JP2022552875A - 多様な固形腫瘍を処置するためのｂ７ｈ３（ｃｄ２７６）を標的とする高親和性ナノボディ - Google Patents

多様な固形腫瘍を処置するためのｂ７ｈ３（ｃｄ２７６）を標的とする高親和性ナノボディ Download PDF

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Abstract

Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）を特異的に結合する単一ドメインモノクローナル抗体が記載される。単一ドメイン抗体は、ファージディスプレイライブラリーから選択されるラクダＶＨＨおよびウサギＶＨドメインナノボディを含む。Ｂ７Ｈ３を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および他の抗体コンジュゲートも記載される。単一ドメイン抗体およびそのコンジュゲートは、Ｂ７Ｈ３を発現する固形腫瘍の診断および処置のために使用することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／９２４，２９８号の利益を主張する。
分野
本開示は、高親和性でＢ７ホモログ３（Ｂ７Ｈ３）を結合する一本鎖モノクローナル抗体に関する。本開示は、例えば固形腫瘍の処置のための、モノクローナル抗体および抗体コンジュゲートの使用にさらに関する。
政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＢＣ０１０８９１の下での政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
背景
ナノボディは、１２ｋＤ～１５ｋＤの分子量および約４×２．５ｎｍのサイズを有するおよそ１２０アミノ酸から形成される、抗体の最も小さな公知の抗原結合断片である（Ｋｈｏｄａｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３７， ３１６－３２２， ２０１８）。最もよく研究されたナノボディは、ラクダ科の動物（ＶＨＨと称される）および軟骨魚類（ＶＮＡＲ）において天然に存在し得る（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂ Ｔｈｅｒ， ２， １－１１， ２０１９）、ならびにｉｎ ｖｉｖｏで一部のヒト重鎖病に存在し得る（Ｐｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４８， ９４９－９５２， １９９２）重鎖（ＶＨ）の可変領域に由来する。それらのサイズが小さいこと、高溶解度、優れた熱安定性、可逆的リフォールディング能、および従来のＩｇＧ全体と比較したｉｎ ｖｉｖｏでの比較的容易な組織浸透により、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（ａＴＴＰ）および血栓症の処置のためのヒト化ラクダ科ＶＨＨである最初のナノボディ薬であるカプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）（ＣＡＢＬＩＶＩ（登録商標））の承認によって証明されるように（Ｅｌｖｅｒｄｉ ａｎｄ Ｅｓｋａｚａｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ， １３， １２５１－１２５８， ２０１９；Ｓｃｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３８０， ３３５－３４６， ２０１９）、医学用途で、または研究ツールとして、ナノボディを使用することができる（Ｋｈｏｄａｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３７， ３１６－３２２， ２０１８；Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８， １５７－１７４， ２００９；Ｈｏ， Ａｎｔｉｂ Ｔｈｅｒ， １， １－５， ２０１８）。
歴史的に、ラクダ科ＶＨＨドメイン抗体は、ヒトＶＨドメイン抗体の出現まで、研究の主体であった（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１０， Ｅ１０８３－１０９１， ２０１３；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ， １２， ４１６－４２６， ２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１４， Ｅ６６２３－Ｅ６６３１， ２０１７）。ラクダ科の血清には、従来のＩｇＧと、特定の種に応じて全血清免疫グロブリンの４５％～７５％を占めるかなりの量の重鎖のみのＩｇＧ（ＨＣＡｂ）との両方が存在する（Ｋｈｏｄａｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３７， ３１６－３２２， ２０１８）。ＨＣＡｂは、ＶＨＨ断片、単独の抗原結合ドメイン、その後のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに従来のＩｇＧにおいてＶＨ－ＣＨ１ドメインと対合する軽鎖からなる。組換えＶＨＨドメインは、活用されている機能的実体である。
自然に進化したラクダ科ＶＨＨドメインを高度に可溶性かつ安定性にするいくつかの構造的特色が存在する。第１に、ヒトＶＨ生殖系列におけるＶａｌ３７（Ｋａｂａｔ番号付け）は、典型的には、ドメインのよりコンパクトかつ安定な疎水性パッキングを形成するＶＨＨドメインのＰｈｅ３７（またはＴｙｒ３７）であり（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２３１， ２５－３８， １９９９）、これは、おそらく、ＶＨＨを特に安定にする駆動力である（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ， １２５， ６５４－６６１， ２０１８）。第２に、ヒトＶＨ生殖系列における軽鎖に接触する残基、Ｇ４４、Ｌ４５およびＷ４７は、ＶＨＨにおけるＥ４４（またはＱ４４）、Ｒ４５（またはＣ４５）およびＧ４７（またはＳｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ）であり（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２１， ４８４－４９０， ２００３）、アクセス可能な表面積をより親水性にし、凝集性を低下させる。さらに、ＶＨＨドメインの一部では、Ｗ１０３がＲ１０３で置き換えられる場合がある。第３に、ＶＨＨドメインは、通常、ヒト／齧歯類ＣＤＲ３よりも長いＣＤＲ３を有し、これらは典型的には、ＣＤＲ１の末端（ラクダ）またはＣＤＲ２の開始部位（ラマ）のＣｙｓとのさらなるジスルフィド結合を形成するＣＤＲ３のＣｙｓを含有する（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９８， １５７－１７４， ２００９）。さらに、このさらなるＣＤＲ３ジスルフィド結合および標準的なＣ２２～Ｃ９２ジスルフィド結合は、ＶＨＨドメインをより安定にし（６０～７８℃の範囲のＴｍ値）、可逆的なアンフォールディング／リフォールディングを可能にする（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２１， ４８４－４９０， ２００３）。
１９８９年に、リゾチームおよびキーホール－リンペットヘモシアニンで免疫したマウスの脾臓から作製されたｃＤＮＡ発現ライブラリーから、第１の非ＶＨＨ哺乳動物ドメイン抗体をスクリーニングし、２つのマウスＶＨドメインが、２０ｎＭ範囲のリゾチームに対する親和性を示し（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１， ５４４－５４６， １９８９）、初めて「単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）」という名称が示唆された。その後、ラクダ科ＶＨＨが発見され、医薬および他の適用においてより魅力的であるヒトＶＨドメイン抗体を調査するという考えが高まった。ラクダ科ドメイン抗体とヒトドメイン抗体の両方が広く研究されているが、供給源にアクセスするのに、特に免疫によるドメイン抗体の発見に関していくつかの技術的制限が存在する。供給源へのアクセス可能性の制限を克服するために、いくつかの戦略が開発されて、ヒトまたはヒト化ＶＨドメイン抗体を生成した。ナイーブヒトＶＨドメインライブラリーのファージディスプレイは証明された方法であるが（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１０， Ｅ１０８３－１０９１， ２０１３；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ， １２， ４１６－４２６， ２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １１４， Ｅ６６２３－Ｅ６６３１， ２０１７）、親和性は、免疫抗体の親和性と常に同程度に高い訳ではない。ヒトドメイン抗体を生成するための別の方法は、ヒトＶＨ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物を使用することである（Ｓｃｈｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ４６， ２１３７－２１４８， ２０１６；Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０３， １５１３０－１５１３５， ２００６）。ヒトドメイン抗体を直接単離する代わりに、免疫動物のＶＨドメイン抗体を生成した後にヒト化することも、高親和性を有するヒト様抗体を生成する１つの方法である。
Ｋｈｏｄａｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３７， ３１６－３２２， ２０１８ Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂ Ｔｈｅｒ， ２， １－１１， ２０１９ Ｐｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １４８， ９４９－９５２， １９９２
概要
本開示は、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）を特異的に結合する１０個のラクダ単一ドメインＶＨＨモノクローナル抗体および２個のウサギＶＨ単一ドメイン抗体について記載する。本明細書において、ＲＷＢ１２（「Ｂ１２」）、ＲＷＧ８（「Ｇ８」）、ＲＷＣ４（「Ｃ４」）、ＲＷＢ２、ＲＷＨ５、ＲＷＤ５、ＲＷＣ３、ＲＷＧ４、ＲＷＤ９およびＲＷＨ１と称されるＢ７Ｈ３特異的ラクダ抗体、ならびに本明細書において、ＲＦＡ１およびＲＦＢ１と称されるＢ７Ｈ３特異的ウサギ抗体は、高親和性でＢ７Ｈ３を結合する。開示されるナノボディから構成されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の生成についても開示される。
Ｂ７Ｈ３を結合する、例えば特異的に結合するモノクローナル抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ナノボディＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＣ４、ＲＷＢ２、ＲＷＨ５、ＲＷＤ５、ＲＷＣ３、ＲＷＧ４、ＲＷＤ９、ＲＷＨ１、ＲＦＡ１またはＲＦＢ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。開示されるモノクローナル抗体を含むコンジュゲートも本明細書において提供される。一部の例では、本明細書において開示されるモノクローナル抗体を含むＣＡＲ（ならびにＣＡＲを発現するＴ細胞およびナチュラルキラー細胞）、イムノコンジュゲート（免疫毒素など）、多特異性抗体（二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）など）、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、抗体－放射性同位体コンジュゲート（がんの診断およびイムノＰＥＴイメージングなどの場合）および融合タンパク質が提供される。
Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物も本開示によって提供される。
本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体、ＣＡＲ、イムノコンジュゲート（免疫毒素など）、多特異性抗体および融合タンパク質をコードする核酸分子およびベクターも本明細書において提供される。Ｂ７Ｈ３モノクローナル抗体またはＣＡＲをコードする核酸またはベクターを含む単離された細胞がさらに提供される。
対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんを処置する方法、および対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの腫瘍成長または転移を阻害する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、対象に、本明細書に開示されるモノクローナル抗体の治療有効量を投与すること、または対象に、本明細書に開示されるモノクローナル抗体を含むＣＡＲ（またはＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ ＮＫ細胞）、イムノコンジュゲート（免疫毒素など）、ＡＤＣ、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲートまたは融合タンパク質の治療有効量を投与することを含む。
さらに、試料中のＢ７Ｈ３の発現を検出する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、試料を本明細書に開示されるモノクローナル抗体と接触させることと、抗体の試料への結合を検出することとを含む。
対象を、Ｂ７Ｈ３陽性がんを有するものとして診断する方法も提供される。一部の実施形態では、方法は、対象から得られた試料を本明細書に開示されるモノクローナル抗体と接触させることと、抗体の試料への結合を検出することとを含む。
前記のおよび他の目的ならびに本開示の特色は、添付の図面を参照しながら進める、以下の詳細な記載からより明らかとなる。
図１Ａ：組換えＢ７Ｈ３を有するウサギの免疫、ＶＨドメインファージディスプレイライブラリーの作成、およびＢ７Ｈ３結合剤の選択を示す概略図。
図１Ｂ：精製されたＢ７Ｈ３－ｈＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。ベータ－メルカプトエタノールによって非還元（Ｎｏｎ．）または還元した（Ｒｅｄ．）、１または５マイクログラムの精製されたＢ７Ｈ３－ｈＦｃを８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ－２５０染色によってタンパク質のバンドを可視化した。
図２Ａ～２Ｂ：Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃ免疫ウサギ血清の力価測定およびその細胞への結合の確認。（図２Ａ）タンパク質結合ＥＬＩＳＡによるＢ７Ｈ３－ｈＦｃ免疫ウサギ血清の力価測定。メソテリンのＮ末端断片に由来するＩＡＢ－ｈＦｃが、ｈＦｃタグ対照としての役割を果たした。Ｒ３１Ｍ０、Ｒ３１Ｍ１、Ｒ３１Ｍ２、およびＲ３１Ｍ３は、免疫前、１回目、２回目、および３回目の免疫の血清を表した。（図２Ｂ）免疫血清の細胞結合アッセイ。網掛け区域は、ＦＩＴＣにコンジュゲートした二次抗体のみ（ヤギ抗ウサギ）で染色した細胞を表す；左の曲線、免疫前の血清で染色した細胞；右の曲線、免疫した血清Ｒ３１Ｍ３で染色した細胞。
図３Ａ～３Ｂ：Ｂ７Ｈ３結合剤の配列および構造モデリング。（図３Ａ）ウサギ抗ハイプシンモノクローナル抗体（ＰＤＢ＃５ＤＵＢ、配列番号３４）由来の類似するＶＨに加えて、Ｂ７Ｈ３結合剤（Ａ１、配列番号１１；Ｂ１、配列番号１２）の配列アライメント。ＩＭＧＴ描画システムによってＣＤＲ領域を規定した。（図３Ｂ）オンラインソフトウェアＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを使用するＡ１およびＢ１結合剤の構造モデリング。５ＤＵＢの結晶構造も比較として示される。 同上。
