CN110072542A

CN110072542A - 在肿瘤的诊断和治疗中的fsh激素受体的配体

Info

Publication number: CN110072542A
Application number: CN201780076373.9A
Authority: CN
Inventors: 安德里亚·卡尔皮; 法比奥·马塞特; 伦佐·达尔·蒙特
Original assignee: Enkoglin Medical Co Ltd
Current assignee: Enkoglin Medical Co Ltd
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2019-07-30
Also published as: WO2018069831A3; RU2019113739A3; JP2020501599A; JP7226803B2; IL265889A; KR20190065331A; CA3039762A1; EP3525810A2; RU2755000C2; KR102636093B1; RU2019113739A; WO2018069831A2

Abstract

本发明涉及用于在肿瘤的诊断和治疗中使用的促卵泡激素(FSH)受体的配体。

Description

在肿瘤的诊断和治疗中的FSH激素受体的配体

技术领域

本发明应用于医学领域，特别是在肿瘤的诊断和治疗中。

背景技术

促卵泡激素(FSH)是属于糖蛋白激素(GPH)类的一种糖蛋白，其包括特征为高度结构相似性的蛋白质，如促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。

FSH在垂体前叶合成，并且作为促性腺激素释放激素(GnRH)刺激的结果而释放到血流中。

FSH在生殖生理中发挥关键作用，包括诱导女性卵泡成熟，而在男性中刺激塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)促进精子发生(Simoni et al.1997)。

重组FSH类制剂，如和或从尿液中提取的制剂，如在临床实践中常规用于治疗女性和男性的不育症以及辅助生殖方案(DeBarross et al.2013)。

FSH是由两个非共价结合的α亚基和β亚基组成的异源二聚体。

α亚基是所有GPH共有的，而β亚基随不同的糖蛋白激素而变化，并限定了其特殊的生物活性。

人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)(Uni Prot编号：P01225)的分子量约为12.5kDa，并由111个氨基酸残基组成，其中的12个半胱氨酸残基参与形成6个二硫键。在天门冬酰胺第7残基和天门冬酰胺第24残基的水平处存在两个N-糖基化位点。

FSH激素的生物活性依赖于α链的天冬酰胺52残基的糖基化状态，其在诱导生物反应中起重要作用。

此外，FSHβ水平的糖基化模式影响激素与特异性受体的结合能力。

低糖基化(hypoglycosylated)形式在体外对受体具有更大的亲和力，但在体内半衰期较短，而在以完全糖基化为特征的同种型中观察到相反的现象(Ulloa-Aguirre etal.2011)。

在血流中释放的FSH能够通过微循环到达机体的任何区域。FSH通过结合并激活特异性受体(FSH受体，FSHR)来发挥其生理作用。

在生理条件下，该受体仅在男性睾丸的塞尔托利氏细胞中表达，以及仅在女性粒层卵巢细胞中表达。

该FSH受体属于G蛋白偶联受体家族，配体受体复合物的形成引发一系列级联信号，但这些信号的代谢重要性尚不完全清楚。

研究最多的生理效应是腺苷酸环化酶的激活，该酶可转化第二信使环磷酸腺苷(cAMP)中的单磷酸腺苷(AMP)，以增加其胞质浓度。

环磷酸腺苷(cAMP)是蛋白激酶A(PKA)的强激活剂，PKA是一种调节细胞生命所必需的不同过程的关键酶。

例如，在塞尔托利氏细胞中，FSHR的激活导致芳香化酶(一种将睾酮转化为17β-雌二醇的酶)表达增加，并刺激与其相关的代谢过程(Ulloa-Aguirre et al.1998)。

早在1999-2000年，科学界就开始强调FSHR在前列腺癌中、但最重要的是在卵巢癌中的异常表达(Ben-Josef et al.1999，Zheng et al.2000)。

在以后的几年中，这方面的证据得到显著地增加，仅在2010年，Radu及其同事(Radu et al.2010)证明FSHR在许多实体瘤的微循环内皮组织水平上以异常的方式表达。

随后，在卵巢肿瘤中，FSHR的过表达与疾病的严重程度相关的证据得到了巩固；还得到了若干证据，这些证据证实了Radu的工作(Radu et al.2010)，并证明FSHR在不同类型的原发性或转移性实体瘤中以高水平表达(Pawlikowski et al.2015；Planeix etal.2015；Siraj et al.2013；Sardella et al.2012；Siraj et al.2010)。

正在开发的FSHR配体

目前，针对FSHR特异性配体的研究遵循两种主要方法学：i)合成肽的开发，ii)单克隆抗体的开发。

这两种策略都有明显的缺陷，如在多肽的情况下特异性有限，或在抗体的情况下固有的不稳定性。

目前已知的对FSHR结合特异性最高的分子是FSH，在血液中生理上以纳摩尔(nM)浓度存在。

因此，有必要确定新的和有效的替代现有的FSH受体的方法，使其能够特异性地到达、诊断和治疗FSH受体相关的癌症。

Luo S.et al.的现有技术文献(European Journal of nuclear medicine andmolecular imaging,vol.40,no.2,16October 2013)描述了用于前列腺癌诊断的FSHβ亚基肽。该文献没有描述在成神经细胞瘤中的应用。

Zhang Xiaoyan et al.发表的文章(International Journal ofPharmaceutics,vol.453,no.2,2013)描述了FSHβ亚基肽与紫杉醇的缀合治疗癌症。

欧洲专利申请EP 2,090,322A1(Inst.Nat.Rech.Med.)描述了用于FSH所表示肿瘤的成像和治疗的FSHR配体。众所周知，FSH由两个亚基(α和β)组成。

欧洲专利申请EP 2,924,049A1描述了嵌合促性腺激素在促激素相关疾病治疗中的应用。

国际专利申请WO 2014/078533A1描述了融合构建体，该融合构建体包括FSHβ亚基或与结石结构域(lithic domain)结合FSHβ亚基的片段。其没有显示在治疗成神经细胞瘤方面的任何证据。

国际专利申请WO 2016/054153A1描述了包含FSH或FSHβ亚基的片段的基因构建体。

Zhang et al.发表的文章(Cancer Research,vol.69,no.16,15August 2009)描述了紫杉醇与FSHβ亚基片段的缀合治疗癌症。

发明内容

本发明基于令人惊讶的发现，人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)能够以高亲和力与FSHR结合。

特别是发现人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)能使FSHR失活。

此外，本专利申请的发明人发现，使用重组DNA技术获得的FSHβ亚基的形式还可以进行高度稳定形式的生产。

这些形式显示以高亲和力与FSHR结合，从而具有特殊和惊人的优点。

发明目的

本发明的第一个目的是通过该人促卵泡激素β(FSHβ)亚基的医学应用来表示。

根据特定的方面，该人促卵泡激素β(FSHβ)亚基在肿瘤的治疗和/或诊断的医学应用中的应用。

在其第二目的中，本发明描述了用于制备重组形式的人促卵泡激素β亚基(ABRβ)的生物技术平台。

利用该平台获得的人促卵泡激素β亚基(ABRβ)是本发明的又一目的。

这些亚基的医学应用，特别是治疗和/或诊断癌症的医学应用，是本发明的又一目的。

根据另一个方面，描述了给予FSHβ亚基和ABRβ亚基的药物制剂。

在这样的制剂中，所述FSHβ亚基和ABRβ亚基可以与具有治疗或诊断活性的分子缀合。

用于获得所述重组形式的构建体和载体的核苷酸序列分别代表本发明的又一方面，正如所述的新氨基酸序列。

在其另一目的中，本发明描述了治疗和/或诊断癌症的方法，该方法包括使用FSHβ亚基或ABRβ亚基。

在本发明的又一目的中，描述了FSHβ亚基或ABRβ亚基在FSH(FSHR)受体失活中的应用。

根据本发明的又一方面，在此描述了制备人促卵泡激素(ABRβ或ABRβ1)受体的配体的方法，该方法包括制备重组人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)，该重组人促卵泡激素具有通过引入KDEL序列表示的C末端区域的修饰。

在特定方面，这种方法还可以包括通过引入His标签所表示的位于人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的序列的N末端的修饰。

因此，位于人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的序列的C末端的KDEL序列和可能地使用位于人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的序列的N末端的His标签用于制备人促卵泡激素(FSHβ)受体的配体的应用也表示了本发明的又一目的。

附图说明

图1示出双元载体pABR的结构：RB/LB，特异性重组位点，左边缘和右边缘；Tml_p，肿瘤形态学膨大基因(tumor morphology large)DNA的启动子；NPT II，新霉素磷酸转移酶II；Tml_t，肿瘤形态学膨大基因DNA的终止子；CaMV35x2_p，花椰菜花叶病毒的启动子；TEV5’，非翻译的TEV序列；Nos_t，nopalyne合成酶的终止子；

图2示出纯化的ABRβ1的电泳分析结果；

图3示出纯化的ABRβ1去糖基化后的SDS-PAGE分析；

图4示出纯化的ABRβ1的质谱(25kDa处的条带)；

图5示出HPLC中通过尺寸排阻色谱对配体ABRβ1聚集状态的分析结果；

图6示出通过荧光技术的配体ABRβ1的稳定性分析结果；

图7示出通过测量塞尔托利氏细胞中雌二醇(E2)的生成的ABRβ1对FSHR激活的影响的分析结果，数据表示为平均值±SD(n＝3)。CTR：未处理细胞；Gonal F：市售药物处理的细胞；ABRβ1：用纯化的配体ABRβ1处理的细胞；T：补充睾酮的细胞；

图8示出癌细胞中用NBD标记的ABRβ1与FSHR结合的分析结果；

图9示出用人FSHR转化的HeLa细胞中Gonal F(图A和图B)和ABRβ1(图C和图D)内化的分析结果，仅用FITC二级抗体孵育的细胞(图A和图C)；

图10示出Gonal F诱导的并由配体ABRβ1中和的cAMP生产的结果；

图11示出配体ABRβ1对癌细胞生长的影响；

图12示出Alexa Fluor 647标记的配体ABRβ1对癌细胞生长的影响；

图13示出用流式细胞技术进行的癌细胞中配体ABRβ1内化的分析结果；

图14示出配体ABRβ1的位置及其在癌细胞的溶酶体隔室中的定位；

图15示出通过免疫流式细胞技术在一系列人类癌细胞中对FSHR进行表达分析的结果；

图16示出通过查询ArrayExpress(EMBL)数据库获得的FSHR基因表达数据分析输出的箱式图示例。分析的数据集包括504个人类婴儿成神经细胞瘤样本；

图17示出NB3细胞中NBD标记的ABRβ1与FSHR结合的分析结果；

图18示出NB3细胞中NBD标记的ABRβ1内化的分析结果(高于96％处理细胞的级分示出出现定位在胞质囊泡中的信号)(图B)(n＝3)，未处理细胞(图A))；

图19示出通过质谱分析经过胰蛋白酶消化的配体ABRβ1的去糖基化形式的氨基酸序列覆盖率(CAM：脲基-半胱氨酸甲酯；(1)：没有裂解；MSO：蛋氨酸亚砜)；

图20示出通过免疫流式细胞技术在人成神经细胞瘤中对FSHR进行表达分析的结果；

图21示出小鼠模型中尾静脉注射ABRβ1的效应(随时间的变化)。

具体实施方式

定义

在本发明的说明书中，如果没有特别说明，术语应理解为具有下述含义。

“FSHR”是指人促卵泡激素(FSH)受体；这种激素包括α和β两个亚基。

“FSHβ”是指人促卵泡激素(FSH)的单个β亚基；这一亚基的特征是对应于SEQ.ID.no.1的序列。

“ABRβ”是指根据本发明使用生物技术平台获得的人促卵泡激素(FSH)的β亚基。

“ABRβ1”是指根据本发明利用在烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)植物细胞中生产的生物技术平台获得的人促卵泡激素(FSH)的特异性β亚基；这一亚基的特征是对应于SEQ.ID.no.2的序列。

