CN101495516A - Cd-33特异性的单链免疫毒素及其使用方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种单链免疫毒素组合物和使用该组合物的治疗方法。优选地，所述免疫毒素包括CD33特异性的单链Fv抗体片段和假单胞菌外毒素A(ETA)的基因工程变体。优选的工程外毒素A为ETA′并且可以包括位于其C－末端的KDEL肽，所述KDEL肽为介导改进的逆向运输到内质网(ER)的细胞肽。所述免疫毒素化合物可以为具有载体的制剂并对患者进行给药，其中，所述抗体部分结合于CD33阳性细胞并杀死这些细胞，从而有效地治疗包括人骨髓白血病在内的疾病。

Description

CD-33特异性的单链免疫毒素及其使用方法

技术领域

本发明通常涉及药物制剂，更具体地涉及含有能够与异常细胞表面抗原结合并导致细胞死亡的活性成分的制剂，由此提供了能用于治疗具有所述异常细胞的患者的制剂。

背景技术

急性骨髓白血病(AML)是成年人中最常见的急性白血病，在美国每年新增约12,000个病例(Jemal等，CA Cance J Clin，54：8-29，2004)。约70-80％的患者在高剂量化疗后能完全缓解，但复发频率高(Loewnberg等，N EnglMed，341：1051-1062，1999)。由于这种复发，使得所有患者的5年总存活率只有22％。大于55岁的患者的预后情况更差(Appelbaum等，Hematology AmSoc Hematol Educ Program，62-86，2001)。此外，由于老年群体对标准化疗的毒性的耐受性差，因此老年人的AML的治疗存在问题(Loewenberg等，NEngl J Med，341：1051-1062，1999)。

与AML最相关的抗原之一是CD33，为67kDa的糖蛋白类(Freeman等，Blood，85：2005-2012，1995)。当该抗原与抗体结合时，该抗原介导了原发性AML细胞的抗增殖作用和促凋亡作用(Mingari等，Immunol Rev，181：260-268，2001)。这种作用是通过胞浆区(cytoplasmic domain)中含有的ITIM-基序来介导的(Paul等，Blood，96：483-2000)。抗原CD33在骨髓分化时表达，并存在于90％的AML患者的白血病母细胞中，但在正常的造血干细胞和非造血组织中不表达(Dinndorf等，Blood，67：1048-1053，1986)。CD33的表达谱及其快速内化的能力(Van der Velden等，Blood，97：3197-3204，2001)使CD33成为基于抗体的AML治疗的合适的目标抗原。这种作用已在多种方法中显示出来(Caron等，Cancer，73：1049-1056，1994；Wellhausen等，J BioRegu；Homeost Agents，16：139-143，2002；Appelbaum等，Semin Hematol，36：2-8，1999)。

在2000年，吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab Ozogamicin)(GO

CMA-676；Siever等，Blood，93：3678-3684，1999)被批准用于AML患者的治疗。所述GO包括人源化抗-CD33IgG-抗体，其中，所述人源化抗-CD33IgG-抗体与细胞毒性试剂加里刹霉素(calicheamicin)化学耦合(Hamann等，Bioconjug Chem，13：47-58，2002)。

GO与CD33的结合导致了内化作用以及细胞内加里刹霉素的释放(vander Velden等，Blood，97：3197-3204，2001)。加里刹霉素结合在DNA的小沟上并导致双链DNA的断裂(Zein等，Science，240：1198-1201，1988)。在II期临床实验中，GO在复发的AML患者中产生了30％的总响应率。(Larson等，Leukemia，16：1627-1636，2002；Sievers等，Expert Opin Biol Ther，1：893-901，2001)。然而，GO的使用引发了包括严重的肝静脉闭塞性疾病在内的肝中毒、肺中毒和涉及呼吸系统和心血管系统的严重的过敏反应(Bross等，ClinCancer Res，7：1490-1496，2001)。GO对源自CD33阴性的ALL抗原的细胞系也具有抗原依赖的细胞毒活性(Jedema等，Leukemia，18：316-325，2004)。

部分地，本发明努力解决上述问题并提供用于治疗的化合物、制剂和方法。

发明内容

公开了一种融合蛋白，该融合蛋白包括抗体片段部分和改性的毒性蛋白部分。优选地，所述抗体片段部分和所述改性的毒性蛋白部分通过稳定的肽键相连接。

在一个实施方式中，所述抗体能够与细胞表面受体结合，该细胞表面受体通常在被标靶的细胞中表达。在一个实施方式中，所述抗体片段部分是scFv片段。在另一个实施方式中，所述抗体片段部分包括scFv抗体片段的重链和轻链。在一个相关的实施方式中，所述抗体片段部分通过重链和轻链之间的二硫键被稳定。在一个优选的实施方式中，所述抗体片段能特异性地与CD33结合。

在一个实施方式中，所述改性的毒性蛋白是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A(ETA)的工程变体。在一个优选的实施方式中，所述变体是缺少了天然ETA的至少一个结合结构域的ETA′变体。在另一个实施方式中，所述改性的毒性蛋白部分包括假单胞菌毒素的结构域II和III。

在另一个实施方式中，所述免疫毒素可以含有能促进融合蛋白向靶细胞的内质网中转运的肽。在一个优选的实施方式中，所述肽含有位于免疫毒素的C-末端的KDEL(SEQ ID NO：1)。

在一个实施方式中，所述抗体片段部分通过位于抗体部分和毒素部分之间的稳定的肽键与所述毒素部分相结合，这使得待释放的毒性成分通过与野生型毒素所利用的机制相同的机制而主要位于细胞内。

本发明的另一方面涉及一种制剂，该制剂含有药学上可接受的载体和融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体片段部分和改性的毒性蛋白部分。所述抗体片段部分优选为scFv抗体片段，该片段能够与如CD33在内的细胞表面抗原结合。优选情况下，所述改性的毒性蛋白部分通过稳定的肽键与所述抗体片段结合。在一个实施方式中，所述改性的毒性蛋白是假单胞菌外毒素A(ETA)的基因工程变体。优选地，所述变体是包括假单胞菌毒性A(ETA)的结构域II和III的ETA′变体。在一个实施方式中，所述毒性蛋白部分还可以进一步被改性为在它的C-末端含有四肽KDEL(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方式中，所述抗体部分与CD33进行结合的结合亲和力为1×10^-6M或更高。在另一个实施方式中，所述融合蛋白在制剂中的浓度为约0.1-100mg/ml。

而在另一方面，公开了一种治疗方法，该方法包括对患有与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病的患者进行诊断；对患者使用治疗有效剂量的制剂进行给药，所述制剂含有药学上可接受的载体和融合蛋白，该融合蛋白包括能够特异性地与结合于毒性蛋白部分的CD33结合的scFv抗体部分。在一个实施方式中，所述融合蛋白可以包括位于抗体部分和毒性蛋白部分之间的肽键和/或由KDEL四肽(SEQ ID NO：1)组成的C-末端序列。在一个实施方式中，所述疾病是急性骨髓白血病(AML)。在另一个实施方式中，所述疾病是儿科急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在一个实施方式中，被诊断为AML的患者是指接受了至少一个前期治疗后复发的AML患者。在另一个实施方式中，所述方法包括在一段时间内使用所述制剂进行反复给药和/或在这段时间内对该患者进行监控。

而在另一方面，公开了一种诱导人细胞凋亡的方法，该方法包括将细胞与融合蛋白接触，其中，所述融合蛋白包括能与任何细胞以1×10^-6M或更高的亲和力进行结合的抗体片段部分，所述融合蛋白的抗体部分通过稳定的肽键与改性的毒性蛋白结合。在一个实施方式中，所述改性的毒性蛋白部分是假单胞菌外毒素A的变体(ETA′)。在另一个实施方式中，所述ETA′缺失了完整的ETA的可靠结合结构域。在另一个实施方式中，所述ETA′还含有四肽KDEL(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方式中，所述细胞选自由U937、HL-60和THP-1所组成的组中的细胞系中。在另一个实施方式中，所述抗体片段部分与CD33进行结合的亲和力为约1×10^-7M。在另一个实施方式中，所述融合蛋白以约50-2,000ng/ml的浓度与细胞接触。

在阅读完下面对化合物、制剂和方法的详细描述后，本领域的技术人员将会清楚地明白本发明的这些和其它的目的、优点和特点。

附图说明

通过下面详细的描述并结合附图，可以更好地理解本发明。应当强调的是，根据惯例，附图的各种特性是不可测量的。相反，为了清楚起见，各种特性的尺寸可以被任意的放大或缩小。附图中包括的是下述附图：

图1为重组的免疫毒素CD33-ETA′的示意图，其中，所述重组的免疫毒素CD33-ETA′包括：STREP，即N-端STREP标签；6xHis，即六组氨酸标签；V_L和V_H，即CD33特异性的scFv的轻链和重链的可变区；4(G₄S)，即含有甘氨酸和丝氨酸残基的柔性接头；ETA′，即含有假单胞菌毒素的结构域II和III的被截短的ETA片段；和KDEL，即内质网(ER)定位基序。所述片段的分子量以kDa为单位由其氨基酸序列计算得到；

图2A为使用抗His的抗体从链霉素珠上洗脱出的重组的免疫毒素的蛋白质印迹分析图；1-4道是洗脱级分(elution fraction)1-4；图2B为考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶的图象，该图象显示了纯化的重组免疫蛋白(道的序号如图2A所示)的纯度；

图3A、3B、3C和3D是细胞数相对于荧光强度的曲线图，该图显示了重组的免疫毒素与抗原阳性细胞的特异性结合；用纯化的scFv-ETA′融合蛋白(黑色)和非相关的scFv-ETA′融合蛋白(白色)在相同浓度下对细胞进行染色，并用荧光激活细胞分类器(FACS)进行分析；图3A显示了CD33阳性的U937细胞用CD33-ETA′染色的结果；图3B显示了CD33阴性的CEM细胞用CD33-ETA′染色的结果；图3C显示了CD19阳性的Namalwa细胞用CD19-ETA染色的结果；图3D显示了CD19阴性的U937细胞用CD19-ETA染色的结果；