図４Ａ～４Ｃ：Ｂ７Ｈ３結合剤の結合特性。（図４Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来の精製されたＡ１およびＢ１結合剤（ＶＨ－Ｈｉｓ－ＦＬＡＧ融合体）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。β－メルカプトエタノールによって還元していない（Ｎｏｎ．）または還元した（Ｒｅｄ．）、２マイクログラムの精製されたＢ７Ｈ３－ｈＦｃを、８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。ＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーＲ－２５０染色によってタンパク質のバンドを可視化した。（図４Ｂ）ＥＬＩＳＡによるタンパク質結合親和性の測定。５マイクログラムのＢ７Ｈ３－ｈＦｃをＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、様々な濃度のドメイン抗体をプレートと共にインキュベートし、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体Ｍ２によって結合を検出した。ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して結合曲線をプロットし、一部位結合の双曲線のソフトウェアのアルゴリズムによってＥＣ５０の計算値を決定した。（図４Ｃ）フローサイトメトリーによる細胞結合の決定。１ｍＬ当たり１０マイクログラムのドメイン抗体を１００万個の細胞と共に共インキュベートした。ＡＰＣにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体によって、抗体結合を可視化した。「１」と標識した曲線は、二次抗体のみで染色した細胞を表し；「２」と標識した曲線は、Ａ１またはＢ１ドメイン抗体で染色した細胞を表す。 同上。
図５：ＨＥＫ－２９３細胞におけるＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質の産生。組換えＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ－２９３細胞中で発現させ、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製されたＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＤＡ－ＰＡＧＥゲル上で示されたように純度９９％を超えており、非還元条件下で（左）１５４ｋＤａおよび還元条件下で（右）７７ｋＤａの分子量を有した。Ｂ７Ｈ３－Ｆｃの収量は２ｍｇ／Ｌであった。Ｇｌｙｐｉｃａｎ ２（ＧＰＣ２）－Ｆｃを対照タンパク質として使用した。
図６：Ｂ７Ｈ３結合剤に関する８つのラクダＶＨＨライブラリーでのファージパニング。８個体のラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ）から作成された８つのＶＨＨ単一ドメイン抗体ライブラリーを使用して、組換えＢ７Ｈ３－Ｆｃタンパク質でのファージパニングを３回行った。各回のファージ力価が図に示される。３回目のファージパニングにおけるファージ力価の増加は、Ｂ７Ｈ３への高親和性ＶＨＨ結合剤の富化を示した。
図７Ａ～７Ｂ：ＲＷＣ４ ＶＨＨナノボディの精製。（図７Ａ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から溶出したＲＷＣ４ ＶＨＨラクダナノボディ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（図７Ｂ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのナノボディ溶出のクロマトグラフ。ＲＷＣ４の収量は３３．８ｍｇ／Ｌであった。
図８Ａ～８Ｂ：ＲＷＧ８ ＶＨＨナノボディの精製。（図８Ａ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から溶出したＲＷＧ８ ＶＨＨラクダナノボディ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（図８Ｂ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのＲＷＧ８ナノボディ溶出のクロマトグラフ。ＲＷＧ８の収量は５０ｍｇ／Ｌであった。
図９Ａ～９Ｂ：ＲＷＢ１２ ＶＨＨナノボディの精製。（図８Ａ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から溶出したＲＷＢ１２ ＶＨＨラクダナノボディ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（図９Ｂ）ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からのＲＷＢ１２ナノボディ溶出のクロマトグラフ。ＲＷＢ１２の収量は１３２ｍｇ／Ｌであった。
図１０：選択Ｂ７Ｈ３標的化（ｔａｒａｇｅｔｅｄ）ＶＨＨナノボディのＮＢＥＢ神経芽腫細胞への結合。Ｂ７Ｈ３特異的ナノボディの結合をＦＡＣＳ解析によって評価した。試験抗体（ＲＷＣ４、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＡ１２、ＲＷＧ４およびＲＷＤ５）のうちの６つはＮＢＥＢ細胞を結合することが可能であった。
図１１：選択Ｂ７Ｈ３標的化（ｔａｒａｇｅｔｅｄ）ＶＨＨナノボディのＡ４３１類表皮癌細胞への結合。Ｂ７Ｈ３特異的ナノボディの結合をＦＡＣＳ解析によって評価した。試験抗体（ＲＷＣ４、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＡ１２、ＲＷＧ４およびＲＷＤ５）のうちの６つはＡ４３１細胞を結合することが可能であった。
図１２：ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＣ４の動態。ＲＷＣ４の会合／解離特性を組換えヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃタンパク質を使用して、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）で測定した。ＲＷＣ４のＫＤ＝３．８ｎＭ、ＲＷＣ４のＫｏｎ＝２．６５×１０４、およびＲＷＣ４のＫｄｉｓ＝１．０１×１０－４。
図１３：ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＧ４の動態。ＲＷＧ４の会合／解離特性を組換えヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃタンパク質を使用して、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）で測定した。ＲＷＧ４のＫＤ＝６．９４ｎＭ、ＲＷＧ４のＫｏｎ＝９．１３×１０３、およびＲＷＧ４のＫｄｉｓ＝６．３４×１０－５。
図１４：Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲを発現するレンチウイルスのＴ細胞トランスフェクション効率。トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって測定した。
図１５Ａ～図１５Ｄ：Ｂ７Ｈ３陽性細胞におけるＢ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性。（図１５Ａ）ヒト神経芽腫ＮＢＥＢ細胞。（図１５Ｂ）ヒト神経芽腫ＬＡＮ－１細胞。（図１５Ｃ）ヒト腺癌ＢＸＰＣ－３細胞。（図１５Ｄ）ヒト膵癌Ｍｉａｃａｐａ２細胞。ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８およびＲＷＣ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的溶解を誘導するのに最も有効であった。 同上。 同上。 同上。
図１６Ａ～１６Ｄ：Ｂ７Ｈ３陽性およびＢ７Ｈ３ノックアウト細胞におけるＢ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性。（図１６Ａ）ヒト神経芽腫ＩＭＲ３２細胞。（図１６Ｂ）マウス結腸腺癌ＭＣ３８－ＣＤ２７６＋細胞。（図１６Ｃ）ヒト神経芽腫ＩＭＲ３２－ＣＤ２７６－／－細胞。（図１６Ｄ）マウス結腸腺癌ＭＣ３８－ＣＤ２７６－／－細胞。ＣＡＲ－Ｔ細胞のうちの３つ（ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８およびＲＷＣ４）は、Ｂ７Ｈ３陽性細胞への強力な細胞傷害性を示したが、Ｂ７Ｈ３陰性細胞には示さなかった。 同上。 同上。 同上。
図１７Ａ～１７Ｃ：膵がん細胞に対するＢ７Ｈ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性。ヒトＢ７Ｈ３標的化ナノボディ由来のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｂ１２、Ｇ８、およびＣ４）の細胞傷害性を、ルシフェラーゼを発現する２つのＢ７Ｈ３陽性膵がん細胞系Ｐａｎｃ－１ ＧＦＰ－Ｌｕｃ（ＧＬ）およびＢｘＰＣ－３ ＧＬを使用して評価した。（図１７Ａ）フローサイトメトリーは、Ｐａｎｃ－１とＢｘＰＣ－１の両方がＢ７Ｈ３陽性細胞系であることを示す。（図１７Ｂ）Ｇ８、Ｃ４およびＢ１２ ＣＡＲによるＴ細胞形質導入効率は、それぞれ、６０．４％、５８．６％、および６８．４％であった。無関係のＣＡＲ（ＣＤ１９）によるＴ細胞の形質導入効率は、３２％であった。（図１７Ｃ）Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ（Ｇ８／Ｂ１２／Ｃ４）Ｔ細胞および無関係の対照ＣＡＲ（ＣＤ１９）Ｔ細胞を、Ｐａｎｃ－１ ＧＬ細胞またはＢｘＰＣ－３ ＧＬ細胞と共に、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間インキュベートした。Ｐａｎｃ－１ ＧＬ細胞とＢｘＰＣ－３ ＧＬ細胞の両方が、３つすべてのＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞によって用量依存的に効果的に溶解された一方、最小限の殺滅は、対照ＣＡＲ Ｔ細胞から観察された。 同上。
図１８Ａ～１８Ｄ：高用量のヒトＢ７Ｈ３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＰａｎｃ－１マウスモデル。１０００万個のＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の注入後のＰａｎｃ－１異種移植マウスモデルにおける腫瘍退縮を評価した。（図１８Ａ）Ｐａｎｃ－１異種移植研究の概略図。１００万個のＰａｎｃ－１ ＧＦＰ／Ｌｕｃ腫瘍細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｖ．移植して、腫瘍モデルを確立した。２０日後（０日目）に、マウスに、１０００万個のＣ４、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞（または対照ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞）をｉ．ｖ．注入した。イメージングを毎週実施した。（図１８Ｂ）ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおけるＰａｎｃ－１腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージ。１０００万個のＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃ４、Ｇ８またはＢ１２）で処置したマウスは、対照ＣＡＲ Ｔ細胞の注入と比較して、有意に低下した腫瘍成長を示した。（図１８Ｃ）図１８Ｂに示されるマウスの１秒当たりの光子としての腫瘍バイオルミネセンスの定量。（図１８Ｄ）１０００万個のＣ４、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞による処置後の腫瘍保有マウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。結果は、Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、高用量（１０００万個）で投与された場合に、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞よりもマウスの生存を促進するのに有力であることを実証し、１０００万個のＣＡＲ Ｔ細胞の投与がマウスにとって安全であることを示す。 同上。
図１９Ａ～１９Ｄ：低用量のヒトＢ７Ｈ３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したＰａｎｃ－１マウスモデル。５００万個のＢ７－Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の注入後のＰａｎｃ－１異種移植マウスモデルにおける腫瘍退縮を、腫瘍再負荷後に測定した。（図１９Ａ）実験の概略図。１００万個のＰａｎｃ－１－Ｌｕｃ細胞の接種の２０日後（０日目）に、Ｐａｎｃ－１異種移植マウスに、５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞、形質導入されていないＴ細胞（モック）またはＰＢＳをｉ．ｖ．注入した。検出可能な腫瘍を示さなかったＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスに、３５日目に、１００万個のＰａｎｃ－１細胞をｉ．ｖ．移植した。対照として、ナイーブマウスにＰａｎｃ－１細胞を移植した。イメージングを毎週実施した。（図１９Ｂ）ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおけるＰａｎｃ－１腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージ。５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、モックＴ細胞またはＰＢＳを投与したマウスと比較して有意に低下した腫瘍成長を示した。対照マウスでは腫瘍が急速に成長したが、Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞で以前に処置したマウスの１００％は、Ｐａｎｃ－１腫瘍を再負荷した後も腫瘍を有さないままであり、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で以前に処置したマウスの６０％は、処置の１０週間後まで腫瘍を有さないままであった。（図１９Ｃ）図１９Ｂに示されるマウスにおける１秒当たりの光子としての腫瘍バイオルミネセンスの定量。（図１９Ｄ）５００万個のＣ４またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスが７０日目にも依然として生存していたことを示す、処置後の腫瘍保有マウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線。対照的に、ＰＢＳやモックＴ細胞で処置したマウスは、注入後３０日を超えて生存しなかった。 同上。
図２０Ａ～２０Ｄ：ＩＭＲ５神経芽腫マウスモデルにおけるＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の試験。（図２０Ａ）Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞を使用する神経芽腫細胞系ＩＭＲ５のｉｎ ｖｉｔｒｏでの殺滅を評価した。Ｂ７Ｈ３標的化Ｇ８、Ｂ１２またはＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、および市販の抗ヒトＢ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体３７６．９６ベースのＣＡＲ Ｔ細胞を、ＩＭＲ５ ＧＬ細胞と共に、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間インキュベートした。すべてのＣＡＲ Ｔ細胞は、モックＴ細胞と比較して、用量依存的にＩＭＲ５腫瘍細胞を効果的に溶解したが、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験した他のＣＡＲ Ｔ細胞よりもわずかに効果的であった。（図２０Ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ研究の実験の概略図。ＩＭＲ５異種移植マウスに、腫瘍接種の３５日後に、５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｇ８ ＣＡＲ Ｔ細胞、３７６．９６ ＣＡＲ Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞（モック）をｉ．ｖ．注入した。（図２０Ｃ）異種移植モデルにおけるＩＭＲ５腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージ。５００万個のＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、３７６．９６ ＣＡＲ Ｔ細胞およびモックＴ細胞と比較して有意に低下した腫瘍成長を示した。Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞も中程度の抗腫瘍活性を示した。（図２０Ｄ）処置したマウスにおける１秒当たりの光子としての腫瘍バイオルミネセンス。 同上。 同上。