通常，FSHβ、ABRβ和ABRβ1亚基可称为FSHR受体的“配体”，因为它们能够与受体本身结合。

根据本发明的第一目的，描述了人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的医学应用。

特别地，本发明描述了人促卵泡激素β亚基(FSHβ)在癌症的治疗和/或诊断中的应用。

术语癌症是指肿瘤和癌症，即由不受控制的细胞增殖引起的异常生长为特征的组织。

在优选的方面，这样的肿瘤或癌症是原发性或转移性实体瘤。

具体而言，包括前列腺(特别是前列腺腺癌)、乳腺、结肠、胰腺、肾、肺、肝、睾丸、卵巢、脑和甲状腺肿瘤和癌症；也包括肉瘤。

根据本发明的一个方面，这种医学应用可以应用于婴儿成神经细胞瘤的治疗。

特别是，这种医学应用用于儿科患者，并且优选是在6岁以下的患者中。

为了本发明的目的，FSHβ亚基用于癌症治疗以及或与抗癌药联用。

在与FSHR缀合中，FSHβ亚基可以以不与任何药物缀合的形式作为FSH竞争剂，并从而能够阻断受体的活性。

至于可以使用并与β亚基缀合的抗癌药物，它们可以属于：

-细胞毒性剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：嘧啶拮抗剂如卡培他滨，酶抑制剂如喜树碱家族，例如伊立替康；

-烷基化剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：金属盐家族如顺铂，DNA嵌入剂如多柔比星，蒽环类化合物家族；

-蛋白合成调节剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：蛋白酶体抑制剂家族如硼替佐米，mTOR抑制剂家族如替西罗莫司；

-有丝分裂抑制剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：安丝菌素家族如美登素，微管聚合抑制剂家族如澳瑞他汀E(auristatin E)；

-β放射性同位素类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：¹³¹I、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr和90Y。

根据本发明的一个方面，FSHβ亚基用于肿瘤的诊断。

特别地，肿瘤就是上面提及的肿瘤和癌症。

因此，一旦经过适当的缀合，FSHβ亚基允许肿瘤学诊断成像中的检测。

用于此目的的技术包括，例如：正电子发射断层扫描(PET)、核磁共振(NMR)、单光子发射断层扫描(SPECT)和超声；因此，FSHβ亚基可与适合使用以下技术进行诊断的分子适当缀合，如正电子发射断层扫描(PET)、核磁共振(NMR)、单光子发射断层扫描(SPECT)和超声。

出于这一目的，术语诊断也是指在治疗期间检查肿瘤随时间进展和/或进展或消退的能力。

出于本发明的目的，诊断还意味着使用FSHβ亚基进行实验室目的的体外分析。

根据第一个方面，FSHβ亚基可与荧光分子适当缀合，荧光分子如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5)。

在核医学领域，FSHβ亚基可与放射性分子缀合，如：¹²³I、¹¹¹In、¹⁸⁸Re、¹⁸F、³⁵S、⁹⁹Tc。

在特定方面，FSHβ亚基也可能与性质不同的纳米颗粒缀合。

与纳米颗粒的缀合可以通过合适的接头。

纳米颗粒

在医学上用作载体的纳米颗粒(例如用于药物、放射性同位素、荧光分子或酶)通常具有1nm和1μm之间的尺寸。

纳米颗粒可以具有光滑或不平坦的表面，可以是由小管交叉或由透镜状结构组成的实心、空心。

纳米颗粒是由无机或有机材料制成的颗粒；无机类材料可以由Au、Ag、Si、Se、Cd或碳化合物(如石墨烯)组成，而有机来源的材料例如可以由糖或脂质的聚合物(胶束、脂质体)或分子(如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA))组成。

纳米颗粒的目的是将其中含有的大量分子传递到参考位点。

出于本发明的目的，术语“缀合”是指FSHβ亚基或ABRβ亚基，或者更具体地说ABRβ1亚基，与具有诊断或治疗活性的分子适当连接。

特别地，该键可以由通过合适的接头来引导或获得的共价化学键，或配位键来表示。

至于FSHβ亚基的来源，这可以通过人尿液的纯化或使用重组DNA技术获得；它也可以是市售产品，如Metrodin (Serono)、(Merk Sharp&Dohme)。

根据本发明的另一个方面，FSHβ亚基，处于与具有治疗活性分子的缀合形式或非缀合形式，用于与治疗剂联合治疗肿瘤的方法(联合治疗，combo therapy)。

FSHβ亚基与治疗剂的组合能够提供协同效应。

此治疗剂可以选自用于治疗癌症特异性形式的分子。

在第二目的中，本发明描述了从植物细胞、更具体地从烟草本塞姆氏(Nicotianabenthamiana)制备人促卵泡激素的β亚基(ABRβ1)的生物技术平台。

更普遍地，生物技术平台使用一种方法，其中FSHβ亚基的氨基酸序列被适当地修饰，以便插入植物细胞特征的信号肽以引导至内质网。

因此，本发明使用KDEL序列来修饰人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的C末端区域，具体是为了将蛋白保持在内质网中。

因此，由此产生的蛋白经历了一个独特的糖基化过程，这让指导蛋白折叠的过程出乎意料地保持不变。

特别地，本发明的ABRβ1配体被糖基化在成熟蛋白的天冬酰胺第13和30残基上。

更具体而言，糖基化位点包括甘露糖残基的分支结构。

甘露糖残基的总数约为45至75，优选约为50至70，更优选约为58至62，其中甘露糖残基的总数可以为60或61。

每个糖基化位点包括两个N-乙酰氨基葡萄糖残基和甘露糖残基的分支结构。

特别地，每个分支结构包括29、30或31个甘露糖残基。

每个甘露糖残基可以包括磷酸化、磺酰化或甲基化。

此外，多糖部分可以结合到包括酚基的分子上。

包括酚基的分子是植物细胞的特征。

特别地，此类酚基是烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)的植物细胞的典型特征。

在特定方面，本发明的目的是使用本文所描述的方法获得的FSHβ亚基(ABRβ1)。

特别地，此种方法包括对人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)在C末端用KDEL序列的修饰和在N末端用6个His标签的修饰。

因此，本发明所描述的平台在人促卵泡激素β亚基(FSHβ)的序列的C末端使用KDEL序列并且可能在N的末端还使用His标签用于制备人促卵泡激素受体(FHSR)的配体。

因此，根据优选的方面，本发明描述了一种用于制备促卵泡激素(FSH)的β亚基的重组形式的方法，包括以下步骤：

I)获得由质粒转化的合适载体，该质粒含有对应于SEQ.ID.no.3的序列；

II)使用步骤I)的载体转化烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)细胞；

III)筛选已转化的烟草本塞姆氏细胞；

IV)使稳定的烟草本塞姆氏细胞生长；

V)制备细胞提取物；

VI)纯化FSHR受体配体。

在优选的方面，步骤I)的载体是由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)所代表的。

特别地，在步骤II)中，在约25℃和持续搅拌的黑暗中共培养进行转化持续48小时。

此后，选择细胞。

优选地，在步骤III)中，使用的筛选培养基包括：补充有0.9％w/v琼脂和抗生素的MS。

在优选的方面，以下各项用于这一目的：羧苄青霉素和卡那霉素，最好是250mg/L的羧苄青霉素和100mg/L的卡那霉素。

在本发明的优选的方面，步骤V)中，将烟草本塞姆氏细胞悬浮培养。

在另一优选的方面，培养物提供了等于最终培养体积的10％的烟草本塞姆氏细胞的初始接种。

细胞培养物在补充有蔗糖、萘乙酸(NAA)和激动素的MS培养基(Murashige 1962)中于24至27℃和维持50至100mbar的通气下连续孵育15天。

此外，通过转移新鲜培养基中的一份细胞悬浮液，每7天制备一次传代培养物(sub-cultures)。

在搅拌、黑暗和25℃的恒温条件下孵育细胞。

根据本发明，步骤V)包括使用含有以下各项的提取缓冲液：50mM Na₂HPO₄、150mMNaCl、20mM柠檬酸、40mM抗坏血酸、5mM EDTA、1mM PMSF、0.05％(v/v)吐温-20，pH 6.5，添加1％(w/v)XAD-4和1％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。

随后，向提取物中加入硫酸铵，直至达到70％的饱和浓度，在4℃下持续搅拌孵育1小时。

然后通过离心回收沉淀，并在IMAC缓冲液中重新悬浮。

将制备液离心并过滤。

所得溶液在步骤VI)中通过柱上管道进行纯化。

特别地，将溶液上样至IMAC色谱柱。

优选地，使用Ni Sepharose 6FF柱。

随后，合并目标级分并上样至脱盐柱。

优选地，使用Sephadex G-25培养基柱。

随后，合并目标级分并上样至离子交换层析柱。

优选地，使用SP Sepharose HP柱。

纯化期间，监测在280和254nm处的吸光度。

如上所述，根据本文所描述的方法获得的人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)(ABRβ1)及其在肿瘤的治疗和/或诊断中的医学应用是本发明的又一目的。

特别地，本发明描述了ABRβ亚基在癌症的治疗和/或诊断中的应用。

在优选的方面，此类肿瘤或癌症是原发性或转移性实体瘤。

具体而言，包括前列腺、乳腺、结肠、胰腺、肾、肺、肝、睾丸、卵巢、大脑和甲状腺肿瘤和癌症；也包括肉瘤。

根据本发明的一个方面，此医学应用可以应用于婴儿成神经细胞瘤的治疗。

特别地，此医学应用用于儿科患者，最好是在6岁以下的患者。

如上所述，ABRβ1亚基是通过生物技术途径从烟草本塞姆氏植物细胞悬浮培养获得。

根据本发明的替代方面，可以通过生物技术途径在其他细胞中获得ABRβ亚基，如在哺乳动物、酵母、细菌细胞或其他植物细胞中。

特别地，在植物细胞中，可以使用胡萝卜(Daucus carota)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、玉米细胞等。

