WO2013168403A1 - トレハロース含有肺塞栓形成予防用哺乳動物細胞懸濁液 - Google Patents
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Abstract
Description
1-1 方法
1-1-1 ラット静脈投与に用いるMSC懸濁液の調製
〔1〕Lew/SsN Slc系、雌性ラット脂肪由来MSCをトリプシン消化処理により剥離した後、200×gで3分間遠心して細胞を回収した。
〔2〕MSCを、ダルベッコリン酸緩衝食塩水(D-PBS)(Invitrogen社製)で2×106細胞/mlになるように調製した後、1×107細胞(5ml)を3つのチューブに分注し、それぞれに8.3mg/mlXenoLight DiR蛍光試薬(Caliper社製、製品番号125964)を13μl添加し、37℃で30分間、MSCの標識を行った。
〔3〕200×gで3分間遠心して標識溶液を除去した後、5mlD-PBSを加え再度200×gで3分間遠心を行い、上清を除いた。沈殿した細胞を生理食塩液(大塚製薬工場社製「大塚生食注」)、乳酸リンゲル溶液(大塚製薬工場社製「ラクテック注」)、及び3%(30mg/ml)トレハロース(和光純薬社製)含有乳酸リンゲル溶液にMSC濃度が2×106細胞/mlになるようにそれぞれ懸濁し、MSC懸濁生理食塩液、MSC懸濁乳酸リンゲル溶液及びMSC懸濁トレハロース含有乳酸リンゲル溶液を作製した。
〔1〕ラットは、Lew/SsN Slc系、雌性10週齢のものを用いた。なお、MSC懸濁液を投与する24時間前に絶食を施した。
〔2〕ラットへの投与ルート確保のために、保定器でラットを保定し、24Gのサーフロー留置針を尾静脈内へ挿入した。
〔3〕50mg/kgソムノペンチル(共立製薬株式会社製)を尾静脈内へ急速投与し、麻酔処理した。維持麻酔のため、1時間後に25mg/kgソムノペンチル(共立製薬株式会社製)の追加投与を行った。
〔4〕血液凝固防止のために、尾静脈投与ルートから100IU/kgヘパリン(持田製薬株式会社製)を投与した。
〔5〕頸部切開により左頸動脈を露出し、ビニールチュ-ブを挿入・固定した。
〔6〕体温維持装置(株式会社ニューロサイエンス製直腸温プローブを3.5cm挿入)を用いて体温を37℃に保持した。
〔7〕気管内に16Gのプラスチック製留置針を挿管し、留置針の他端はレスピレーターと接続し人工呼吸管理下(空気による換気、換気量:10ml/kg/回、換気回数:約70ストローク/分)においた。
〔8〕自発呼吸の発現を回避するために、尾静脈投与ルートから筋弛緩薬(2又は4mg/kgミオブロック静注;MSD株式会社製)を投与した。
〔9〕MSC懸濁液投与前の血液ガス分圧(酸素分圧[pO2]及び二酸化炭素分圧)(mmHg)を測定するために、頸動脈ラインから300μl採血を行った。
〔10〕上記「1-1-1 ラット静脈投与に用いるMSC懸濁液の調製」に記載の方法により作製した3種類のMSC懸濁液(MSC懸濁生理食塩液、MSC懸濁乳酸リンゲル溶液及びMSC懸濁トレハロース含有乳酸リンゲル溶液)を、それぞれのラットへ尾静脈より40分間投与した。なお、MSC懸濁生理食塩液、MSC懸濁乳酸リンゲル溶液及びMSC懸濁トレハロース含有乳酸リンゲル溶液のそれぞれをラットに静脈投与する群を、それぞれMSC懸濁生理食塩液投与群(n=4)、MSC懸濁乳酸リンゲル溶液投与群(n=4)、及びMSC懸濁トレハロース含有乳酸リンゲル溶液投与群(n=4)とした。
〔1〕MSC懸濁液投与から10分ごとに60分後まで、頸動脈ラインから300μlの採血を行い、血液ガス分圧(酸素分圧[pO2]及び二酸化炭素分圧)(mmHg)をカイロン348(シーメンス社製)により測定した。
なお、コントロールとして上記「1-1-2 MSC懸濁液のラットへの静脈投与」の工程〔8〕で調製したMSC懸濁液投与前に採血したものを用いた。