図２１Ａ～２１Ｃ：Ｇ８は、マウスＢ７Ｈ３と交差反応し、マウスがん細胞を死滅させる。（図２１Ａ）フローサイトメトリーによって検出された抗Ｂ７Ｈ３ナノボディのマウス抗原への結合活性。Ｇ８は、３つのＫＰＣ細胞系（ＣＲＥＰ１２８０９６、ＣＲＥＰ１３３２３９、およびＰＤＡ９５７７５）およびマウス黒色腫細胞系Ｂ１６で発現したマウスＢ７Ｈ３に対する正の結合を示したが、Ｃ４またはＢ１２は示さなかった。（図２１Ｂ）Ｇ８ ＣＡＲ Ｔ細胞のみが、マウスＢ７Ｈ３陽性Ｂ１６細胞系の特異的殺滅を示した。（図２１Ｃ）。抗Ｂ７Ｈ３ナノボディおよび市販の抗体３７６．９６のエピトープマッピング。ヒトＢ７Ｈ３タンパク質から合計４８個のペプチドを設計し、合成した。各ペプチドは、１８個のアミノ酸からなり、９個のアミノ酸で隣接するペプチドと重複していた。ＥＬＩＳＡ技術を使用して、抗体の各ペプチドへの結合能力を試験した。数字はＯＤ４５０値を示す。Ｇ８と３７６．９６の両方がペプチド１０、１１、および１５（配列番号３５～３７）に結合し、これらが類似するエピトープを結合することを示した。ペプチド配列を表の下に示す。Ｃ４およびＢ１２は、直鎖化されたペプチドのライブラリーによって予測することができなかった立体構造エピトープを有し得る。 同上。 同上。
図２２：ＥＬＩＳＡによるＢ７Ｈ３特異的抗体Ｂ１２、Ｃ４、Ｇ８および３７６．９６のＢ７Ｈ３タンパク質への結合。
配列表
添付の配列表に列挙された核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されるヌクレオチド塩基に関する標準的な文字の略語、およびアミノ酸に関する３文字コードを使用して示される。各核酸配列の一本の鎖のみが示されるが、表示された鎖のいずれかを参照して相補鎖が含まれるものと理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１０月１９日に作成された２７．８ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。添付の配列表では：
配列番号１はラクダ抗体ＲＷＢ１２のアミノ酸配列である。
配列番号２はラクダ抗体ＲＷＧ８のアミノ酸配列である。
配列番号３はラクダ抗体ＲＷＣ４のアミノ酸配列である。
配列番号４はラクダ抗体ＲＷＢ２のアミノ酸配列である。
配列番号５はラクダ抗体ＲＷＨ５のアミノ酸配列である。
配列番号６はラクダ抗体ＲＷＤ５のアミノ酸配列である。
配列番号７はラクダ抗体ＲＷＣ３のアミノ酸配列である。
配列番号８はラクダ抗体ＲＷＧ４のアミノ酸配列である。
配列番号９はラクダ抗体ＲＷＤ９のアミノ酸配列である。
配列番号１０はラクダ抗体ＲＷＨ１のアミノ酸配列である。
配列番号１１はウサギ抗体ＲＦＡ１のアミノ酸配列である。
配列番号１２はウサギ抗体ＲＦＢ１のアミノ酸配列である。
配列番号１３はＢ７Ｈ３の細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号１４～２６はプライマー配列である。
配列番号２７はＧＭＣＳＦＲｓｓのアミノ酸配列である。
配列番号２８はＣＤ８αヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号２９はＣＤ８α膜貫通領域のアミノ酸配列である。
配列番号３０は４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
配列番号３１はＣＤ３ζのアミノ酸配列である。
配列番号３２は自己切断Ｔ２Ａペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号３３はｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列である。
配列番号３４はウサギＶＨドメイン抗体５ＤＵＢのアミノ酸配列である。
配列番号３５～３７はＢ７Ｈ３ペプチドのアミノ酸配列である。
詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＤＣ 抗体－薬物コンジュゲート
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
Ｂ７Ｈ３ Ｂ７ホモログ３
ＢＢＩＲ ビオチン結合免疫受容体
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＥＣＤ 細胞外ドメイン
ＥＧＦ 表皮成長因子
ＥＧＦＲ 表皮成長因子受容体
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
ＥＭ エフェクター部分
ＦＡＣＳ 蛍光活性化細胞分取
ＧＭＣＳＦＲｓｓ 顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列
ｈＦｃ ヒトＦｃ
ｈｕＥＧＦＲｔ ヒト切断型表皮成長因子受容体
ＩＣ５０ 阻害濃度５０
Ｉｇ 免疫グロブリン
ＫＯ ノックアウト
ＮＫ ナチュラルキラー
ＰＢＤ ピロロベンゾジアゼピン
ＰＥ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素
ＰＥＴ 陽電子放出断層撮影
ＴＭ 膜貫通
ＶＨ 可変重
ＶＬ 可変軽
ＩＩ．用語および方法
別段に注記されていなければ、技術用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓによって２００９年に公表されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｘ；およびＷｉｌｅｙ－ＶＣＨによって２００８年に１６巻で公表されたＭｅｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；および他の類似する参照文献に見出され得る。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段に文脈が明確に指摘していなければ、単数と複数の両方を指す。例えば、「抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、単一の抗原も複数の抗原も含み、「少なくとも１つの抗原（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）」という語句と等しいと考えることができる。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。別段に指摘されていなければ、核酸またはポリペプチドについて与えられるありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値はおよその値であり、便宜的に与えられるものであることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載の方法および材料に類似するかまたはそれに等しい多くの方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料が本明細書に記載されている。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法、および例は、例証に過ぎず、限定されることを意図するものではない。様々な実施形態の精査を容易にするために、以下の用語の説明が与えられる：
４－１ＢＢ：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化リンパ球によって、およびナチュラルキラー細胞を含む他の細胞によって発現される共刺激分子。４－１ＢＢのライゲーションは、サイトカイン産生、抗アポトーシス分子の発現および免疫応答の増強をもたらすシグナル伝達カスケードを誘導する。４－１ＢＢの例示的なアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号３０として示されている。
投与：任意の効果的な経路によって、本明細書において提供されるモノクローナル抗体、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現する細胞などの薬剤を対象に提供または与えること。例示的な投与経路としては、以下に限定されないが、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、前立腺内、および腫瘍内など）、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が挙げられる。
抗体：抗原のエピトープを認識し、結合する（例えば、特異的に認識し、特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物の免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖（そのそれぞれが、それぞれ、可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と称される可変領域を有する）から構成される。合わせて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担っている。哺乳動物の免疫グロブリンには５つの主要な重鎖の分類（またはアイソタイプ）が存在し、これらは、抗体分子：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの機能的活性を決定する。哺乳動物に見られない抗体アイソタイプには、ＩｇＸ、ＩｇＹ、ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲが含まれる。ＩｇＹは、鳥類および爬虫類によって産生される一次抗体であり、哺乳動物のＩｇＧおよびＩｇＥに機能的に類似する。ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲ抗体は、軟骨魚類によって産生される一方、ＩｇＸ抗体は両生類に見られる。
抗体可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として公知の「フレームワーク」領域および超可変領域を含有する。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担っている。抗体のフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを位置付け、アラインメントする役割を果たす。所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９９１；「Ｋａｂａｔ」の番号付けスキーム）、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７， １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７， １９８９；およびＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８， １９９７；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキームを参照されたい）、Ｋｕｎｉｋら（Ｋｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ８：ｅ１００２３８８， ２０１２；およびＫｕｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２１－５２４， ２０１２；「Ｐａｒａｔｏｍｅ ＣＤＲｓ」を参照されたい）およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：２０７－９， ２００１；「ＩＭＧＴ」番号付けスキームを参照されたい）によって記載されたスキームを含む、いくつかの周知の番号付けスキームのいずれかを使用して、容易に決定することができる。Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅおよびＩＭＧＴのデータベースはオンラインで維持されている。
「単一ドメイン抗体」は、さらなる抗体ドメインの非存在下で、抗原、または抗原のエピトープを特異的に結合することが可能である単一ドメイン（可変ドメイン）を有する抗体を指す。単一ドメイン抗体には、例えば、ＶＨドメイン抗体、ＶＮＡＲ抗体、ラクダ科ＶＨＨ抗体、およびＶＬドメイン抗体が含まれる。ＶＮＡＲ抗体は、コモリザメ、ウォビゴンザメ、ツノザメおよびテンジクザメなどの軟骨魚類によって産生される。ラクダ科ＶＨＨ抗体は、天然で軽鎖が欠けている重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含むいくつかの種によって産生される。
「モノクローナル抗体」は、リンパ球の単一のクローンによって、または単一抗体のコード配列がトランスフェクトされた細胞によって産生された抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基、および別の種に由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有する。
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ラット、サメまたは合成の）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、すべてのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンのドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、これらが存在する場合、これらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％またはそれより高い割合で同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲは除いて、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合や他の免疫グロブリン機能に対して実質的に効果を有さないさらなる保存的アミノ酸置換を有し得る。
抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）：細胞傷害剤などの薬物にコンジュゲートした抗体（または抗体の抗原結合断片）を含む分子。ＡＤＣを使用して、細胞表面で発現される腫瘍抗原への抗体の特異的結合によって、薬物をがん細胞に特異的に標的化することができる。ＡＤＣと共に使用するための例示的な薬物には、微小管阻害剤（メイタンシノイド、オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＦなど）および鎖間架橋剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン；ＰＢＤ）が含まれる。一部の場合には、ＡＤＣは二特異性ＡＤＣであり、薬物にコンジュゲートした、それぞれが異なる抗原またはエピトープに向けられる２つのモノクローナル抗体またはその抗原断片から構成される。一例では、抗体に結合した薬剤は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ ＤＸ（ＩＲ７００、Ｌｉ－ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）であり、これは、その後、抗体が結合するがん細胞を死滅させるために、近赤外光ＮＩＲ光と共に使用され得る（光免疫療法；例えば、ＵＳ８，５２４，２３９および１０，５３８，５９０を参照されたい）。例えば、アミノ反応性ＩＲ７００は、ＩＲ７００のＮＨＳエステルを使用して抗体に共有結合によりコンジュゲートされ得る。
微小管阻害剤：有糸分裂を停止させることによって細胞成長をブロックする薬物の種類。「抗有糸分裂剤」とも称される微小管阻害剤を使用してがんを処置する。
Ｂ７ホモログ３（Ｂ７Ｈ３）：いくつかの種類の固形腫瘍によって発現される免疫チェックポイント分子。このタンパク質は、Ｂ７スーパーファミリーの共刺激分子のメンバーである。Ｂ７Ｈ３は、ＣＤ２７６としても公知である。
Ｂ７Ｈ３陽性がん：Ｂ７Ｈ３を発現または過剰発現するがん。Ｂ７Ｈ３陽性がんの例としては、以下に限定されないが、肝臓がん（肝細胞癌など）、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、脳がん（神経芽腫または神経膠芽腫など）、小児がん（骨肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫またはユーイング肉腫など）、黒色腫および中皮腫（例えば、Ｓｅａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３１（４）：５０１－５０５， ２０１７を参照されたい）が挙げられる。
結合親和性：抗体の抗原に対する親和性。一実施形態では、親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６：１０１－１０６， １９７９により記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の修正によって計算される。別の実施形態では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の実施形態では、高結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。他の実施形態では、抗体親和性は、フローサイトメトリーによって、または表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によって測定される。抗原（Ｂ７Ｈ３など）を「特異的に結合する」抗体は、高親和性で抗原を結合し、他の無関係の抗原を有意に結合しない抗体である。