根据另一个方面，描述了给予FSHβ亚基和ABRβ亚基、更特别是ABRβ1亚基的药物制剂。

更具体地说，此类制剂可以包括FSHβ亚基或ABRβ亚基，或更具体地，ABRβ1亚基和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在本发明的优选的方面，此类亚基可以与具有治疗或诊断活性的合适分子缀合，如上所述参照FSHβ亚基。

根据本发明的另一个方面，ABRβ1亚基，处于与具有治疗活性的分子的缀合形式或非缀合形式，还用于与治疗剂联合治疗肿瘤的方法(联合治疗)。

ABRβ1亚基与治疗剂的联合能够提供协同效应。

此类治疗剂可以选自用于治疗癌症的特异性形式的分子的组。

因此，本发明提供了包含上述ABRβ1、FSHβ亚基或其他ABRβ亚基(通过应用于其他细胞的重组DNA技术可获得的)的诊断制剂和治疗制剂。

更具体地，此类制剂配制为静脉给予。

根据又一目的，本发明描述了治疗和/或诊断癌症的方法，该方法包括使用FSHβ、ABRβ1亚基或其他ABRβ亚基。

特别地，此方法包括向需要其的患者给予可能在适当药物制剂中配制的药物有效量的FSHβ或ABRβ或ABRβ1亚基的步骤。

出于本目地，患者意在是患有原发性或转移性实体瘤的受试者。

具体而言，包括前列腺(特别是前列腺腺癌)、乳腺、结肠、胰腺、肾、肺、肝、睾丸、卵巢、大脑和甲状腺肿瘤和癌症；也包括肉瘤。

根据特定方面，此方法可以应用于婴儿成神经细胞瘤的治疗。

诊断方法也是指在治疗期间检查肿瘤随时间进展和/或其进展或消退的能力。

换言之，参考用于在治疗性治疗期间检查肿瘤随时间进展和/或其进展或消退的方法，该方法包括在不同时间和后续时间(如时间t₀和时间t₁)确定受试者肿瘤范围的步骤，其中可以在所述时间(如t₀和t₁)之间进行肿瘤治疗步骤。

本发明提供了FSHR受体的体内灭活的方法，该方法包括给予药物活性量的FSHβ或ABRβ或ABRβ1亚基的步骤。

出于不同目的，可以在实验室中可替代地体外进行此方法。

根据本发明的另一方面，描述了FSHβ或ABRβ或ABRβ1亚基用于灭活FSHR受体的应用。

特别地，可以在体内或体外进行此灭活。

因此，在本专利申请中，描述了以下序列：

SEQ.ID.no.1	人FSHβ亚基的序列
		SEQ.ID.no.2	ABRβ1序列
SEQ.ID.no.3	ABRβ1编码序列

参考ABRβ1亚基的序列，所有与SEQ.ID.no.2具有相似性的序列，如不改变与FSHR受体的相互作用，意在包含在本发明的目的中。

特别地，“相似性”是指可以用不同的或结构上等同的氨基酸取代的占据相同位置的氨基酸的百分比，其中相似性等于100％是指两个序列相同。

相似性可以通过比对确定，特别是根据一个或多个已知算法或程序如CLUSTALW或BLAST进行比对。

在本发明的优选的方面，相似性的百分比仅涉及与FSHβ亚基序列相同的ABRβ1亚基序列。

在本发明的另一优选的方面中，相似性的百分比仅涉及ABRβ1序列部分的氨基酸，该ABRβ1序列不包括与受体相互作用的氨基酸。

涉及与受体相互作用的ABRβ1的氨基酸对应于FSHβ序列的第33-53氨基酸。

出于本发明的目的，相似性大于约90％，优选在约90至99.9％之间，并更优选在约95至97％之间。

实验部分

1.ABR配体的生产和纯化

如在以下涉及材料和方法的部分中所描述的，对人FSHβ的蛋白序列(UniProt：P01225)进行电脑模拟(in silico)修饰。编码新蛋白的基因序列，包括信号肽区域(ABRβ1配体)，被优化用于在植物中表达(SEQ.ID.no.3)。

然后将核苷酸序列插入双元载体pABR表达盒(图1)中，并且使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为植物细胞转化系统，获得并筛选出表达最高水平ABRβ1配体的烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)稳定克隆。

使用连续色谱，从悬浮培养的植物细胞中纯化ABRβ1配体。

2.ABRβ1配体的化学表征

使用SDS-PAGE电泳分析了优化和纯化工艺后获得的ABRβ1配体。

用人FSHβ特异性抗体和聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色或更灵敏的银染的免疫印迹分析显示，ABRβ1配体实现了达到95-98％的纯度水平。该分析表明存在FSHβ抗体的两种反应性物质。

图2示出纯化的ABRβ1的电泳分析结果。在SDS-PAGE中分析了0.1μg纯化的ABRβ1。MW分子量标记物；SS，银染；WB，使用人FSHβ特异性抗体的免疫印迹。银染检测到在25和37kDa处的形式与人FSHβ特异性抗体具有反应性。表观分子量为25kDa和37kDa的两种物质是不同蛋白糖基化模式的结果。用糖基化酶(肽N-糖苷酶F，PNGase F)处理样品可使两种高分子量物质消失成为表观分子量为14kDa的单一形式。

图3示出纯化的ABRβ1去糖基化后的SDS-PAGE分析结果。使0.1μg纯化的ABRβ1经受去糖基化的方案，并在SDS-PAGE和随后的银染中进行分析。在左侧，分子量标记物；1.纯化并且未经受去糖基化的ABRβ1配体；2.纯化并且经受去糖基化的ABRβ1配体。去糖基化后，25和37kDa处的糖基化形式消失，并观察到具有分子量为14kDa的非去糖基化形式的生成。

用不同的质谱技术分析所有的分子物质以确定准确的分子量和它们的氨基酸序列。糖基化物质分别被指定为24493.2Da和37654.57Da的分子量，去糖基化蛋白具有13783.6Da的分子量。

蛋白指纹图谱分析表明，ABRβ1配体的氨基酸序列与按照本专利申请中所描述进行修饰的成熟人FSHβ的氨基酸序列完全相同(图19)。

由于三级结构对与FSHR的有效连接至关重要，因此验证了ABRβ1配体二硫键的组装模式。通过ABRβ1配体部分蛋白水解获得的样品质谱分析可鉴别形成二硫键的半胱氨酸对。识别参与形成二硫键的半胱氨酸对示出与在成熟人FSHβ中观察到的模式相同的模式，这证实ABRβ1配体具有正确的蛋白折叠。

3.糖基化

ABRβ1配体在C末端具有KDEL氨基酸序列。考虑到两种糖基化蛋白形式和去糖基化蛋白形式的分子量，可以推导出蛋白中葡萄糖部分的质量。假设在同一蛋白中存在的两个天冬酰胺残基形成的糖基化模式相似，我们可以推断在24493Da蛋白中存在由N-乙酰葡萄糖胺和30个甘露糖残基组成的第一葡萄糖部分和由2个N-乙酰葡萄糖胺和31个甘露糖残基组成的第二葡萄糖部分。在37654蛋白形式中，存在由N-乙酰葡糖胺和70个甘露糖残基组成的葡萄糖部分和由2个N-乙酰葡糖胺和71个甘露糖残基组成的第二葡萄糖部分。

在ABRβ1配体生产和纯化工艺的第二步中，修改了细胞培养条件，以实现工艺优化和糖基化ABRβ1的单一和特殊形式的生产。由此获得的唯一形式的ABRβ1具有13783.6的去糖基化氨基酸序列的分子量。正如质谱分析(图4)所示，在对应于24493的糖基化形式的条带中，存在3种彼此不同的糖基化同种型，原因是存在1个或2个甘露糖磷酸残基。这种超糖基化排列完全出乎意料，并且与哺乳动物细胞中、特别是人类中的糖基化模式极为不同。

4.稳定性和聚集

为了验证ABRβ1配体的稳定性和聚集趋势，将纯化蛋白进行3次冷冻/融解循环、真空冷冻干燥或在20℃和37℃条件下孵育72小时。

使用HPLC中的尺寸排阻色谱(SEC)技术进行了聚集评估。

分析显示，纯化工艺结束时相对于ABRβ1配体中的总蛋白的聚集蛋白百分比小于4％。

图5示出HPLC中通过尺寸排阻色谱对配体ABRβ1的聚集状态的分析结果；ABRβ1配体示出仅存在一个主峰的色谱图，对应于可溶性形式。对峰下面积的分析显示，在分析的所有样品中，聚集均低于4％(n＝3，p≤0.05)。

通过荧光技术分析纯化的ABRβ1配体和在溶液中随时间的稳定性。取一份ABRβ1，解冻，定容至1600μl的最终体积(1μM浓度，具有20mM HEPES缓冲液，pH 7.4，0.15M NaCl，0.1％PEG-8000(w/v)。然后立即分析样品，并随后储存于4℃冰箱中。随时间推移，重新分析样品，测量并记录荧光发射光谱。如图6所示，ABRβ1的荧光光谱特征在首次分析后7天内未发生改变。

接受上述处理的纯化蛋白样品的聚集百分比无显著变化，这表明该条件下的蛋白具有良好的溶解性和稳定性。

5.ABRβ1配体对塞尔托利氏细胞中FSHR受体活化的影响

塞尔托利氏细胞是FSH和FSHR体外激活研究的首选模型。在这些细胞中，FSHR的激活诱导芳香化酶的表达增加，芳香化酶将睾酮转化为雌二醇。由此产生的雌二醇的增加代表了确定分子是否能够激活FSHR的重要参数。在这一模型中，与未处理细胞相比，Gonal-F诱导雌二醇生成增加约300％。令人惊讶的是，在相同的实验条件下，ABRβ1配体不会引起雌二醇生成的任何变化，从而证明完全不能激活FSHR。

图7示出通过测量塞尔托利氏细胞中雌二醇(E2)的生成的ABRβ1对FSHR激活影响的分析结果，数据表示为平均值±SD(n＝3)。CTR：未处理的细胞；Gonal F：市售药物处理的细胞；ABRβ1：用纯化的配体ABRβ1处理的细胞；T：补充睾酮的细胞；使用图中所示浓度的各种试剂。Gonal F结合FSHR，导致E2相对于Ctr增加约300％，ABRβ1配体不能激活FSHR，并且E2的生成为零(p≤0.0001)。睾酮处理揭示了不同条件下的最大潜在芳香化酶活性(实验对照)。

6.ABRβ1配体标记和与FSHR结合

为了验证ABRβ1配体能够特异性和有效结合FSHR的假设，有必要使用荧光探针使纯化的蛋白衍生化，该荧光探针允许在体外在细胞模型上进行配体-受体结合分析。

为此，采用了基于荧光显微镜和流式细胞术的技术。使用两种不同的荧光分子使ABRβ1配体衍生化：4-氯-7-硝基苯并呋喃(NBD)和Alexa Fluor 647。

选择人永生化细胞系(卵巢癌模型)OVCAR-3、OVCAR-5、CAOV-3作为表达FSHR的体外模型。用荧光ABRβ1配体短时间的孵育细胞显示均质并且显著的细胞膜装饰(decoration)，该装饰与孵育中使用的荧光蛋白浓度相关，并且在与共孵育时消失，从而证明ABRβ1配体与FSHR的结合特异性。

