TWI547561B - 幹細胞懸濁液 - Google Patents

幹細胞懸濁液 Download PDF

Info

Publication number
TWI547561B
TWI547561B TW100140841A TW100140841A TWI547561B TW I547561 B TWI547561 B TW I547561B TW 100140841 A TW100140841 A TW 100140841A TW 100140841 A TW100140841 A TW 100140841A TW I547561 B TWI547561 B TW I547561B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
stem cells
trehalose
cells
cell
polydextrose
Prior art date
Application number
TW100140841A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201226568A (en
Inventor
小林英司
和田圭樹
藤田泰毅
吉永至宏
土居雅子
藤本康弘
寺谷工
Original Assignee
大塚製藥工場股份有限公司
學校法人自治醫科大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大塚製藥工場股份有限公司, 學校法人自治醫科大學 filed Critical 大塚製藥工場股份有限公司
Publication of TW201226568A publication Critical patent/TW201226568A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI547561B publication Critical patent/TWI547561B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/04—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/02—Esters
    • C08B31/04—Esters of organic acids, e.g. alkenyl-succinated starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

幹細胞懸濁液
本發明是關於哺乳動物幹細胞懸濁液及含有該懸濁液的醫藥製劑。又，本發明是關於抑制哺乳動物幹細胞的凝集的製劑及哺乳動物幹細胞的凝集的抑制方法。再者，本發明是關於抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低的製劑、哺乳動物幹細胞的生存率降低的抑制方法。
由於近年來的幹細胞研究的進步，幹細胞的臨床應用，已經由基礎性的研究階段移行到開發階段。在藉由幹細胞的疾病治療上，將受傷害的患者的細胞或組織的功能，以由幹細胞或由重新分化的該細胞或器官來彌補。這裏，由幹細胞分化成體細胞或組織的態樣，可將藉由幹細胞的治療大約分成2類。
其中之一的態樣是，在體外(in vitro)將幹細胞在特定條件下培養而使其分化成所希望的體細胞或組織，將所得體細胞或組織移植到接受者的體內。例如ES細胞或iPS細胞等多能性幹細胞，如將其直接移植於生體內就怕有形成畸腦瘤(teratoma)的可能性，所以通常是在體外分化成為特定的體細胞或組織，在畸腦瘤形成能力確實消失之後，將其移植於體內。
另一種態樣是，將幹細胞直接移入於生體內。有報告指出由此方法，對於肌肉萎縮性側索硬化症、再生不良性貧血、帕金森病、多發性硬化症、膠原病、克隆氏症(Crohn disease)、潰瘍性大腸炎、阿爾茨海默氏症(Alzheimer’s disease)、白血症、生活習慣寎、癌等疾病有效果。
間葉系幹細胞是存在於哺乳類的骨髓等，已知為分化成為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等的幹細胞。間葉系幹細胞因其多分化能力之故，做為多種組織的再生醫療用的移植材料而受到注目。即，「藉由細胞移植的再生醫療」，係使用間葉系幹細胞，將利用以往的治療方法無法再生，因疾病或障礙而失去的組織，使其再生，恢復功能。具體而言，例如有開始或計劃對下肢虛血(伯格氏症(Buerger’s disease))患者的骨髓間葉系幹細胞的移植，對牙周病患部的骨髓間葉系幹細胞的移植，對變形性關節症患者的骨髓間葉系幹細胞的移植等的治療。
另一方面，海藻糖(trehalose)是葡萄糖以1,1-葡萄糖苷鍵結而成的二糖類之一種。海藻糖有甘味，有高保水力，所以被使用於種種的食品或化粧品中。又，海藻糖有使細胞膜安定化，抑制細胞傷害的性質，所以在移植器官時被使用做為器官保護液的有效成分。已開發ET-Kyoto液或New ET-Kyoto液等含有海藻糖的優異的器官保存液(專利文獻1及2，非專利文獻1)。
羥乙基澱粉是醚化澱粉之一，被使用當做接著劑、乳化劑、糊料等。
聚葡萄糖(,dextran)是由葡萄糖所成的多糖類之一，當做增黏劑、保濕劑等而被廣泛使用於醫藥品、化粧品的領域。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第3253131號公報
[專利文獻2]國際公開第2007/043698號小冊
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Yonsei Medical Journal, vol. 45, No.6, p.1107-1114, 2004
本發明者等精心檢討將幹細胞在生體內的移植能安定且順利進行的條件。幹細胞在生體內的移入，多半場合是將幹細胞的懸濁液對生體內以點滴注入而實施，但本發明者等發現，在實施點滴期間，輸液袋內的懸濁液中的幹細胞互相凝集，而有將小管(Kanüle)塞住，或在肺靜脈等細血管中有形成栓塞的危險性。再者，本發明者等發現，在實施點滴期間，輸液袋內的幹細胞生存率有緩緩降低的可能性。
本發明的目的是提供在幹細胞移植時，抑制懸濁液中的幹細胞互相凝集的技術。
又，本發明的目的是提供抑制懸濁液中的幹細胞生存率降低的技術。
本發明者等精心檢討之結果，發現藉由在幹細胞的懸濁液中添加海藻糖等多糖類，可抑制幹細胞的凝集。又， 同時發現這些多糖類可抑制幹細胞生存率降低。再者，發現將這些多糖類之數種組合，可以增強抑制幹細胞生存率降低的效果。據這些知識，再加檢討結果，完成本發明。
即，本發明如下。
[1]一種哺乳動物幹細胞懸濁液，該懸濁液係含有哺乳動物幹細胞及由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成之群中選擇的至少1種多糖類。
[2]如[1]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其含有的組合含有海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖。
[3]如[1]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其中幹細胞是附著性幹細胞。
[4]如[3]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其中附著性幹細胞是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
[5]如[1]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其中哺乳動物幹細胞包含呈單一細胞狀態的哺乳動物幹細胞。
[6]如[1]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其中多糖類是海藻糖，且海藻糖的濃度在4.53至362.4mg/ml之範圍內。
[7]如[1]所述的哺乳動物幹細胞懸濁液，其中多糖類是聚葡萄糖，且聚葡萄糖的濃度在30至100mg/ml範圍內。
[8]一種哺乳動物幹細胞懸濁液的製造方法，該製造方法包含將哺乳動物幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成之群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液。
[9]如[8]所述的製造方法，其中生理性水溶液含有海藻糖 及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖。
[10]一種哺乳動物幹細胞懸濁液製劑，係含有[1]至[7]所述的任一種哺乳動物幹細胞懸濁液。
[11]一種哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，係含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成之群中選擇的至少1種多糖類。
[12]如[11]所述的哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，其中幹細胞為附著性幹細胞。
[13]如[12]所述的哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
[14]如[11]所述的哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，其中多糖類為海藻糖，且哺乳動物幹細胞懸濁液中的海藻糖濃度以成為在4.53至362.4mg/ml的範圍內的方式使用。
[15]如[11]所述的哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，其中多糖類為聚葡萄糖，且哺乳動物幹細胞懸濁液中的聚葡萄糖濃度以成為在30至100mg/ml的範圍內的方式使用。
[16]一種哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，係含有將該幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液。
[17]如[16]所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中幹細胞為附著性幹細胞。
[18]如[17]所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
[19]如[16]所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中 哺乳動物幹細胞包含呈單一細胞狀態的哺乳動物幹細胞。
[20]如[16]所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中多糖類為海藻糖，且海藻糖的濃度在4.53至362.4mg/ml的範圍內。
[21]如[16]所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中多糖類為聚葡萄糖，且聚葡萄糖的濃度在30至100mg/ml的範圍內。
[22]一種哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，係含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類。
[23]如[22]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，其含有的組合含有海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖。
[24]如[22]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，其中幹細胞為附著性幹細胞。
[25]如[24]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
[26]如[22]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，其中多糖類為海藻糖，且哺乳動物幹細胞懸濁液中海藻糖的濃度以成為在4.53至362.4mg/ml的範圍內的方式使用。
[27]如[22]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制劑，其多糖類為聚葡萄糖，且哺乳動物幹細胞懸濁液中聚葡萄糖的濃度以成為在30至100mg/ml的範圍內的方式使用。
[28]一種哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，係含有將哺乳動物幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液。
[29]如[28]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中生理性水溶液所含的組合包含海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖。
[30]如[28]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中幹細胞為附著性幹細胞。
[31]如[30]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
[32]如[28]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中哺乳動物幹細胞係呈單一細胞的狀態。
[33]如[28]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中多糖類為海藻糖，且海藻糖的濃度在15.1至362.4mg/ml的範圍內。
[34]如[28]所述的哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法，其中多糖類為聚葡萄糖，且聚葡萄糖的濃度在30至100mg/ml的範圍內。