一部の例では、モノクローナル抗体（本明細書において提供される抗Ｂ７Ｈ３単一ドメイン抗体など）は、試料または対象における他の分子に関する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ－１高いか、１０４Ｍ－１高いか、または１０５Ｍ－１高い結合定数で、標的（Ｂ７Ｈ３など）に特異的に結合する。一部の例では、抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、１μＭもしくはそれより小さい、例えば、９００ｎＭもしくはそれより小さい、５００ｎＭもしくはそれより小さい、２５０ｎＭもしくはそれより小さい、１００ｎＭもしくはそれより小さい、５０ｎＭもしくはそれより小さい、１０ｎＭもしくはそれより小さい、５ｎＭもしくはそれより小さい、または１ｎＭもしくはそれより小さい平衡定数（Ｋｄ）を有する。例えば、単一ドメインモノクローナル抗体は、少なくとも約１×１０－６Ｍ、少なくとも約０．５×１０－６Ｍ、少なくとも約１×１０－７Ｍ、少なくとも約０．５×１０－７Ｍ、少なくとも約１×１０－８Ｍ、少なくとも約０．５×１０－８Ｍ、少なくとも約１×１０－９Ｍ、少なくとも約０．５×１０－９Ｍ、または少なくとも約０．１×１０－９の結合親和性で、Ｂ７Ｈ３などの標的に結合する。ある特定の実施形態では、その標的に結合する特異的結合剤は、≦１０００ｎＭ、≦７５０ｎＭ、５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２．５ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．２５ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－６Ｍまたはそれより小さい、例えば１０－６Ｍ～１０－１０Ｍ、例えば１０－７Ｍ～１０－９Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。一部の例では、結合親和性は、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）技術に基づくＯｃｔｅｔシステム（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して測定される。一部の例では、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥＳ－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥＳ－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。
二特異性抗体：２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含み、それによって、２つの異なる抗原を結合することが可能である組換えタンパク質。一部の実施形態では、二特異性抗体は、例えば、ＣＴＬ（ＣＤ３などのＣＴＬ受容体構成成分など）またはエフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、腫瘍抗原（Ｂ７Ｈ３など）との両方を同時に標的とすることによって、がん免疫療法のために使用される。同様に、多特異性抗体は、２、３または４つの異なるモノクローナル抗体などの少なくとも２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片を含む組換えタンパク質である。
脳がんまたは腫瘍：脳組織から発症するがんまたは腫瘍の種類。脳がんとしては、以下に限定されないが、神経芽腫、髄芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、星状細胞腫、脈絡叢癌、上衣腫および松果体芽腫が挙げられる。
乳がん：乳房の組織、通常は乳管および小葉において形成するがんの種類。乳がんの種類としては、例えば、非浸潤性乳管癌、侵襲性乳管癌、トリプルネガティブ乳がん、炎症性乳がん、転移性乳がん、髄様癌、管状癌および粘液癌が挙げられる。トリプルネガティブ乳がんは、がん細胞が、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体や有意なレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を発現しない乳がんの種類を指す。トリプルネガティブ乳がんは、ＥＲ陰性ＰＲ陰性ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性乳がんとも呼ばれる。
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置において治療有用性を有する任意の化学薬剤。このような疾患としては、腫瘍、新生物、およびがんならびに乾癬などの肥厚成長によって特徴付けられる疾患が挙げられる。一実施形態では、化学療法剤は、Ｂ７Ｈ３陽性腫瘍を処置する際に使用する薬剤である。一実施形態では、化学療法剤は放射性化合物である。当業者であれば、使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ８６ ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｈ． １７ ｉｎ Ａｂｅｌｏｆｆ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．， （著作権）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ， Ｌ．， Ｂｅｒｋｅｒｙ， Ｒ． （ｅｄｓ．）： Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， １９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｄ．Ｓ．， Ｋｎｏｂｆ， Ｍ．Ｆ．， Ｄｕｒｉｖａｇｅ， Ｈ．Ｊ． （ｅｄｓ）： Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ４ｔｈ ｅｄ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ， １９９３を参照されたい）。併用化学療法は、がんを処置するための１つよりも多い薬剤の投与である。一例は、放射性または化学化合物と組み合わせて使用されるＢ７Ｈ３を結合する抗体の投与である。一例では、化学療法剤は、生物製剤、例えば、本明細書において提供される抗Ｂ７Ｈ３抗体などの治療用抗体（例えば、治療用モノクローナル抗体）、および抗ＰＤ１もしくは抗ＰＤＬ１（例えば、ペンブロリズマブおよびニボルマブ）、抗ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、またはそれらの組合せ（例えば、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４）などの他の抗がん抗体である。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：抗原結合部分（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体など）およびシグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体由来のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を含むキメラ分子。典型的には、ＣＡＲは、抗原結合部分、膜貫通ドメインおよびエンドドメインから構成される。エンドドメインは、典型的には、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなどの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖を含む。一部の事例では、エンドドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７および／またはＤＡＰ１０などの少なくとも１つのさらなる共刺激ドメインの細胞内部分をさらに含む。一部の例では、ＣＡＲは多特異性（二特異性など）またはバイシストロニックである。多特異性ＣＡＲは、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープをそれぞれ結合する少なくとも２つの抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体など）から構成される単一のＣＡＲ分子である（例えば、ＵＳ２０１８／０２３０２２５を参照されたい）。例えば、二特異性ＣＡＲは、異なる抗原をそれぞれ結合する２つの抗原結合ドメインを有する単一のＣＡＲ分子を指す。バイシストロニックＣＡＲは、異なる抗原を結合する抗原結合部分をそれぞれ含有する２つの完全なＣＡＲ分子を指す。一部の場合には、バイシストロニックＣＡＲ構築物は、切断リンカーによって連結された２つの完全なＣＡＲ分子を発現する。二特異性またはバイシストロニックＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、結合性部分が向けられる抗原の両方を発現する細胞を結合することができる（例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １３０：８１０， ２０１７；およびＷＯ／２０１８／２１３３３７を参照されたい）。
結腸がん：結腸または直腸において発症するがんの種類。結腸がん（「結腸直腸がん」としても公知）の最も一般的な種類は、結腸直腸腺癌であり、すべての結腸がんのおよそ９５％を占める。腺癌は、結腸および／または直腸の内側を覆う細胞で発症する。結腸直腸がんの他の種類としては、消化管カルチノイド腫瘍、転移性結腸直腸がん、原発性結腸直腸リンパ腫（非ホジキンリンパ腫の一種）、消化管間質腫瘍（肉腫として分類され、カハールの介在細胞から生じる）、平滑筋肉腫（平滑筋細胞から生じる）および結腸直腸黒色腫が挙げられる。
相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗体の結合親和性および特異性を規定する超可変性アミノ酸配列の領域。哺乳動物の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と名付けられた３つのＣＤＲを有する。単一ドメイン抗体は、本明細書においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含有する。
コンジュゲート：本開示の文脈では、「コンジュゲート」は、エフェクター分子または第２のタンパク質（第２の抗体など）に共有結合により連結した抗体または抗体断片（例えば、抗原結合断片）である。エフェクター分子は、例えば、薬物、毒素、治療剤、検出可能な標識、タンパク質、核酸、脂質、ナノ粒子、光子吸収体、炭水化物または組換えウイルスであり得る。抗体コンジュゲートは、「イムノコンジュゲート」と称されることが多い。コンジュゲートが薬物（細胞傷害剤など）に連結した抗体を含む場合、コンジュゲートは、「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称されることが多い。他の抗体コンジュゲートとしては、例えば、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられる。
保存的バリアント：Ｂ７Ｈ３に対する抗体などの、タンパク質の親和性に実質的に影響を及ぼしも、それを低下させもしない保存的アミノ酸置換を含有するタンパク質。例えば、Ｂ７Ｈ３を特異的に結合するモノクローナル抗体は、多くて約１、多くて約２、多くて約５、および多くて約１０、または多くて約１５個の保存的置換を含み、Ｂ７Ｈ３ポリペプチドを特異的に結合することができる。「保存的バリアント」という用語は、抗体がＢ７Ｈ３を特異的に結合する限り、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸の使用も含む。非保存的置換は、Ｂ７Ｈ３に対する活性または結合を低下させる置換である。
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表は、当業者にとって周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
接触させること：直接的な物理的会合状態に置くこと；固体形態と液体形態の両方を含む。
細胞傷害剤：細胞を死滅させる任意の薬物または化合物。
細胞傷害性：生物の残りの部分の細胞とは対照的に、標的とされることが意図される細胞に対する、免疫毒素などの分子の毒性。対照的に、「毒性」という用語は、免疫毒素の標的化部分によって標的とされることを意図された細胞であるもの以外の細胞に対する免疫毒素の毒性を指し、「動物毒性」という用語は、免疫毒素によって標的とされることを意図された細胞以外の細胞への免疫毒素の毒性による、動物への免疫毒素の毒性を指す。
縮重バリアント：遺伝暗号の結果として、縮重である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどが１つよりも多いコドンによって指定される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列が変更されない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
診断：Ｂ７Ｈ３陽性がんなどの病態の存在または性質を特定すること。診断方法はその感度および特異度において異なる。診断アッセイの「感度」は、試験で陽性である罹患した個体のパーセンテージ（真陽性のパーセント）である。診断アッセイの「特異度」は、１マイナス偽陽性率であり、ここで、偽陽性率は、試験陽性である疾患を有さないものの比率として定義される。特定の診断方法は、状態の確定診断を提供することできないとしても、その方法が診断を助ける正の指標を提供するならば十分である。「予後」は、がんなどの病態の発症の確率（重症度など）である。
診断腫瘍イメージング：陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）のための陽電子放出放射性核種を有するカップリング抗体およびそれらの誘導体は、イムノＰＥＴと称されることの多いプロセスである。全長抗体によって良好なイムノＰＥＴ剤が作製され得るが、これらの生物学的半減期によって、イメージングの前に数日待つことが必要となり、非標的放射線量の増加がもたらされる。より小さい単一ドメイン抗体、またはナノボディは、同日イメージングに適している生物学的半減期を有する。
薬物：対象における疾患または状態を処置、緩和または防止するために使用される任意の化合物。本明細書における一部の実施形態では、薬物は、抗がん剤、例えば、細胞傷害剤、例えば、抗有糸分裂剤または微小管阻害剤である。
エフェクター分子：キメラ分子に標的とされる細胞に対して所望の効果を有することが意図されるキメラ分子の部分。エフェクター分子は、エフェクター部分（ＥＭ）、治療剤、診断剤、または類似の用語としても公知である。治療剤（または薬物）は、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体などの化合物、糖タンパク質、放射性同位体、光子吸収体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスを含む。核酸治療および診断部分は、アンチセンス核酸、一重鎖または二重鎖ＤＮＡと共有結合により架橋するための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドを含む。あるいは、抗Ｂ７Ｈ３抗体などの標的化部分に連結した分子は、薬物、核酸（アンチセンス核酸など）、または循環系への直接的曝露から遮蔽され得る別の治療成分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）などの治療用組成物を含有するリポソームまたはミセルなどの封入系であってもよい。抗体に結合したリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒ ２８：３４１－３６５， １９８５を参照されたい）。診断剤または部分は、放射性同位体および他の検出可能な標識を含む。このような目的に対して有用な検出可能な標識はまた、当技術分野で周知であり、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオロフォア、化学発光剤、ならびに酵素を含む。
エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である（特定の免疫応答を誘発する）分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、Ｂ７Ｈ３などのポリペプチド上の特定の抗原エピトープを特異的に結合する。
フレームワーク領域：ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列。免疫グロブリン分子のフレームワーク領域は、可変軽および可変重フレームワーク領域を含む。
融合タンパク質：２つの異なる（異種の）タンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質。
異種：別個の遺伝源または種に由来すること。
免疫応答：刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。