流式细胞仪分析显示，标记的细胞相对于总细胞的百分比所有情况下均大于96％。

在其他细胞系上也获得了相同的结果。如LS-180(人结肠癌模型)。

图8示出癌症细胞中NBD标记的ABRβ1与FSHR结合的分析结果。

使用标记的ABRβ1配体处理图中所示的癌细胞，然后在分析荧光信号之前用生理盐水清洗(FL；FITC通道)。使用流式细胞仪进行实验。分析表明，结合ABRβ1的细胞(浅灰色峰)占处理细胞总数的96％以上(深灰色峰)，(n＝3)。

7.ABRβ1的内化分析

通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析ABRβ1配体对FSHR受体内化动力学的影响。用允许人FSHR过表达的质粒转染接种在载玻片上的HeLa细胞(在完全DMEM培养基中培养)，接种后24小时，用0.1μg/ml的ABRβ1或NBD标记的ABRβ1处理细胞。

固定用标记有NBD的ABRβ1处理的细胞(如材料和方法章节所述)，并使用共聚焦显微镜在荧光显微镜下进行分析。固定用处理的或未标记的ABRβ1配体处理的细胞，并进行免疫细胞化学方案。在这种情况下，通过使用抗人FSHR的特异性抗体和允许在共聚焦荧光显微镜中揭示FSHR的二级抗体，突出示出FSHR的内化。如图9所示，在所有情况下均观察到荧光胞质囊泡的出现。用该质粒转化粘附在玻片上的HeLa细胞，以表达人FSHR。转染后24小时，细胞与Gonal F或ABRβ1配体(100ng/mL，15min)孵育，然后在盐水中清洗，进一步在37℃孵育30min，然后固定，并使用人FSHR特异性抗体和与FITC(通过共聚焦荧光检测)缀合的二级抗体进行免疫组化分析。分析表明，Gonal F(图A和图B)和ABRβ1配体(图C和图D)具有高的内化率，如由胞质囊泡中局部信号的出现所证明的。仅用二级FITC抗体孵育了细胞(图A和图C)。

使用的不同技术揭示并证实观察到的现象是由于特定配体诱导的FSHR内化。

8. 诱导的cAMP生成和ABRβ1诱导的中和作用的分析

为了验证ABRβ1配体与FSHR的结合特异性和有效性，在与的竞争性研究中评价了其对cAMP生成(受体结合和激活的结果)的影响。HEK293细胞与含有编码人FSHR基因的质粒和编码蛋白探针Epac1-camps的质粒(允许通过荧光显微镜测量camps的变化)共转染。的初步剂量-效应分析允许确定灵敏度、系统的动态响应范围和产生最大效应的浓度。竞争实验中测量cAMP变化，其中ABRβ1配体的浓度固定在500ng/mL而的浓度在1至100ng/mL范围内变化，从而生成竞争曲线/ABRβ1配体。

图10示出由Gonal F诱导并由配体ABRβ1中和的cAMP产生的结果；用人FSHR和用探针转染HEK293细胞，这允许通过FRET测定荧光中cAMP的细胞质浓度(Epac2-cAMP)。Gonal F以剂量依赖性方式诱导cAMP的产生(黑线)。在浓度为500ng/mL的ABRβ1配体存在下(灰线)，需要加入50ng/mL的Gonal F，以在不存在竞争的情况下获得其最大活性的50％。Dr/R/min，对基础率荧光归一化的荧光变化。数据表示为平均值±SD(*＝p≤0.01；**＝p≤0.05)。

获得的数据显示，在存在500ng/mL的ABRβ1配体的情况下，需要50ng/mL的才能在没有竞争的情况下达到药物最大活性的50％。因此，为了中和50ng/mL的(已知的最强FSHR配体)，500ng/mL的ABRβ1配体是足够的。此浓度比，即1:10，发现非常低，突出示出ABRβ1与竞争人FSHR的极端有效性，也证实了其极端的亲和力和特异性。

9.ABRβ1配体对癌细胞生长率的影响：与Gonal F竞争

由于FSHR的活化参与调节细胞生长的机制，本发明人在三种人类肿瘤模式细胞系中测试了ABRβ1配体对细胞生长速率的影响：CAOV-3、OVCAR-3(卵巢肿瘤)和MDA-MB-231(三阴性乳癌)。在所有细胞系中，Gonal F(0.1μg/ml)的处理在给予48小时诱导在细胞生长率方面的显著的增加(CAOV-3，MDA-MB-231+40％OVCAR-3+20％)。与对照条件下的测量值相比，ABRβ1配体(0.1μg/ml)的处理使CAOV-3细胞中的细胞生长率降低了15％，使OVCAR-3细胞中的细胞生长率降低了40％。令人惊讶的是，所有细胞系中的ABRβ1配体能够抵消GonalF对细胞生长的作用，使其作用无效。

图11示出ABRβ1配体对癌细胞生长的影响。在t＝0小时，以单剂量ABRβ1配体(0.1μg/ml)、Gonal F(0.1μg/ml)或两种Gonal F+ABRβ1(浓度均为0.1μg/ml)的混合物处理图中所示的癌细胞。相对于对照组(Ctr)，Gonal F诱导生长率增加，48小时处，CAOV-3细胞和MDA-MB-231增加约40％(p≤0.05)，OVCAR-3增加约20％(p≤0.05)。在48小时处，ABRβ1配体诱导生长率的降低，CAOV-3细胞降低约15％(p≤0.1)，OVCAR-3细胞降低约40％(p≤0.05)。在细胞系中，ABRβ1配体与Gonal F竞争，消除其对细胞生长的影响(p≤0.005)。为了清楚起见，图中未示出S.D.(n＝3)。

这意味着“在体外”，ABRβ1配体在可比的浓度下与Gonal F竞争与FSHR的相互作用。

10.使用Alexa fluor 647标记的ABRβ1配体对癌细胞生长率的影响：与Gonal F竞争

使用Alexa Fluor 647标记ABRβ1配体，从而在“体内”实验中获得能够在动物体内示踪的分子。这对于检查很重要，例如，在动物中诱导的肿瘤块内特异性ABRβ1配体的蓄积。为了验证标记过程不影响ABRβ1配体与FSHR的结合能力，重复了第8节中所述的实验。ABRβ1Alexa Fluor 647能够与Gonal F竞争，尽管相对于未标记的ABRβ1配体效率略低(图12)。

特别地，图12示出Alexa Fluor 647标记的ABRβ1配体对癌细胞生长的影响。在t＝0小时，以单剂量Alexa Fluor 647标记的ABRβ1配体(ABRβ1_FL)(0.1μg/ml)、Gonal F(0.1μg/ml)或二者Gonal F+ABRβ1_FL(浓度均为0.1μg/ml)的混合物处理癌细胞。ABRβ1_FL配体以与ABRβ1配体相似的方式抑制Gonal F的作用，证明Alexa Fluor 647标记仅部分影响其有效性。为了清楚起见，图中未示出S.D.(n＝3)。效率降低是由于与荧光分子结合，削弱了ABRβ1配体与FSHR的相互作用能力。所观察到的影响仍然包含并证实ABRβ1Alexa Fluor647可以用于“体内”实验。

11.OVCAR-3和MDA-MB-231中ABRβ1 NBD外化(internationalization)的流式细胞分析

实验前24小时将细胞(4×10⁴OVCAR-3或MDA-MB-231)接种于24孔板上。为确定最佳实验条件，将细胞与浓度递增的荧光ABRβ1配体共同孵育。孵育1小时后，应用Versene溶液清洗细胞，应用通过加入200μL FBS中和的胰蛋白酶与孔板分离。将离心后的细胞重新悬浮于Versene溶液中，用于FACS荧光测量。488nm激光用于荧光团激发(NBD衍生的ABRβ1)。每次实验一式三份分析1×10⁴个事件(event)。使用FACSDiva软件进行数据分析。如图13所示，细胞中荧光配体的内化取决于孵育中使用的荧光配体浓度。

12.OVCAR-3和MDA-MB-231中ABRβ1在内化后聚集在溶酶体中

ABRβ1配体的内化和亚细胞定位是使用Alexa Fluor 647衍生的配体进行的，并是通过共聚焦显微镜对过表达FSHR的OVCAR-3和MDA-MB-231的细胞进行评价的。在与荧光配体孵育前24小时，将细胞(1x10⁵个OVCAR-3和8×10⁴个MDA-MB-231)接种到载玻片上进行共聚焦显微镜检查。然后，细胞与标记的ABRβ1配体(500ng/mL的ABRβ1Alexa Fluor 647和LysoTracker Green DND-26，75nM)在完全培养基中于37℃共孵育1小时。在图像获取之前，使用HBSS溶液清洗细胞两次，在相同缓冲液中保存，并立即通过共聚焦显微镜进行分析。如图14所示，在这两种细胞系中，由于特异性聚集在细胞溶酶体中的Lyso Tracker Green产生的信号与ABRβ1信号共定位。这意味着在内化之后，ABRβ1分隔在细胞溶酶体中。

13.一系列肿瘤细胞系中FSHR表达的分析

在FACS中分析一系列人肿瘤的细胞系模型，以验证细胞表面是否存在FSHR，使用针对人FSHR开发的特异性一级抗体进行分析。从培养瓶中收获细胞(0.5x10^6/样本)，并在整个实验期间置于冰中的流式细胞仪试管中。为每种细胞系制备3份样品：ì)未处理的细胞，ìì)用在家兔中开发的的抗FSHR一级抗体(SAB4501041，Sigma-Aldrich)以及用与Alexa488(Termo Fisher)缀合的抗IgG二级抗体孵育的细胞，ììì)单独用二级抗体孵育的细胞。标记方案结束时，在FACS中分析细胞，对于每个阳本，使用FACSDiva软件获取2x10⁵个事件并进行分析。分析的细胞系列表和结果示于图15中。

14.婴儿成神经细胞瘤中的ABRβ1和FSHR

为了确定婴儿成神经细胞瘤(NB)中的FSHR基因表达模式，对存放在欧洲分子生物学实验室EMBL的名为“E-MTAB-16”的数据集进行了分析。

在该数据库中，使用微阵列技术收集基因表达分析。

收集的504份NB样本，分为以下7类：风险分类、肿瘤演变阶段、MYCN基因状态、存活/死亡、复发、诊断时年龄和诊断后生存。

从数据库中检索原始数据作为标准化数据https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/files/E-MTAB-161/E-MTAB-161.processed.1.zip)。

使用bowtie2软件在参考基因组hg19上重新分配作为目的基因探针的序列。

只有鉴定出具有高度特异性和可信度的目的基因的探针才用于后续分析。

使用可用数据的中位值对出现在相同基因上的不同探针情况下获得的基因表达水平进行标准化。进行分析以描述FSHR基因表达与用于NB分类的许多不同参数的关系，如诊断时的患者年龄、肿瘤分期、MYCN表达状态。