图4为曲线图，该曲线图显示了CD33-ETA在低浓度下诱导了CD33阳性的U937细胞死亡，而没有诱导CD33阴性的CEM和Namalwa细胞死亡的结果；对U937(◆)、CEM(■)和Namalwa(▲)细胞用单剂量指定浓度的CD33-ETA′处理72小时；通过核的碘化丙锭(PI)染色和FACS分析对部分细胞进行细胞死亡率评价；各数据的取值点是三个不同实验的平均值；达到统计显著性(P＜0.05)的值用星号表示，P值表示了处理组的细胞死亡程度与未处理对照组的细胞死亡程度的差别；

图5为曲线图，该曲线图显示了亲本CD33-scFv是如何阻断由CD33-ETA′导致的细胞死亡的结果；在时间点0，使用PBS(○)、100ng/ml的单剂量的CD33-ETA′(◇)、100ng/ml的CD33-ETA′+CD33-scFv(△)、100ng/ml的CD33-ETA′+同型对照scFv(▲)、CD33-scFv(□)或同型对照scFv(◆)对U937细胞进行处理；在指定的时间点，通过台盼蓝拒染法(trypan blueexclusion)对活细胞进行计数；在每一个时间点检测三个样品；给出的值代表三个不同实验；

图6A-6E为在指定的时间点用膜联蛋白V和PI进行染色的细胞的图象；图6A-6B显示了U937(图6A)和CD33阴性CEM细胞(图6B)用100ng/ml单剂量的CD33-ETA′处理后的结果；图6C-6E显示了U937(图6C)、HL-60(图6D)和THP-1(图6E)细胞分别用100ng/ml单剂量的CD33-ETA′或CD19-ETA′(U937，THP-1)或者用500ng/ml单剂量的CD33-ETA′或CD19-ETA′(HL-60)处理的结果；每一幅图的右下角的数表示处于早期凋亡(膜联蛋白V阳性和Pl阴性)的细胞百分数；每一幅图的右上方的数值表示死亡的细胞(膜联蛋白V阳性和Pl阳性)的百分数，数据代表三个不同的实验；

图7是CD33-ETA′诱导的源自患者的原发性AML细胞的死亡结果的曲线图；从患者1的骨髓分离的含有约50％的CD33阳性细胞的单核细胞(MNCs)未被处理(◆)或用500ng/ml单剂量的CD33-ETA′(▲)、500ng/ml单剂量的CD33-ETA′+CD33-scFv(■)进行处理，或者用500ng/ml单剂量的CD33-ETA′+同型对照scFv(●)进行处理；在用膜联蛋白V和PI染色后，通过FACS分析对膜联蛋白V阳性细胞进行检测来检测死亡细胞的百分数；每一个时间点检测三个样品；

图8A和8B显示了CD33-ETA′诱导的源自患者的原发性AML细胞的死亡结果；图8A显示了CD33-ETA′对从患者2的外周血中分离的含有约50％的CD33阳性细胞的单核细胞(MNCs)的作用；图8B显示了CD33-ETA′对来源于患者10的骨髓的含有约25％的CD33阳性细胞的MNCs的作用；未被处理的细胞(◆)或用500ng/ml单剂量的CD33-ETA′(▲)、500ng/ml单剂量的CD19-ETA′(■)进行处理；在用膜联蛋白V和Pl染色后，通过FACS分析对膜联蛋白V阳性细胞进行检测来检测死亡细胞的百分数；每一个时间点检测三个样品；

图9A和9B显示了在分析的初期(9A)和后期(9B)用于测定人类患者中CD33水平的固相诊断装置；

图10显示了根据本发明构建的用于诊断癌症的遗传易感性的基因芯片的部分结构。

具体实施方式

在描述本发明的化合物、制剂和方法之前，应当理解的是本发明不限于具体描述的实施方式，可以进行改变。还应当理解的是本文中使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方式而不是为了限制本发明，本发明的范围由所附的权利要求限定。

当给出变量的范围时，除非上下文中明确指出，应当理解为该变量的上限和下限之间的精确到较小限制单位的十分之一的中间值也具体公开了。任何规定的值或规定的范围的中间值与任何其它规定的值或规定的范围的中间值之间的更小范围也包括在本发明的范围之内。本发明的范围可以独立地包括或不包括所述更小范围的上下限端点值，包括上下限两个端点之一的范围、不含上下限端点的范围及含有上下限两个端点的范围在内的更小范围也包括在本发明范围内，使任何特异性地排除的限定包括在规定的范围内。当规定的范围包括上下限两个端点之一或两个端点时，本发明还包括排除了上下限两个端点之一或两个端点的范围。

除非有其它定义，本文中所有的科技术语的含义与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用任何与本文所描述的方法或材料相似或相同的方法或材料，但优选使用本文中描述的方法和材料。本文中提到的所有出版物一并引入本文作为参考，以对所引用的出版物相关的方法和/或材料进行公开和描述。应该理解的是，本发明公开的内容与并入的出版物公开的内容不一致的地方，以本发明公开的内容为准。

必须提出的是，除非上下文明确指出，在本文和所附的权利要求书中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、“该(the)”包括所指物的复数。因此，如，“蛋白质”包括这一类蛋白质；“制剂”包括一种或多种制剂及本领域技术人员熟知的等价物等。

本文中讨论的出版物仅提供本申请的申请日前的公开内容。不应理解为，本发明的内容不早于所述出版物，因为本发明具有优先权。此外，提供的出版日期可以与实际的出版日期不同，这需要独立地证实。

A.定义

“可被操作地连接”是指使所述成分的正常功能可以被实现的并列。因此，编码序列“可被操作地连接”于控制序列是指一种结构，其中，编码序列在这些序列的控制下表达，且被连接的DNA序列位于临近的位置，如果有分泌前导序列，则被连接的DNA序列位于临近的位置且处于阅读框中。例如，如果表达成能参与多肽分泌的前蛋白质，则将前序列或分泌前导序列的DNA可被操作地连接到多肽的DNA上；如果要影响该序列的转录，则将一个启动子或增强子可被操作地连接到编码序列上；如果位于能够促进翻译的位置，则将核糖体结合位点可被操作地连接到编码序列上。通过在便利的限制位点进行结合而实现连接。如果不存在这些位点，则根据传统方法使用合成的寡聚核苷酸衔接头(adaptor)或接头(linker)。

“控制序列”是指可被操作地连接的编码序列在特定的宿主有机体中的表达所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、选择性的操纵子序列、核糖体结合位点、和其它可能的现在了解不多的序列。众所周知，真核细胞使用启动子、多聚酰苷酸信号和增强子。

“表达系统”是指在可被操作的连接中包括预期的编码序列和控制序列的DNA序列，以使转化有这些序列的宿主能够产生编码的蛋白质。为了影响转化，表达系统可以含有载体；然而，相应的DNA随后也可以整合到宿主染色体中。

本文中使用的“细胞”、“细胞系”、“细胞培养”可以相互交换使用，并且所有这些名称包括后代。因此，“转化株”或“转化细胞”包括原发性细胞和来源于该原发性细胞的培养物，并且不考虑转代次数。还应当理解的是，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可以不完全一致。具有与在初始的转化细胞中被筛选的细胞具有相同功能的突变后代也包括在内。当使用不同的名称时，通过上下文的内容可以清楚地理解该名称的含义。

“质粒”是指能够自主复制的典型的环状双链DNA分子。在本文中，质粒被表示为在前的小写字母p和/或在后的大写字母和/或数字。本文中的初始质粒可以是商购得到的、可以是不受限制而被公众所用的、或根据公开的方法由可用的质粒构建得到的。此外，所述质粒还包括本领域公知的其它等效质粒，这些质粒对于普通的技术人员来说是很清楚的。

DNA的“消化”是指通过仅在DNA的某些位点起作用的酶使DNA被催化断裂。所述的酶被称为限制性酶；所述的每一个特定位点被称为限制性位点。本文中使用的各种限制性酶均可商购获得，并且它们的反应条件、辅助因子和其它必要条件按照酶供应商所建立的条件进行操作。通常，限制性酶通过由大写字母和紧接大写字母后的其它代表获得该限制酶来源的微生物的字母及表示特定酶的数字组成的缩写来表示。通常，约1mg的质粒或DNA片段使用在约20毫升的缓冲溶液中的约1-2单位的酶。生产商详细地说明了特定的限制性酶的缓冲溶液和底物的适当的量。通常在37℃下孵育约1小时，但也可以根据供应商的说明书改变反应条件。孵育后，用酚和氯仿除去蛋白质，然后用乙醇对含水部分进行沉淀来回收消化的核酸。限制性酶的消化很少伴随着细菌碱性磷酸酶对5′末端的磷酸酯的水解，细菌碱性磷酸酶对5′末端的磷酸酯的水解是为了抑制DNA片段的两个限制性断裂端点进行“环化”或形成封闭的环，“环化”或形成封闭的环将阻碍在限制性位点插入另一种DNA片段。除非另有说明，消化后的质粒不进行5′末端的去磷酸化作用。去磷酸化作用的方法和试剂是常规的(Maniatis等，1982，supra)。

将给定的DNA片段从限制性消化混合物中“回收”或“分离”是指将消化混合物通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶电泳进行分离，并通过与已知分子重量的DNA标记物片段的迁移率的比较对感兴趣的片段进行鉴定，切除含有所要片段的凝胶部分，并将DNA从胶中分离出来。该方法是众所周知的(如，Lawn等，Nucleic Acids Res.，9：6103-6114，1981，和Goeddel等，Nucleic Acids Res.，8：4057，1980)。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis等1982，supra，p.146)。除非另有说明，所述连接可以通过已知的缓冲液和在每0.5mg近似等摩尔量的要连接的DNA片段使用10单位的T4DNA连接酶的条件实现。

从转化株中“制备”DNA是指从培养的微生物中分离质粒DNA。除非另有说明，可以使用Maniatis等在supra的第90页中描述的碱性/SDS方法。

“寡聚核苷酸”是指通过已知的方法化学合成的短长度单链或双链的聚脱氧核苷酸，所述已知的方法如欧洲专利No.266,032中描述的固相技术使用磷酸三酯、亚磷酸盐或亚磷酸胺制备或使用Froehler等(Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986)通过脱氧核苷H-磷酸酯中间体制备。然后通过聚丙烯酰胺凝胶进行纯化。