イムノコンジュゲート：エフェクター分子の抗体またはその機能的断片への共有結合による連結。エフェクター分子は、例えば、検出可能な標識、光子吸収体（ＩＲ７００など）、または毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアントを含む免疫毒素などの免疫毒素を形成するための）であってもよい。毒素の具体的な非限定的な例としては、以下に限定されないが、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ、例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８、およびＰＥ４０）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、もしくはこれらの改変毒素、または直接的もしくは間接的に、細胞成長を阻害するかもしくは細胞を死滅させる他の毒性剤が挙げられる。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的には肝毒性によって死をもたらす毒性の高い化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴは、毒素の本来の標的化構成成分（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）を除去し、それを異なる標的化部分、例えば、抗体で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態へと改変され得る。一実施形態では、抗体をエフェクター分子に結合させる。別の実施形態では、エフェクター分子に結合させた抗体は、例えば、体内でのその半減期を増加させるために、脂質または他の分子にさらに結合させる。連結は、化学的手段によるものであっても、組換え手段によるものであってもよい。一実施形態では、連結は化学的であり、抗体部分とエフェクター分子の間の反応は、２つの分子間に形成された共有結合を生じさせて、１つの分子を形成する。ペプチドリンカー（短いペプチド配列）は、抗体とエフェクター分子の間に必要に応じて含まれてもよい。イムノコンジュゲートは、もともと、抗体およびエフェクター分子などの別々の官能基を有する２つの分子から調製されたため、これらは、「キメラ分子」と称されることもある。したがって、「キメラ分子」という用語は、本明細書で使用される場合、エフェクター分子にコンジュゲートした（カップリングした）リガンドまたは抗体などの標的化部分を指す。「コンジュゲートした」または「連結した」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることを指す。
イムノリポソーム：その表面にコンジュゲートした抗体または抗体断片を有するリポソーム。イムノリポソームは、腫瘍細胞などの抗体によって標的とされる細胞に対する細胞傷害剤または他の薬物を有し得る。
鎖間架橋剤：ＤＮＡの２本の鎖の間で共有結合し、それによって、ＤＮＡ複製および／または転写を防止することが可能な細胞傷害性薬物の種類。
単離された：核酸、タンパク質（抗体を含む）またはオルガネラなどの「単離された」生物学的構成成分は、構成成分が天然に存在する環境（細胞など）における他の生物学的構成成分、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびにオルガネラから実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
標識：抗体またはタンパク質などの別の分子の検出を容易にするために、この分子に直接的または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物。標識の具体的な非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素結合、および放射性同位体が挙げられる。一例では、「標識された抗体」は、抗体における別の分子の組み込みを指す。例えば、標識は、放射標識されたアミノ酸の組み込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的方法または比色分析方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合などの、検出可能なマーカーである。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下に限定されないが、以下：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（例えば、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次リポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、またはガドリニウムキレートなどの磁性剤が挙げられる。一部の実施形態では、標識を、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって結合する。
リンカー：一部の場合には、リンカーは、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合する役割を果たす、抗体結合断片（Ｆｖ断片など）内のペプチドである。「リンカー」は、抗体などの標的化部分を細胞毒素または検出可能な標識などのエフェクター分子に連結させる役割を果たすペプチドも指し得る。「コンジュゲートさせること」、「結合させること（ｊｏｉｎｉｎｇ）」、「結合すること（ｂｏｎｄｉｎｇ）」または「連結すること（ｌｉｎｋｉｎｇ）」という用語は、２つのポリペプチドを１つの連続的なポリペプチド分子にすること、または放射性核種もしくは他の分子を抗体などのポリペプチドに共有結合によって付着させることを指す。連結は、化学的手段によるものであっても、組換え手段によるものであってもよい。「化学的手段」は、１つの分子を形成するために、２つの分子間に形成された共有結合が存在するような、抗体部分とエフェクター分子の間の反応を指す。
肝臓がん：肝臓組織において生じるがんの任意の種類。肝臓がんの最も一般的な種類は、肝細胞癌（ＨＣＣ）であり、これは肝細胞内で発症する。他の種類の肝臓がんとしては、胆管で発症する胆管癌；肝臓の血管内で開始する肝臓がんの稀な形態である肝臓血管肉腫；およびほとんどの場合小児において見られる肝臓がんの非常に稀な種類である肝芽腫が挙げられる。
肺がん：肺において形成する任意のがん。肺において開始するほとんどのがんは癌である。肺癌の２つの主要な種類は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣのサブクラスは、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌を含む。
作動可能に連結した：第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、近接しており、かつ、２つのタンパク質コード領域を結合させるのに必要である場合、同じリーディングフレーム内に存在する。
卵巣がん：卵巣の組織において形成するがん。ほとんどの卵巣がんは、卵巣上皮癌（卵巣の表面の細胞内で開始するがん）または悪性生殖細胞腫瘍（卵細胞内で開始するがん）のいずれかである。別の種類の卵巣がんは、ホルモンを放出し、卵巣の様々な構造に接続する細胞を起源とする間質細胞がんである。
膵臓がん：悪性細胞が膵臓の組織内に見られる疾患。膵腫瘍は、がんの細胞起源に基づいて、外分泌腫瘍または神経内分泌腫瘍のいずれかであり得る。膵臓がんの大多数（約９４％）は外分泌腫瘍である。外分泌がんとしては、例えば、腺癌（最も一般的な種類の外分泌腫瘍）、腺房細胞癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、および粘液性嚢胞腺癌が挙げられる。一部の例では、膵臓がんは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。膵臓神経内分泌腫瘍は、膵島細胞腫瘍とも称され、それらが産生するホルモンの種類によって分類される。例示的な神経内分泌腫瘍としては、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍（ｇｌｕｃａｇａｎｏｍａ）、インスリン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍（血管作動性腸管ペプチド）および非機能性膵島細胞腫瘍が挙げられる。
小児がん：０～１４歳の小児において発症するがん。主要な種類の小児がんとしては、例えば、神経芽腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、胎児性横紋筋肉腫（ＥＲＭＳ）、胞巣状横紋筋肉腫（ＡＲＭＳ）、ユーイング肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＲＣＴ）、骨肉腫、脳および他のＣＮＳ腫瘍（神経芽腫および髄芽腫など）、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。
薬学的に許容される担体：使用する薬学的に許容される担体は従来通りである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００５）は、本明細書に開示される抗体および他の組成物の医薬品送達に好適な組成物および製剤について記載する。一般に、担体の性質は、用いられる特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとしての水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態など）では、従来の非毒性の固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などのような微量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
光免疫療法：標的とした細胞を死滅させるために、近赤外光によって活性化され得る抗原特異的抗体－光吸収体コンジュゲートを利用する標的がん治療。光吸収体は、典型的には、近赤外（ＮＩＲ）フタロシアニン色素（例えば、ＩＲ７００としても公知のＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ）などのフタロシアニン色素をベースとする。抗体（例えば、Ｂ７Ｈ３特異的抗体）は、適切な細胞表面抗原（例えば、Ｂ７Ｈ３）に結合し、光活性化色素は、ＮＩＲ光への曝露後に細胞膜に致命的な損傷を誘導する。ＮＩＲ光曝露（例えば、６９０ｎｍ）は、隣接する細胞に損傷を与えることなく、数分以内に選択的の高い、壊死性のがん細胞死を誘導する（例えば、米国出願第２０１８／０２３６０７６号を参照されたい）。
疾患を防止、処置または緩和すること：疾患を「防止すること」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」は、疾患または病態が発症し始めた後に、腫瘍負荷の軽減または転移の数もしくはサイズ（ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｉｚｅ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）の低下などの、疾患または病態の兆候または症状を緩和する治療介入を指す。「緩和すること」は、がんなどの疾患の兆候または症状の数または重症度の低減を指す。
精製された：精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ相対的用語として意図される。よって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、そのペプチドまたはタンパク質が細胞内の自然環境内に存在するよりも富化されている調製物である。一実施形態では、調製物は、タンパク質またはペプチドが、調製物の総ペプチドまたはタンパク質含量が少なくとも５０％に相当するように精製される。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞構成成分からの精製を示す。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。よって、具体的な非限定的な一例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞構成成分を９０％含まない。
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種でもともと発見された配列選択的ＤＮＡ副溝結合架橋剤の分類。ＰＢＤは、合成化学療法薬よりも有意に強力である。ＰＢＤの作用機序は、ＤＮＡの副溝に付加物を形成し、それによって、ＤＮＡプロセシングを妨害するそれらの能力に関連している。本開示の文脈では、ＰＢＤは、天然で生成され単離されたＰＢＤ、化学的に合成された天然に存在するＰＢＤ、および化学的に合成された天然に存在しないＰＢＤを含む。ＰＢＤは、単量体、二量体およびハイブリッドのＰＢＤも含む（精査のために、Ｇｅｒｒａｔａｎａ， Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ３２（２）：２５４－２９３， ２０１２を参照されたい）。
組換え体：組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、または配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工的組合せによって作製される配列を有するものである。この人工的組合せは、化学合成によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成されることが多い。
試料（または生体試料）：対象から得られたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、またはそれらの組合せを含有する生物学的検体。例としては、以下に限定されないが、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織生検、微細針吸引液、外科的検体および剖検材料が挙げられる。一例では、試料は腫瘍生検を含む。
配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表現され、別途、配列同一性と称される。配列同一性は、同一性パーセンテージ（または類似性もしくは相同性）に関して測定されることが多く、パーセンテージが高いほど、２つの配列の類似性も高い。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準的方法を使用してアライメントされた場合に、比較的高い度合いの配列同一性を有する。
比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４， １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３：２３７， １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１， １９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１， １９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４， １９８８。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ６：１１９， １９９４は、配列アライメント方法および相同性の計算について詳細な考察を提示している。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３， １９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含むいくつかの供給源から利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法についての説明は、インターネットのＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