制作FSHR基因表达的箱形图(图16)，并使用Wilcoxon统计检验进行分析，并为不同组相关数据指定统计学显著性值。

本专利申请的发明人发现，在形成患者组的所有样本中，无论病理状态的演变状态如何，FSHR在婴儿成神经细胞瘤FSHR中过表达。

与此相关的是，FSHR在早期诊断和高生存概率患者的样本以及晚期诊断和死亡患者的样本中均过表达。

为了验证FSHR蛋白在成神经细胞瘤中的表达，使用了NB3细胞(成神经细胞瘤细胞模型)。用荧光ABRβ1配体孵育细胞，并在荧光显微镜和流式细胞仪中分析。

这些数据表明，在分析的所有细胞中，用(荧光)ABRβ1配体标记并因此在细胞表面表达FSHR的细胞百分比均高于96％。

图17示出NB3细胞中NBD标记的ABRβ1与FSHR结合的分析结果用标记的ABRβ1配体处理NB3细胞(体外成神经细胞瘤模型)，然后使用流式细胞仪在FITC通道中进行荧光信号(FL)分析之前，在盐溶液中清洗。分析表明，结合ABRβ1的细胞(图B)占总处理细胞(图A)的96％以上，(n＝3)。

而且，显微镜实验表明，细胞NB3中的ABRβ1配体具有高的内化率，从而影响了大多数细胞，正如在96％以上的分析细胞中出现的荧光胞质囊泡所证明的。

图18示出NBD标记的ABRβ1在NB3细胞中的内化结果。将贴壁在载玻片上的NB3细胞与标记的ABRβ1配体(150ng/mL)孵育15min，然后在生理盐水中洗涤，37℃再次孵育30min，然后进行荧光显微镜分析(FITC通道)。分析表明，ABRβ1配体具有高的内化率。高于96％处理细胞的级分显示信号出现在胞质囊泡中(图B)(n＝3)。未处理细胞(图A)。在人成神经细胞瘤细胞IMR-32和SH-SY5Y上使用抗人FSHR的特异性抗体进行的流式细胞术分析显示细胞膜上存在该受体，如图20所示。

15.ABRβ1配体急性毒性的初步分析

在初步研究中，评估了体内ABRβ1配体的急性毒性。为此，使用ABRβ1配体(载体：140mM NaCl，50mM NaHPO₄，60μM吐温20，pH6.8)处理12-14周龄的CD1系雄性小鼠(n＝3)和雌性小鼠(n＝3)。使用0.22μm的PES膜预过滤的浓度为1.25mg/mL的ABRβ1的溶液以200μl/25g处理每只小鼠。将50μl的溶液涂覆于LB/蛋白胨/琼脂上，在37℃孵育3天(C.F.U.＝0)，测定内毒素含量(E.U.<0.1/1μg ABRβ1)。对照小鼠由未处理动物(n＝2)或单独用载体处理的动物(n＝2)表示。给予前、给予后24小时和直到静脉内注射给予15天的每72小时，对动物称重。处理后观察行为2小时，并在上午9:00至10:00进行的每次后续称重操作时观察行为。

单独用载体处理的动物在处理时和随后2小时内无疼痛体征。接下来15天的行为观察并没有显示异常或痛苦迹象的出现。ABRβ1配体(10mg/kg)处理超过2小时或给予后15天在任何小鼠中均未观察到疼痛。在所有情况下，体重在15天内保持与处理前测量的体重一致(图21)，表明不同组的同性别动物之间无显著差异。

治疗后15天处死小鼠，肉眼评估主要器官的状况。在观察到的所有器官(胸腺、心脏、肺、胃、肝、脾、肠、肾、肾上腺、卵巢、睾丸)中，未观察到载体或ABRβ1(10mg/kg)给予导致的显著肉眼可见的变化(相对于对照)。

材料和方法

载体的构建

为了转化细菌和植物细胞，我们使用了pABR载体，该载体来源于双元载体pGreenII，其中多克隆位点和lacZ基因序列被移除并用含有真核生物中卡那霉素抗性基因的新序列和新的表达盒取代。

表达盒由以下形成：重复的花椰菜花叶病毒CaMV 35Sx2的基因转录的启动子(Franck et al.1980年)，其下游插入了促进编码人蛋白的基因转录和翻译的TEV序列(Nopo et al.2012)。

在VTE序列和胭脂碱合成酶终止子(Luo Z et al.2007)之间，其有助于提高所产生mRNA的稳定性和终止其翻译的效率，是用于插入编码外源蛋白的cNDA序列的多克隆位点(图1，其中RB/LB：重组特异位点，左边界和右边界；Tml p：肿瘤形态学膨大基因DNA启动子；NPT II：新霉素磷酸转移酶II；Tml t：肿瘤形态学膨大基因DNA终止子；CaMV35x2_p：花椰菜花叶病毒启动子；TEV 5’，非翻译的TEV，5’序列；Nos t：胭脂碱合成酶终止子)。

ABRβ1配体(人FSHβ)编码序列的构建

人FSHβ的氨基酸序列是通过查询UniProtKB数据库获得的，该数据库可获自www.expasy.org。蛋白标识号为P01225。

出于本发明的目的，对成熟蛋白的序列进行了适当的修饰，获得了如下所示的新氨基酸序列；

通过使用生物信息学工具，创建了编码这种蛋白的核苷酸序列，然后针对在植物细胞中表达，对这种序列进行了优化。

此序列的5’和3’是限制性内切酶Eco RI和Xba I的识别位点，其用于在pABR载体中正确克隆在表达盒内。

与此序列相对应的DNA片段是通过实验室的基因合成方法获得的。

如下示出编码ABRβ1配体的包括指向内质网的信号肽的新序列。

烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)悬浮液中的细胞培养

在250mL液体MS培养基(Murashige 1962)、30g/L蔗糖、2mg/L萘乙酸(NAA)和0.2mg/L激动素中持续进行烟草本塞姆氏的细胞培养。

每7天通过在新鲜培养基中转移125ml的一份细胞悬浮液制备传代培养物(sub-culture)。

在搅拌(120rpm)、黑暗和25℃恒温的条件下孵育细胞。

烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)细胞培养物的稳定转化

在添加100mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素(Duchefa)的YEP培养基(0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v植物蛋白胨，25g/L LB-Broth Miller)中培养转化有pABR质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(LBA4404)。

取25mL细菌培养物，置于100mL烧瓶中，在28℃，120rpm条件下培养至1OD。

然后通过离心(在室温下4000g离心10min)收获细菌，并在25mL MS中重新悬浮。将200μl细菌悬液接种于25mL的烟草本塞姆氏培养物中(植物细胞的鲜重等于9g)。

在黑暗、25℃和120rpm条件下共培养48小时后，用尼龙网过滤细胞，用过量培养基清洗，然后再悬浮于25mL相同的培养基中。然后将细胞接种到含有筛选培养基的培养皿中，该筛选培养基包括添加0.9％w/v琼脂、250mg/L羧苄青霉素和100mg/L卡那霉素(Duchefa)的MS。

在25℃黑暗条件下孵育胶囊约3周，直至出现愈伤组织。随后，将愈伤组织转移至新鲜选择培养基中，每15天一次，持续2个月。这一阶段后，在不含抗生素的MS中保持稳定的克隆。

来自烟草本塞姆氏悬浮液中细胞培养物的ABRβ1配体的纯化方案

1.提取缓冲液的制备

提取缓冲液：50mM Na₂HPO₄、150mM NaCl、20mM柠檬酸、40mM抗坏血酸、5mM EDTA、1mM PMSF、0.05％(v/v)吐温-20，pH 6.5，添加有1％(w/v)XAD-4和1％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。

在加入提取缓冲液之前需要处理聚苯乙烯树脂XAD-4，其由以下组成：在甲醇中清洗至少1或2h，然后用去离子水充分冲洗。

必须在使用前至少2-4小时将PVPP加入提取缓冲液中，以便使其水合。

2.提取

将用编织物过滤(截止值约为50μm)并储存于-80℃条件下的一份混悬液细胞置于4℃并过夜解冻。以2:1的比例加入缓冲液20mM Na₂HPO₄、10mM EDTA，pH 7.2，即每克细胞加入2mL缓冲液。将悬浮液在4℃下持续搅拌1小时，然后在4℃的受控温度下以18000rpm离心20min，弃去上清液。

以3:1(3mL/g细胞)的比例向沉淀物中加入提取缓冲液，并在4℃下保持1h。然后将提取物在4℃下以18000rpm离心20min，回收上清液。

3.硫酸铵沉淀

向提取物中加入硫酸铵，以获得70％的饱和浓度(证明ABRβ1配体完全沉淀的浓度)。

在恒定搅拌下，将溶液在4℃下保持1h。4℃，18000rpm离心20min后，弃去上清液，将沉淀重新悬浮于1/10初始体积的缓冲液中，该体积的缓冲液适合促进蛋白与IMAC树脂的相互作用。

4.IMAC色谱法

将硫酸铵处理后得到的沉淀物以1/10初始体积重新悬浮于20mM Na₂HPO₄、300mMNaCl、10mM咪唑，pH 8.0的缓冲液中，以18000rpm离心并以0.22μm过滤。将所得溶液上样至用20mM Na₂HPO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，pH 8.0的缓冲液平衡的Ni Sepharose 6FF树脂(GEHealthcare，17-5318-01)填充的色谱柱中，并用20mM Na₂HPO₄、300mM NaCl、500mM咪唑，pH8.0的缓冲液通过多级梯度洗脱。监测在280和254nm处的吸光度。

使用增强化学发光(ECL)作为检测技术，通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹技术以收获级分。

这些分析使用兔中表达的抗hFSHβ多克隆一级抗体(Abcam，AB171431)、辣根过氧化物酶衍生化的二级IgG抗兔抗体(KPL，474-1506)和作为参比标准品的在大肠杆菌中表达的人重组hFSH-β(Abnova，H00002488-Q01)。

5.尺寸排阻色谱法

合并在其中发现有ABRβ1配体的IMAC色谱法所得的级分，并将其上样至填充Sephadex G-25培养基树脂的色谱柱中(GE Healthcare，17-0033-01)。平衡色谱柱，并且用50mM醋酸钠、150mM NaCl、60μM吐温-20(pH 5.5)缓冲液洗脱。监测在280和254nm处的吸光度。

通过SDS-PAGE电泳和带ECL检测的免疫印迹技术分析色谱峰处收获的洗脱液，以监测其中是否存在重组蛋白。这些分析使用兔中表达的抗hFSHβ多克隆一级抗体(Abcam，AB171431)、辣根过氧化物酶衍生的二级IgG抗兔抗体(KPL，474-1506)和作为参比标准品的在大肠杆菌中表达的人重组hFSH-β(Abnova，H00002488-Q01)。

6.离子交换色谱法

合并分子排阻色谱法得到的对ABβR配体呈阳性的级分，上样至SP Sepharose HP树脂(GE Healthcare，17-1087-01)填充的色谱柱中，使用50mM醋酸钠、150mM NaCl、60μM吐温-20，pH 5.5的缓冲液平衡，并用50mM醋酸钠、1M NaCl、60μM吐温-20，pH 5.5的缓冲液以多步骤梯度洗脱。监测在280和254nm处的吸光度。