根据本发明，对癌症的“筛选”是指检测个体中作为癌症或具有增加癌症风险的指示的CD33的水平。

根据本发明，癌症治疗的“时期”包括基于被检测的CD33水平的对个体的癌症时期的确定和制定该时期的治疗。按照癌细胞定位的程度，癌症分为已知的四个时期。此外，癌症可以分为早期和晚期，其中，早期对许多基于激素的治疗具有响应，晚期为更严重的对雄激素不依赖的时期。应当指出的是，目前AML并不分为这些时期。相反，通常根据以前的治疗情况选择治疗方法，如未经过治疗的、缓解状态的和复发的或难以治疗的。

做为癌症的指标，“CD33的减少表达”可以包括野生型CD33蛋白水平的降低或具有特定抗原决定簇或结构域的CD33蛋白水平的降低。也就是说，任何CD33蛋白的缺失或缺陷的CD33蛋白的存在均可以作为癌症如AML的指示。

缩写：AML：急性骨髓白血病；scFv：单链可变片段；ETA：外毒素A；ETA′：改性的外毒素A。

B.免疫毒素

本发明公开并描述了用于治疗以表达CD33为特征的疾病的CD33-特异的单链免疫毒素。优选地，通过将抗CD33的scFv连接到被截短的假单胞菌外毒素A，形成重组毒素。

应当理解为，关于CD33的重组scFv-ETA′分子的构建原则也适用于那些描述的关于CD22、CD25、CD7和CD64的抗原的构建(Kreitman等，N EnglJ Med，345：241-247，2001；Kreitman等，J Clin Oncol，78：1622-1636，2000；Peipp等，Cancer Res，62：2848-2855，2002；Tur等，Cancer Res，63：8414-8419，2003)。

在低范围如ng/ml的浓度范围内，一些scFv-ETA′毒素表现出细胞毒性效应，所述scFv-ETA′毒素包括CD22-ETA′和CD25-ETA′毒素(Kreitman等，NEngl J Med，345：241-247，2001；Kreitman等，J Clin Oncol，78：1622-1636，2000)及本文中描述的CD33-ETA′毒素和其它公开的构建体(Weis等，lnt J Cancer，60：137-144，1995；Tur等，Cancer Res，63：8414-8419，2003)。

此外由CD33-ETA′毒素导致的细胞溶解是高度抗原特异性的。

本发明的融合蛋白对抗原CD33的亲和力为1×10^-6M或更高，或尤其是约1×10^-7M。本发明的另一方面，细胞调亡引起的CD33-ETA′诱导的细胞的死亡通过膜联蛋白V的染色进行了证实。

不局限于理论，据认为，以前使用免疫毒素进行治疗的尝试具有副作用可能是因为抗体中存在Fc部分以及抗体部分和毒素部分之间的不稳定的化学连接导致了非同特异性活性。在一个实施方式中，本发明的免疫毒素是单链免疫毒素，该单链免疫毒素含有(1)单链Fv抗体部分和(2)工程毒素。在一个优选的实施方式中，所述免疫毒素含有CD33特异的单链Fv抗体部分和(2)假单胞菌外毒素A(ETA)的变体。所述变体毒素优选在其C-末端含有介导运输的细胞肽如KDEL肽(SEQ ID NO：1)和介导改良的逆向运输到内质网(ER)的细胞肽。如实施例1.1中的描述，获得了抗MTA的、编码假单胞菌外毒素A(ETA)的cDNA。构建了抗CD33的scFv-ETA′的重组免疫毒素，并在大肠杆菌(E.Coli)中进行了表达和纯化。分别用CD33阳性的人单核细胞系(U937)和和CD33阴性的CEM细胞检测了CD33-ETA′。如图3A-3B所示：CD33-ETA′与CD33阳性的U937细胞特异性的反应，但不与CD33阴性的CEM细胞反应，该CEM细胞是来源于人T细胞型急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)的细胞系，它与同样构建的CD7特异的免疫毒素(Peipp等，CancerRes，62：2848-2855，2002)反应。

为了比较，同样构建的CD19特异的ETA′免疫毒素与来源于人Burkitt淋巴瘤的CD19阳性的Namalwa细胞反应(图3C)，而不与CD19阴性的U937细胞反应(图3D)。

如实施例1.2所示：CD33-ETA′免疫毒素介导了CD33阳性细胞特异性死亡，但对CD33阴性的细胞没有作用。从图4可以看出，CD33-ETA′免疫毒素介导了培养的CD33阳性的U937细胞的特异性死亡，但对CD33阴性的CEM细胞和Namalwa细胞没有作用。从图4中可以看出，在免疫毒素的浓度高于100ng/ml时，U937细胞(CD33⁺)的死亡率为100％。相反，在免疫毒素的所有浓度中，CD33阴性的CEM细胞和Namalwa细胞的死亡率均低于10％。这些结果证实了CD33-ETA′能够以高抗原特异性的方式导致来源于各种不同疾病的人源细胞系的不同的CD33阳性肿瘤细胞的死亡。

用单剂量30-40ng/ml，相应于约0.5nM处理了72小时导致了50％的细胞裂解。当用单剂量500ng/ml(7nM，P＜0.002)处理了72小时导致了全部细胞裂解。与未处理的对照组相比，用大于等于10ng/ml的单剂量进行处理，获得了统计显著性的裂解(P＜0.04)。因此CD33-ETA′以高抗原特异性的方式起作用，并在较低的纳摩尔浓度范围内对培养的恶性瘤细胞是有效的。

如实施例1.3所示，含有载体和纯化的融合蛋白的制剂导致来源于人AML的细胞系U937、HL-60和THP-1的凋亡。在单剂量浓度为500ng/ml，相应于约7nM作用了72小时后，所述制剂杀死了几乎所有的U937细胞(图6A)。杀死细胞是抗原特异性的并以凋亡的方式介导的。除了用上述的计数含有SubG1-DNA的细胞的方法外，用膜联蛋白V和PI染色的方法分别提供了细胞死亡的独立的证据。通过比较发现，CD33-ETA′没有明显导致CD33阴性的、CD7阳性的CEM细胞的死亡(图6B)，而相应的CD7-ETA′毒素导致了这种细胞全部裂解(Peipp等，Cancer Res，62：2848-2855，2002)。

1、抗体

在一个优选的实施方式中，所述免疫毒素的抗体部分是抗体片段。更优选地，所述抗体部分是单链Fv抗体部分(scFv)。所述抗体的scFv是与短的接头(linker)(通常是丝氨酸和甘氨酸)结合在一起的免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合。在优选的实施方式中，所述scFv是CD33特异性的。在这部分中描述了用于免疫毒素的含有CD33特异性的单链Fv抗体片段的产品；然而，应当理解为其它的抗体片段也适用于本发明。CD33是由单核细胞/骨髓系细胞包括绝大多数急性骨髓白血细胞所表达的抗原。CD33基因(也被称为GP67)编码由单核细胞/骨髓系细胞包括绝大多数急性骨髓白血细胞所表达的抗原。

人CD33基因(基因库(GenBank)收藏号：NC_001772)具有7个外显子并位于19号染色体的q13.3区。该基因编码一个364个氨基酸、67kDa的蛋白(基因库收藏号：NP_001763)，该蛋白也被称为p67，它在正常人骨髓祖代细胞和来源于大多数患有急性骨髓白血病的患者的白血病细胞的表面表达(Peiper，等，Blood，72(1)：314-21，1988)。小鼠Cd33基因(NM_021293)位于7号染色体上，编码的蛋白质(NP_067268)具有334个氨基酸。人的这种蛋白质包括信号肽(氨基酸1-17)、含有IgV结构域(氨基酸18-121)和lgC2型的结构域(氨基酸156-219)的241个氨基酸残基的细胞外区域、跨膜结构域(氨基酸260-282)和胞质尾区(氨基酸283-364)。当没有被还原时进行分析，该分子是同型二聚体。

可用于本发明的CD33抗体可以通过常规的各种方法制备的单克隆抗体、多克隆抗体和/或重组抗体获得。小鼠和人的CD33抗体还可以商购获得(Becton Dickinson，New Jersey)。在一个实施方式中，所述CD33抗体是人源CD33抗体。例如，该抗体可以通过表达CD33基因获得。纯化的CD33蛋白作为免疫原。或者，可以使用CD33的一部分肽作为致敏抗原。尤其是，为了制备特异作用于选定的CD33的抗原决定簇或结构域的抗体，可以使用被定义为抗原决定簇或结构域的肽作为免疫原。在另一个实施方式中，所述抗体是通过已知的杂交瘤方法制备的小鼠单克隆抗体。

抗CD33抗体可以用各种可检测的标记进行标记，所述可检测的标记包括可检测的报告分子，如用于酶联免疫吸收测定(ELISA)中的酶；可检测的粒子，如金粒子和含有报告分子的脂质体；显色报告分子或荧光报告分子；如量子纳米晶体粒子在内的标记；放射同位素标记和包括结合有第二可检测标记(如标记有报告分子的链霉素标记)的生物素标记在内的标记。在一些测定方法中，未标记的抗CD33的抗体，如小鼠IgG抗体，通过与标记的抗体如标记的抗小鼠IgG抗体的反应进行测定。

为了诊断的用途，可以通过在体外用CD33将人淋巴细胞敏化并将敏化的淋巴细胞与具有永久分裂潜能的人源骨髓瘤细胞融合来制备具有CD33结合活性的人单克隆抗体。或者，将CD33作为抗原施用到具有人抗体基因所有的组成成分的转基因动物以获得产生抗CD33抗体的细胞，然后可以从这些产生永生化抗CD33抗体的细胞中获得用于CD33的人源抗体。

也可以用其它的方法制备特异性作用于CD33抗原的人源抗体或人源化抗体，如已被报道的重组技术(例如，见美国专利No.6,090,382和6,258,562)。

应理解的是，可以通过定点突变和在V_H和V_L链之间引入一个附加的二硫键来稳定scFv成分(M.Schwemmlein，unpublished data)。然而，也可以理解的是，这种稳定的scFv的亲和力可能降低。

2、毒素

所述化合物的毒素部分优选为假单胞菌外毒素A(ETA)。更优选地，所述毒素部分是缺失了结构域I和仅含有结构域II和M的被截短的ETA(Weis等，lnt J Cancer，60：137-144，1995)。结构域I是存在于大多数哺乳细胞的2-巨球蛋白报告分子(CD91)的结合结构域(Kounnas等，J Biol Chem，267：12420-12423，1992)。