Ｂ７Ｈ３ポリペプチドを特異的に結合する抗体のホモログおよびバリアントは、典型的には、デフォルトパラメーターに設定したｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐであるＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ２．０を使用して、抗体のアミノ酸配列との完全長アライメントに対して計数した少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性の占有によって特徴付けられる。約３０個よりも多いアミノ酸のアミノ酸配列の比較では、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト１１、および１残基当りのギャップコスト１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を用いる。短いペプチド（およそ３０個よりも少ないアミノ酸）をアライメントする場合、アライメントは、Ｂｌａｓｔ ２配列関数を使用し、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティ）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを用いて実施されるべきである。参照配列に対してさらにより高い類似性を有するタンパク質は、本方法で評価した場合に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性などの同一性のパーセンテージの増加を示す。全配列より少ない配列を配列同一性について比較する場合、ホモログおよびバリアントは、１０～２０個のアミノ酸のショートウィンドウに対して典型的には少なくとも８０％の配列同一性を有し、それらの参照配列との類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％、の配列同一性を有し得る。このようなショートウィンドウに対する配列同一性を決定するための方法は、インターネットのＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲がガイダンスのみのために提供されるものであり、提供された範囲外にある非常に重要なホモログを得ることができる可能性が十分にあることを理解するであろう。
低分子：典型的には、約１０００ダルトン未満、または一部の実施形態では、約５００ダルトン未満の分子量を有する分子であって、ある程度測定可能に、標的分子の活性をモジュレートすることが可能な分子。
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む、ヒト対象と獣医学対象の両方を含むカテゴリーの生きている多細胞脊椎動物。
合成：実験室で人工的手段によって生成されること、例えば、合成核酸またはタンパク質（例えば、抗体）は、実験室で化学的に合成され得る。
治療有効量：処置される対象において所望の効果を達成するのに十分な特定物質の量。例えば、これは、腫瘍の成長を阻害または抑制するのに必要な量であってもよい。一実施形態では、治療有効量は、腫瘍を排除する、腫瘍のサイズを低減する、または腫瘍の転移を防止、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくはさらには１００％まで腫瘍サイズおよび／もしくは体積を低減する、ならびに／または、例えば、処置前のサイズ／体積／数と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくはさらには１００％まで転移の数および／もしくはサイズ／体積を低減するのに必要な量である。対象に投与される場合、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示された標的組織濃度（例えば、腫瘍中の）を達成する投薬量が、一般に使用される。
毒素：細胞に対して細胞傷害性である分子。毒素には、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシンもしくはゲロニン、またはその改変毒素が含まれる。例えば、ＰＥおよびＤＴは、典型的には肝毒性によって死をもたらす毒性の高い化合物である。しかし、ＰＥおよびＤＴは、毒素の本来の標的構成成分（ＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖など）を除去し、それを抗体などの異なる標的化部分で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態へと改変され得る。
ベクター：宿主細胞中に導入され、それによって形質転換された宿主細胞を生成する核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝エレメントも含んでもよい。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
ＩＩＩ．Ｂ７Ｈ３に特異的な単一ドメインモノクローナル抗体（「ナノボディ」）
ナノボディは、ラクダ科ＶＨＨ、軟骨魚類ＶＮＡＲ、およびヒトＶＨ単一ドメイン抗体を含む。ウサギモノクローナル抗体は、マウスおよびヒトにおいて免疫原性の乏しいものを含む多様なエピトープを認識することができる。本開示は、組換えＢ７Ｈ３タンパク質を有するウサギの免疫およびファージディスプレイしたＶＨ単一ドメインライブラリーの作成について記載する。３回のファージパニング後に、２つの結合剤（ＲＦＡ１およびＲＦＢ１と称される）を選択した。いずれの結合剤もＥ．ｃｏｌｉで十分に発現し、２ｍｇ／Ｌ（ＲＦＡ１）と１０ｍｇ／Ｌ（ＲＦＢ１）の収量であった。ウサギナノボディは、Ｂ７Ｈ３陽性腫瘍細胞系（ＩＭＲ３２、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３＋、Ａ４３１、およびＮＢＥＢ）に対する抗原依存性の結合を示したが、Ｂ７Ｈ３ノックアウト細胞系（ＩＭＲ３２－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ）には示さなかった。本開示は、８つの異なるラクダＶＨＨライブラリーから単離された１０個のＢ７Ｈ３特異的ラクダＶＨＨナノボディについても記載する。選択されたナノボディは、神経芽腫細胞、類表皮癌細胞および膵腫瘍細胞などのＢ７Ｈ３発現細胞を結合することが可能である。
１０個のラクダ単一ドメイン抗体および２つのウサギ単一ドメイン抗体のアミノ酸配列を以下に提供する。Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰａｒａｔｏｍｅの方法を使用して決定したＣＤＲ配列を、それぞれ、下線、太字およびイタリック体で示す。表は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＰａｒａｔｏｍｅのいずれかを使用して決定した各抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸位置を列挙する。当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームなどの代替の番号付けスキームを使用して、ＣＤＲ境界を容易に決定することができる。
ＲＷＢ１２（配列番号１）
Figure 2022552875000002
Figure 2022552875000003
ＲＷＧ８（配列番号２）
Figure 2022552875000004
Figure 2022552875000005
ＲＷＣ４（配列番号３）
Figure 2022552875000006
Figure 2022552875000007
ＲＷＢ２（配列番号４）
Figure 2022552875000008
Figure 2022552875000009
ＲＷＨ５（配列番号５）
Figure 2022552875000010
Figure 2022552875000011
ＲＷＤ５（配列番号６）
Figure 2022552875000012
Figure 2022552875000013
ＲＷＣ３（配列番号７）
Figure 2022552875000014
Figure 2022552875000015
ＲＷＧ４（配列番号８）
Figure 2022552875000016
Figure 2022552875000017
ＲＷＤ９（配列番号９）
Figure 2022552875000018
Figure 2022552875000019
ＲＷＨ１（配列番号１０）
Figure 2022552875000020
Figure 2022552875000021
ＲＦＡ１（配列番号１１）
Figure 2022552875000022
Figure 2022552875000023
ＲＦＢ１（配列番号１２）
Figure 2022552875000024
Figure 2022552875000025
細胞表面または可溶性Ｂ７Ｈ３などのＢ７Ｈ３を結合する（例えば、特異的に結合する）モノクローナル抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＶＨ単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体である。
一部の実施形態では、単一ドメインモノクローナル抗体は、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、ＰａｒａｔｏｍｅもしくはＣｈｏｔｈｉａ、またはこれらの任意の組合せなどの任意の番号付けスキームによって決定した、抗体ＲＷＢ１２（配列番号１）、ＲＷＧ８（配列番号２）、ＲＷＣ４（配列番号３）、ＲＷＢ２（配列番号４）、ＲＷＨ５（配列番号５）、ＲＷＤ５（配列番号６）、ＲＷＣ３（配列番号７）、ＲＷＧ４（配列番号８）、ＲＷＤ９（配列番号９）、ＲＷＨ１（配列番号１０）、ＲＦＡ１（配列番号１１）およびＲＦＢ１（配列番号１２）のいずれか１つに由来する１つまたは複数の（３つすべてなどの）ＣＤＲ配列などの配列番号１～１２のいずれか１つ、として本明細書において示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。一部の例では、単一ドメイン抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。特定の例では、ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴもしくはＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキーム、またはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキームの組合せを使用して決定される。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号１の残基３１～３５、５０～６６および９７～１１８；配列番号１の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１９；または配列番号１の残基２７～３５、４７～６２および９８～１１８を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号２の残基３１～３５、５０～６６および９７～１０５；配列番号２の残基２６～３３、５１～５８および９７～１０６；または配列番号２の残基２７～３５、４７～６１および９７～１０６を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号２を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号３の残基３１～３５、５０～６６および９７～１１４；配列番号３の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１５；または配列番号３の残基２６～３５、５０～６１および９８～１１４を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号３を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号４の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１０；配列番号４の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１０；または配列番号４の残基２７～３５、４７～６０および９６～１０９を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号４を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号５の残基２７～３０、４５～６１および９０～１０９；配列番号５の残基２６～２８、４６～５３および９０～１１０；または配列番号５の残基２７～３０、４３～５５および９０～１１０を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号５を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号６の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１１１；配列番号６の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または配列番号６の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号６を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号７の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１１１；配列番号７の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または配列番号７の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号７を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号８の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１１１；配列番号８の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または配列番号８の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号８を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号９の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１１１；配列番号９の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または配列番号９の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号９を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号１０の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１１３；配列番号１０の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１４；または配列番号１０の残基２７～３５、４７～６０および９７～１１４を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１０を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号１１の残基３０～３４、５０～６４および９３～１０５；配列番号１１の残基２５～３２、５０～５６および９３～１０４；または配列番号１１の残基２６～３４、４６～５９および９３～１０５を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１１と、または配列番号１１の残基１～１１３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１１を含むかまたはそれからなる。他の具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１１の残基１～１１３を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列はそれぞれ、配列番号１２の残基３２～３５、５１～６５および９４～１０７；配列番号１２の残基２６～３３、５１～５７および９４～１０７；または配列番号１２の残基２７～３５、４７～６０および９４～１０８を含む。一部の例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２と、または配列番号１２の残基１～１１６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２を含むかまたはそれからなる。他の具体的な例では、抗体のアミノ酸配列は、配列番号１２の残基１～１１６を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
本明細書に開示される単一ドメインモノクローナル抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も本明細書において提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達部分、シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せをさらに含む。具体的な非限定的な例では、ヒンジ領域はＣＤ８αヒンジ領域を含み、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、共刺激シグナル伝達部分は４－１ＢＢシグナル伝達部分を含み、および／またはシグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
ユニバーサルＣＡＲ系でのそれらの使用が可能になるように改変されたＢ７Ｈ３特異的抗体も本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｂ７Ｈ３特異的抗体は、特異的結合対の１つの構成成分に融合される。一部の例では、抗体は、ロイシンジッパーまたはビオチンに融合される。