与先前色谱相同，有必要分析收获的级分，以确定其中是否存在人重组蛋白。

肽N-糖苷酶F的去糖基化

使用约为10kDa的截止值的Vivaspin(VS0403，Sartorious)将离子交换色谱法中的一份ABRβ1配体浓缩至0.5mg/mL，并用50mM NH₄HCO₃，0.1％(V/V)Rapigest SF(Waters，Manchester，U.K.)，pH 7.9的缓冲液替代。

采用生产商描述的方案，通过二辛可宁酸法(bicinconinic acid assay)(QuantiPro^TMBCA assay Kit，QPBCA，SigmaAldrich)测定蛋白浓度。

以1:50(酶:底物)的摩尔比在37℃恒温条件下孵育补充有肽N-糖苷酶F(RocheCustom Biotech,Mannheim,Germany)的样本过夜。

反应结束后，溶液中补充有45三氟乙酸(w/v)，在13000rpm离心10min。

然后在12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE(Laemmli 1970)和高效质谱分析样本。

原位胰蛋白酶消化

用超纯水冲洗使用考马斯亮蓝G250染色的聚丙烯酰胺凝胶，切取与待测序蛋白对应的电泳条带。将条带切割成小片段，用100-150μl超纯水清洗5min。对其离心，除去液体。加入相当于碎片体积的3-4倍的体积的乙腈(CH₃CN)，等待10-15min，直至方块出现“褶皱”收缩。

取出上清液，通过冷冻干燥器干燥。使用0.1M NH₄HCO₃，10mM DTT的缓冲液加至覆盖片段来进行回收，并在56℃条件下孵育30min·11·以还原蛋白质的二硫键。

对其离心，取出液体，并如上所述再次用乙腈处理。

用含0.1M NH₄HCO₃、55mM碘乙酰胺的缓冲液替代乙腈，室温下黑暗孵育20min，以衍生化半胱氨酸残基。

除去碘乙酰胺溶液，用约150μl的0.1M NH₄HCO₃缓冲液清洗15min。

对其离心，取出液体，并再次用乙腈处理。

如果凝胶碎片仍有蓝色染色，则用150μl的0.1m NH₄HCO₃缓冲液再水合10-15min。

然后加入等体积乙腈，置于轨道振荡仪上20min。

对其离心，除去溶液，用乙腈处理，用冷冻干燥器干燥。

重复这些步骤，直至蓝色染色持续存在。随后，加入13μl的12.5ng/μl胰蛋白酶修饰溶液(测序级修饰胰蛋白酶V5111，Promega)，并用50mM NH₄HCO₃覆盖片段。

将样本在4℃下放置约30-45min，使碎片再水合并吸收含有酶的溶液。

在该步骤中，检查溶液体积是否足以覆盖碎片，可选择加入50mM NH₄HCO₃缓冲液。将样本置于37℃受控温度下孵育24h。

孵育结束时，提取衍生自胰蛋白酶水解的肽。

1)向溶液中加入10-15μl的25mM NH₄HCO₃缓冲液，并使用热混合器在37℃下搅拌样本15min。对其离心，加入等于凝胶片段体积的1-2倍体积的CH₃CN。在热混合器中于37℃下搅拌15min。对其离心，并收集上清液。

2)将残留凝胶片段与40-50μl的5％(v/v)甲酸(HCOOH)混合。将样本置于37℃条件下持续搅拌15min。对其离心，加入相当于凝胶片段1-2倍体积的CH₃CN。在热混合器中于37℃下搅拌15min。对其离心，并收集上清液。

合并提取物并在冻干机中蒸发至干。

胰蛋白酶消化物色谱分析

在原位蛋白水解后，冻干蛋白材料，并在2:3:95的甲酸:乙腈:水中重新悬浮。

取20μl上样至Vydac C18色谱柱(1x150mm，5μm粒径，孔隙率)，该色谱柱用2％(v/v)乙腈水溶液和2％(v/v)甲酸平衡。在25min内，以50μl/min的速度，以3-65％乙腈线性梯度洗脱该色谱柱。

采用质谱仪Xevo G2-XS Q-TOF监测总离子流(TIC)，检查洗脱液。

通过分子排阻色谱法测定聚集百分比

采用YARRA色谱柱(3mm SEC 3000，150mmx7.8mm(Phenomenex)，分配间隔为10-600kDa)，通过分子排阻色谱法评价ABRβ1配体的标准聚集状态。

将一份20μl的ABRβ1配体(160μg/ml)上样，用20mM Na₂HPO₄、150mM NaCl，pH 7.4缓冲液洗脱该色谱柱。

荧光技术的稳定性分析

取一份ABRβ1(250μl的纯化蛋白)，用20mM HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.1％PEG-8000(w/v)的缓冲液稀释至1600μl的终体积(ABRβ1的终浓度等于1μM)。分析样本(T0)，然后在4℃下储存一周。每隔24小时对同一样本重复分析一次。荧光光谱在以下条件下进行：T＝25℃，λ_exc＝280nm，λ_em＝295-500nm。

二硫键的分配

通过上述肽N-糖苷酶F对一份ABRβ1配体进行酶去糖基化，并在非还原条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应混合物。凝胶用考马斯亮蓝G250染色。按照上文所述，对ABRβ1配体完全去糖基化对应的条带进行三次原位消化，但保持硫键完整，从而避免半胱氨酸残基的还原和烷基化。

在添加枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin Carlsberg P-5380,Sigma)的50mM NH₄HCO₃、1mM CaCl₂缓冲液(pH 8.2)中，回收来源于胰蛋白酶蛋白水解的肽混合物的冻干产物，其中酶:底物摩尔比等于1:50。

将溶液在37℃的受控温度下孵育过夜，然后冻干。

将样本再次溶解于2:3:95的甲酸:乙腈:水中。

将等于20μl的体积上样至Vydac C18色谱柱(1x150mm，5μm粒径，孔隙率)中。在12min内，以50μl/min的速度，以3％-65％的乙腈线性梯度洗脱该色谱柱。

采用质谱仪Xevo G2-XS Q-TOF记录TIC(总离子流)信号，监测分析，并测定各色谱峰的分子量。

塞尔托利氏细胞的分离与培养

用来自青春期前雄性仔猪、7-15日龄的大白猪的睾丸制备塞尔托利氏细胞(SC)。在与育种相关的去势常规操作期间，由具备资质的人员适当采集和储存材料，因此，将其用于研究目的的体外实验无需获得当地伦理委员会的批准。

SC分离程序涉及从麻醉仔猪中取出睾丸。除去纤维帽后，将睾丸细碎以获得均匀的组织碎片，随后使用2mg/mL胶原酶P(Roche Diagnostics)的Hanks平衡盐水(HBSS，Sigma-Aldrich)进行连续酶消化。

该消化一直持续到曲细精管的物理分解。

清洗后，用补充有胰蛋白酶和DNase I的HBSS溶液孵育破碎的组织悬浮液15min(Sigma-Aldrich)。

第二次消化结束时，将倾析后得到的组织团块在HBSS中清洗两次，然后在120rpm下离心3min。所得团块通过500微米不锈钢网过滤，重新悬浮于含有2M甘氨酸、2mM EDTA、pH7.2的缓冲液中。目的是消除所有残留的睾丸间质细胞(来狄吉细胞，Leydig cell)。

然后收获无管周细胞的残留小管，并在存在0.166nM维甲酸(Sigma-Aldrich)和5mL/500mL胰岛素/硒(Becton Dickinson)的条件下持续培养。将细胞培养物置于37℃的培养箱中。培养3天后，处理细胞以消除任何残留的生殖细胞(Galdierietal et al.1981；Korbutt et al.1997；Luca et al.2005；Luca et al.2007)。

芳香化酶活性的测定

在进行各种激素处理之前，通过在荧光显微镜(Nikon Optiphot-2，NikonCorporation)下使用溴化乙锭和荧光素二乙酸酯(Sigma-Aldrich)染色评价培养细胞的活力。为了评价α-芳香化酶的活性，用不同浓度的促卵泡激素(Gonal-F)或相同浓度的ABRβ1配体处理20×10⁶个3天。处理期结束时，向培养物中加入0.2mg/mL睾酮，并再孵育8小时。

刺激结束时，在细胞培养基中释放产生的17β-雌二醇(E2)，并使用特定的高灵敏度试剂盒(ADVIA Centaur,Estradiol-6III,Bayer Diagnostics)进行评价。

用荧光分子标记ABRβ1配体

对于体外结合和体内定位实验，将ABRβ1配体与两种不同的荧光分子缀合：4-氯-7-硝基苯并呋喃(NBD)(Sigma)和Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific)。

对于NBD标记，制备50mM的荧光探针乙腈浓缩液。

50μM/ml的ABRβ1配体的标记反应发生在50mM醋酸钠、500mM NaCl、60μM吐温20、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、30mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris/HCl)，pH 7.0和5mM NBD的溶液中(Bernal-Perez et al.2012)。

将该溶液在24℃条件下孵育16小时，通过荧光计和荧光显微镜分析评价蛋白标记和可能存在的聚集(exc.465nm；em.515nm)。参见ABRβ1配体与Alexa Fluor 647的缀合(exc.650nm；em.665nm)，遵循生产商提供的说明书，使用了商业化试剂盒Alexa Fluor647Antibody Labeling Kit(Thermo Fisher Scientific)。

使用流式细胞术分析与ABRβ1配体受体的结合

将稳定的人细胞系(卵巢癌的OVCAR-3、OVCAR-5和结肠癌的LS180)和原代卵巢癌细胞系A116在补充有10％热灭活胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素链霉素的RPMI1640培养基中培养。

在不使用抗生素或在无血清培养基中培养24小时后进行一些对照实验，以排除血清成分或抗生素的任何干扰。

免疫荧光试验后，通过胰蛋白酶-EDTA孵育，将细胞从培养支持液中分离，计数后，将其稀释至浓度为100,000个细胞/100μl，并与荧光ABRβ1配体孵育。使用细胞荧光法对37℃下与10μl/ml(350ng)NBD标记的ABRβ1配体预孵育15min的细胞进行直接免疫荧光分析，在流式细胞仪上使用FITC通道进行分析。细胞标记也可以在较低浓度的ABRβ1配体中突出显示，当细胞与浓度低于70ng/mL的ABRβ1配体预孵育时，荧光信号不再明显。在流式细胞术分析之前，为了评估细胞活力和ABRβ1配体的结合(不受蛋白水解酶的干预，蛋白水解酶可能通过导致配体与特异性受体分离而改变结果)，在不使细胞与底物分离的情况下进行了一些实验，使用共聚焦显微镜Olympus FV500进行了此类分析。