〔2〕MSC懸濁液投与から60分経過後、頸動脈からの放血を行い安楽死させた。
〔3〕肺を摘出し、IVIS Spectrum (キャリパーライフサイエンス社製)を用いたイメージング解析により蛍光及び発光強度を測定した(励起波長710nm、吸収波長780nm)。
1-2-1 MSC懸濁液を投与したラットにおける血中酸素分圧解析
MSC懸濁液として生理食塩液及び乳酸リンゲル溶液を用いた場合、MSC懸濁液投与開始から血中酸素分圧の低下が認められ、少なくとも投与終了後20分経過した時点(投与後60分)まで血中酸素分圧は低下していたことが明らかとなった(図1、表1)。他方、MSC懸濁液としてトレハロース含有乳酸リンゲル溶液を用いた場合、投与中(投与開始0~40分後)や投与後(投与開始40~60分後)の少なくとも20分間は血中酸素分圧の低下は認められなかった(図1、表1)。これらの結果から、MSCをトレハロース不含溶液(生理食塩液や乳酸リンゲル溶液)で懸濁したものを投与(移植)すると、肺塞栓形成が生じたと考えられるのに対して、MSCをトレハロース含有乳酸リンゲル溶液で懸濁したものを投与(移植)すると、肺塞栓形成が予防されたと考えられる。
イメージング解析によりラット生体における投与後のMSCの生体内分布を調べたところ、MSC懸濁液として生理食塩液を用いた場合、肺におけるMSC由来の蛍光量が最も高かったことが明らかとなった(図2、表2)。他方、MSC懸濁液としてトレハロース含有乳酸リンゲル溶液を用いた場合、MSC由来の蛍光量が最も低く、また、生理食塩液を用いた場合と比べ、統計学的に有意差(Tukey’s testでp<0.05)が認められた(図2、表2)。これらの結果は、MSCをトレハロース不含溶液(生理食塩液や乳酸リンゲル溶液)で懸濁したものを投与(移植)すると、MSCが肺、特に肺の毛細血管に集積したのに対して、MSCをトレハロース含有する溶液(乳酸リンゲル溶液)で懸濁したものを投与(移植)すると、かかるMSCの肺、特に肺の毛細血管における集積が減少したことを示している。
Claims (10)
- 哺乳動物細胞及びトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩を含む、哺乳動物細胞を血管経由で投与する際の肺塞栓形成を予防するための哺乳動物細胞懸濁液。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物幹細胞である、請求項1記載の哺乳動物細胞懸濁液。
- 哺乳動物幹細胞が哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物多能性幹細胞である、請求項2記載の哺乳動物細胞懸濁液。
- 哺乳動物細胞が単一細胞の状態にある哺乳動物細胞を含む、請求項1~3のいずれか記載の哺乳動物細胞懸濁液。
- トレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩の濃度が0.1~20%の範囲内である、請求項1~4のいずれか記載の哺乳動物細胞懸濁液。
- トレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩を有効成分として含む、哺乳動物細胞を血管経由で投与する際の肺塞栓形成の予防剤。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物幹細胞である、請求項6記載の予防剤。
- 哺乳動物幹細胞が哺乳動物間葉系幹細胞又は哺乳動物多能性幹細胞である、請求項7記載の予防剤。
- 哺乳動物細胞を血管経由で投与する際の肺塞栓形成の予防剤を調製するためのトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩の使用。
- 哺乳動物細胞が哺乳動物幹細胞である、請求項9記載の使用。
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