Ｂ７Ｈ３特異的ＣＡＲを発現する細胞がさらに提供される。一部の例では、細胞は、Ｔリンパ球、例えばＣＴＬ、またはナチュラルキラー細胞である。ＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞は、項目ＩＶにおいてさらに記載される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体およびエフェクター分子を含むイムノコンジュゲートも本明細書において提供される。一部の実施形態では、エフェクター分子は、以下に限定されないが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアント、例えばＰＥ３８などの毒素である。他の実施形態では、エフェクター分子は、検出可能な標識、例えば以下に限定されないが、フルオロフォア、酵素または放射性同位体である。他の実施形態では、エフェクター分子は、光子吸収体、例えばＩＲ７００である。光子吸収体を含むイムノコンジュゲートは、光免疫療法のために使用され得る。イムノコンジュゲートは、項目Ｖにおいてさらに記載される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体にコンジュゲートした薬物を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態では、薬物は、低分子、例えば微小管阻害剤、抗有糸分裂剤および／または細胞傷害剤である。ＡＤＣは、項目ＶＩにおいてさらに記載される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体および少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む多特異性抗体も本明細書において提供される。一部の実施形態では、多特異性抗体は二特異性抗体である。他の実施形態では、多特異性抗体は三特異性抗体である。一部の実施形態では、少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｔ細胞受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の構成成分を特異的に結合する。多特異性抗体は、項目ＶＩＩにおいてさらに記載される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体にコンジュゲートしたナノ粒子を含む抗体－ナノ粒子コンジュゲートが本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、またはニオソームを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は細胞傷害剤を含む。抗体－ナノ粒子コンジュゲートは、項目ＶＩＩＩにおいてさらに記載される。
本明細書に開示される単一ドメイン抗体および異種タンパク質またはペプチドを含む融合タンパク質も本明細書において提供される。一部の実施形態では、異種タンパク質は、Ｆｃタンパク質またはロイシンジッパーである。
本明細書に開示される抗体、ＣＡＲ、イムノコンジュゲート、多特異性抗体または融合タンパク質をコードする核酸分子が本明細書においてさらに提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結されている。開示される核酸分子を含むベクターも提供される。本明細書に開示される核酸分子または（ａｒｅ）ベクターを含む単離された細胞がさらに提供される。
ＣＡＲおよび切断型ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）を発現する核酸構築物も本明細書において提供される。一部の実施形態では、核酸は、５’から３’の方向に：第１の顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的単一ドメインモノクローナル抗体をコードする核酸；細胞外ヒンジ領域をコードする核酸；膜貫通ドメインをコードする核酸；細胞内共刺激ドメインをコードする核酸；細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸；自己切断２Ａペプチドをコードする核酸；第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および切断型ヒト表皮成長因子受容体（ｈｕＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含む。一部の例では、核酸は、第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸の５’にヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む。一部の例では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。一部の例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。一部の例では、共刺激シグナル伝達部分は、４－１ＢＢシグナル伝達部分を含む。一部の例では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。一部の例では、Ｂ７Ｈ３特異的抗体のアミノ酸配列は、配列番号１～１２のいずれか１つを含む。核酸構築物を含むベクターも提供される。一部の実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔを共発現する単離された細胞がさらに提供される。一部の例では、細胞は、ＣＴＬまたはＮＫ細胞である。
薬学的に許容される担体、および本明細書に開示される単一ドメインモノクローナル抗体、ＣＡＲ、単離された細胞（ＣＡＲを発現する細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ ＮＫ細胞など）、イムノコンジュゲート、ＡＤＣ、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、または融合タンパク質を含む組成物が、本開示によってさらに提供される。組成物およびそれらの使用は、項目ＩＸにおいてさらに記載される。
ＩＶ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
開示されるナノボディは、ＣＡＲを発現するように操作されたＣＡＲ（キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体またはキメラ免疫受容体としても公知）および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成するためにも使用され得る。一般に、ＣＡＲは、結合部分、細胞外ヒンジおよびスペーサーエレメント、膜貫通領域およびシグナル伝達機能を果たすエンドドメインを含む（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４， ２０１０；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０８（７）：ｄｊｖ４３９， ２０１６）。多くの事例では、結合部分は、ｓｃＦｖなどのモノクローナル抗体、または単一ドメイン抗体の抗原結合断片である。スペーサー／ヒンジ領域は、典型的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＤおよびＣＤ８ドメインなどのＩｇＧサブクラス由来の配列を含む。膜貫通ドメインは、種々の異なるＴ細胞タンパク質、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８に由来し得る。いくつかの異なるエンドドメインは、ＣＡＲを生成するために使用されている。例えば、エンドドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなどのＩＴＡＭを有するシグナル伝達鎖からなってもよい。一部の事例では、エンドドメインは、少なくとも１つの追加の共刺激ドメインの細胞内部分、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７および／またはＤＡＰ１０をさらに含む。
ＣＡＲを発現するＣＴＬ、ＮＫ細胞（または他の免疫細胞）を使用して、Ｂ７Ｈ３陽性腫瘍細胞などの特定の細胞型を標的とすることができる。よって、本明細書に開示されるナノボディを使用して、Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体を含有するＣＡＲを発現するＣＴＬまたはＮＫ細胞を操作し、それによって、操作されたＣＴＬまたはＮＫ細胞はＢ７Ｈ３を発現する腫瘍細胞を標的とすることができる。操作されたＴ細胞は、いくつかの種類のがんに対する養子療法のために以前から使用されている（例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５（４）：８２５－８３３， ２００７を参照されたい）。ＣＡＲを発現するＴ細胞の使用は、ＣＡＲを発現するＣＴＬがＨＬＡに限定されないため、標準的なＣＴＬベースの免疫療法よりも一般的であり、したがって、標的抗原を発現する腫瘍を有する任意の患者に対して使用することができる。
多特異性（二特異性など）またはバイシストロニックＣＡＲもまた、本開示によって企図される。一部の実施形態では、多特異性または二特異性のＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３に対して特異的なナノボディ（ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＣ４、ＲＷＢ２、ＲＷＨ５、ＲＷＤ５、ＲＷＣ３、ＲＷＧ４、ＲＷＤ９、ＲＷＨ１、ＲＦＡ１、およびＲＦＢ１のうちのいずれか１つなど）および異なる抗原、例えばＴ細胞抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を含む。同様に、バイシストロニックＣＡＲは、１つのＣＡＲ分子が、Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲであり、第２のＣＡＲが第２の抗原を標的とする、同じ構築物から発現される２つのＣＡＲ分子を含む。例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １３０：８１０， ２０１７；およびＷＯ／２０１８／２１３３３７を参照されたい。
したがって、本明細書に開示されるナノボディのいずれか１つなどの、Ｂ７Ｈ３に特異的な抗体を含むＣＡＲが本明細書において提供される。ＣＡＲ（二特異性およびバイシストロニックＣＡＲを含む）をコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにＣＡＲ、二特異性ＣＡＲまたはバイシストロニックＣＡＲを発現するＣＴＬまたはＮＫ細胞などの宿主細胞も提供される。Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体から構成されるＣＡＲを発現するＣＴＬまたはＮＫ細胞は、Ｂ７Ｈ３を発現するがんの処置のために使用することができる。本明細書における一部の実施形態では、ＣＡＲは二特異性ＣＡＲである。本明細書における他の実施形態では、ＣＡＲはバイシストロニックＣＡＲである。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、抗原結合ドメインに対してＮ末端にシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、免疫グロブリン軽鎖カッパ、またはＩＬ－２由来のシグナル配列などの任意の好適なシグナルペプチド配列であってもよい。シグナルペプチド配列は、細胞表面のＣＡＲの発現を容易にすることができるが、発現されたＣＡＲにおけるシグナルペプチド配列の存在は、ＣＡＲが機能するために必ずしも必要ではない。細胞表面でのＣＡＲの発現の際に、シグナルペプチド配列は、ＣＡＲから切断されて取り除かれてもよい。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲはシグナルペプチド配列を欠いている。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ヒトＥＧＦＲの切断型バージョン（ｈｕＥＧＦＲｔ）も発現する構築物から（例えば、レンチウイルスベクターから）発現される。ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔは、自己切断ペプチド配列（Ｔ２Ａなど）によって分離され、その結果、形質導入された細胞における発現の際に、ＣＡＲはｈｕＥＧＦＲｔから切断される。
本明細書に開示される一部の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、以下のアミノ酸配列をコードする。
Figure 2022552875000026
ヒト表皮成長因子受容体は、４つの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメインおよび３つの細胞内ドメインから構成される。ＥＧＦＲドメインは、以下のＮ末端からＣ末端の順に見出される：ドメインＩ－ドメインＩＩ－ドメインＩＩＩ－ドメインＩＶ－膜貫通（ＴＭ）ドメイン－膜近傍ドメイン－チロシンキナーゼドメイン－Ｃ末端テール。ドメインＩおよびドメインＩＩＩは、リガンド結合に関与するロイシンリッチドメインである。ドメインＩＩおよびドメインＩＶは、システインリッチドメインであり、ＥＧＦＲリガンドと接触しない。ドメインＩＩは、他のＥＧＦＲファミリーのメンバーに由来する類似ドメインとのホモまたはヘテロ二量体の形成を媒介し、ドメインＩＶは、ドメインＩＩとのジスルフィド結合を形成し得る。ＥＧＦＲ ＴＭドメインは、細胞膜を１回通過し通る単一のパスを作製し、タンパク質二量体化の役割を果たし得る。細胞内ドメインは、膜近傍ドメイン、チロシンキナーゼドメインおよびＣ末端テールを含み、これらは、ＥＧＦＲシグナル形質導入を媒介する（Ｗｅｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ， Ｃａｎｃｅｒｓ ９（５２）， ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃａｎｃｅｒｓ９０５００５２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３７：３５３－３７３， ２００８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３， ２０１１）。
本明細書において「ｈｕＥＧＦＲｔ」と称される、ヒトＥＧＦＲの切断型バージョンは、ドメインＩＩＩ、ドメインＩＶおよびＴＭドメインのみを含む。よって、ｈｕＥＧＦＲｔは、ドメインＩ、ドメインＩＩ、および３つすべての細胞内ドメインを欠いている。ｈｕＥＧＦＲｔは、ＥＧＦを結合することができず、シグナル伝達活性を欠いている。しかし、この分子は、ＦＤＡに認可されたセツキシマブなどの特定のＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体を結合する能力を保持する（参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５６８９４号）。
本明細書に開示されるｈｕＥＧＦＲｔと腫瘍抗原特異的ＣＡＲの両方をコードする構築物（レンチウイルスベクターなど）でのＴ細胞（またはＮＫ細胞）の形質導入により、標識されたＥＧＦＲモノクローナル抗体であるセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（商標））を使用する形質導入されたＴ細胞の選択が可能になる。例えば、セツキシマブをビオチンで標識することができ、形質導入されたＴ細胞は、市販されている（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから）抗ビオチン磁気ビーズを使用して選択することができる。ｈｕＥＧＦＲｔの共発現によっても養子移入されたＣＡＲを発現するＴ細胞（またはＮＫ細胞）のｉｎ ｖｉｖｏでの追跡が可能になる。さらに、セツキシマブのｈｕＥＧＦＲｔを発現するＴ細胞への結合によって、ＡＤＣＣエフェクター細胞の細胞傷害性が誘導され、それによって、治療の終了時などに、形質導入されたＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで排除するメカニズムが提供される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３， ２０１１）。