如使用本發明，在幹細胞的移植時，可抑制懸濁液中的幹細胞互相間的凝集。因此可降低在小管中的塞住，或在肺靜脈等細血管中形成塞栓的的危險性。
再者，如使用本發明，可抑制懸濁液中的幹細胞生存 率降低。因此可藉由在更良好狀態的幹細胞實施治療，所以可以期望治療效果的提高。
I、哺乳動物幹細胞懸濁液
本發明是提供一種哺乳動物幹細胞懸濁液，係含有哺乳動物幹細胞及由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成之群中選擇的至少1種多糖類。
哺乳動物而言，例如可舉：小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等齧齒類，兔等兔目，豬、牛、山羊、馬、羊等有蹄目，狗、貓等貓目，人、猴、紅毛猴、食蟹猴、狨猴(marmoset)、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類。哺乳類理想是齧齒類(小鼠等)、有蹄目(豬等)或靈長類(人等)。
在本說明書中，「幹細胞」是指具有自己複製能力及分化、增殖能力的未成熟細胞而言。幹細胞視其分化能力而有多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、單能性幹細胞(unipotent stem cell)等亞集團。多能性幹細胞是指其本身不能成為個體，但具有分化為構成生體的所有組織或細胞的能力的細胞。複能性幹細胞是指雖不是全部的種類，但具有分化為複數種組織或細胞的能力的細胞。單能性幹細胞是指具有分化為特定組織或細胞的能力的細胞而言。
多能性幹細胞而言，可舉胚性幹細胞(ES細胞)、EG細胞、iPS細胞等。ES細胞是將內部細胞塊在餵養細胞(feeder cell)上或在含有LIF的培養基中培養而製造。ES 細胞的製造法方法揭示於例如WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780，US6,200,806，US6,280,718等。EG細胞是可將原始生殖細胞在含有mSCF、LIF及bFGF的培養基中培養而製造(Cell,70：841-847,1992)。iPS細胞是在體細胞(例如纖維母細胞、皮膚細胞等)導入Oct3/4、Sox2及K1f4(視必要而再加c-Myc或n-Myc)等再編程因子(Reprogramming Factors)而可製造(Cell,126：p.663-676,2006；Nature,448：p.313-317,2007；Nat Biotechnol.,26：p.101-106,2008；Cell 131：p.861-872,2007；Science,318：p.1917-1920,2007；Cell Stem Cells 1：p.55-70,2007；Nat Biotechnol,25：p.1177-1181,2007；Nature,448：p：318-324,2007；Cell Stem Cells 2：p.10-12,2008；Nature 451：p.141-146,2008；Science,318：p.1917-1920,2007)。將藉由將體細胞的核進行核移植而製作的初期胚予以培養而樹立的幹細胞，也是理想的多能性幹細胞(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))，Rideout III等(Nature Genetics,24,109(2000))。
複能性幹細胞而言，可舉間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等體性幹細胞。複能性幹細胞理想是間葉系幹細胞。間葉系幹細胞是 指可分化成骨母細胞、軟骨母細胞及脂肪母細胞的全部或幾個的幹細胞的意思。複能性細胞可藉由自體公知的方法，由生體單離。例如，間葉系幹細胞可由哺乳動物的骨髓、脂肪組織、末梢血、臍帶血等以公知的一般性的方法採取。例如，可藉由將骨髓穿刺後的造血幹細胞等的培養、繼代而將人的間葉系幹細胞單離(Journal of Autoimmunity,30(2008)163-171)。複能性幹細胞也可將上述多能性幹細胞以適當的誘導條件下培養而得到。
在本發明的懸濁液中所含的幹細胞理想是附著性。附著性的幹細胞在懸濁液中雖然容易凝集，但本發明的懸濁液由於含有海藻糖，會有效率地抑制此凝集。在本說明書中的「附著性」細胞是指接著於立足點而可生存、增殖、進行物質的生產的立足點依賴性的細胞的意思。附著性幹細胞而言，可舉多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神經系幹細胞、骨髓幹細胞、生殖幹細胞等。附著性幹細胞理想是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
哺乳動物幹細胞是由生體內分離出來的，或在體外以繼代培養出來的都可以。
本發明的懸濁液所含的哺乳動物幹細胞是單離過的或精製過的為理想。在本說明書中，「單離或精製」是指有實施過除去目的之成分以外的成分的操作的意思。單離或精製過的哺乳動物幹細胞的純度(對全細胞數中的哺乳動物幹細胞數的比率)通常是在30%以上，理想是在50%以上，更理想的是在70%以上，再更理想是在90%以上(例如100%)。
在本發明的懸濁液中所含的哺乳動物幹細胞是含有單一細胞(single cell)的狀態的哺乳動物幹細胞為理想。在本說明書中的「單一細胞的狀態」是指沒有與其他的細胞集合而形成塊(即，沒有凝集的狀態)的意思。單一細胞狀態的哺乳動物幹細胞，可將在體外培養的哺乳動物幹細胞以胰蛋白酶/EDTA等做酶處理而調製。在哺乳動物幹細胞中所含的單一細胞的狀態的哺乳動物幹細胞的比率通常是在70%以上，理想是90%以上，更理想是在95%以上，再更理想是在99%以上(例如100%)。單一細胞狀態的細胞的比率，可將哺乳動物幹細胞分散於PBS，將其在顯微鏡下觀察，將以無規則性選擇出來的多數個(例，1000個)細胞加以調查有無凝集而決定。
在本發明的懸濁液中，哺乳動物幹細胞理想是在浮游。在本說明書中的「浮游」是指細胞不會接觸於收納懸濁液的容器的內壁，保持在懸濁液中的狀態而言。
本發明懸濁液是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類。如在後述的實施例所示，這些多糖類有抑制哺乳動物幹細胞凝集的效果。因此，理想是在本發明的懸濁液中，哺乳動物幹細胞的凝集有受到抑制。在本說明書中，「凝集」是指2個以上的細胞集合而成塊的現象而言。
特別是，附著性幹細胞是在懸濁液中浮游，且在單一細胞狀態則容易凝集，但由於上述多糖類，有效抑制凝集，而可長時間維持單一細胞狀態。
並不是受理論的拘束，但幹細胞懸濁液中含有上述多糖類時，可較長時間維持懸濁液中的細胞的浮游狀態，抑制細胞的沉澱，抑制細胞互相間的接觸。再者，一般而言，已知附著性細胞暴露在長時間浮游狀態，則因細胞會受到壓力，隨浮游時間而以與盤子等接著的方式而長出突起，但上述多糖類(特別是海藻糖)賦予細胞的壓力輕微，所以這個突起的形成受到抑制。可想與這些作用互相加成，上述多糖類因而會發揮優異的哺乳動物幹細胞凝集抑制效果。
又，如在後述的實施例所示，上述多糖類具有抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低的效果。因此，理想是在本發明的懸濁液中，哺乳動物幹細胞的生存率降低有受到抑制。特別是，附著性幹細胞在懸濁液中的浮游狀態(尤其是，在懸濁液中浮游，且成為單一細胞的狀態)下容易受到傷害，生存率容易降低，但由於上述多糖類的添加，可有效抑制附著性幹細胞的生存率的降低。
可在本發明的懸濁液使用的海藻糖有α,α-海藻糖、α,β-海藻糖及β,β-海藻糖的3種的存在。海藻糖的種類，只要能抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則並無特別的限定，但理想是使用α,α-海藻糖。
本發明的懸濁液可用的羥乙基澱粉的重量平均分子量(Mw)，只要能抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則並無特別的限定，但通常是5x104至67x104，理想是7x104至60x104，更理想是7x104至20x104的範圍內。
由強化哺乳動物幹細胞對哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低的抑制效果之觀點而言，使用比較低的重量平均分子量(Mw)(例如，5x104至9x104，理想是6x104至8x104(例，7x104))的羥乙基澱粉。
又，在本發明的懸濁液可用的羥乙基澱粉的取代度(每1個葡萄糖單元的羥乙基數)，只要能抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則無特別的限定，但通常是在0.4至0.8之範圍內。
在本發明的懸濁液可用的羥乙基澱粉的合適的例而言，可舉重量平均分子量(Mw)為7x104，取代度為0.5至0.55的羥乙基澱粉，重量平均分子量(Mw)為20x104，取代度為0.5至0.55的羥乙基澱粉。這些羥乙基澱粉，例如，以伊舒血伴(Hespander，註冊商標)之名由Fresenium Kabi Japan公司出售。
在本發明的懸濁液可用的聚葡萄糖是由D-葡萄糖所成的多糖(C6H10O5)n，以α 1→6鍵結為主鏈。聚葡萄糖的種類只要能抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則並無特別的限定。聚葡萄糖的重量平均分子量(Mw)也只要能抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則並無特別的限定，但例如，可舉聚葡萄糖40(Mw=40000)，聚葡萄糖70(Mw=70000)等為合適的例。
本發明的懸濁液中的上述多糖類的濃度，只要足於抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率降低則無特別的限定。上述多糖類的濃度越高，抑制凝集及/或生存率降低效 果會越高，但如該多糖類濃度過高時，對幹細胞生存率有給予不好影響的可能性。
例如，做為上述多糖類而使用海藻糖時，本發明的懸濁液中的海藻糖的濃度通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的海藻糖濃度，通常是362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，懸濁液中的海藻糖的濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可適宜設定對幹細胞的凝集及/或生存率降低發揮抑制效果，以及抑制對幹細胞生存率的不好影響的濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，本發明的懸濁液中的羥乙基澱粉的濃度，例如，1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如500mg/ml以下，理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如，1至500mg/ml，理想是10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，本發明的懸濁液中的聚葡萄糖的濃度，例如，1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的聚葡萄糖濃度，例如500mg/ml以下，理想是200mg/ml以下，更理想是125mg/ml以下，再更理想是 100mg/ml以下。因此，懸濁液中的聚葡萄糖濃度，例如，1至500mg/ml，理想是10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
本發明的懸濁液，理想是含有的組合包含海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖。將羥乙基澱粉或聚葡萄糖與海藻糖組合，可期待抑制哺乳動物幹細胞生存率的降低的效果會增強。特別是，可期待有效抑制在懸濁液中浮游的附著性幹細胞(尤其是，在懸濁液中浮游，且為單一細胞狀態的附著性幹細胞)的生存率降低。
將海藻糖與羥乙基澱粉或聚葡萄糖組合而使用時的本發明的懸濁液中的各多糖類的濃度，理想是設定為：比將海藻糖、羥乙基澱粉或聚葡萄糖單獨使用時，將海藻糖與羥乙基澱粉或聚葡萄糖組合而使用時的抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低的效果會增強。
在本發明的懸濁液中，哺乳動物幹細胞是懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中。生理性水溶液，可以是生理食鹽水、磷酸緩衝化生理食鹽水、Tris緩衝化生理食鹽水、HEPES緩衝化生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、5%葡萄糖水溶液、哺乳動物培養用的液體培養基、等張液(葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉等)的水溶液等的等張水溶液。在本說明書中，「等張」是指滲透壓在250至380mOsm/l的範圍內的意思。
生理性的水溶液，可再含有安定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液)、鉗合劑(例如，EDTA、EGTA、檸檬酸、水場酸鹽)、溶解輔助劑、保存劑、抗氧化劑等。
本發明的懸濁液，可將哺乳動物幹細胞在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液(理想是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的等張水溶液)中懸濁而製造。該生理性水溶液的各多糖類的濃度，與上述本發明的懸濁液中各多糖類的濃度相同。本發明也提供這種哺乳動物幹細胞懸濁液的製造方法。
將哺乳動物幹細胞懸濁於含有上述多糖類的生理性水溶液，也包含在哺乳動物幹細胞的懸濁液中添加上述多糖類，而得含有哺乳動物幹細胞及上述多糖類的哺乳動物幹細胞懸濁液。