ETA的结构域II和III分别是细胞内运输所需要的和含有毒素的活性中心，它们通过阻断翻译延伸因子EF-2来抑制蛋白质的合成，从而导致细胞凋亡(Lord等，Cell Microbiol，7：85-91，1999)。因此，只要缺失结构域I的ETA的截短变体，缩写为ETA′，保留在细胞外间隙，则ETA′没有毒性。此外，使用ETA′进行给药对血管内皮细胞的副作用很小，因为它对这些细胞的亲和力比例如蓖麻毒素A等低约1000倍(Baluna等，Proc Natl Acad Sci USA，96：3957-3962，1999)。可以理解的是，还可以使用其它毒素成分来产生免疫毒素(参考Schnell等，Leuk Lymphoma，30：525-537，1998；Grossbard等，JClin Oncol，77：726-737，1993)。

所述免疫毒素的毒性蛋白部分可以进一步包括运输肽如KDEL(SEQ IDNO：1)，该运输肽的C-末端具有腔内ER蛋白变体的内质网滞留序列(Munro等，Cell，48：899-907，1987)。优选地，为了产生scFv-ETA′免疫毒素，所述毒素部分包括C-末端的KDEL基序。据报道，用KDEL序列(SEQ ID NO：1)替换ETA′的天然的REDLK的C-末端序列(SEQ ID NO：2)能使ETA′毒素的细胞毒性增加到5倍(Seetharam等，J Biol Chem，266：17376-17381，1991)。

可以理解到是，在一个实施方式中，本发明的重组毒性蛋白部分通过scFv结构域和这些细胞的内化机制而仅仅被CD33阳性细胞吸收，其中，该内化机制是通过抗体或抗体片段占据CD33抗原而引发的。

C、治疗的方法和药物制剂

本发明还可以包括治疗方法，例如减少患有以表达CD33为特征的癌症的患者的肿瘤负担。在下面的部分将描述与急性骨髓瘤相关的内容，然而，应当理解为所述方法可以适用于表达CD33的其它癌症。

scFv抗体片段针对于能够内化ETA′变体的抗原的偶合导致了有效的免疫毒素。有证据表明可以使用相似的CD22特异性的构建体和CD25特异性的构建体治疗毛细胞白血病和CD25阳性的血液恶性肿瘤(Kreitman等，NEngl J Med，345：241-247，2001；Kreitman等，J Clin Oncol，78：1622-1636，2000)。

为了治疗的应用，本发明的融合蛋白(如CD33-ETA′毒素)被制成制剂并对哺乳动物(优选为人类)进行给药，其中，所述制剂为药学上可接受的剂型，包括可以以丸剂或通过肌肉、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内、口腔、局部的、或吸入途径以连续注入一段时间的形式对人进行静脉给药的剂型。本发明的融合蛋白还适用于通过肿瘤内、肿瘤周边、皮损内或皮损周边的途径进行给药以产生局部或系统的作用。例如，在急性骨髓白血病或儿科淋巴细胞白血病的治疗中，静脉注射被认为是尤其有效的。

所述剂型还可以包括本身无毒性的和无治疗作用的药学上可接受的载体。所述载体的实例包括离子交换剂；氧化铝；硬脂酸铝；卵磷脂；血清蛋白，如人血清白蛋白；缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐；或电解质，如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠、锌盐、胶质二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质和聚乙二醇。用于局部的或凝胶型的CD33-ETA′毒素蛋白的载体包括多糖，如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；聚丙烯酸酯；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物；聚乙二醇；和木质腊醇(wood wax alcohol)。对于所有的给药来说，可以使用常规的储存形式。例如，所述的储存形式包括微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏剂、吸入剂、鼻腔喷剂、舌下片剂和缓释制剂。缓释组合物是公知的并在美国专利No.3,773,919、EP 58.481A、美国专利No.3,887,699、EP 158.277A、加拿大专利No.1176565及Sidman等，Biopolymers 22：547，1983和Langer等，Chem.Tech.，12：98，1982中进行了描述。CD33-ETA′毒素蛋白通常被制成载体浓度为约0.1mg/ml到100mg/ml。

可添加到本发明融合蛋白的药物制剂中的其它选择性的成分如抗氧化剂，包括但不局限于维生素C；低分子量(少于约十个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；单糖、二糖和包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精在内的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；和糖醇，如甘露醇或山梨醇。

应当理解的是，用于治疗给药的所述融合蛋白(如可注射的CD33-ETA′毒素)的某些剂型必需是无菌的。可以通过无菌的过滤膜(如，0.2微米膜)进行过滤而容易地实现无菌。通常将融合蛋白以冻干的形式进行保存，如果融合蛋白对热变性或氧化变性很稳定，那么也可以以水溶液的形式进行保存。尽管在某些情况下pH值也可以高些或低些，融合蛋白制剂的pH通常为约6-8。

为了预防或治疗疾病，融合蛋白如CD33-ETA′毒素的合适剂量取决于被治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、给予融合蛋白是为了预防目的还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对融合蛋白的反应以及主治医师的判断。融合蛋白如CD33-ETA′毒素适合对患者进行一次或一系列的给药来进行治疗。为了实现本发明的目的，融合蛋白的“治疗有效剂量”是指能有效预防、减轻被治疗的病症的恶化、减轻被治疗的病症或治愈被治疗的病症的剂量，尤其是指能在体内充分减少或抑制表达CD33抗原的细胞的剂量。

特别是，本发明的融合蛋白可以制成制剂并用于治疗包括急性骨髓白血病(AML)和儿科急性成淋巴细胞性白血病(ALL)在内的疾病。当治疗这些疾病时，本发明的融合蛋白被制成包括可注射的制剂在内的剂型，并根据患者的体重进行给药，并且照看人(caregiver)还应该考虑其它标准，如患者的病症、性别、年龄和其它相关特征。相对于每千克患者的体重，剂量可以是如约1毫克到约200毫克或者约3毫克到约50毫克。可以是通过静脉注射每隔一天给药一次，共给药约3个剂量。在监测患者的反应时，这种治疗循环可以进行多次。可以通过根据如计算机体层摄影、流式细胞计量术来确定患者骨髓中白血病抗原和组织抗原的特性，从而对患者的反应进行检测。

本发明的融合蛋白可以用于治疗各种疾病和失调。本发明包括治疗的方法，该方法包括对患有与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病的患者进行诊断。使用治疗有效剂量的制剂对患者进行给药，其中，所述治疗有效剂量的制剂包括选择性的药学上可接受的载体和含有能够与CD33特异地结合的scFv抗体部分的融合蛋白，所述抗体部分通过肽键结合到毒性蛋白部分。所述毒性蛋白部分还可以包括含有KDEL肽(SEQ ID NO：1)的C-末端序列。在本发明的一个方面，所述疾病是急性骨髓白血病(AML)；在本发明的另一个方面，被诊断为患有AML的患者是指经过前期治疗后复发的AML患者。而在本发明的了另一方面，所述疾病是指儿科急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。在另一方面，使用所述融合蛋白对患者进行一段时间的反复给药，并且在此期间监测患者。

如实施例1.3所述，在原发性骨髓白血病胚细胞中检测scFv毒素(AML；从诊断患有AML的或复发的AML患者的外周血或骨髓中获取，并且所述AML患者目前没有进行化疗)。从表1中可以清楚地看出，取自10个患者的细胞经过培养，在用抗CD33的scFv-ETA处理后，其中9个患者的原发性细胞的裂解增加。

在另一方面，诱导人细胞凋亡的方法包括将选自U937、HL-60和THP-1的细胞系与融合蛋白接触。在这方面。所述融合蛋白含有抗体片段部分，该片段部分与细胞系U937、HL-60和THP-1中任何一种细胞系进行结合的亲和力为1×10^-6M或更高。如上所述，所述抗体部分通过稳定的肽键结合到改性的毒性蛋白部分以形成融合蛋白。优选地，所述改性的毒素蛋白部分是假单胞菌外毒素A的变体(ETA′)，并且所述ETA′还含有四肽KDEL。优选地，所述抗体片段部分与CD33进行结合的亲和力为约1×10^-6M或更高，或为1×10^-7M。在一个实施方式中，所述融合蛋白的ETA′部分缺少结合结构域。优选地，所述融合蛋白以约50ng/ml到约2,000ng/ml的浓度与细胞接触。

如上所述，MYLOTARG^TM是加合物，化学连接于完整的抗CD33抗体和有效的毒素加里刹霉素(calicheamicin)之间；加里刹霉素被认为适合临床用于年过60岁且不再适合采用包括化疗在内的其它治疗的患者。MYLOTARG^TM具有副作用，但是如果没有其它被认可的替代药物，它在临床上是有益的。毒性似乎是由于加里刹霉素与抗体之间的化学连接不稳定，以及抗体的Fc部分与非白血病细胞的Fc受体的结合所导致的。毒素与抗体之间的连接较弱；并且一旦毒素经过抗体被内化，能够使毒素在细胞内进行释放。为了到达其在细胞核的靶位点，毒素部分进入细胞后必须与抗体断开，其中，所述到达其在细胞核的靶位点将导致DNA链断裂及细胞死亡。这种连接是不稳定的，并在溶酶体中pH值低于某一阈值时发生断裂。MYLOTARG^TM的抗体部分与毒素部分之间的连接似乎不稳定，这可能导致细胞的抗原非特异性的裂解。培养的细胞实验表明MYLOTARG^TM导致了CD33阴性的T-ALL细胞系CEM(来源于急性白血病T细胞)的裂解，从而证实了其抗原非特异性作用。

与此相反，本发明的抗CD33的scFv假单胞菌ETA′融合蛋白只特异地消除CD33阳性的细胞，而对抗原阴性的细胞没有作用。其它研究者还发现MYLOTARG^TM在体外杀死抗原阴性的B淋巴细胞系。应当指出的是，MYLOTARG^TM从最初的冻干试剂配制的重悬的溶液必需在7小时内使用。

如实施例1.3所述，用CD33-ETA′免疫毒素处理U937、CEM和Namalwa细胞后，用膜联蛋白V和PI染色来检测凋亡。

实验表明，CD33特异的毒素不仅介导CD33阳性细胞的死亡，而且还介导原发性AML细胞的死亡，尽管介导原发性AML细胞的死亡的效力较低。通过两种不同的方法检测所述试剂特异性：(a)使用CD33阳性细胞和CD33阴性细胞的杀死实验，和(b)使用亲本的抗CD33的scFv和不相关的对照scFv(抗-CD 19)进行预孵育处理。

