 24時間保存された肝臓移植片の超構造を解析するため TEMが行われた。 UW群においては、肝細胞の細胞死、すなわちアポトーシス性変化（核濃縮

- (pyknosis), エネルギー代謝に関係するミトコンドリ.ァ浮腫及び空胞変性）力改変 Ne w E T— K群におけるそれよりも、頻繁に認められた（図 5A、 B)。更に、 UW群においては、幾つかの SECは、脱離、不連続性、水疱形成、核凝集及びアポトーシス小体などのアポトーシスの特徴を示した（図 5 C)。一方、改変 N e w ET— K群においては、そのような変化は穏やかであり、 S ECはしばしばよく保存されていた（図 5D)。

以上の結果から、改変 Ne w £丁ー1：液は、肝細胞及び S E Cの超構造を維持する作用に優れていることが示された。

[実施例 2 ]

〔1〕材料及び方法実施例 1と同様に、 8週齢の近交系雄 L e w 1 sラット（S L C) を用た同種同系肝臓移植を行い、種々の濃度のニトログリセリン（NTG) を含む保存液を用いて保存された肝臓を移植した後の生存率が評価された。

試験に使用された保存液は以下の通りである .

- ET-K + d b— c AM P ( 2 mM) + 1 /4 NTG (0. 1 1 mM) - ET-K + d b— c AMP ( 2 mM) + 1/8 NTG ('0. 0 5 5 mM) - ET-K + d b - c AMP ( 2 mM) + 1/ 1 00 NTG (0. 0044 mM)

- ET-K + d b— c AMP ( 2 mM) (コントロール：改変 N e w E T 一 K液） '

肝臓移植の条件は保存液の種類が異なることを除き、実施例 1と同一である。〔2〕結果

結果を表 2に示す。

表 2 レシビエン卜

グループドナー重量 (g) 保存時間（分）無肝時間（分） 1VC再流 (分）生存日数コン卜ローレ 368 1474 410 13 23 7 コン卜ローレ 364 1434 376 16 28 1 コントロール 340 1440 364 16 27 7

1/4 398 1500 410 15 26 1

1/4 356 1375 360 15 29 2

1/4 358 1398 366 16 30 1

1/8 396 1479 396 14 26 2

1/8 342 1378 352 16 27 2

1/8 328 1407 330 16 29 1

1/8 342 1438 370 16 27 1

1/100 338 1449 350 15 26 2

1/100 350 1443 380 15 26 7 肝臓移植後の 7日間生存率は、コント口ール (改変 N e w E T- K) 群において 6 6 % (2/3) であった。ニトログリセリン含有量を N e w E T— K液の 1 8〜 1/4倍量（0. 055〜0. 1 1 mM) にまで減じても、 7日間生存率は 0%であり、この濃度範囲においては、ニトログリセリンによる毒性が十分には改善されていないことが示唆された。一方、ニトログリセリン含有量を N e w E T— K液の '1 100倍量（0. 0044 mM) にまで減じると、 7日間生存率は 50% (1/2) となり、コントロール群とほぼ同等であった。従つて、ニトログリセリンの含有量が 0. 0044 mM以下であれば、ニトロクリセリンによる毒性がほとんど発現せず、肝臓移植後のレシピエントの生存率が向上することが示された。，

[実施例 3 ] ,

〔1〕材料及び方法

実施例 1と同様に、 8週齢の近交系雄 L e w i sラット（S LC) を用いた同種同系肝臓移植を行い、 ET— K液への d b - c AMP添加による肝臓移植後生存率の上昇が、他の保存液でも観察されるか否か調べた。，試験に使用された保存液は以下の通りである：

· E T-K

• UW .

• ET— K + d b - c AMP ( 2 mM) (改変 N e w ET— K液）

• UW + d b - c AMP ( 2mM)

肝臓移植後の 7日間生存率は、 ET— K+ d b— c AMP群では 86% (7/ 8)、 ET— K群では 0% (0/10) であり、 d b— c AMPの添加により生存率が顕著に上昇した（図 6)。

一方、 UW+ d b - c AMP群では 38 % (3/8), UW群では 25 % (2/ 8 ) であり、 d b— c AMPの添加によりわずかに生存率は上昇したものの、 E T一 K液で観察されたような顕著な効果は認められなかった（図 7)。従って、 d b— c AMPの添加による移植後生存率の著しい上昇は、 ET—K 液に特異的な効果であることが示唆された。

また、 d b _ c AMPを添加した ET— K液の優れた臓器保存効果が、肝臓と同様に腎臓においても確認されたことから、上記本発明の保存液は、腎臓の保存にも有用であることが示唆された。産業上の利用可能性

本発明の肝臓保存液は、優れた肝保存能を有しており、移植医療の分野において有用である。，本出願は日本で出願された特願 2005 - 299 3 14 (出願日： 2005年 10月 1 3日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. トレハロース及びジブチリル c AMPを含有する、肝臓保存液。 .

2. ニトログリセリンの含有量が 0. 44 mMを下回る、請求項 1記載の保存液。

3. ニトログリセリンの含有量が 0. 0044mM以下である、請求項 1記載の保存液。

4. ニトログリセリンを実質的に含有しない、請求項 1記載の保存液。

5. ジブチリノレ c AMPの濃度が 0. 0◦ 5〜 1 0 mMの範囲にある、請求項 1 記載の保存液。

6. トレハロースの濃度が 50~24 OmMの範囲にある、請求項 1記載の保存液。，

7. ヒドロキシェチル澱粉を更に含有する、請求項 1記載の保存液。

8. 少なくとも下記の成分を下記の範囲内で更に含有する、請求項 1記載の保存液 .

N a ⁺ 1 0 ~ 1 40 mM

K⁺ 4〜： 1 40 mM

H₂ P 0₄—又は H P 0₄—— 1 2〜 6 5mM C 1 -、 HC0₃—、 C0₃_-、有機酸及び有機酸ァニオンから

選ばれる少なくとも 1種 1 5〜 1 50mM。

9. 少なくとも下記の成分を下記の範囲内で含有する、肝臓保存液 .

ジブチリル c AMP 0. 005 〜 1 0 mM トレノヽロース 50〜 24 0 mM ヒドロキシェチル澱粉 1〜 80 g/ 1

N a ⁺ 1 0〜 1 4 0 mM

K ⁺ 4,〜 1 4 0 mM

Η₂ Ρ0₄—又は HP0₄—— 1 2〜 6 5 mM

C 1―、 HC0₃—、 C0₃~ -、有機酸及び有機酸ァニオンから '

選ばれる少なくとも 1種 1 5〜1 50mM。

10. ニトログリセリンの含有量が 0. 44mMを下回る、請求項 9記載の保存液。

1 1. トレハロース及びジブチリル c AMPを含有する、腎臓保存液。