將哺乳動物幹細胞的含有上述多糖類的生理性水溶液中的懸濁，可使用吸管(吸吐(pipetting))或輕拍(tapping)等該技術領域周知的方法而實施。
本發明的懸濁液的溫度通常是在0至37℃，理想是在0至25℃的範圍內。
本發明的懸濁液中的哺乳動物幹細胞的密度，只要由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇至少1種多糖類抑制哺乳動物幹細胞的凝集及/或生存率的降低的效果能達成，則無特別的限定，但通常是在103至1010個 /ml的範圍內。
在理想的態樣中，在本發明的懸濁液中，由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇至少1種多糖類抑制哺乳動物幹細胞的凝集，所以使用該懸濁液實施幹細胞移植，則可減低幹細胞的凝集物塞住小管中，或在肺靜脈等細血管中形成栓塞的危險性。又，在理想的態樣中，本發明的懸濁液是由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇至少1種多糖類抑制哺乳動物幹細胞生存率的降低，所以使用本發明的懸濁液，則可以由狀態更良好的幹細胞實施幹細胞移植，而可期望治療效果的提升。因此，本發明也提供含有上述本發明的懸濁液的哺乳動物幹細胞懸濁液製劑。
本發明的哺乳動物幹細胞懸濁液製劑可將上述本發明的懸濁液收納於合適的滅菌容器內而製造。該容器而言，可舉瓶、小瓶、注射筒、輸液袋等可塑性的袋、試管等。這些容器，可由玻璃或塑膠等各種材料形成。這些容器，可連接小管及/或注射針以便將容器內的哺乳動物幹細胞懸濁液點滴注入於病人。
II、哺乳動物幹細胞凝集的抑制 (1、哺乳動物幹細胞凝集抑制劑)
本發明是提供哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，該抑制劑係含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群所選的至少1種多糖類。特別是，懸濁液中的哺乳動物幹細胞(即，浮游的哺乳動物幹細胞)的凝集受到抑制。
「海藻糖」、「羥乙基澱粉」、「聚葡萄糖」、「哺乳動物」、「幹細胞」、「附著性」、「單離或精製」、「單一細胞的狀態」、「浮游」、「凝集」、「等張」、「生理性水溶液」等各用語的定義，如無另有限定，均與上述I項所述相同。
成為本發明的凝集抑制劑的適用對象的哺乳動物幹細胞，理想是附著性幹細胞。此係：附著性幹細胞在懸濁液中(即，在浮游狀態下)更容易凝集之故。理想是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
哺乳動物幹細胞可為由生體內分離者，也可為體外繼代培養者。
成為本發明的凝集抑制劑的適用對象的哺乳動物幹細胞，理想是予以單離或精製。
成為本發明的凝集抑制劑的適用對象的哺乳動物幹細胞，含有單一細胞(single cell)的狀態的哺乳動物幹細胞為理想。在哺乳動物幹細胞中所含的單一細胞的狀態的哺乳動物幹細胞的比率通常在70%以上，理想是在90%以上，更理想的是自95%以上，再更理想的是在99%以上(例如100%)。
成為本發明的凝集抑制劑的適用對象的哺乳動物幹細胞是，理想是在該幹細胞的懸濁液中浮游。
特別是，附著性幹細胞是在懸濁液中浮游，且為單一細胞的狀態是容易凝集，但由於本發明的凝集抑制劑，可有效抑制凝集，可長時間維持單一細胞的狀態。
本發明的凝集抑制劑，含有由海藻糖、羥乙基澱粉及 聚葡萄糖所成的群中選擇的1、2或3種的多糖類。本發明的凝集抑制劑含有這些群中選擇的2種、3種的多糖類時的多糖類的組合為海藻糖與羥乙基澱粉的組合，海藻糖與聚葡萄糖的組合，羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合或海藻糖與羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合。
本發明的凝集抑制劑，可以是由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類本身，也可以是含有在生理學上可容許的承載物。生理學上可容許的承載物而言，例如可以含有生理性水溶液(例如生理食鹽水、磷酸緩衝化生理食鹽水、Tris緩衝化生理食鹽水、HEPES緩衝化生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、5%葡萄糖水溶液、哺乳動物培養用的液體培養基、等張液(葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉等)的水溶液等的等張水溶液)，安定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液)、鉗合劑(例如，EDTA、EGTA、檸檬酸、水楊酸鹽)、賦形劑、結合劑、溶解輔助劑、保存劑、抗氧化劑等。本發明的凝集抑制劑，理想是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液(生理性水溶液中的上述多糖類的溶液)，更理想是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的等張水溶液。
本發明的凝集抑制劑，可在哺乳動物幹細胞的懸濁液中添加而使用。或，本發明的凝集抑制劑是含有由海藻糖、 羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液時，也可使用本發明凝集抑制劑而將哺乳動物幹細胞懸濁。以達成充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的該多糖類濃度的方式，將本發明的凝集抑制劑添加，或藉由本發明的凝集抑制劑而將哺乳動物幹細胞懸濁。
做為上述多糖類而使用海藻糖時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集的海藻糖濃度通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，海藻糖濃度越高則凝集抑制效果越高，但海藻糖濃度過高，則有對幹細胞生存率給予不好影響的可能性。因此，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的海藻糖濃度，通常為362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，懸濁液中的海藻糖濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以照海藻糖為基準，可以適宜設定充分地抑制在懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集的濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集的羥乙基澱粉濃度，例如，1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如500mg/ml以下，理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如，1至500mg/ml，理想是10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集的聚葡萄糖濃度，例如，1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，懸濁液中的聚葡萄糖濃度，例如500mg/ml以下，理想是200mg/ml以下，更理想是125mg/ml以下，再更理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的聚葡萄糖濃度，例如，1至500mg/ml，理想是10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，在使用由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的2種、3種的多糖類時，以結果為懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集受到抑制的方式，添加本發明的凝集抑制劑，或由本發明的凝集抑制劑將哺乳動物幹細胞加以懸濁。
在本發明的凝集抑制劑中，如上述的方式使用時，含有抑制哺乳動物幹細胞凝集的充分量的由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類。本發明的凝集抑制劑中的該多糖類的含有量通常是0.001至100(w/w)%的範圍內。
本發明的凝集抑制劑是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液時，該水溶液中的該多糖類的濃度，只要為充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的濃度則無特別的限定。上述多糖類 的濃度越高，抑制凝集的效果越高，但該多糖類濃度過高，則有賦予幹細胞生存率不好影響的可能性。
例如，做為上述的多糖類而使用海藻糖時，該水溶液中的海藻糖濃度通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，為避免對幹細胞的不好影響，該水溶液中的海藻糖濃度通常是在362.4mg/ml以下，理想是在181.2mg/ml以下。因此，該水溶液中的海藻糖的濃度通常是在4.53至362.4mg/ml，理想是在15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可適宜設定充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的海藻糖濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，該水溶液中的羥乙基澱粉濃度例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，為迴避對幹細胞不好影響的觀點而言，該水溶液中的羥乙基澱粉濃度例如在500mg/ml以下，理想是在100mg/ml以下。因此，該水溶液中的羥乙基澱粉的濃度是例如在1至500mg/ml，理想是在10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，該水溶液中的聚葡萄糖濃度例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，為避免對幹細胞不好影響的觀點而言，該水溶液中的聚葡萄糖濃度例如在500mg/ml以下，理想是在200mg/ml以下，更理想是在125mg/ml以下，再更理想是在100mg/ml以下。因此，該水溶液中的聚葡萄糖的濃度例如是1至 500mg/ml，理想是在10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，在使用由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇2或3種的多糖類時，以結果為抑制哺乳動物幹細胞凝集的方式，於該水溶液中包含各多糖類。
藉由在含有調製成這樣濃度的由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中懸濁哺乳動物幹細胞，可簡便地抑制哺乳動物幹細胞的凝集。
(2.哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法)
本發明是提供一種哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，係含有將哺乳動物幹細胞懸濁在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中(理想是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的等張水溶液)。由於這些多糖類，特別是懸濁液中的哺乳動物幹細胞(即，成為浮游狀態的哺乳動物幹細胞)的凝集受到抑制。
將哺乳動物幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液，也包含在哺乳動物幹細胞的懸濁液中添加含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類，而獲得含有該多糖類的生理性水溶液中的哺乳動物幹細胞懸濁液。
「海藻糖」、「羥乙基澱粉」、「聚葡萄糖」、「哺乳動 物」、「幹細胞」、「附著性」、「單離或精製」、「單一細胞的狀態」、「浮游」、「凝集」、「等張」、「生理性水溶液」、等的各用語的定義，如無特別註明，則與上述I所述相同。
本發明的凝集抑制方法所用的哺乳動物幹細胞，理想是附著性幹細胞。附著性幹細胞在懸濁液中(即，在浮游狀態時)容易凝集之故。附著性幹細胞理想是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
哺乳動物幹細胞可為由生體內分離者，也可以是在體外繼代培養者。
本發明的凝集抑制方法所用的哺乳動物幹細胞，經過單離或精製的為理想。
本發明的凝集抑制方法所用的哺乳動物幹細胞，含有單一細胞(single cell)的狀態的哺乳動物幹細胞為理想。在哺乳動物幹細胞中所含的單一細胞的狀態的哺乳動物幹細胞的比率通常是在70%以上，理想是在90%以上，更理想是在95%以上，再更理想是在99%以上(例如100%)。
特別是，附著性幹細胞浮游在懸濁液中，且呈單一細胞狀態時容易凝集，但藉由自海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類，可有效抑制凝集，可長時間維持單一細胞狀態。
在本發明所使用的生理性水溶液，含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的1、2或3種多糖類。該生理性水溶液含有這些群中所選擇的2種或3種的多糖類時的多糖類的組合是海藻糖與羥乙基澱粉的組合， 海藻糖與聚葡萄糖的組合，羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合或海藻糖與羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合。