如实施例1.4所述，所述免疫毒素还介导了原发性人AML细胞的死亡，尽管观察到免疫毒素对来源于不同患者的多个样品的功效的变化大于对来源于肿瘤的细胞系的功效的变化。在两个病例中，观察到对来源于三位刚刚分别被诊断为AML的并且没有开始化疗的患者的骨髓和外周血单核细胞(MNCs)，一例的20％的细胞被特异性地裂解，一例的30％的细胞被特异性地裂解(见图7、8A和8B)。

数据清楚的表明，CD33的结合位点的阻断不仅预防了细胞被免疫毒素所裂解，并且使预处理细胞的增殖速度与未处理的对照细胞的增殖速度一样快。这些实验表明，CD33-ETA′以高度的抗原特异性的方式起作用。由于其它的作者报道了GO能够杀死CD33阴性细胞系(Jedema等，Leukemia，-/8：316-325，2004)，因此CD33-ETA′以高度的抗原特异性的方式起作用的特性与GO相比尤为显著。

事实上，高度抗原特异性是融合蛋白尤其是CD33-ETA′优于目前处理标准的一个优点。其它的非限制性的优点包括由于本发明的毒素成分与scFv成分之间的连接是通过肽键而不是GO中使用的不稳定的化学键而具有更高的稳定性。此外，CD33-ETA′融合蛋白缺失了与哺乳动物的细胞上的假单胞菌外毒素A受体(即a2巨球蛋白受体)(Lord等，Cell Microbiol，7：85-91，1999)结合的结构域。CD33-ETA′的毒素成分需要通过蛋白质的水解作用才能被释放，因此，它不能结合到受体上，也不具有毒性。与此相反，如果加里刹霉素毒素从GO的抗体成分中被释放出，加里刹霉素可能还会对旁边的细胞产生毒副作用。

本发明免疫毒素的另一个优点是抗体部分与毒素部分通过肽键形成稳定的连接，从而降低了由于该键在细胞外间隙的断裂而导致的非特异性的毒性。而且，由于scFv和毒素之间遗传的连接，分子种群在分子水平上的同源性很高，尤其是与目前被认可的治疗AML的MYLOTARG^TM相比。由于所述的免疫毒素比目前可得到的治疗药物小，预期免疫毒素比较大的化合物具有更好的生物分布性和药物动力学特性。

此外，在一个优选的实施方式中，由于缺失Fc部分，避免了Fc部分与非肿瘤靶细胞上的Fc受体之间的不需要的相互作用。而且，如上所述，不需要的细胞上的Fc受体除去的越少，由免疫毒素导致的不需要的副作用则越少。

可以在重组细菌体系中生产融合蛋白，因此降低了生产成本(COG；商品成本)。

如同其它作者观察到的，scFv-ETA免疫毒素具有有限的毒性，预计CD33-ETA′也具有类似剂量的有限的毒性(Kreitman等，N Engl J Med，345：241-247，2001；Kreitman等，J Clin Oncol，-/8：1622-1636，2000)。然而，尽管在进行的实验和实施例中描述了存在副作用，但是治疗医师总是可以容易的进行处理。

为了证实免疫毒素的特性，构建并纯化了一种对照蛋白，其中，如实施例1所描述的，所述对照蛋白包括与ETA-KDEL毒素融合的CD19特异性的单链Fv抗体部分。该对照蛋白不会导致CD19阴性的细胞系U937、HL-60和MP-1的裂解。CD33-ETA毒素还会介导来源于患者的骨髓和外周血的新制备的AML细胞的裂解。在三个实验中，用单剂量500ng/ml处理细胞导致了20-30％的细胞的裂解。本发明蛋白和制剂具有显著的抗原特异性，表明它们具有治疗骨髓白血病的功效。从表1中可以看出，十位刚刚被诊断为AML并未经治疗的患者，在他们的骨髓和外周血中具有不同比例的CD33阳性的细胞，在其中九位患者中，被杀死的CD33阳性的细胞最多达到30％。

从实施例中可以看出，CD33-ETA′消除了20-30％的原发性AML细胞。在可比的条件下，超过95％的U937细胞被破坏。然而，应当指出的是，在如实施例所用的实验条件下培养，U937细胞分裂倍增的时间接近24小时。相反，原发性AML细胞在同样的条件下不增殖。因此，如果所述试剂需要作用整个细胞周期才能获得成功的话，那么可以预测到，只会导致相当少量的细胞死亡。据报道，静止期的原发性AML细胞对白喉毒素具有相对的耐药性(Jedema等，Exp Hematol，32：188-194，2004)，所述白喉毒素是通过与假单胞菌外毒素A相同的机制发挥其细胞毒性效应的。可以推测出，静止期的AML细胞对CD33-ETA′融合蛋白可能也具有部分的耐药性。

此外，在72小时后，完全裂解的细胞不能被FACS分析检测出来，而是通过检测细胞总数的减少来确定患者10的细胞死亡数目(图8B)。最终，描述的细胞死亡百分数的计算是相对于实验中采用的患者细胞总数。然而，这些细胞中只有一部分是CD33阳性的，没有计算恶性胚细胞的确切的分数。不占据CD33而通过如采用磁性标记抗体的磁性细胞分选方法进行CD33阳性细胞种群的分离是不可行的，因为CD33可能导致免疫毒素的结合位点的封闭，从而导致靶抗原的内化。

CD33-ETA′在较低的纳摩尔浓度范围内也表现出活性。这个浓度范围非常类似于其它作者报道的类似的构建体scFv-ETA′免疫毒素和GO的浓度范围(Peipp等，Cancer Res，62：2848-2855，2002；Tur等，Cancer Res，63：8414-8419，2003；Amico等，Blood，707：4589-4597，2003)。

在普通的免疫疗法中，被诊断为AML的患者通过使用抗CD33免疫毒素进行给药治疗。优选地，所述融合抗体是按照上述方法制备的人源抗体或人源化抗体，并且使用合适的生理载体通过静脉内(IV)或者皮下注射来进行给药。在治疗过程中，一般通过肿瘤显色法(tumor-visualization procedure)并结合检测CD33抗原的水平来监测患者癌症状态的变化。该治疗方法还可以结合包括药物治疗或放射性同位素治疗在内的其它癌症治疗的方法来进行；该治疗可以持续至观测到的肿瘤大小减小所需要的水平。

D、诊断方法和试剂

一方面，本发明包括一种筛选在人体中表达CD33的细胞的方法。另一方面，本发明包括一种对受实验者中表达CD33的癌症进行分段治疗的方法。根据本发明，通过下述的方法实现上述的目的，即使用能与选定的CD33的结构域或抗原决定簇特异性反应的抗体与研究对象的体液样品进行反应，然后确定免疫测定产品的存在和/或免疫测定产品的量，以及确定与人样品中CD33的正常范围相比研究对象的CD33蛋白的水平是否增加。该蛋白水平增加表示存在癌症的迹象。

该检测可以通过多种用于检测体液抗原的分析方法中的任何一种来实现，包括酶联免疫吸附(ELISA)技术；包括荧光淬灭在内的均相法；和各种固相夹心法，其中，CD33抗原被固相支持物所携带的抗CD33的抗体捕获，然后使用抗CD33的第二抗体如携带有比色报导分子或金粒子报导分子的第二抗体，对固定的抗原抗体复合物进行标记。

图9A和9B表示根据本发明的一个实施方式构建的固相检测带，它适合于进行刚刚提到的夹心免疫检测，并分别显示了最初和最终的检测状态。所述检测带通常在10包括多孔支持物或垫片(pad)12，在支持物的上游区域具有点样区14和在下游区域具有样品检测区16。所述点样区包括可检测的抗CD33抗体的试剂，如标记有金粒子的抗CD33抗体；所述试剂以非结合的形式存在该区中，即非固定形式。所述试剂表示为实心园，如在18。可以与被标记的抗体试剂相同或不同的抗CD33抗体被固定在位于检测区的固定支持物上，并以“Y”形表示，如在20。

还表示了参照区22，该区与检测区邻近，具有一种或多种颜色或形状的区域，这些区域与体液样品中CD33的不同的检测水平相对应。在一个实施方式中，区22包括三个区：22a、22b和22c，它们相应于CD33不同的检测水平；(a)表示低于存在癌症的水平；(b)表示与存在癌症的最低阈值相对应的水平；和(c)表示远远高于，如比区22b的阈值高2-3倍的水平。这三个区提供了一个标准指示剂，该指示剂的可检测反应水平的评价可以用于评估与存在癌症有关的水平。检测带和参照区一起构成了用于筛选患者患有表达CD33的癌症的检测装置，或构成了用于对患者的癌症进行分段治疗的检测装置。

在操作中，将已知体积的待测试的体液样品加入到所述检测带的点样区，其中，样品在该区中扩散，使抗体试剂与样品中的CD33抗原反应形成抗原抗体复合物。然后，该复合物与未结合的抗体试剂通过毛细管作用迁移到检测区，在检测区中，抗原与抗体复合物被固定的抗体所捕获，而未结合的抗体试剂被转运到支持物的末端，如24所示。可以理解的是，体液中抗原浓度越高，在检测区中捕获试剂的密度越高，则在该区中的颜色越浓或强度越强。将检测区产生的颜色和强度与参照区的标准进行比较，以确定与是否存在癌症相关的CD33的定性水平。如果在检测中观察到CD33水平升高，则将该研究对象归为存在癌症的可能性较高的一类，可以推荐研究对象进行另外的检测和/或更频繁的检测。

在另一个实施方式中，检测装置包括与上述类似的检测带，但已知的参照指示剂由读带读出器(strip-reader instrument reader)提供，其中，所述读带读出器具有(i)用于接受检测带的阅读槽；(ii)光源和光学检测器，如分光光度检测器，该光源和光学检测器用于检测检测带的检测区中与检测相关的光学情况；(iii)电子或处理单元，该电子或处理单元用于记录并处理来源于光学检测器的信号，并将信号转变为CD33的检测水平；和(iv)使用者的显示屏或窗口。该仪器可以对检测的CD33体液样品给出确定的报告，使操作者将显示的值与由检测带或仪器提供已知标准指示剂进行比较，以评价研究对象是否具有升高到与存在癌症相关的水平，或者评价癌症可能处于的时期，以便于制定治疗方案。选择性地，所述仪器本身可以包括储存的已知标准的不同水平的指示剂，该指示剂可以在内部与检测的水平进行比较以输出是否检测到CD33升高到与存在癌症相关的水平的结果，或者输出癌症所处时期的结果。