ABRβ1内化

然后将细胞在4℃条件下在4％多聚甲醛(w:v PBS 1X，磷酸盐缓冲盐水)中固定30min，并在PBS1X中清洗(各清洗3次，每次5min)。在免疫荧光情况下，用PBS 1X(添加1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％Triton-X100(Sigma))在室温下孵育固定细胞5min。通过用PBS1X(各清洗3次，每次5min)清洗消除透化溶液。然后将细胞与用生理盐水稀释并用1％BSA的一级抗体(抗FSHR SAB4501041)在37℃下孵育2小时。孵育结束时，用PBS 1X清洗除去一级抗体(各清洗3次，每次5min)，用添加1％BSA的PBS1X稀释的适当的二级抗体在37℃下孵育细胞30min。在本研究中，使用了与氰基-3缀合的二级抗体(在550nm处激发，在570nm处发出红光)。然后用PBS 1X(各3次清洗，每次5min)清洗细胞，用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)(PBS 1X中1:5000v:v)(Sigma)在室温下标记细胞核5min。用Elvanol安装载玻片，4℃保存，并用共聚焦显微镜Leica SP5或荧光显微镜LEICADFC300FX进行分析。在用NBD标记的ABRβ1处理的情况下，清洗后对细胞进行固定，并立即准备在显微镜中观察(如上所述)，该显微镜使用FITC通道中用于观察的一对过滤器。

细胞生长曲线分析

在补充有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺(Sigma)的DMEM培养基中培养CAOV-3细胞，在补充有10％胎牛血清的L15培养基中培养MDA-MB-231细胞(ATCC)。在补充有20％胎牛血清和2mM谷氨酰胺和0.01mg/mL胰岛素(Sigma)的RPMI中培养OVCAR-3细胞。

细胞培养物保存在37℃培养箱中。对于生长率的分析，根据细胞系，在存在适当培养基的情况下，将细胞以5x10⁴个细胞/孔的浓度接种到6孔板上。使用浓度为0.1μg/ml的ABRβ1配体或两种药物处理细胞。向培养基中加入和ABRβ1后24、48和72小时，以评价细胞生长。在指定时间，采用活力试验即台盼蓝拒染法，通过细胞计数评价细胞增殖率。

分析FSHR在人类肿瘤细胞系中的表达。

使用针对人FSHR开发的特异性一级抗体在流式细胞仪中进行分析。从培养瓶中收获细胞，置于冰上直至测定。为每个分析制备3份对照样本：ì)未处理的细胞，ìì)应用在兔(SAB4501041，Sigma-Aldrich)中建立的抗FSHR一级抗体以及应用与Alexa488(TermoFisher)偶联的抗IgG二级抗体孵育的细胞，ììì)单独与二级抗体孵育的细胞。三个实验条件的制备允许指定信号阳性并排除任何假阳性。标记和清洗结束时，在FACS中分析细胞。获取并分析每份样本的2x10⁵个事件(细胞)。

NB3细胞中ABRβ1与FSHR的结合分析(婴儿成神经细胞瘤模型)

使用NBD标记的ABRβ1配体进行FACS分析获得的数据表明，在分析的所有细胞中，在细胞表面表达FSHR的标记细胞百分比大于96％。

流式细胞仪分析NBD标记的ABRβ1的外化。

实验前24小时将细胞(4×10⁴个OVCAR-3或MDA-MB-231)接种于24孔板上，并用浓度递增的荧光ABRβ1配体孵育1小时。使用Versene溶液清洗细胞，使用通过加入200μL的FBS中和的胰蛋白酶与孔板分离。然后离心细胞，并在Versene溶液中重新悬浮，以进行流式细胞计数测量。488nm激光用于荧光团激发(NBD衍生的ABRβ1)。

内化后溶酶体中ABRβ1蓄积的分析

使用共聚焦显微镜进行配体BRβ1配体的内化和亚细胞定位。在与Alexa Fluor647衍生的荧光ABRβ1配体孵育前24小时，将细胞接种于载玻片进行共聚焦显微镜检查。将细胞与标记的ABRβ1配体(250ng/mL的ABRβ1和Lyso Tracker Green DND-26，75nM)在完全培养基中于37℃下共同孵育1小时。采集图像之前，使用HBSS溶液清洗细胞两次，在相同缓冲液中保存，并立即通过共聚焦显微镜进行分析。

ABRβ1在NB3细胞中的内化

在DMEM中培养NB3细胞，并在实验前24小时接种于载玻片上。将细胞与150ng/mL的NBD标记的ABRβ1配体在37℃培养箱中孵育15min。处理结束后，在盐水中清洗细胞，在完全培养基中孵育不同时间，在盐水中冲洗，并在荧光显微镜下使用FITC的一对过滤器进行观察。这允许评价由于位于细胞质中的荧光囊泡的出现而导致的细胞中荧光ABRβ1的内化。

诱导的cAMP生成和用ABRβ1中和的分析

该分析使用HEK293细胞，其中人FSHR(HG15960-UTDBA)和环腺苷酸(cAMP)的生物传感器Epac1-camps的外源表达是通过短暂共转染编码这两种结构的基因获得的。该分析在单个活细胞中使用荧光显微镜，之前在实验室中对方案进行了优化和验证。

在存在或不存在以不同浓度使用的ABRβ1配体的情况下，比较了用激动剂激活人FSHR诱导的细胞内cAMP变化的动态测量。通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析ABRβ1配体对FSHR受体内化动力学的影响。

根据生产商说明，通过Lipofectamine(Invitrogen)获得HEK293细胞的转染，并在实验室中进行优化。按照1:1的比例混合Epac2-camps和FSHR的DNA，获得共转染混合物。在共转染程序结束时，清洗细胞并在DMEM培养基中37℃孵育48小时(以允许转染的外源性蛋白的合成)。

ABRβ1分子的药理学分析是通过测定活细胞内cAMP水平的变化进行的，活细胞内cAMP的合成非常迅速并被FSH受体激活。该方法基于以cAMP的FRET技术为基础的生物传感器在细胞中的表达(Nikolaev et al.2006)。该生物传感器编码由cAMP高亲和力蛋白结构域连接的荧光蛋白GFP的两种颜色变体。两种GFP变体发射的相对强度取决于细胞内cAMP的浓度。根据经验证的敏化发射比率法，通过计算480±25nm处的通道发射强度与535±35nm处的通道发射强度之间的比率，在单细胞中通过荧光显微镜进行荧光变化测量。将HEK293细胞接种于直径为24mm的载玻片上，并转染以共表达EPAC1-cAMP和FSHR。载玻片安装在适合与倒置显微镜一起使用的小室中，用于成像实验。移除培养基并替换为用Hepes缓冲的林格氏生理盐水(改良的林格氏：125NaCl，5KCl；1Na₃PO₄；1MgSO₄；5.5葡萄糖；20Hepes；1.8CaCl₂，在水中，pH 7.4)。

为测定cAMP合成，用1至100ng/mL浓度的处理细胞。采集2min后，将激动剂药物直接加入成像溶液中，旨在估计基线FRET水平。在一组单独的实验中，使用相同浓度的在浓度范围为10至500ng/mL的ABRβ1配体孵育5min的细胞中进行cAMP测量。通过Image J软件(NIH,Bethesda,MD,USA)进行图像采集和分析。采用Anova检验对实验组进行比较，以P<0.05为具有统计学显著。所有数据用平均值±SEM来表示。

本领域的技术人员将能够从上述说明书中理解本发明的优点。

至于FSH的β亚基，令人惊讶的发现它并不能激活所谓的cAMP级联反应。

对于重组产生的β亚基，特别通过重组技术获得的ABRβ1亚基和在烟草本塞姆氏中表达，已证明能够提供许多优势，包括：高质量和生物安全性，因为通常用于生产治疗性蛋白质的病毒、致癌基因、朊病毒、毒素或危险试剂残留物的污染风险几乎为零。

在植物宿主中获得这样的ABRβ1亚基的能力同样有用且令人惊讶。

此外，ABRβ1亚基表现出惊人的稳定性，甚至明显高于FSH和抗体。

这些优点不损害对FSH受体的活性和亲和力；特别地，亲和力是处于纳摩尔(nM)水平。

另一个优点是ABRβ1亚基也不激活FSH受体，cAMP级联反应的非激活就证明了这一点。

从不同于酵母、昆虫、哺乳动物特别地人类细胞FSHβ亚基糖基化模式的糖基化模式来看，这些特性尤其令人惊讶和意外。

对于FSHβ和ABRβ1亚基，可以看到与FSHR的特异性结合并不增加癌细胞的生长速度。

虽然没有激活受体，但ABRβ1在作为模型系统使用的细胞中显示出显著的内化率。

现有技术描述了FSHβ亚基肽片段在治疗中的可能应用。

这并没有以任何方式使FSHβ亚基的治疗应用变得显而易见。

事实上，这两种结构有明显的区别。

例如，从Agris et al.(J.Prot.Chem.1992)已知的FSH33-53肽的结构包括在残基41-46和残基50-52之间的两个转角，而在FSHβ亚基的相同区域有β链构象。而且，该肽在34-36位氨基酸之间有一个小的螺旋区，而在FSHβ亚基中，相同的区域为β链。另一个不同之处是半胱氨酸Cys51在FSHβ亚基中形成二硫键，而该键在肽中缺失。

本发明的一个绝对重要的优点是在治疗和诊断成神经细胞瘤方面的潜在应用。

成神经细胞瘤实际上是婴儿时期最常见的颅外实体癌，起源于神经嵴的未分化细胞。

它是1岁以下儿童最常见的癌症，在最高达6岁的年龄组仍广泛流行。

原发肿瘤通常在肾上腺髓质区域或脊柱旁神经节中发现，不幸的是，在诊断时，超过50％的病例已经存在转移。

在成神经细胞瘤患者中，MYCN致癌基因表达分析(V-Myc禽髓细胞瘤病毒致癌基因成神经细胞瘤)在20％的病例中呈阳性，这与致死性预后的高风险密切相关。

目前，MYCN扩增代表了成神经细胞瘤风险分配的最佳遗传标记物。

死亡风险的分配基于多种临床和生物学因素的整合，包括成神经细胞瘤的进展阶段(Brodeur et al.1993)，诊断时的年龄(Brodeur et al.1988)，MYCN的扩增(Seeger etal.1985)和组织学检查(Shimada et al.1984)。

在所有这些标准中，年龄和早期诊断是转移患者风险分配的最重要变量。

中度风险组包括在1岁前确诊的患者。

而延误诊断的患者则被纳入高风险类别，而中和低风险患者一般预后良好，生存率约80％。

在存活率降至40％以下的高风险患者中，情况极为不利。

而且，最近识别了一类“非常高风险”的患者，他们对抗癌治疗没有反应或复发的概率很高(Maris et al.2007；Matthay et al.2012)。

目前正在研究的治疗成神经细胞瘤的疗法是基于放射性标记的分子，这些分子在健康组织中以优先的方式被肿瘤捕获，基于免疫疗法使用针对表面肿瘤抗原的单克隆抗体和控制细胞周期的合成激酶抑制剂。

然而，由于抗体的不稳定性和其他分子对肿瘤组织的特异性有限，患者会出现明显的副作用，这限制了治疗方案的有效性(Matthay et al.2012b)。

本发明可以代表当前可用治疗的一种有前景的替代方法。

序列表

<110> ABR - 活性植物学研究 S.r.L.