本發明所使用的生理性水溶液，含有充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的濃度的上述多糖類。
做為上述多糖類而使用海藻糖時，該生理性水溶液中的海藻糖濃度，只要為充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞凝集的濃度，則無特別的限定，但通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，為迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點，該生理性水溶液中的海藻糖濃度通常是362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，懸濁液中的海藻糖的濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可適宜設定充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，該生理性水溶液中的羥乙基澱粉濃度只要為充分地抑制哺乳動物幹細胞凝集的濃度，則無特別的限定，但例如1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，為避免對幹細胞生存率的不好影響，該生理性水溶液中的羥乙基澱粉濃度，例如在500mg/ml以下，理想是在100mg/ml以下。因此，該水溶液中的羥乙基澱粉的濃度是例如在1至500mg/ml，理想是在10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，該生理性水溶液中的聚葡萄糖濃度只要為足以抑制哺乳動物幹細胞凝集的 濃度，則無特別的限定，但例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，為避免對幹細胞生存率的不好影響，該生理性水溶液中的聚葡萄糖濃度通常在500mg/ml以下，理想是在200mg/ml以下，更理想是在125mg/ml以下，再更理想是在100mg/ml以下。因此，該生理性水溶液中的聚葡萄糖的濃度是通常在1至500mg/ml，理想是在10至200mg/ml，再理想是30至125mg/ml，更理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，在使用由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇2或3種的多糖類時，以結果為能抑制哺乳動物幹細胞凝集的方式，在該水溶液中含有各多糖類。
將哺乳動物幹細胞懸濁時的含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液的溫度通常是0至37℃，理想是在0至25℃的範圍內。
懸濁液中的哺乳動物幹細胞的密度，只要能達成藉由自海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的凝集抑制效果則無特別的限定，但通常是103至1010個/ml的範圍內。
哺乳動物幹細胞懸濁在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液，可使用吸管吸吐或輕拍等該技術領域周知的方法而實施。如此操作，哺乳動物幹細胞會在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生 理性水溶液中浮游。
III.哺乳動物幹細胞生存率降低之抑制 (1.哺乳動物幹細胞生存率降低之抑制劑)
本發明是提供一種哺乳動物幹細胞生存率降低之抑制劑，該抑制劑含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類。哺乳動物幹細胞生存率降低之抑制劑含有由這些群中選擇的2種或3種的多糖類時，由於海藻糖與羥乙基澱粉的組合，海藻糖與聚葡萄糖的組合，羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合或海藻糖與羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合，特別地，可以抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞(即，浮游的哺乳動物幹細胞)生存率的降低。
「海藻糖」、「羥乙基澱粉」、「聚葡萄糖」、「哺乳動物」、「幹細胞」、「附著性」、「單離或精製」、「單一細胞的狀態」、「浮游」、「凝集」、「等張」、「生理性水溶液」、等的各用語的定義，如無特別交待，則與上述I所述相同。
本發明的生存率降低之抑制劑的適用對象之哺乳動物幹細胞，理想是附著性幹細胞。附著性幹細胞與非附著性細胞比較時，附著性幹細胞在懸濁液中(即，在浮游狀態時)生存率更容易降低之故。附著性幹細胞理想是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
哺乳動物幹細胞可為由生體內分離者，也可以是在體外繼代培養者。
本發明的生存率降低之抑制劑的適用對象之哺乳動物幹細胞，經過單離或精製的為理想。
本發明的生存率降低之抑制劑所用的哺乳動物幹細 胞，含有單一細胞(single cell)的狀態的哺乳動物幹細胞為理想。在哺乳動物幹細胞中所含的單一細胞的狀態的哺乳動物幹細胞的比率通常是在70%以上，理想是在90%以上，更理想是在95%以上，再更理想是在99%以上(例如100%)。
本發明的生存率降低之抑制劑的適用對象的哺乳動物幹細胞，理想是在該幹細胞的懸濁液中浮游。
特別是，附著性幹細胞在懸濁液中浮游，且呈單一細胞狀態下容易受傷害，生存率容易降低，但藉由本發明的生存率降低的抑制劑，可將生存率的降低有效抑制。
本發明的生存率降低的抑制劑，其含有的組合理想是含有海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖的組合。將羥乙基澱粉或聚葡萄糖與海藻糖組合，則可期望增強哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制效果。特別是，可期望將在懸濁液中浮游的附著性幹細胞在浮游狀態下(尤其是，在懸濁液中浮游，且呈單一細胞狀態的附著性幹細胞)的生存率降低有效抑制。
本發明的生存率降低的抑制劑，由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類所成也可以，除這些構成因子之外再含生理學上可以容許的承載物也可以。生理學上可以容許的承載物而言，例如可含有生理性水溶液(例如生理食鹽水、磷酸緩衝化生理食鹽水、Tris緩衝化生理食鹽水、HEPES緩衝化生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、5%葡萄糖水溶液、哺乳動物 培養用的液體培養基、等張液(葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、乳糖、氯化鈉等)的水溶液等的等張水溶液)，安定劑(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液)、鉗合劑(例如，EDTA、EGTA、檸檬酸、水楊酸鹽)、賦形劑、結合劑、溶解輔助劑、保存劑、抗氧化劑等。本發明的生存率降低的抑制劑，理想是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的1種、2種或3種的多糖類的生理性水溶液(生理性水溶液中的上述多糖類溶液)，更理想的是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的1種、2種或3種的多糖類的等張水溶液。
本發明的生存率降低的抑制劑，可藉由在哺乳動物幹細胞的懸濁液中添加而使用。或，本發明的生存率降低的抑制劑是含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理水溶液時，使用本發明的生存率降低的抑制劑將哺乳動物幹細胞懸濁也可以。以達成充分地抑制哺乳動物幹細胞生存率降低的上述多糖類的濃度的方式，而添加本發明的生存率降低的抑制劑，或使用本發明的生存率降低的抑制劑將哺乳動物幹細胞加以懸濁。
做為多糖類而使用海藻糖時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞的生存率降低所需的海藻糖的濃度通常是4.53mg/ml以上，理想是15.lmg/ml以上。又，海藻糖的濃度越高生存率降低抑制效果會越高，但海藻糖的濃度過高， 則反而有對幹細胞的生存率給予不好影響的可能性。因此，從迴避此不好影響的觀點而言，懸濁液中的海藻糖濃度，通常是362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，懸濁液中的海藻糖的濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可以適宜設定充分地抑制在懸濁液中的哺乳動物幹細胞生存率降低的海藻糖濃度。
做為多糖類而使用羥乙基澱粉時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞生存率降低的羥乙基澱粉的濃度，通常是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，羥乙基澱粉的濃度越高抑制生存率降低的效果越高，但羥乙基澱粉的濃度過高，則反而對幹細胞生存率有給予不好影響的可能性。因此，從迴避此不好影響的觀點而言，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，通常500mg/ml以下，理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，通常1至500mg/ml，理想是10至100mg/ml。
做為多糖類而使用聚葡萄糖時，充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞生存率降低的聚葡萄糖的濃度，通常是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，聚葡萄糖的濃度越高抑制生存率降低的效果越高，但聚葡萄糖的濃度過高，則反而對幹細胞的生存率有給予不好影響的可能性。因此，又，從迴避對此不好影響的觀點而言，懸濁液中的聚葡萄 糖濃度，通常500mg/ml以下，理想是200mg/ml以下，更理想是125mg/ml以下，再更理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的聚葡萄糖濃度，通常1至500mg/ml，理想是10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，做為多糖類而使用含有海藻糖及羥乙基澱粉；海藻糖及聚葡萄糖；或海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖的組合時，懸濁液中的各多糖類的濃度，理想是設定為比將海藻糖、羥乙基澱粉或聚葡萄糖各分別單獨使用時，使用這些組合時的抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低的效果受增強的方式。
在本發明的生存率降低的抑制劑中，如上述的方式使用時，含有充分地抑制哺乳動物幹細胞生存率降低的量的由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類。本發明的生存率降低的抑制劑中該多糖類的含有量通常是0.001至100(w/w)%的範圍內。
做為多糖類而使用含有海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖的組合時，本發明的生存率降低的抑制劑中海藻糖的含有量通常在0.001至99.999(w/w)%的範圍內，羥乙基澱粉或聚葡萄糖的含有量通常在0.001至99.999(w/w)%的範圍內。
做為多糖類而使用含有海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖的組合時，本發明的生存率降低的抑制劑中各多糖類的含有量，各分別通常在0.001至99.997(w/w)%的範圍內。
本發明的生存率降低的抑制劑，含有至少1種由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群選擇的多糖類的生理性水溶液時，該水溶液中的該多糖類的濃度是，足於抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低的濃度則無特別的限定。上述多糖類的濃度越高，抑制生存率的降低效果越高，但該多糖類濃度過高，則對幹細胞的生存率有不好影響的可能性。
例如，做為多糖類而使用海藻糖時，該水溶液中的海藻糖的濃度，為充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞的生存率降低的方式，通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，為了避免不好影響，該水溶液中的海藻糖濃度，通常是362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，該水溶液中的海藻糖的濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可以適宜設定充分地抑制在懸濁液中的哺乳動物幹細胞生存率降低的濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，該水溶液中的羥乙基澱粉的濃度，例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，從迴避不好影響的觀點而言，該水溶液中的羥乙基澱粉濃度，例如500mg/ml以下，理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如是1至500mg/ml，理想是10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，該水溶液中的聚 葡萄糖的濃度，例如1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，迴避不好影響的觀點而言，該水溶液中的聚葡萄糖濃度，例如是500mg/ml以下，理想是200mg/ml以下，更理想是125mg/ml以下，再更理想是100mg/ml以下。因此，該水溶液中的聚葡萄糖濃度，例如是1至500mg/ml，理想是10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，做為多糖類而使用含有海藻糖及羥乙基澱粉；海藻糖及聚葡萄糖；或海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖的組合時，該水溶液中的各多糖類的濃度，理想是設定為比將海藻糖、羥乙基澱粉或聚葡萄糖各分別單獨使用時，使用這些組合時的抑制哺乳動物幹細胞生存率降低的效果增強的方式。