E、与癌症相关的遗传突变的确定

另一方面，本发明提供了一种用于在人类研究对象中确定与包括AML在内的癌症的风险增加相关的突变的方法。下面将描述与AML相关的内容；然而，应当理解为，所述方法也可以用于涉及表达CD33的其它癌症。在实际的方法中，从患有AML的患者中提取基因组DNA，所述患者优选包括代表不同种族和不同年龄的男性和女性的患者。检测DNA序列，尤其是(i)位于19号染色体的q13.3染色体区的CD33基因的外显子1到7中的一个或几个，其中，19号染色体包括所述外显子的邻近的剪切位点受体和供体序列；(ii)该基因的外显子1的10kB以内的或更小的5′UTR区；和(iii)外显子7的10kB以内的或更小的3′UTR区。

通过将每一个序列与来源于正常(野生型)组织的相同区域的序列进行对比，以确定位于该区域的一个或多个位点的突变。优选地，对从多个野生型个体中得到的序列进行检测，以确保该序列是真正的野生型序列。对于提取的各个DNA样品，对患者的序列和野生型的序列进行比较，以对患者序列的突变进行鉴定，因此，这种突变可能与增加的癌症风险相关。

一旦鉴定了大量的这种突变，如至少50-200或更多，它们可以用于构建用于筛选具有癌症的遗传易感性的个体的遗传筛选设备，如基因芯片。在一个实施方式中，所述设备包括如图10的30所示的基因芯片，所述基因芯片具有一系列的区域如区域34和36；每一个区域含有结合的已知序列片段，如区域34中的片段37。所述片段或探针的长度优选为25-70个碱基，并且每一个片段或探针含有上述鉴定的与癌症相关的突变的CD33基因的上游序列之一。基因芯片的构建体和用这些芯片对突变的序列进行检测是公知的。

在典型的遗传筛选方法中，获取患者的细胞，提取基因组DNA，使用荧光标记的探针通过标准的PCR对感兴趣的序列区进行扩增。然后，在合适的杂交条件下将扩增的材料与芯片阵列序列进行反应，然后洗涤阵列表面以除去未结合的材料，然后通过合适的芯片阅读仪进行扫描，以鉴定出任何与癌症相关的突变序列。图中显示了表示为42的标记的基因组DNA片段与阵列区38的结合，其中，阵列区38具有结合探针分子40。阵列区中荧光信号的检测是重要的上游CD33区域中公知的遗传突变的诊断方法，该诊断方法可以成为AML的遗传易感性的诊断方法。

在一个可替换实施方式中，按照上述方法检测到的突变被用于构建一系列具有检测存在有基因组突变能力的分子倒置探针(molecular inversionprobes(MIPs))。已经描述了所述构建体和用于鉴定基因组突变的MIPs的应用(例如，参见，Wang，等，Nucleic Acids Research，(England)2005，Vol.33，p.21)。

实施例

给出下述实施例的目的是为了给本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的描述，而不是为了限制本发明的范围，也不意味下面的实施例是本发明的发明人所作出的全部的实施例，或者本发明的发明人只作出了下述实施例。已努力确保所使用的数值(如数量，温度等)的正确性，但应当考虑到某些实验误差或实验偏差。除非另有指出，份是指重量份；分子量是指重均分子量；温度是摄氏度；压力是大气压或接近大气压。

材料和方法

菌株和质粒

使用埃希氏大肠杆菌XLi-Blue菌株(Stratagene，Amsterdam，theNetherlands)进行质粒的扩增和克隆，使用大肠杆菌TG1(来自于Dr.G.Winter，MRC，Cambridge，United Kingdom)筛选抗体文库。使用噬菌粒载体pAK100构建文库，使用pAK400表达可溶性的scFvs(Krebber等，J Immunol Methods，207：35-55，1997)。大肠杆菌BL21(DE3；Novagen，Inc.，Madison，Wl)用于表达scFv-ETA′融合蛋白。为了生成在表面表达人源CD33的293T细胞，通过Not I和Hind III对含有人CD33cDNA的质粒πH3M(来自于Dr.Bryan Seed，Massachusetts General Hospital，Boston，MA；Simmons等，J Immunol，141：2797-2800，1988)进行消化，将插入片段连接到载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)上，形成了构建体pcDNA3.1-hCD33。为了表达作为融合蛋白的具有源自人IgGI免疫球蛋白的Fc部分的可溶性的CD33，使用引物5′-GGC AGG GCG GCC CAG CCG GCC GAT CCA AATTTC TGG CTG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-CTC CGC GGC CGC CAT GAA CCACTC CTG C-3′(SEQ ID NO：5)通过PCR对缺失了跨膜结构域和细胞内结构域的CD33的cDNA片段进行扩增。将扩增的DNA片段连接到pSecTag-C-FcpSecTag-C-Fc载体上，该载体含有人IgGI重链的Fc部分的编码序列(如Peipp等，J Immunol Methods，257：161-176，2001所描述)，得到质粒pSecTag-C-hCD33-Fc。

患者样品和细胞系

在获得Erlangen-Nuremberg大学伦理委员会(Ethics Committees of theUniversity of Erlangen-Nuremberg)的同意和批准后，制得了源自AML患者的肝素化外周血样品和骨髓样品。用Percoll分离溶液(Biochrom，Berlin，Germany)分离单核细胞(MNCs)，并将MNCs培养在含有20％的胎牛血清(FCS)，以及含有或不含有50ng/ml的IL-3和10ng/ml的GM-CSF(Sigma，Deisenhofen，Germany)的RPMI 1640-Glutamax-I培养基(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。将源自白血病的细胞系U937、HL-60、THP-1、CEM和Namalwa(DSMZ；German Collection of Microorganisms and Cell Lines，Braunschweig，Germany；(Drexler，H.G.The leukemia-lvmphoma cell line facts book，SanDiego：Academic Press，2001)培养在含有10％的FCS和100单位/ml的青霉素(Invitrogen)及100μg/ml的链霉素(Invitrogen)的RPMI 1640-Glutamax-I培养基中。将人293T细胞(ATCC)培养在含有10％的FCS和100单位/ml的青霉素及100.μg/ml的链霉素的DMEM-Glutamax-I培养基(Life Technologies，Karlsruhe，Germany)中。

免疫毒素的细胞毒性效应的检测

对于剂量反应实验，将细胞以1.5×10⁵/ml的浓度接种在24孔培养板中，加入不同浓度的免疫毒素。正如公开所述，通过使用PI的低渗溶液进行核染色以检测细胞的死亡(Dorrie等，Cancer Res，67：4731-4739，2001；Nicoletti等，J Immunol Methods，739：271-279，1991)。通过检测亚二倍体核DNA片段的含量来确定细胞死亡的程度。对于每一个样品，收集15,000份数据并分析亚二倍体核DNA的含量。为了确定细胞的死亡是否是由细胞凋亡所导致的，以2.5×10⁵/ml浓度接种细胞，并用免疫毒素进行处理。按照生产商提供的方法，使用溶解于PBS中的结合有异硫氰酸荧光素(FITC)的膜联蛋白V和PI对全细胞进行染色(Pharmingen，Heidelberg，Germany；Vermes等，JImmunol Methods，784：39-51，1995)。对于抑制实验，将细胞以1.5×10⁵/ml的浓度接种在24孔培养板中，在加入免疫毒素1小时前，向细胞中加入100倍摩尔过量的亲本scFv抗体或不相关的scFv抗体。通过台盼蓝染色法进行活细胞计数。

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

按照标准的方法进行SDS-PAGE(Laemmli，Nature，227：680-685，1970)。用考马斯亮蓝R250(Sigma)对凝胶进行染色。用结合有辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的第二抗体进行蛋白质印迹分析(Dianova，Hamburg，Germany；Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual.In.ColdSpring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998)。用增强的化学发光试剂(Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany)进行检测。用五-组氨酸抗体对ScFvs和scFv-ETA′融合蛋白进行检测(Qiagen，Inc.，Hilden Germany)。

统计分析

所有的统计分析都是采用微软的EXCEL软件进行的。P值是通过双尾配对的t检验(two-tailed paired t tests)获得的，其中，该检验以95％的置信区间来评价与未处理组相比的统计显著性。

实施例1

CD33scFV-ETA′免疫毒素的制备

重组免疫毒素的制备及其特异性结合

用纯化的来源于人CD33的重组嵌合蛋白对Balb/c小鼠进行免疫，以制备新的CD33特异性的单链Fv(scFv)抗体片段。为了制备免疫原，将CD33的细胞外结构域融合到人IgG I抗体的Fc部分以确保嵌合蛋白的溶解性和天然构象。从免疫的小鼠的脾脏RNA中制备噬菌体展示文库，并分离了六种新的CD33反应性噬菌体。对从具有最强反应活性的噬菌体中分离的cDNA插入片段进行亚克隆，并融合到编码缺失受体结合结构域的被截短的假单胞菌外毒素A的编码序列中。用能够确保细胞蛋白的正确逆向运输的KDEL四肽的编码序列替换能够指导真正的毒素的逆向运输的C-末端的五肽REDLK的编码序列(SEQ ID NO：2)。所述替换按照公开的实施例的方式进行(Brinkmann等，Proc Natl Acad Sci U S A，88：8616-8620，1991)，以优化细胞内到内质网(ER)的运输。可变的轻链和重链的结构域(V_L和V_H)通过编码20个氨基酸的人工接头(G₄S)₄的序列进行连接。

将编码STREP-标签的序列和编码六组氨酸-标签的序列结合到N末端以便于检测和纯化，并且在图1中表示了得到的纯化融合蛋白的示意性说明。将得到的多肽在大肠杆菌中表达，并使用streptactin基质通过亲和层析对将外周胞质的提取物进行纯化。一个亲和纯化循环就能得到含量很高的与对六组氨酸标签具有特异性的抗体反应的蛋白。蛋白质印迹成像和考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶的成像分别表示在图2A和2B中。