<120> 在肿瘤的诊断和治疗中的FSH激素受体的配体

<130> @E0111478

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys

20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr

65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu

100 105 110

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FSHR 配体

<400> 2

His His His His His His Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile

1 5 10 15

Ala Ile Glu Lys Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr

20 25 30

Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro

35 40 45

Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr

50 55 60

Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp

85 90 95

Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe

100 105 110

Gly Glu Met Lys Glu Lys Asp Glu Leu

115 120

<210> 3

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 编码SEQ. ID. n. 2

<400> 3

gaattcaaca atggctactc agagaagggc taacccatct tctcttcacc tgattaccgt60

gttctctctg cttgtggctg tggtgtctgc tgaggtgttc catcatcacc atcatcacaa120

ttcttgcgag ctgaccaaca tcaccattgc tatcgagaaa gaagagtgca ggttctgcat180

cagcatcaac actacttggt gcgctggtta ctgctacacc agggatcttg tgtacaagga240

tcctgctagg cctaagatcc aaaagacctg caccttcaaa gagctggttt acgagactgt300

tagggtgcca ggttgtgctc atcatgctga ttctctgtac acctaccctg ttgctactca360

gtgccattgc ggtaagtgcg atagcgattc tactgattgc accgtgagag gtctgggacc420

ttcttactgt tctttcggtg agatgaaaga aaaggatgag ctgtagtcta ga 472

Claims

1.一种人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其特征在于对应于SEQ.ID.no.2的序列或与SEQ.ID.no.2具有至少约90％相似性的序列，优选相似性在约90至99.9％之间，并更优选相似性在约95至97％之间。

2.一种人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其特征在于由对应于SEQ.ID.no.3的序列编码。

3.根据权利要求1或2所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其特征在于在成熟蛋白的精氨酸残基N13和N30处包括糖基化位点，所述糖基化位点各自包括两个N-乙酰葡萄糖胺残基和甘露糖残基。

4.根据前述权利要求中任一项所述的人促卵泡激素受体的配体用于医学应用。

5.根据前述权利要求中任一项所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体用于在肿瘤的治疗和/或诊断中的医学应用。

6.根据前述权利要求4或5所述的用于在肿瘤的治疗和/或诊断中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述肿瘤为原发性实体瘤或转移性实体瘤。

7.根据前述权利要求4至6中任一项所述的用于在肿瘤的治疗中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述肿瘤包括：前列腺癌并且特别地是前列腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、脑癌和甲状腺癌、肉瘤。

8.根据前述权利要求4至7中任一项所述的用于在肿瘤的治疗中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述配体与具有抗肿瘤活性的分子缀合，所述分子选自包括以下各项的组：

-细胞毒性剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：嘧啶拮抗剂，如卡培他滨，酶抑制剂，如喜树碱家族，例如伊立替康；

-烷基化剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：金属盐家族，如顺铂，DNA嵌入剂，如多柔比星，蒽环类化合物家族；

-蛋白合成调节剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：蛋白酶体抑制剂家族，如硼替佐米，mTOR抑制剂家族，如替西罗莫司；

-有丝分裂抑制剂类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：安丝菌素家族，如美登素，微管聚合抑制剂家族，如澳瑞他汀E；

-β-放射性同位素类，其中此类化合物优选地选自包括以下各项的组：¹³¹I、¹⁶⁹Er、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr和⁹⁰Y。

9.根据前述权利要求4至8中任一项所述的以缀合或非缀合形式用于与一种或多种具有抗肿瘤活性的药物联合在肿瘤的治疗中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体。

10.根据前述权利要求4至7中任一项所述的用于在肿瘤的诊断和/或体外分析中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述配体与以下各项缀合：

-荧光分子，选自包括以下各项的组：荧光素异硫氰酸酯(FITC)、藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5)；或

-放射性分子，选自包括以下各项的组：¹²³I、¹¹¹In、¹⁸⁸Re、¹⁸F、³⁵S、⁹⁹Tc；

-纳米颗粒。

11.根据前述权利要求1或2或3所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述配体与具有抗肿瘤活性的分子缀合，所述具有抗肿瘤活性的分子选自包括以下各项的组：

12.根据权利要求1或2或3所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述配体与具有诊断活性的分子缀合，所述具有诊断活性的分子选自包括以下各项的组：

-荧光分子，选自包括以下各项的组：荧光素异硫氰酸酯(FITC)、藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5)；

-纳米颗粒。

13.一种药物制剂，包含根据权利要求1或2或3所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

14.一种药物制剂，包含根据权利要求11或12所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

15.根据权利要求13或14所述的药物制剂用于静脉给予。

16.根据权利要求1或2或3所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体在所述受体的体外灭活中的应用。

17.一种制备根据权利要求1或2或3所述人促卵泡激素受体(FSHR)的配体的方法，包括通过引入氨基酸序列KDEL修饰所述人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的序列的C端区域的步骤。

18.一种制备根据前述权利要求所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体的方法，包括在所述人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)的序列的N-末端引入His标签的另外的步骤。

19.一种人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其特征在于以用于医学应用的所述人促卵泡激素的β亚基(FSHβ)为代表。

20.一种根据前述权利要求所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体用于在肿瘤的治疗和/或诊断中的医学应用。

21.根据前述权利要求19或20所述的用于在肿瘤的治疗和/或诊断中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述肿瘤为原发性实体瘤或转移性实体瘤。

22.根据前述权利要求20或21所述人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述肿瘤包括：前列腺癌并且特别是前列腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、睾丸癌、卵巢癌、脑癌和甲状腺癌、肉瘤。

23.根据前述权利要求4至22中任一项所述的用于在肿瘤的治疗中使用的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述配体与具有抗肿瘤活性的分子缀合，所述具有抗肿瘤活性的分子选自包括以下各项的组：

24.根据前述权利要求19至23中任一项所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，处于缀合或非缀合形式，用于与一种或多种具有抗肿瘤活性的药剂联合在肿瘤的治疗中使用。

25.根据前述权利要求19至24中任一项所述的用于在肿瘤的诊断中中使用和/或用于进行体外分析的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述亚基与以下各项缀合：

-放射性分子，选自包括以下各项的组：¹²³I、¹¹¹In、¹⁸⁸Re、¹⁸F、³⁵S、⁹⁹Tc；或

-纳米颗粒。

26.根据前述权利要求19至25中任一项所述的与具有抗肿瘤活性的分子缀合的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，所述具有抗肿瘤活性的分子选自：

27.根据前述权利要求19至26中任一项所述用与具有诊断活性的分子缀合的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，所述分子选自：

-纳米颗粒。

28.根据前述权利要求19至27中任一项所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述亚基为人类来源的或是通过重组DNA技术获得的。

29.一种药物制剂，包含根据前述权利要求19至28中任一项所述的人促卵泡激素受体(FSHR)的配体和一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

30.根据权利要求29所述的药物制剂用于静脉给予。

31.人促卵泡激素(FSHR)的FSHβ亚基在FSHR受体的体外灭活中的应用。

32.用于在成神经细胞瘤的治疗和/或诊断中医学应用的促卵泡激素(FSH)的配体。

33.根据前述权利要求的所述促卵泡激素(FSH)的配体，其特征在于所述配体包括：

-所述促卵泡激素(FSHβ)的β亚基的序列；或

-对应于SEQ.ID.no.2的氨基酸序列。

34.根据前述权利要求所述的促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中所述氨基酸序列特征在于在成熟蛋白的精氨酸残基N13和N30处包括糖基化位点，所述糖基化位点各自包括两个N-乙酰葡萄糖胺残基和甘露糖残基。

35.根据前述权利要求32至34中任一项所述的配体，其中所述肿瘤是在儿科患者中，并且优选是在6岁以下的患者中。

36.根据前述权利要求32至35中任一项所述的用于在成神经细胞瘤的治疗中医学应用的促卵泡激素受体(FSHR)的配体，其中，所述配体与具有抗肿瘤活性的分子缀合，所述具有抗肿瘤活性的分子选自包括以下各项的组：

37.根据前述权利要求32至36中任一项所述的用于在成神经细胞瘤的治疗中医学应用的促卵泡激素(FSH)的配体，其中所述配体以缀合或非缀合形式与一种或多种具有抗肿瘤活性的药剂联合使用。

38.根据前述权利要求32至37中任一项所述的用于在成神经细胞瘤的诊断中使用的促卵泡激素(FSH)配体，其中所述亚基与以下各项缀合：

-纳米颗粒。

39.一种药物制剂，包括根据前述权利要求32至38中任一项所述的用于在成神经细胞瘤的治疗和/或诊断中使用的促卵泡激素(FSH)的配体，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

40.根据前述权利要求所述的药物制剂用于静脉给予。

41.一种制备以促卵泡激素(FSH)的β亚基为代表的促卵泡激素(FSH)受体的配体的方法，包括以下步骤：

I)获得转化有质粒的合适载体，所述质粒含有对应于SEQ.ID.no.3的序列；

II)用步骤I)的所述载体转化烟草本塞姆氏(Nicotiana benthamiana)细胞；

III)选择所述烟草本塞姆氏细胞；

IV)使稳定的烟草本塞姆氏细胞生长；

V)制备细胞提取物；

VI)纯化FSHR受体配体。

42.根据前述权利要求所述的方法，其中步骤I)的所述载体由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)表现。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中在步骤II)中，在约25℃和持续搅拌的黑暗条件下共培养进行转化持续48小时。

44.根据前述权利要求41至43中任一项所述的方法，在步骤III)中使用了筛选培养基，所述培养基包括：补充有0.9％w/v琼脂和抗生素的MS。

45.根据前述权利要求41至44中任一项所述的方法，其中在步骤III)中使用羧苄青霉素和卡那霉素。

46.根据前述权利要求41至45中任一项所述的方法，其中在步骤V)中，悬浮培养所述烟草本塞姆氏细胞。

47.根据前述权利要求41至46中任一项所述的方法，其中在步骤V)中，在补充有蔗糖、萘乙酸(NAA)和激动素的MS培养基(Murashige，1962)中，在24至27℃和维持50至100mbar的通气的条件下孵育烟草本塞姆氏细胞15天的时间段。

48.根据前述权利要求41至47中任一项所述的方法，其中在步骤V)中使用的提取缓冲液包含：50mM Na₂HPO₄、150mM NaCl、20mM柠檬酸、40mM抗坏血酸、5mM EDTA、1mM PMSF、0.05％(v/v)吐温-20，pH6.5，补充有1％(w/v)XAD-4和1％(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)。

49.根据前述权利要求41至48中任一项所述的方法，其中按以下顺序进行步骤VI)：色谱柱IMAC、脱盐柱和离子交换色谱柱。

50.一种通过权利要求41至49中任一项所述的方法可获得的以促卵泡激素(FSH)的β亚基为代表的促卵泡激素(FSH)的受体的配体。