藉由在含有調整為這種濃度的由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中，將哺乳動物幹細胞加以懸濁，而可簡便抑制哺乳動物幹細胞生存率的降低。
(2.哺乳動物幹細胞生存率降低的抑制方法)
本發明提供一種哺乳動物幹細胞生存率降低之抑制方法，該抑制方法是含有將哺乳動物幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的1種、2種或3種的多糖類的生理性水溶液(理想是由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的1種、2種或3種的 多糖類的等張水溶液)。組合2種或3種的多糖類而使用時，由於海藻糖與羥乙基澱粉的組合，海藻糖與聚葡萄糖的組合，羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合或海藻糖與羥乙基澱粉與聚葡萄糖的組合，特別是，可以抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞(即，浮游的哺乳動物幹細胞)的生存率的降低。
將哺乳動物幹細胞懸濁在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中，也包含在哺乳動物幹細胞的懸濁液中添加由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類，而獲得在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中的懸濁液。
「海藻糖」、「羥乙基澱粉」、「聚葡萄糖」、「哺乳動物」、「幹細胞」、「附著性」、「單離或精製」、「單一細胞的狀態」、「浮游」、「凝集」、「等張」、「生理性水溶液」、等的各用語的定義，如無特別註明，則與上述I所述相同。
本發明的生存率降低的抑制方法所用的哺乳動物幹細胞，理想是附著性幹細胞。附著性幹細胞與非附著性幹細胞比較時，附著性幹細胞在懸濁液中(即，在浮游狀態時)生存率更容易降低之故。附著性幹細胞理想是間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
哺乳動物幹細胞可為由生體內分離者，也可以是在體外繼代培養者。
本發明的生存率降低的抑制方法所用的哺乳動物幹 細胞，經過單離或精製的為理想。
本發明的生存率降低的抑制方法所用的哺乳動物幹細胞，含有單一細胞(single cell)的狀態的哺乳動物幹細胞為理想。在哺乳動物幹細胞中所含的單一細胞的狀態的哺乳動物幹細胞的比率通常是在70%以上，理想是在90%以上，更理想是在95%以上，再更理想是在99%以上(例如100%)。
特別是，附著性幹細胞浮游在懸濁液中，且呈單一細胞狀態下容易受傷害，生存率容易降低，但藉由自由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類，可將生存率的降低有效抑制。
本發明所使用的生理性水溶液中，含有的組合包含海藻糖及羥乙基澱粉，或海藻糖及聚葡萄糖的組合。將羥乙基澱粉或聚葡萄糖與海藻糖組合，可期待抑制哺乳動物幹細胞的生存率的降低的效果會增強。特別是，可期待將在懸濁液中浮游的附著性幹細胞(尤其是，在懸濁液中浮游，且呈單一細胞狀態的附著性幹細胞)的生存率降低有效抑制。
含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中的該多糖類的濃度，只要充分地抑制哺乳動物幹細胞的生存率降低，則無特別的限定。
做為多糖類而使用海藻糖時，該水溶液中的海藻糖的濃度，為充分地抑制懸濁液中的哺乳動物幹細胞的生存率 降低的方式，通常是4.53mg/ml以上，理想是15.1mg/ml以上。又，為了避免對幹細胞生存率的不好影響，該水溶液中的海藻糖濃度，通常是362.4mg/ml以下，理想是181.2mg/ml以下。因此，該水溶液中的海藻糖濃度通常是4.53至362.4mg/ml，理想是15.1至181.2mg/ml。
使用海藻糖以外的上述多糖類時，以海藻糖為基準，可以適宜設定充分地抑制在懸濁液中的哺乳動物幹細胞的生存率降低的濃度。
做為上述多糖類而使用羥乙基澱粉時，該水溶液中的羥乙基澱粉的濃度，例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，該水溶液中的羥乙基澱粉濃度，例如是500mg/ml以下，理想是100mg/ml以下。因此，懸濁液中的羥乙基澱粉濃度，例如是1至500mg/ml，理想是10至100mg/ml。
做為上述多糖類而使用聚葡萄糖時，該水溶液中的聚葡萄糖的濃度，例如是1mg/ml以上，理想是10mg/ml以上，更理想是30mg/ml以上，再更理想是65mg/ml以上。又，從迴避對幹細胞生存率的不好影響的觀點而言，該水溶液中的聚葡萄糖濃度，例如是500mg/ml以下，理想是200mg/ml以下，更理想是125mg/ml以下，再更理想是100mg/ml以下。因此，該水溶液中的聚葡萄糖濃度，例如是1至500mg/ml，理想是10至200mg/ml，更理想是30至125mg/ml，再理想是30至100mg/ml，再更理想是65至100mg/ml。
又，做為多糖類而使用含有海藻糖及羥乙基澱粉；海藻糖及聚葡萄糖；或海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖的組合時，該水溶液中的各多糖類的濃度，理想是設定為比將海藻糖、羥乙基澱粉或聚葡萄糖各分別單獨使用時，使用這些組合時的抑制哺乳動物幹細胞生存率降低的效果增強的方式。
將哺乳動物幹細胞懸濁時的含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液的溫度通常是0至37℃，理想是在0至25℃的範圍內。
懸濁液中的哺乳動物幹細胞的密度，只要由海藻糖的凝集抑制效果能達成，則無特別的限定，但通常是在103至1010個/ml的範圍內。
將哺乳動物幹細胞懸濁在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液，可使用吸管吸吐或輕拍等該技術領域周知的方法而實施。如此操作，可使哺乳動物幹細胞在含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類的生理性水溶液中浮游。
包含刊物、專利文獻等在本說明書引用的所有參考文獻，經引用而將各個在本說明書中做為具體的參考而延用，且其內容全體具體地被記述同樣的程度在本說明書中延用。
以下，以實施例更詳細具體地說明本發明，但本發明 並不受下列實施例的任何限定。
[實施例] [實施例1] 1.源自豬皮下脂肪的間葉系幹細胞(Pig AT-MSC)的調製 (1)豬組織的調製
將豬皮下脂肪由鼠蹊部採取後，以微剪刀除去目視可辨認的血管及肌肉等與脂肪組織不同的組織，之後反覆細切與以HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)清洗數次。將血球(或血塊)的除去及肌肉等膜狀浮游物質的除去能以視覺確認為止繼續清洗作業。所得豬皮下脂肪以剪刀細切。
經細切的組織以同量的HBSS混合。將混合物緩慢振盪後，靜置而分成2層。只回收上層。在回收的上層加0.2%膠原酶(collagenase,(Type I)/HBSS)，在37℃下緩緩振盪到脂肪完全成為液狀為止(最大90分鐘)。在反應液加含10%胎牛血清(FBS)的α MEM對膠原酶反應液量的等量以上而混合後，將混合物離心分離而分離成3層(下層有核細胞、溶液、脂肪)。只回收下層，再懸濁於HBSS。重複此操作3次，將最後懸濁於含10%FBS的α MEM的細胞懸濁液移到培養皿而培養。MSC接著於培養皿的底面。
(2)用於實驗的細胞(Pig AT-MSC P6)的調製
以(1)的操作，在培養皿接著的MSC繼續增殖，5至7日後培養皿底面擠滿了細胞。達到滿盤(confluent)時增殖停止或誘導細胞死，所以未達到滿盤之前，將MSC由培養皿剝離，在新的培養皿以低密度播種。在培養皿底面附著 的MSC以PBC清洗3次後，加胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)，將MSC由培養皿剝離後，加入使細胞成低密度的量的含10%FBS的α MEM而懸濁，移到新的培養皿。將此操作重複6次(6次繼代=P6)。
(3)將細胞以各液懸濁
將在(2)所得的Pig AT-MSC P6用於實驗。
每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次後，以各溶液{ET-Kyoto(ET-K，大塚製藥工場公司製)、HBSS、MSCM(DMEM+10%FBS)}再度，實施馴化清洗1次。又，在ET-K中含有45.3mg/ml濃度的海藻糖。之後，以各溶液懸濁成為2.5x105cells/50μl細胞濃度。
將懸濁液在各溫度(0、25、37℃)靜置，在0、30、60、120、240分後以20μl微量吸取器(pipetman)吸吐數次，將10μl移到培養皿中。
將立體顯微鏡的焦點調整在培養皿上的懸濁液的最下面而觀察。
在顯微鏡下互相鄰接成細胞塊時做為細胞凝集塊。細胞凝集塊是將培養皿在顯微鏡的置物檯上搖動，確認會明顯地成塊而動。
2.細胞生存率的檢討
檢討各條件對細胞生存率的影響。
將每50μl中生存的細胞數以錐蟲藍(trypan blue)染色而算出，與開始時在50μl中生存的細胞數(2.5x105個)比較，而算出細胞的生存率。結果示於第1表。
使用MSCM或HBSS時，隨著時間的經過看到顯著的細胞生存率的降低，但在ET-K則有生存率降低受到抑制。
3.細胞的凝集狀態的檢討
使用MSCM時，在25℃及37℃，試驗開始30分鐘後可看到細胞凝集塊的形成。在0℃，在試驗開始60分鐘後也可看到細胞凝集塊的形成。
使用HBSS時，在25℃及37℃，在試驗開始120分鐘後可看到細胞凝集塊的形成。在0℃，在試驗開始240分鐘後也可看到細胞凝集塊的形成。
另一方面，使用ET-K時，在25℃及37℃，在試驗開始120分鐘後為止沒有看到細胞凝集塊的形成，試驗開始240分鐘後，可看到一些細胞凝集塊的形成。在0℃，在試驗開始240分鐘後也沒有看到細胞凝集塊的形成。在任何溫度下，使用ET-K時，細胞的浮游狀態維持到試驗開始後240分鐘為止。
4.細胞形態的檢討
使用MSCM時，看到有些細胞產生突起。膨脹細胞出現率則低。
使用HBSS時，產生突起的細胞的比率隨時間而增加。又，膨脹細胞出現率則高。
另一方面，使用ET-K時，產生突起的細胞的比率比MSCM及HBSS較低。膨脹細胞的出現率也比MSCM及HBSS較低。
一般而言，已知附著性細胞隨浮游時間而會產生突起而要接著於培養皿。這是浮游狀態會對細胞產生壓力。又，細胞的膨脹，可想是表示細胞質內外的滲透壓調節力的降低。由以上的細胞形態的觀察結果，可認為ET-K比其他組成液對細胞的壓力較輕微。
[實施例2]
在實施例1調製的源自豬皮下脂肪的間葉系幹細胞繼代2次所得的細胞(Pig AT-MSC P2)播種於3個10cm培養皿。每一個10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處 理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞(1.7x106個，生存率94.1%)移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次，懸濁於5ml的ET-kyoto(ET-K，大塚製藥工場公司製)。在10根的15ml試管中將ET-K中的細胞懸濁液分別加入500μl，在室溫(25℃)靜置10分鐘。將適量的生理食鹽水加入於各試管中而稀釋ET-K中的細胞懸濁液2至10倍，再靜置30分鐘。之後，與實施例1同樣算出生存率，觀察細胞凝集塊的有無。結果示於第2表。
(細胞凝集性)
使用ET-K的原液，其2倍稀釋液及3倍稀釋液時，沒有觀察到細胞凝集塊。將ET-K稀釋4倍以上，則可看到少量2至3個細胞結合的凝集塊。因此，表示在至少15.1mg/ml以上的海藻糖濃度，發揮幹細胞的凝集抑制效果。
(細胞浮游性)
觀察細胞凝集性後，將細胞再度懸濁，在室溫(25℃)靜置10分鐘後，在顯微鏡下觀察浮游性。使用ET-K的原 液，其2倍稀釋液及3倍稀釋液時，細胞安定浮游。另一方面，將ET-K稀釋8倍以上，則與MSCM及HBSS幾無不同，細胞產生沉澱。因此，表示至少在15.1mg/ml以上的海藻糖濃度，幹細胞會安定浮游。
(細胞形態及生存率)
雖將ET-K以生理食鹽水稀釋，在試驗的稀釋範圍內，並沒有看到細胞形態及生存率的顯著變化。
[實施例3]
將在實施例1調製的源自豬皮下脂肪的間葉系幹細胞繼代10次所得的細胞(Pig AT-MSC P10)播種於10cm培養皿。每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞(3.3x108個，生存率98.5%)移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次後，懸濁於5ml的ET-Kyoto(ET-K，大塚製藥工場公司製)。將ET-K中的細胞懸濁液在4℃靜置5小時或27小時。之後，與實施例1同樣，算出生存率，觀察細胞凝集塊的有無。結果示於第2表。在靜置5小時或27小時後，再將細胞培養24小時，之後，在顯微鏡下觀察細胞的形態。