每升大肠杆菌培养物产生约15-20μg的纯化蛋白质。为了比较，从公开的小鼠抗人CD19杂交瘤4G7开始，通过类似的方法构建含有ETAKDEL变体(SEQ ID NO：3)的CD19特异性免疫毒素(Meeker等，Hybridoma，3：305-320，1984；Lang等，Blood，703：3982-3985，2004)。在大肠杆菌中表达后，将外周胞质纯化，获得了相似的产率。用CD33阳性人单核细胞系U93和来自人T细胞型急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)的CD33阴性的CEM细胞来检测CD33免疫毒素(被称为CD33-ETA′)的特异性结合性能，结果分别如图3A和3B所示。

为了比较，构建了CD19特异性的ETA′免疫毒素(被称为CD19-ETA′)，并用源自人Burkitt淋巴瘤的细胞系CD19阳性Namalwa细胞和CD19阴性U937细胞与其进行反应，结果分别如图3C和3D所示。以摩尔浓度远远过量的相应亲本scFv进行竞争结合实验，以进一步证明CD33-ETA′的特异性结合性能，结果如图5所示。

a、可溶性CD33-Fc-融合蛋白的表达和纯化

使用包括5mmol/l的氯喹的磷酸钙的方法将20μg表达载体pSecTag-C-hCD33-Fc瞬时转染到293T细胞中(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Ed.3.Cold Spring Harbor，NY：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)。12小时后，用新鲜的培养基替换转染培养基。每天收集上清，持续收集5天，并将收集的上清合并。使用蛋白A琼脂糖珠(Sigma)通过亲和层析进行纯化。

b、CD33转染的细胞的制备

为了制备在表面表达hCD33的293T细胞，按照上述方法用20μg载体pcDNA3.1-hCD33瞬时转染293T细胞。在24小时后，通过FACS分析对表面表达的CD33进行检测。

c、小鼠的免疫

按照欧洲对实验动物的保护的标准来饲养BALB/c小鼠(Charles River，Sulzfeld，Germany)。将约60μg的纯化的CD33-Fc融合蛋白与TiterMaxGold^TM佐剂(Sigma)混合，在第0天进行腹膜内注射。在第26天和41天，通过皮下注射40μg蛋白质进行强化。在第74天，使用40μg蛋白质进行最后一次的腹膜内注射。三天后，处死小鼠并在无菌条件下收集脾脏。在不同的时间点，通过用表达质粒pcDNA3.1-hCD33瞬时转染的293T细胞进行FACS检测，对血清中是否含有抗-hCD33进行分析。

d、scFv噬菌展示文库的构建

按照生产商提供的方法用Trizol试剂(Invitrogen)提取免疫小鼠的脾脏的总RNA。用10-15μg的总RNA制备第一链cDNA(Krebber等，J ImmunolMethods，207：35-55，1997)。按照公开的方法通过PCR对免疫球蛋白可变区的cDNAs进行扩增，并克隆到噬菌粒载体pAK100上(Krebber等，J ImmunolMethods，207：35-55，1997；Peipp等，J Immunol Methods，257：161-176，2001)。按照下述公开的方法，对组合的scFv文库和丝状噬菌体进行增殖(Peipp等，JImmunol Methods，257：161-176，2001)。

e、具有完整细胞的噬菌体展示文库的淘选(Panning)

使用CD33阳性293T转染子按照公开的方法对具有完整细胞的噬菌体展示文库进行淘选(Peipp，等，J Immunol Methods，257：161-176，2001)。用50mM的HCI洗脱结合的噬菌体。淘选6轮后，纯化个体噬菌体并通过应用生物系统自动DNA序列仪(ABI Prism 310 Genetic Analyzer；Perkin-Elmer，Ueberlingen，Germany)对插入的序列进行序列分析(Sambrook等，2001，supra)。

f、可溶性scFv抗体在细菌中的表达和纯化

对于抗体片段的可溶性表达，将编码CD33特异性的scFvs的cDNAs亚克隆到表达载体pAK400中，并将质粒在大肠杆菌HB2151(来自Dr.G.Winter；MRC，Cambridge，United Kingdom)中进行增殖。CD33特异性的scFv抗体的表达和纯化按照公开的方法进行(Peipp等，J Immunol Methods，257：161-176，2001)。

g、scFv-ETA′融合蛋白的构建和纯化

将编码CD33-特异性的和CD19-特异性的scFvs的序列从含有相应的scFv片段的pAK400-抗CD33和pAK400-抗CD19(Meeker等，Hybridoma，3：305-320，1984)的表达构建体中分离出，并以Sfil框(Sfil-cassettes)克隆到载体pASK-20aa-接头中(M.Peipp，unpublished data)，该载体含有编码N-末端STREP-组氨酸和六-组氨酸标签的序列和20个氨基酸的接头(G₄S)₄的序列。使用Not I和Cel II消化质粒，将截短的ETA变体(Peipp等，Cancer Res，62：2848-2855，2002)的编码序列连接到载体上，得到质粒pASK-STREP-His-CD33-ETA′-REDLK和pASK-STREP-His-CD19-ETA′-REDLK。将编码两种免疫毒素的序列克隆到表达载体pet27b(+)(Novagen，Inc.)中。为了将C-末端REDLK滞留基序(SEQ ID NO：3)替换成KDEL基序(SEQ ID NO：1)，以载体pet27b(+)-STREP-His-CD33-ETA′-REDLK作为模版，以5′-CG CGC TCG AGC CTG C-3′(SEQ ID NO：6)和5-CCA AAG CTC AGCAAG CTT TCA TTA CAG CTC GTC CTT CGG CGG TTT GCC GGG-3(SEQID NO：7)作为引物进行PCR反应。使用Xhol和Cel II消化获得的DNA片段，然后连接到通过相同的限制性酶消化的pet27b(+)-STREP-His-CD33-ETA-REDLK和pet27b(+)-STREP-His-CD19-ETA-REDLK中，这样制备了表达载体pet27b(+)-STREP-His-CD33-ETA-KDEL和pet27b(+)-STREP-His-CD19-ETA-KDEL。

在公开的渗透压力条件下表达scFv-ETA′融合蛋白(Barth等，Blood，95：3909-3914，2000)。在诱导16-20小时后，收获诱导的培养物。在4℃温度下，将从1升培养基中获得的细菌沉淀重悬在200ml的外周胞质提取缓冲液中[100mM Tris，pH 8.0，0.5M sucrose，1mM EDTA]3小时。按照生产商提供的方法，使用链霉素琼脂糖珠通过亲和层析对scFv-ETA′融合蛋白进行富集(IBA GmbH，Goettingen，Germany；Skerra等，Methods Enzymol，326：271-304，2000)。

h、流式细胞分析

采用FACSCalibur FACS仪器和CellQuest软件(Becton Dickinson，Mountain View，CA)对scFvs与细胞的结合情况进行分析。按照公开的方法(Peipp等，J Immunol Methods，257：161-176，2001)用scFv抗体对细胞进行染色。用非相关的scFv作为对照背景染色。对于每一个样品，收集10,000份数据，并采用适当的散射门(scatter gates)对全细胞进行分析，以排除细胞碎片和聚集物。为了监测scFv-ETA′融合蛋白的结合，将5×10⁵个细胞与20μl的浓度为5μg/ml的免疫毒素在冰浴中孵育30分钟。用非相关的免疫毒素作为对照背景染色。用PBA缓冲液洗涤细胞(含有PBS、0.1％BSA和7mM Na-叠氮化合物)，然后将细胞与用PBA缓冲液稀释了250倍的50μl的多克隆兔抗-假单胞菌ETA血清(Sigma)进行孵育。对细胞进行洗涤，并将细胞与结合荧光素-异硫氰酸酯(FITC)的猪抗-兔-IgG(DAKO Diagnostica GmbH，Hamburg，Germany)孵育30分钟。在洗涤后，用FACS分析细胞。为了检测转染的293T细胞中hCD33在细胞表面的表达，将5×10⁵个细胞与20μl的浓度为1μg/ml的抗-hCD33的抗体(Clone WM-54；DAKO Diagnostica GmbH)在冰浴中孵育30分钟。小鼠的IgG I作为同型对照。用PBS洗涤细胞后，加入20μl的结合了PE的山羊-抗-小鼠-IgG I抗体。在洗涤后，按照上述方法分析细胞。

2、CD33-ETA′的抗原特异性细胞毒素的活性

在处理后的0、24、48、72和96小时，通过碘化丙锭(PI)染色和流式细胞检测对核DNA含量进行检测，以确定CD33-ETA′介导的培养的CD33阳性U937细胞CD33阴性CEM细胞和Namalwa细胞的特异性死亡，结果如图4所示。

为了进一步证实免疫毒素的抗原特异性，将试剂加入到U937细胞和用台盼蓝拒染法计数的活细胞中。用过量浓度的亲本CD33特异的scFv抗体进行的预处理抑制了细胞的死亡。以相似的摩尔过量的CD19特异性的scFv的预孵育处理不能抑制细胞的裂解。此外，通过缺失了毒素成分的CD33-特异性的和CD19-特异性的scFvs处理细胞，检测不到细胞活力的丧失。结果如图5所示。

3、CD33-ETA′免疫毒素导致的细胞凋亡

为了研究所述试剂导致的死亡是通过细胞凋亡或者排除通过其它的细胞途径，通过膜联蛋白V和PI染色对细胞凋亡进行特异性检测。实际上，可以清楚地检测到从膜联蛋白V⁺PI^-(膜联蛋白V阳性和PI阴性)的早期凋亡时期至膜联蛋白V⁺PI⁺的晚期凋亡时期的细胞的整个凋亡时期。如图6A-6E，CD33-ETA′导致了CD33阳性U937细胞、HL-60细胞和THP-1细胞的凋亡，而CD19-ETA′细胞不能导致这些细胞的调亡。在使用CD33-ETA′对U937细胞处理24小时后，导致了36％的细胞处于早期凋亡和18％的细胞死亡，而在48小时和72小时后，相应的数值分别为17％、53％和8％、84％(图6A)。

此外，CD33-ETA′还通过细胞凋亡导致了两种额外的CD33阳性人恶性细胞系HL-60和THP-1的死亡，而CD19-ETA′则难以导致这两种细胞系的裂解(图6D-6E)。然而，为了确定CD19直接导致毒性的功能，在平行实验中，CD19-ETA′导致了来源于儿科急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的CD19阳性细胞系Nalm-6和REH的裂解。这些结果证实了CD33-ETA′具有以高抗原特异性的方式对来源于不同的CD33阳性的人肿瘤细胞系通过细胞凋亡的方式杀死靶细胞的能力，其中，所述人肿瘤细胞系代表了不同的疾病。