(細胞凝集性)
由培養皿剝離後，在懸濁於ET-K的狀態下將細胞在4℃靜置結果，5小時或27小時後都不會發生細胞凝集的形成，維持在單一細胞的狀態。因此，顯示ET-K的細胞凝 集抑制效果在4℃也會發揮。
(生存率)
5小時後生存率是78.7%，27小時後的生存率是65.9%。確認了由0小時至5小時間是3.96%/hr，5小時至27小時間是0.58%/hr的生存率降低。
(細胞的形態)
靜置5小時或27小時後，再將細胞培養24小時，則確認與生存率相符的與盤接著的細胞。但是，在保存27小時的細胞確認有約10%的異形態的細胞。在保存5小時的細胞的異形態細胞的比率是1%以下。
[實施例4] (1)源自人骨髓的MSC(hBM-MSC)的調製
由人腸骨以含有6000單位的肝素(heparin)的注射筒採取20至30ml的骨髓細胞。將骨髓細胞以PBS(-)清洗1次，以900g、20分鐘的離心而回收細胞，並再重複1次。懸濁於含有10%FBS的α MEM中，移到培養皿而實施接著培養。
(2)用於實驗的細胞(hBM-MSC P3)的調製
以(1)的操作，在培養皿接著的MSC繼續增殖，在5至7日後培養皿底面擠滿了細胞。達到滿盤(confluent)時增殖停止或誘導細胞死，所以未達到滿盤之前，將MSC由培養皿剝離，在新的培養皿以低密度播種。在培養皿底面接著的MSC以PBC清洗3次後，加胰蛋白酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶，0.53mM EDTA-4Na)，將MSC由培養皿剝離後， 加使細胞成低密度的量的含10%FBS的α MEM而懸濁，移到新的培養皿。將此操作重複3次(3次繼代=P3)
將源自人骨髓的MSC播在10cm培養皿而培養。每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞的狀態。所得細胞移到15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次後，懸濁於下列的組成液，靜置240分及480分鐘後，觀察細胞凝集的有無。
NS：生理食鹽水(大塚製藥工場)
H：伊舒血伴(Hespander)(杏林製藥)
1xT&NS：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)的生理食鹽水
1xT&H：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)的伊舒血伴(杏林製藥)
1xT&H&TRase：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)及海藻糖酶(Trehalase,Sigma)(2Unit/ml)的伊舒血伴(杏林製藥)
海藻糖是ET-K的主要成分，45.3mg/ml是在ET-K所含海藻糖的濃度。又，伊舒血伴是含有6(w/v)%羥乙基澱粉(重量平均分子量(Mw)約70000，取代度0.50至0.55)的羥乙基澱粉製劑。
其結果，使用NS及H時，試驗開始240分鐘後起可看到細胞凝集塊的形成。另一方面，使用1xT&NS及1xT&H 時，試驗開始240分鐘後及480分後都沒有看到細胞凝集塊的形成。但是以海藻糖酶分解海藻糖，則看到細胞凝集塊的形成。
由以上的結果，可知ET-K的細胞凝集抑制效果是由於海藻糖。
[實施例5] (1)源自人脂肪的MSC(hBM-MSC)的調製
將人皮下脂肪採取後，以微剪刀除去目視可辨認的血管及肌肉等與脂肪組織不同的組織，之後，重複細切與以HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)的清洗數次。將血球(或血塊)的除去及肌肉等膜狀浮游物質的除去能以視覺確認為止繼續清洗作業。所得人皮下脂肪以剪刀細切。
經細切的組織以同量的HBSS混合。將混合物緩慢振盪後，靜置而分成2層。只回收上層。在回收的上層加0.05%膠原酶(Type I)/HBSS，在37℃下緩緩振盪到脂肪完全成為液狀為止。在反應液加含10%胎牛血清(FBS)的α MEM而混合後，將混合物離心分離而分離成2層。只回收下層，再懸濁於HBSS。反覆此操作3次，將最後懸濁於含10%FBS的α MEM的細胞懸濁液移到培養皿而培養。MSC接著於培養皿的底面
(2)用於實驗的細胞(hAT-MSC P3)的調製
以(1)的操作，在培養皿接著的MSC繼續增殖，5至7日後培養皿底面擠滿了細胞。達到滿盤時增殖停止或誘導細胞死，所以未達到滿盤之前，將MSC由培養皿剝離，在 新的培養皿以低密度播種。在培養皿底面接著的MSC以PBC清洗3次後，加胰蛋白酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶，0.53mM EDTA-4Na)，將MSC由培養皿剝離後，加使細胞成低密度的量的含10%FBS的α MEM而懸濁，移到新的培養皿。將此操作重複3次(3次繼代=P3)。
將hAT-MSC及hBM-MSC繼代3次而得到的細胞(hAT-MSC P3及hBM-MSC P3)播於10cm培養皿。每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞(hAT-MSC P3：1.0x105個，生存率：98.4%/hBM-MSC P3：1.25x105個，生存率：96.8%)移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次後，懸濁於下面的組成液100μl，在室溫(約25℃)靜置240分鐘或24小時後，測定細胞的生存率，觀察細胞的凝集及形態。再靜置240分鐘或24小時後，再培養細胞12小時，觀察細胞的形態。
0.1xT&H：含有4.53mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)的伊舒血伴(杏林製藥)
0.1xT&NS：含有4.53mg/ml D-(+)-海藻糖的生理食鹽水(大塚製藥工場)
1xT&H：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
1xT&NS：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖的生理食鹽水
2xT&H：含有90.6mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
2xT&NS：含有90.6mg/ml D-(+)-海藻糖的生理食鹽水
ET-K：ET-Kyoto(大塚製藥工場)
H：伊舒血伴
NS：生理食鹽水
MSCM：含有10%FBS的α MEM
(細胞生存率)
結果示於第3表。
由個別單獨添加海藻糖或羥乙基澱粉(伊舒血伴)，可看到細胞生存率的上昇。添加海藻糖及羥乙基澱粉(伊舒血伴)的雙方，則細胞生存率大幅上昇。
(細胞的凝集及形態)
在0.1xT&NS，在試驗開始240分鐘後在AT及BM的雙方都看到一些細胞凝集塊的形成，但在組成液中含有海藻糖的其他的群(0.1xT&H、1xT&H、1xT&NS、2xT&H、2xT&NS 及ET-K)，則沒有看到細胞凝集塊的形成。在組成液中含海藻糖的群中，沒有看到細胞的變形。
在組成液中不含海藻糖也不含羥乙基澱粉的群(NS、MSCM)中，可以看到顯著的細胞凝集塊及細胞變形。只含有羥乙基澱粉的群(H)中，可以看到細胞凝集塊，但細胞變形則僅有少數。
(靜置後的培養)
無關海藻糖添加的有無，確認與生存率相符的接著細胞數的增減。含有0.1xT的群及海藻糖無添加組的一部分，確認有細胞形態的異常。另一方面，與NS比在H的細胞形態較良好，確認有與生存率相符的細胞數的增減。
由以上的結果，顯示海藻糖可抑制細胞的凝集，提高細胞的生存率，可維持細胞形態及功能。又，顯示羥乙基澱粉可提高細胞的生存率，維持細胞形態及功能。再者，將海藻糖與羥乙基澱粉組合，則顯示細胞的生存率會顯著上昇。
[實施例6]
將hAT-MSC及hBM-MSC繼代3次所得的細胞(hAT-MSC P3及hBM-MSC P3)播於10cm培養皿。每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞(hAT-MSC P3：4.25x105個，生存率97.5%/hBM-MSC P3：5.0x105個，生存率98.2%)移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次， 懸濁於下列的組成液100μl中，在室溫(約25℃)靜置8小時或36小時後，測定細胞的生存率，觀察細胞的凝集。
1xT&H：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)的伊舒血伴(杏林製藥)
2xT&H：含有90.6mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
4xT&H：含有181.2mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
8xT&H：含有362.4mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
ET-K：ET-Kyoto(大塚製藥工場)
H：伊舒血伴
1xT&H&TRase：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖及海藻糖酶(SIGMA)(2Unit/ml)的伊舒血伴
(細胞的凝集)
組成液中含有海藻糖的群(1xT&H、2xT&H、4xT&H、8xT&H及ET-K)，hAT-MSC及hBM-MSC雙方在試驗開始8小時後沒有看到細胞凝集塊的形成。另一方面，使用不含海藻糖的伊舒血伴(H)時，hAT-MSC及hBM-MSC雙方在試驗開始8小時後看到細胞凝集塊的形成。再者，以海藻糖酶分解海藻糖，則看到細胞凝集塊的形成(1xT&H&TRase)。以上的結果顯示海藻糖有細胞凝集抑制效果。
(細胞生存率)
將試驗開始36小時後的細胞生存率示於第4表。
如第4表所示，添加任一濃度的海藻糖，細胞的生存率較伊舒血伴單獨(H)都有上昇。添加到181.2mg/ml(4xT)的濃度的海藻糖為止，細胞生存率顯示顯著的上昇，但將海藻糖的添加濃度提高到362.4mg/ml(8xT)，其效果反而減弱。因此，由提高細胞生存率的觀點而言，海藻糖的濃度是在181.2mg/ml(4xT)以下為理想。
[實施例7]
將hAT-MSC及hBM-MSC繼代6或8次所得的細胞(hAT-MSC P8及hBM-MSC P6)播於10cm培養皿。每一10cm培養皿以5ml的伊舒血伴(杏林製藥)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞(hAT-MSC P8：2.4x106個/hBM-MSC P6：2.3x106個)移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，懸濁於下列的組成液中，在室溫(約25℃)靜置1小時後，測定細胞的生存率，觀察細胞的凝集。
1xT&H：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖(和光純藥)的伊舒血伴(杏林製藥)
0.5xT&H：含有22.65mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
0.1xT&H：含有4.53mg/ml D-(+)-海藻糖的伊舒血伴
1xT&F&H：含有45.3mg/ml D-(+)-海藻糖及10μg/ml的褐藻糖膠(fucoidan，燒津水產化學工業)的伊舒血伴
0.5xT&F&H：含有22.65mg/ml D-(+)-海藻糖及10μg/ml的褐藻糖膠的伊舒血伴
0.1xT&F&H：含有4.53mg/ml D-(+)-海藻糖及10μg/ml的褐藻糖膠的伊舒血伴
F&H：含有10μg/ml的褐藻糖膠的伊舒血伴
ET-K：ET-Kyoto(大塚製藥工場)
H：伊舒血伴
MSCM：含有10%FBS的α MEM
將結果示於第1及2圖。
(細胞生存率)
添加任一濃度的海藻糖，細胞的生存率比伊舒血伴單獨(H)比較都有上昇。另一方面，添加褐藻糖膠，則細胞生存率降低，由此顯示褐藻糖膠具有細胞毒性。海藻糖表現抑制褐藻糖膠的細胞毒性的趨勢。
(細胞的凝集)
在hAT-MSC及hBM-MSC的雙方，由於海藻糖的添加，觀察到細胞浮游效果及細胞凝集抑制效果。另一方面，褐藻糖膠看到有阻礙細胞浮游的趨勢，沒有看到細胞凝集抑制效果。比只有伊舒血伴時，添加海藻糖時細胞的突起形成較受到抑制，細胞的形態較好。0.5xT&H的細胞凝集抑 制效果是與ET-K相同的程度。浮游效果是ET-K比0.5xT&H稍微較優異。0.1xT&H時，在有些細胞表面觀察到有突起。
[實施例8]
將在實施例1調製的源自豬皮下脂肪的間葉系幹細胞繼代7次而得的細胞(Pig AT-MSC P7)在10cm培養皿上培養。將每10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態，懸濁於ET-K液。將所得細胞懸濁液用於下面的試驗。
(在輸液袋內壁的接著性的評估)
將Soldem 3AG輸液袋(TERUMO)細斷，將斷片設置於50ml管的壁面。以細胞懸濁液充滿管，將管橫置於無菌無塵作業台內在室溫(25℃)靜置30分鐘。之後，將輸液袋斷片以PBS清洗，以顯微鏡觀察評估輸液袋內壁有無細胞的接著。
在以PBS清洗前，可看到MSCs的一部分(以眼估算10%以下)在輸液袋內壁的接著，但以PBS清洗，接著的MSCs的大部分(以眼估算90%以上)被除去。因此，顯示由海藻糖可迴避細胞的接著的可能性。
(通過導管試驗)
使用CV導管組(日本Sherwood公司)。18G注射針連接於導管前端。以5mL注射針筒吸入細胞懸濁液。於導管設置注射針筒，押出細胞懸濁液。此操作重複操作規定的次數後，測定細胞生存率，且在顯微鏡下觀察。顯微鏡觀 察之前，以5mL的PBS洗淨導管。
結果示於第5表。
至少10次為止與通過次數無關，細胞生存率不變。在導管的內壁觀察到有極少數的MSCs與ET-K液的殘留，但在通過導管後的細胞數不變，在PBS清洗後未能確認接著細胞。因此顯示由海藻糖可迴避在導管內壁的細胞的接著的可能性。
[實施例9]
將豬間葉系幹細胞在10cm培養皿上培養。以胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA‧4Na)處理而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得的細胞懸濁於下列的組成液，在室溫(約25℃)靜置360分鐘後，測定細胞的生存率，觀察細胞的凝集。
NS：生理食鹽水
MSCM：含有10%FBS的α MEM
ET-K：ET-Kyoto(大塚製藥工場)
Saviosol：Saviosol(商品名)(大塚製藥工場)
Dextran：低分子聚葡萄糖L注(大塚製藥工場)
又，saviosol是含有30mg/ml的濃度的重量平均分子量為40000的聚葡萄糖(聚葡萄糖40)的乳酸林格氏液。低 分子聚葡萄糖L注是，含有100mg/ml的濃度的重量平均分子量為40000的聚葡萄糖(聚葡萄糖40)的乳酸林格氏液。
(細胞生存率)
將試驗開始30分鐘及360分後的細胞生存率示於第6表。
如第6表所示，使用任一種組成物時，細胞的生存率與使用生理食鹽水時比較都顯著地高。
(細胞的凝集)
試驗開始後360分後在顯微鏡下觀察細胞凝集塊的形成。使用生理食鹽水或MSCM中保存時，觀查到大的細胞凝集塊的形成，但在ET-K、Saviosol或聚葡萄糖時，細胞凝集塊的形成受到抑制，維持細胞的分散狀態。
[實施例10] (1)大鼠組織的調製
將大鼠皮下脂肪由鼠蹊部採取後，以微剪刀除去目視可辨認的血管及肌肉等與脂肪組織不同的組織，之後重複細切與以HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)清洗數 次。將血球(或血塊)的除去及肌肉等膜狀浮游物質的除去能以視覺確認為止繼續清洗作業。所得大鼠皮下脂肪以剪刀細切。
經細切的組織以同量的HBSS混合。將混合物緩慢振盪後，靜置而分成2層。只回收上層。在回收的上層加0.2%膠原酶(Type I)/HBSS，在37℃下緩緩振盪到脂肪完全成為液狀為止(最大90分鐘)。在反應液加含10%胎牛血清(FBS)的α MEM對膠原酶反應液量的等量以上而混合後，將混合物離心分離而分離成3層(下層有核細胞、溶液、脂肪)。只回收下層，再懸濁於HBSS。重複此操作3次，將最後懸濁於含10%FBS的α MEM的細胞懸濁液移到培養皿而培養。MSC接著於培養皿的底面。
(2)用於實驗的細胞(Rat AT-MSC P6)的調製
以(1)的操作，在培養皿接著的MSC繼續增殖，5至7日後培養皿底面擠滿了細胞。達到滿盤時增殖停止或誘導細胞死，所以未達到滿盤之前，將MSC由培養皿剝離，在新的培養皿以低密度播種。在培養皿底面接著的MSC以PBC清洗3次後，加胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)，將MSC由培養皿剝離後，加使細胞成低密度的量的含10%FBS的α MEM而懸濁，移到新的培養皿。將此操作重複6次(6次繼代=P6)。
(3)將細胞以各液懸濁
將在(2)所得的Rat AT-MSC P6用於實驗。
每一10cm培養皿以5ml的PBS(-)清洗3次後，以1ml 的胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶，1mM EDTA-4Na)處理20秒而剝離細胞，呈單一細胞狀態。將所得細胞移入於15ml容量的Falcon管，離心而回收細胞，以PBS(-)清洗2次後，以下列的各溶液再度，實施馴化清洗1次。
Saline：生理食鹽水
Medium：含10%FBS的α MEM
ET-K：ET-Kyoto(大塚製藥工場)
Saviosol：Saviosol(商品名)(大塚製藥工場)
HES70K：6(w/v)%羥乙基澱粉(重量平均分子量70000)+0.9(w/v)% NaCl(德國，布朗公司)
HES200K：6(w/v)%羥乙基澱粉(重量平均分子量200000)+0.9(w/v)% NaCl(德國，費森尤斯卡比公司)
ET-K+Saviosol：ET-K與Saviosol的混合液(容積比1：1)
之後，用各溶液懸濁成為2.5x105cells/50μl的細胞濃度。
將懸濁液在各溫度(0、25、37℃)靜置，在30至360分鐘後以20μl微量吸取器(pipetman)吸吐數次，將10μl移到培養皿上。
將顯微鏡對焦於培養皿上的懸濁液的最下面而觀察。
在顯微鏡下互相鄰接而形成細胞塊時做為細胞凝集塊。細胞凝集塊是將培養皿在顯微鏡的置物檯上搖動，確認有明顯成塊而動。
(細胞生存率)
將試驗開始30至360分鐘後的細胞生存率示於第3 圖及第4圖。如這些圖所示，使用任一種組成物，細胞的生存率都比使用生理食鹽水時顯著較高。抑制細胞生存率降低的效果是HES70K比HES200K較高。
(細胞的凝集)
試驗開始起至360分鐘後以顯微鏡觀察細胞的凝集性。結果示於第7表。
與在培養基中保存時比較，在其他條件下，細胞凝集塊的形成受到抑制。抑制細胞凝集的效果是HES70K比HES200K較高。ET-K、Saviosol、HES70K及ET+Saviosol時，沒有看到細胞凝集的形成，細胞的分散被維持良好。
[實施例11]
將由人分離精製的源自骨髓的間葉系幹細胞(繼代次數第8次)與源自脂肪組織的間葉系幹細胞(繼代次數第8次)的各細胞，培養至將Nunc公司製的細胞皿底面覆蓋約90%為止。以TaKaRa公司製的PBS(-)將培養皿清洗3次，以GIBCO公司製的胰蛋白酶溶液將各間葉系幹細胞由培養 皿剝離，以ASSIST公司製的15ml離心管回收細胞。以1000rpm、5分鐘的離心操作，在離心管底形成細胞塊，以吸引器丟棄上澄液。以指彈擊使細胞塊解散，加TaKaRa公司製的PBS(-)，以數次的吸管吸吐操作將細胞更加解散，以1000rpm離心5分鐘。確認在離心管底有細胞塊的形成，以吸引器丟棄上澄液。將以PBS(-)的清洗操作再重複2次。以血球計算盤測定細胞數，在ASSIST公司製的1.5ml離心管中以1.0x106個/管的條件移入細胞。以1000rpm離心5分鐘，在離心管底形成細胞塊，以吸引器丟棄上澄液。在各管中將
(1)生理食鹽水(大塚製藥工場公司製)1ml
(2)Saviosol(大塚製藥工場公司製)500μl與聚葡萄糖L注(大塚製藥工場公司製)500μl的混合液(聚葡萄糖40 6.5(w/v)%)
(3)Saviosol(大塚製藥工場公司製)250μl與聚葡萄糖L注(大塚製藥工場公司製)750μl的混合液(聚葡萄糖40 8.25(w/v)%)
(4)聚葡萄糖L注(大塚製藥工場公司製)(聚葡萄糖40 10(w/v)%)1ml計4種類的液分別加入，以漩渦混合機混合數秒鐘。以TERUMO製的30G注射針與1ml注射筒，進行細胞的單一細胞化操作，在室溫(約25℃)使用試管架靜置。在靜置30分鐘後及60分鐘後，由各管吸取10μl的液，與GIBCO製的錐蟲籃(trypan blue)液等量混合的液，以血球計算盤 測定細胞數及生存率。評估用的液是，由各管的液面中心(上)、液中的中心(中)及管底中心(下)的3處分別靜靜地吸取。將上、中、下的各細胞數的合計值做為100%，將各別的細胞數做為分子，合計細胞數做為分母而以比率算出細胞的分佈狀況。又，另外算出細胞全體的生存率。
結果示於第5圖及第6圖。含有聚葡萄糖的緩衝液(6.5至10(w/v)%)中保存間葉系幹細胞時，與間葉系幹細胞的來源無關地，在管的上、中、下的細胞數沒有大差異，顯示維持細胞的均勻分散。又這時，細胞的生存率是100%而沒有改變。另一方面，使用生理食鹽水時，細胞沉到管底，60分鐘保存後的細胞的生存率降低至80%。
[產業上利用的可能性]
使用本發明，則在幹細胞的移植時，可抑制懸濁液中的幹細胞互相間的凝集。因此，幹細胞的凝集物在小管(Kanüle)中阻塞，或肺靜脈等的細血管中形成栓塞的危險性降低。
再者，使用本發明，則可抑制懸濁液中的幹細胞生存率的降低。因此，可以用良好狀態的幹細胞實施治療，所以可期待治療效果的提高。
因此，本發明在利用幹細胞的移植醫療領域有用。
本申請案是在日本申請的特願2010--251273(申請日：2010年11月9日)及特願2010-293908(申請日：2010年12月28日)為基礎，將其內容全部包含在本說明書內。
第1圖顯示於各組成液中在25℃靜置1小時後的hBM-MSC P6的形態及生存率。
第2圖顯示於各組成液中在25℃靜置1小時後的hAT-MSC P8的形態及生存率。
第3圖顯示於各組成液中在25℃靜置後的生存率。6根長條分別表示由左起Saline、Medium、ET-K、Saviosol、HES70K及HES200K。
第4圖顯示於各組成液中在25℃靜置後的生存率。5根長條分別表示由左起Saline、Medium、ET-K、Saviosol、ET-K+Saviosol。
第5圖顯示於含聚葡萄糖40的緩衝液(6.5至10(w/v)%)或生理食鹽水中保存源自人骨髓的間葉系幹細胞時，在管的上、中、下層的各細胞數。圖中央的數值表示細胞全體生存率。
第6圖顯示於含聚葡萄糖40的緩衝液(6.5至10(w/v)%)或生理食鹽水中保存源自人脂肪組織的間葉系幹細胞時，在管的上、中、下層的各細胞數。圖中央的數值表示細胞全體生存率。

Claims (7)

  1. 一種由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成之群中選擇的至少1種多糖類的用途，其係用於製造使用於哺乳動物幹細胞懸濁液之哺乳動物幹細胞凝集抑制劑，前述哺乳動物幹細胞凝集抑制劑不含人類血清白蛋白，該用途係前述多糖類為海藻糖時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的海藻糖的濃度成為在4.53至362.4mg/ml的範圍內的方式使用，前述多糖類為羥乙基澱粉時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的羥乙基澱粉的濃度成為在1至500mg/ml的範圍內的方式使用，前述多糖類為聚葡萄糖時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的聚葡萄糖的濃度成為在30至100mg/ml的範圍內的方式使用。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中幹細胞為附著性幹細胞。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的用途，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
  4. 一種哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，係含有將該哺乳動物幹細胞懸濁於含有由海藻糖、羥乙基澱粉及聚葡萄糖所成的群中選擇的至少1種多糖類且不含人類血清白蛋白的生理性水溶液，該抑制方法係前述多糖類為海藻糖時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的海藻糖的濃度成為在4.53至362.4mg/ml的範圍內的方式使用，前述多糖類為羥乙基澱粉時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的羥乙基澱粉的濃度成為在1至500mg/ml的範圍內的方式使 用，前述多糖類為聚葡萄糖時，哺乳動物幹細胞懸濁液中的聚葡萄糖的濃度成為在30至100mg/ml的範圍內的方式使用。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中幹細胞為附著性幹細胞。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中附著性幹細胞為間葉系幹細胞或多能性幹細胞。
  7. 如申請專利範圍第4項所述的哺乳動物幹細胞凝集的抑制方法，其中哺乳動物幹細胞包含呈單一細胞狀態的哺乳動物幹細胞。
TW100140841A 2010-11-09 2011-11-09 幹細胞懸濁液 TWI547561B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010251273 2010-11-09
JP2010293908A JP5341059B2 (ja) 2010-11-09 2010-12-28 幹細胞懸濁液

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201226568A TW201226568A (en) 2012-07-01
TWI547561B true TWI547561B (zh) 2016-09-01

Family

ID=46051010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100140841A TWI547561B (zh) 2010-11-09 2011-11-09 幹細胞懸濁液

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10087421B2 (zh)
EP (1) EP2639296B1 (zh)
JP (1) JP5341059B2 (zh)
KR (1) KR101868653B1 (zh)
CN (1) CN103298926B (zh)
AU (1) AU2011327239B2 (zh)
CA (1) CA2817172C (zh)
CY (1) CY1117419T1 (zh)
DK (1) DK2639296T3 (zh)
ES (1) ES2568731T3 (zh)
NZ (1) NZ610556A (zh)
SG (1) SG190169A1 (zh)
SI (1) SI2639296T1 (zh)
TW (1) TWI547561B (zh)
WO (1) WO2012063870A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5432322B2 (ja) * 2012-05-08 2014-03-05 株式会社大塚製薬工場 トレハロース含有肺塞栓形成予防用哺乳動物細胞懸濁液
JP5196618B1 (ja) * 2012-09-28 2013-05-15 株式会社大塚製薬工場 トレハロース含有細胞洗浄溶液を用いた接着細胞の洗浄方法