4、人的原发性AML细胞的诱导死亡

为了研究所述试剂对人的原发性细胞的效果，从三位被诊断患有AML的患者的骨髓中分离出MNCs。将免疫毒素加入到源自患者的AML细胞中。新鲜细胞由幕尼黑医科大学(University Hospital Munich)(Klinikum derlnnenstadt der LMU；Prof.Bertold Emmerich；Dr.Fuat Oduncu)、Erlangen医科大学(the University Hospital Erlangen)(Medizin Klinik III；Prof.J.Kalden；Dr.B.Stockmeyer)和纽伦堡Nord医院(Klinikum Nord，City of Nuremberg)(Prof.Wilhelm)提供。

在第一个病例中(患者1)，被诊断为AML的处于FAB M4时期的患者的骨髓中含有约50％的CD33阳性细胞。在时间点为0时用500ng/ml的单剂量的我们的试剂处理这种混合细胞，48小时后导致的细胞裂解比自发裂解的背景值高20％(图7)。用100倍摩尔过量的亲本CD33-scFv对细胞进行的预处理抑制了细胞的死亡，但用相同过量的非相关的CD19-scFv对细胞进行的预处理不能抑制细胞的死亡。

类似地，另一位被诊断为AKL FAB M1期的患者(患者2)的外周血含有约50％的CD3阳性细胞。培养96小时后，使用500ng/ml单剂量的所述试剂对细胞进行处理，被杀死的细胞比未处理对照组多30％(图8A)。第三位被诊断为AML FAB M4时期的患者(患者10)的骨髓细胞含有约25％的CD33阳性细胞，在用CD33-ETA′处理该细胞48小时后，裂解的细胞比背景组的自发裂解的水平高19％(图8B)。通过比较发现，CD19-ETA′毒素对来自于患者2和3的细胞没有作用(图8A和8B)。含有不同百分比的CD33阳性细胞的来自其它六位AML患者的外周血或骨髓的细胞，通过所述免疫毒素处理后，与背景水平相比，裂解的细胞提高了10％或不足10％。在48小时后用500ng/ml的第二剂量免疫毒素处理来自于患者9的细胞，并且用50ng/ml的白介素-3(IL-3)和/或10ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与来自患者7-10的细胞进行孵育并没有增加CD33-ETA′导致的细胞裂解(见下表1)。来自于一位患者(患者5)的骨髓细胞对CD33-ETA′没有反应。

表1：CD33-ETA′对不同AML患者的MNCs的细胞毒素活性

^*细胞通过GM-CSF(10ng/ml)进行处理；

细胞通过IL-3(50ng/ml)进行处理；

细胞在48小时后通过第二剂量的CD33-ETA′进行处理；BM：骨髓；PB：外周血。

应当理解为，根据一方面描述的实施方式可以用于所描述的组合物和方法的每一方面。还应当理解的是，所述实施方式可以以结合的形式或者单独的形式使用。还应当意识到，所述实施方式的次组合(sub-combination)可以用于不同方面。尽管所述实施方式被描述为具有多种选择性的特征，但是除非特别指出，所述的特征是不必要的。

上述内容仅仅说明了本发明的原则。应当理解为，在不背离本发明的原则的情况下，本领域的技术人员能够设计出各种调整，尽管在本文中没有明确地描述或表示出来，但均包括在本发明的精神和范围内。此外，在本文中叙述的实施例和限制性的语言主要是为了帮助读者理解本发明的原则及深化由发明人提出的本领域的概念，不应理解为仅局限于所述的特定实施例和条件。此外，本文中叙述的原则、方面和本发明的实施方式及其具体的实施例旨在包括其结构和功能的等价物。而且，所述等价物包括目前已知的等价物和未来开发的等价物，即所开发的具有相同功能的任何元素，不管其结构是否相同。因此，本发明的范围不局限于本文中所示的和描述的示例性的实施方式。此外，所附的权利要求体现了本发明的范围和精神。

序列表

<110>埃朗根-纽伦堡大学

     G.H.法伊

     M.施韦姆莱恩

<120>CD-33特异性的单链免疫毒素及其使用力法

<130>598498009WO0

<140>Not Yet Assigned

<141>Filed Herewith

<150>US 60/703,692

<151>2005-07-29

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>内质网滞留信号序列

<400>1

Lys Asp Glu Leu

1

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>假单孢菌属(Pseudomonas sp)

<400>2

Arg Glu Asp Leu Lys

1               5

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成变体

<400>3

Glu Thr Ala Lys Asp Glu Leu

1               5

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ggcagggcgg cccagccggc cgatccaaat ttctggctg    39

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ctccgcggcc gccatgaacc actcctgc                              28

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgcgct cgag cctgc                                           15

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ccaaagctca gcaagctttc attacagctc gtccttcggc ggtttgccgg g    51

Claims (24)

1、一种融合蛋白，该融合蛋白含有：

抗体片段部分，该片段为能够与细胞表面抗原结合的scFv抗体片段；和

改性的毒性蛋白部分，该毒性蛋白部分通过稳定的肽键结合于所述抗体片段部分，其中，该毒性蛋白部分包括能促进向细胞内质网中转运的C-末端序列。

2、根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述抗体片段能够与CD33特异性地结合。

3、根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述C-末端序列为SEQID NO：1所示的序列。

4、根据权利要求1-3中的任意一项所述的融合蛋白，其中，所述毒性蛋白为假单胞菌外毒素A的变体。

5、根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述改性的毒性蛋白部分假单胞菌外毒素A的变体缺失了结合结构域。

6、根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述改性的毒性蛋白部分假单胞菌外毒素A的变体包括假单胞菌毒素的结构域II和III以及作为内质网滞留基序的KDEL四肽。

7、一种制剂，该制剂含有：

药学上可接受的载体；和

融合蛋白，该融合蛋白含有抗体片段部分和改性的毒性蛋白部分，该抗体片段为能够与细胞表面抗原结合的scFv抗体片段；该毒性蛋白部分通过稳定肽键结合于该抗体片段部分，其中，该毒性蛋白部分包括能促进向细胞内质网中转运的C-末端序列。

8、一种治疗方法，该方法包括：

对患有与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病的患者进行诊断；和

用治疗有效剂量的制剂对所述患者进行给药，该制剂含有药学上可接受的载体和融合蛋白，该融合蛋白含有能够与CD33特异性地结合的scFv抗体部分，该抗体部分通过肽键结合于含有由KDEL肽组成的C-末端序列的毒性蛋白部分。

9、根据权利要求8所述的方法，其中，所述疾病为急性骨髓白血病。

10、根据权利要求9所述的方法，其中，被诊断为急性骨髓白血病的所述患者为接受了前期治疗后复发的急性骨髓白血病患者。

11、根据权利要求8所述的方法，其中，所述疾病为儿科急性成淋巴细胞性白血病。

12、根据权利要求8-11中的任意一项所述的方法，该方法还包括：在一段时间内使用所述制剂对所述患者进行反复给药并在这段时间内对该患者进行监控。

13、一种诱导人细胞凋亡的方法，该方法包括：

将选自U937、HL-60和THP-1的细胞系与融合蛋白接触，其中，该融合蛋白含有抗体片段部分，该抗体片段部分与U937、HL-60和THP-1中的任何一种细胞系进行结合的亲和力为1×10^-6M或更高，该抗体片段部分通过稳定的肽键结合于改性的毒性蛋白部分，其中，该改性的毒性蛋白部分为假单胞菌外毒素A的变体，并且该假单胞菌外毒素A的变体还含有四肽KDEL。

14、根据权利要求13所述的方法，其中，所述抗体片段部分与CD33进行结合的亲和力为约1×10^-7M。

15、根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述假单胞菌外毒素A的变体缺失了完整假单胞菌外毒素A的可靠结合结构域。

16、根据权利要求13-15中的任意一项所述的方法，其中，所述融合蛋白以约50-2,000ng/ml的浓度与细胞接触。

17、一种用于治疗与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病的制剂，该制剂包括：

药学上可接受的注射用载体；和

融合蛋白，该融合蛋白包括scFv抗体片段和含有假单胞菌外毒素A的变体的部分，该抗体片段与CD33进行结合的亲和力为1×10^-6M或更高，该假单胞菌外毒素A的变体包括SEQ ID NO：1的C-末端序列，其中，该假单胞菌外毒素A的变体缺失了结合结构域，并且该融合蛋白在制剂中的浓度为约0.1-100mg/ml。

18、一种融合蛋白，该融合蛋白包括：

抗体片段部分，该抗体片段部分为包括抗体的重链和轻链的可变区的scFv片段，该抗体片段部分能够与CD33结合，并且该抗体片段部分通过重链和轻链之间的二硫键被稳定；和

改性的毒性蛋白部分，该毒性蛋白部分通过稳定的肽键结合于所述抗体片段的位置，其中，该毒性蛋白部分包括能促进向细胞内质网中转运的C-末端序列。

19、根据权利要求18所述的融合蛋白，其中，所述C-末端序列为SEQID NO：1所示的序列，所述毒性蛋白为假单胞菌外毒素A的变体。

20、根据权利要求19所述的融合蛋白，其中，所述改性的毒性蛋白部分假单胞菌外毒素A的变体缺失了结合结构域。

21、一种融合蛋白，该融合蛋白用于治疗与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病，该融合蛋白包括：

抗体片段部分，该片段为能够与细胞表面抗原结合的scFv抗体片段；

改性的毒性蛋白部分，该部分通过稳定的肽键结合于所述抗体片段部分；和

C-末端序列，该序列能促进向细胞内质网中转运。

22、根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述疾病选自急性骨髓白血病和儿科急性成淋巴细胞性白血病。

23、一种融合蛋白在制备用于治疗与表达CD33细胞表面抗原的细胞相关的疾病的药物中的应用，该融合蛋白包括：

抗体片段部分，该片段为能够与细胞表面抗原结合的scFv抗体片段；

改性的毒性蛋白部分，该部分通过稳定的肽键结合于所述抗体片段部分；和

C-末端序列，该序列能促进向细胞内质网中转运。

24、根据权利要求23所述的应用，其中，所述疾病选自急性骨髓白血病和儿科急性成淋巴细胞性白血病。

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