JP5276230B1 (ja) * 2013-01-10 2013-08-28 株式会社大塚製薬工場 トレハロース含有細胞洗浄溶液を用いた接着細胞のインビトロ継代方法
SG10201710158QA (en) 2013-06-28 2018-01-30 Otsuka Pharma Factory Inc Trehalose- and dextran-containing solution for transplanting mammalian cells
EP3569699A1 (en) 2013-09-04 2019-11-20 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Method for preparing pluripotent stem cells
JP6615753B2 (ja) * 2013-10-04 2019-12-04 レジニアス リミテッド 細胞療法のためのバイオマーカー
WO2016069173A2 (en) * 2014-09-29 2016-05-06 Cook General Biotechnology Llc Uses of trehalose in cell suspensions
US20160324898A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Stemedica International, Sa Compositions and methods for the treatment of alzheimer's disease
CN105267952B (zh) * 2015-09-01 2018-05-18 河南卓丰生物科技有限公司 一种用于保护干细胞治疗的药物及其制备方法
AU2017241626B2 (en) * 2016-03-28 2022-03-31 Gallant Pet, Inc. Viable cell compositions, and methods related to same
CZ306800B6 (cs) * 2016-05-13 2017-07-12 Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. Prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk
CZ307325B6 (cs) * 2016-10-14 2018-06-06 Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. Prostředek obsahující kmenové buňky k léčení posttraumatických zánětlivých reakcí a způsob jeho výroby
CN107034184A (zh) * 2017-05-04 2017-08-11 济南赛尔生物科技股份有限公司 一种用于原代培养脐带间充质干细胞的试剂盒
CN107156108A (zh) * 2017-05-27 2017-09-15 魏方萌 一种外周血干细胞保存液及制备方法
WO2018225673A1 (ja) * 2017-06-06 2018-12-13 Ｄｓファーマアニマルヘルス株式会社 細胞凝集低減方法および細胞凝集が低減された治療用組成物
CN107912420A (zh) * 2017-10-27 2018-04-17 北京协科医药科技有限公司 一种细胞保存方法、保存液及保存液制备方法
US20210345602A1 (en) 2018-09-28 2021-11-11 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc Mammal cell preserving solution containing acarbose or stachyose
TW202102664A (zh) 2019-03-15 2021-01-16 日商美加細胞股份有限公司 哺乳動物細胞之保存液
US20220192178A1 (en) 2019-04-26 2022-06-23 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Trehalose-containing liquid for mammalian cell preservation
JP7079045B2 (ja) * 2020-01-17 2022-06-01 株式会社大塚製薬工場 トレハロースを含む血球系細胞保存用液
WO2021193606A1 (ja) * 2020-03-27 2021-09-30 株式会社大塚製薬工場 アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液
CN114574426A (zh) * 2022-01-25 2022-06-03 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鸭小肠隐窝干细胞分离鉴定和3d类器官培养的方法
CN115039762B (zh) * 2022-06-17 2023-04-11 广州沙艾生物科技有限公司 一种胎盘干细胞储存液及储存方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009115581A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Cryo-Save Ag Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells
US20100047213A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Andy Zeitlin Cell composition and methods of making the same
WO2010057107A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Genentech, Inc. Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004681B1 (en) * 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
JP3253131B2 (ja) 1992-07-24 2002-02-04 洋巳 和田 移植臓器用溶液
CN1188171C (zh) * 1994-06-02 2005-02-09 廓德伦特控股剑桥有限公司 防止各种特质在再水化或熔化时聚集的方法以及由此获得的组合物
AU4330597A (en) * 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
JPH114682A (ja) * 1997-06-16 1999-01-12 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞保存方法、有核細胞保存用組成物及び有核細胞分離方法
US20050048460A1 (en) * 2003-05-29 2005-03-03 The Regents Of The University Of California Preservative and method for preserving cells
US20060257842A1 (en) * 2003-05-29 2006-11-16 Pettegrew Jay W Cryopreservation media and molecules
US20060009469A1 (en) * 2004-05-28 2006-01-12 Leonore Witchey-Lakshmanan Particulate-stabilized injectable pharmacutical compositions of posaconazole
US7880925B2 (en) 2005-08-02 2011-02-01 Kabushiki Kaisha Toshiba Apparatus and method for generating an image file with a color layer and a monochrome layer
CA2625628C (en) 2005-10-13 2012-04-24 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Solution for preserving liver
AU2006332680A1 (en) 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition
JP2009296889A (ja) * 2008-06-10 2009-12-24 Foundation For Biomedical Research & Innovation 造血幹細胞の培養方法
US20100035327A1 (en) * 2008-08-11 2010-02-11 Ann Marie Steele Use of rice-derived products in a universal cell culture medium
US20110208162A1 (en) * 2008-10-24 2011-08-25 Indiana University Rsearch and Technology Corporation Methods for preventing aggregation of adipose stromal cells
JP6027300B2 (ja) * 2009-03-19 2016-11-16 国立大学法人岩手大学 細胞または臓器の保存液および保存方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009115581A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Cryo-Save Ag Improved cryopreservation of adipose tissue for the isolation of mesenchymal stem cells
US20100047213A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Andy Zeitlin Cell composition and methods of making the same
WO2010057107A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Genentech, Inc. Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions

Also Published As

Publication number Publication date
US20130260461A1 (en) 2013-10-03
EP2639296B1 (en) 2016-02-03
EP2639296A1 (en) 2013-09-18
AU2011327239A1 (en) 2013-06-20
NZ610556A (en) 2015-03-27
ES2568731T3 (es) 2016-05-04
CA2817172C (en) 2021-05-18
KR20130129382A (ko) 2013-11-28
SI2639296T1 (sl) 2016-09-30
EP2639296A4 (en) 2014-04-30
DK2639296T3 (en) 2016-04-25
JP5341059B2 (ja) 2013-11-13
JP2012115253A (ja) 2012-06-21
WO2012063870A1 (ja) 2012-05-18
CN103298926B (zh) 2017-11-03
US10087421B2 (en) 2018-10-02
AU2011327239B2 (en) 2016-11-17
SG190169A1 (en) 2013-06-28
CA2817172A1 (en) 2012-05-18
CY1117419T1 (el) 2017-04-26
AU2011327239A8 (en) 2013-07-04
CN103298926A (zh) 2013-09-11
KR101868653B1 (ko) 2018-06-18
TW201226568A (en) 2012-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI547561B (zh) 幹細胞懸濁液
KR102193132B1 (ko) 트레할로스 및 덱스트란 함유 포유동물 세포 이식용 용액
JP6512759B2 (ja) 羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤
KR20130092394A (ko) 태반 줄기 세포를 사용한 사르코이드증의 치료
EP3556849A1 (en) Mammalian cell cryopreservation liquid
TWI577379B (zh) 含有海藻糖之預防肺栓塞用哺乳動物細胞懸浮液
JP5753874B2 (ja) 細胞生存率低下抑制剤
WO2013168402A1 (ja) デキストラン含有肺塞栓形成予防用哺乳動物細胞懸濁液
JP6830294B1 (ja) トレハロースを含む哺乳動物細胞保存用液
TW201418464A (zh) 使用了含有海藻糖之細胞洗淨溶液的接著細胞之洗淨方法
JP2019080580A (ja) 羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤
WO2021193606A1 (ja) アカルボース及びデキストランを含む哺乳動物細胞保存用液