ユニバーサルＣＡＲ系でそれらの使用が可能になるように改変されたＢ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体（本明細書に開示されるナノボディなど）も本明細書において提供される。ユニバーサルＣＡＲ系は、ＣＡＲの柔軟性を増大させ、さらなる抗原へとそれらの使用を拡大するために開発されている。現在、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受ける各患者のために、自己Ｔ細胞を培養、拡大、および改変して、抗原特異的ＣＡＲを発現させなければならない。このプロセスは、長時間にわたり、かつ費用がかかり、その使用が限定される。ユニバーサルＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達構成成分が分子の抗原結合部分から分割される系に基づくが、「ロック－キー」系を使用して一体となる。例えば、ビオチン結合免疫受容体（ＢＢＩＲ）ＣＡＲは、アビジンを含む細胞外ドメインに融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成される。次いで、ビオチン化抗原特異的（Ｂ７Ｈ３特異的など）モノクローナル抗体は、ＢＢＩＲを結合して、Ｔ細胞を腫瘍抗原発現細胞へと向かわせることができる。別の例は、分割、ユニバーサルかつプログラム可能な（ｓｐｌｉｔ， ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ａｎｄ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）（ＳＵＰＲＡ）ＣＡＲ系である。ＳＵＰＲＡ系では、ＣＡＲは、同族のロイシンジッパーに融合した抗原特異的モノクローナル抗体と対合する、細胞外ロイシンジッパーに融合した細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ユニバーサルＣＡＲ系の精査のために、例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １１（１）：１３２， ２０１８；およびＣｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １７３：１４２６－１４３８， ２０１８を参照されたい。本明細書における一部の実施形態では、Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体は、特異的結合対の１つの構成成分に融合される。一部の例では、モノクローナル抗体は、ロイシンジッパーまたはビオチンに融合される。
別の種類のユニバーサルＣＡＲは、ソルターゼ酵素を使用して生成することができる。ソルターゼは、カルボキシル末端選別シグナルを認識および切断することによって、表面タンパク質を改変する原核生物の酵素である。ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフとソルターゼアクセプターモチーフの間のペプチド転移を触媒する。よって、抗原特異的ＣＡＲは、ソルターゼ認識モチーフに融合した抗原特異的抗体を細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通領域およびソルターゼアクセプターモチーフを含む細胞外部分を含むＣＡＲ分子の一部と接触させることによって生成することができる。ソルターゼ酵素の存在下で、２つの構成成分は共有結合によって付着して、完全な抗原特異的ＣＡＲを形成する。したがって、本明細書における一部の実施形態では、Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体は、ソルターゼ認識モチーフを含むように改変される（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０１４５５３号を参照されたい）。
Ｖ．イムノコンジュゲート
開示される単一ドメインモノクローナル抗体は、治療剤またはエフェクター分子にコンジュゲートされ得る。イムノコンジュゲートは、以下に限定されないが、治療剤の抗体への共有結合による連結が存在する分子を含む。治療剤は、特定の標的分子または標的分子を有する細胞を対象とする特定の生物活性を有する薬剤である。当業者であれば、治療剤が、ビンブラスチン、ダウノマイシンなどの様々な薬物、天然または改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはジフテリア毒素などの細胞毒素、薬理組成物を含有する封入剤（リポソームなど）、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓなどの放射性剤、ＩＲ７００などの光子吸収体、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドを含んでもよいことを認識するであろう。
特定の治療剤の選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。よって、例えば、治療剤は、特定の標的細胞（腫瘍細胞など）の死をもたらすために使用される細胞毒素であってもよい。逆に、致命的な生物学的応答をもたらさないことが望まれる場合には、治療剤は、致死性のない薬理作用のある物質または致死性のない薬理作用のある物質を含有するリポソームにコンジュゲートされてもよい。
本明細書に記載の治療剤および抗体によって、当業者は、配列が異なるが、同じエフェクター部分または抗体配列をコードする核酸などの機能的に均等な核酸を含有する種々のクローンを容易に構築することができる。よって、本開示は、抗体ならびにそのコンジュゲートおよび融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
エフェクター分子は、当業者に公知の任意の数の手段を使用して目的の抗体に連結され得る。共有結合および非共有結合による付着手段の両方が使用されてもよい。エフェクター分子を抗体に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造によって様々である。ポリペプチドは、典型的には；カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基などの種々の官能基を含有し、これらは、抗体における好適な官能基との反応に利用可能であり、エフェクター分子の結合をもたらす。あるいは、抗体は、さらなる反応性官能基に曝露または結合させるために誘導体化される。誘導体化は、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合に関与し得る。リンカーは、抗体をエフェクター分子に結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体とエフェクター分子の両方に対する共有結合を形成することが可能である。好適なリンカーは、当業者に周知であり、以下に限定されないが、直鎖または分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含む。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーを、その側鎖基によって構成アミノ酸に（例えば、ジスルフィド連結によってシステインに）、または末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基に結合させてもよい。
一部の状況では、イムノコンジュゲートがその標的部位に到達した際に、エフェクター分子を抗体から遊離させるのが望ましい。したがって、これらの状況において、イムノコンジュゲートは、標的部位の近傍で切断可能である連結を含む。エフェクター分子を抗体から放出させるためのリンカーの切断は、イムノコンジュゲートが、標的細胞内または標的部位の近傍のいずれかで供される酵素活性または条件によって促されてもよい。
種々の放射線診断化合物、放射線治療化合物、標識（酵素または蛍光分子など）、薬物、毒素、および他の剤を抗体に結合させるために報告されてきた多数の方法を考慮して、当業者は、抗体または他のポリペプチドに所与の剤を結合させるための好適な方法を決定することができる。
本明細書に開示される抗体は、誘導体化されるか、または他の分子（別のペプチドまたはタンパク質など）に連結されてもよい。一般に、抗体またはその部分は、標的抗原への結合が、誘導体化または標識することによって有害な影響を受けないように誘導体化される。例えば、抗体は、１つまたは他の分子の実体、例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体またはダイアボディ）、検出剤、光子吸収体、医薬剤、および／または抗体もしくは抗体部分の別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドに機能的に連結され得る（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合またはそれ以外の方法によって）。
誘導体化された抗体の１つの種類は、２つまたはそれより多い抗体（例えば、二特異性抗体を作出するために、同一の種類または異なる種類の）を架橋させることによって産生される。好適な架橋剤としては、適切なスペーサー（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）によって分離された２つの異なる反応基を有するヘテロ二官能、またはホモ二官能（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）であるものが挙げられる。このようなリンカーは市販されている。
抗体は、検出可能なマーカー、例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または診断イメージング技法（コンピューター断層撮影（ＣＴ）、コンピューターｘ線体軸断層撮影（ＣＡＴ）法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー検査、および腹腔鏡検査など）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な、非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素結合、放射性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーも使用される。抗体または抗原結合断片は、検出に有用である酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合断片が検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、これは、識別することができる反応生成物を生成するために酵素が使用するさらなる試薬を追加することによって検出することができる。例えば、作用物質である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって、視覚的に検出可能である着色した反応生成物がもたらされる。抗体または抗原結合断片はビオチンともコンジュゲートされ、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定によって検出することができる。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることが留意されるべきである。
抗体は、ガドリニウムなどの磁性剤で標識されてもよい。抗体はまた、ランタニド（ユーロピウムおよびジスプロシウム）、およびマンガンで標識されてもよい。超常磁性酸化鉄などの常磁性粒子も標識として使用される。抗体はまた、二次リポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識されてもよい。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。
抗体はまた、放射標識されたアミノ酸で標識されてもよい。放射標識は、診断目的と治療目的の両方で使用され得る。例えば、放射標識を使用して、ｘ線、発光スペクトル、または他の診断技法によって標的抗原の発現を検出することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下に限定されないが、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられる。
本明細書に開示される抗体はまた、光子吸収体にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、光子吸収体は、フタロシアニン色素、例えば、以下に限定されないが、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（「ＩＲ７００」としても公知）である。抗体－光子吸収体コンジュゲートは、光免疫療法に使用することができる。
抗体はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導体化され得る。これらの基は、血清半減期を増加させる、または組織への結合を増加させるなど、抗体の生物学的特徴を改善するのに有用であり得る。
毒素を本明細書に記載のモノクローナル抗体と共に用いて、免疫毒素を生成することができる。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそれらのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素ＡからＦが挙げられる。これらの毒素は、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図された毒素は、本明細書に記載の毒素のバリアントも含む（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６８９，４０１号を参照されたい、参照されたい）。一実施形態では、毒素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）である（米国特許第５，６０２，０９５号）。本明細書で使用される場合、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」は、完全長の天然の（天然に存在する）ＰＥまたは改変されたＰＥを指す。このような改変には、以下に限定されないが、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩにおける種々のアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換ならびにカルボキシル末端における１つまたは複数の配列の付加が含まれ得る（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１４２５６－１４２６１， １９８９を参照されたい）。
本明細書に記載のモノクローナル抗体と共に用いられるＰＥには、天然の配列、天然の配列の細胞傷害性断片、ならびに天然のＰＥの保存的に改変されたバリアントおよびその細胞傷害性断片が含まれ得る。ＰＥの細胞傷害性断片には、次のタンパク質分解または標的細胞における他のプロセシングにより、またはそれによらないで、細胞傷害性であるものが含まれる。ＰＥの細胞傷害性断片は、ＰＥ４０、ＰＥ３８、およびＰＥ３５を含む。ＰＥおよびそのバリアントについてのさらなる説明については、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；同第５，５１２，６５８号；同第５，６０２，０９５号；同第５，６０８，０３９号；同第５，８２１，２３８号；および同第５，８５４，０４４号；米国特許出願公開第２０１５／００９９７０７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５１６４３号および同第ＷＯ２０１４／０５２０６４号；Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：３３５８－３３６２， １９９１；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：９４７０－９４７５， １９８８；Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３３３：Ｃ１－Ｃ６， １９９７を参照されたい。
プロテアーゼ耐性ＰＥバリアントならびに以下に限定されないが、ＰＥ－ＬＲ、ＰＥ－６Ｘ、ＰＥ－８Ｘ、ＰＥ－ＬＲ／６ＸおよびＰＥ－ＬＲ／８Ｘなどの免疫原性が低減したＰＥバリアントも本明細書において企図される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｌｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １１３（１６）：３７９２－３８００， ２００９；Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（３２）：１１３１１－１１３１６， ２００８；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０１６１５０号、同第ＷＯ２００９／０３２９５４号および同第ＷＯ２０１１／０３２０２２号を参照されたい）。
一部の例では、ＰＥは、ＰＥ－ＬＲなどのリソソーム分解に対して耐性であるバリアントである（Ｗｅｌｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １１３（１６）：３７９２－３８００， ２００９；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０３２９５４号）。他の例では、ＰＥは、ＰＥ－ＬＲ／６Ｘと名付けられたバリアントである（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０３２０２２号）。他の例では、ＰＥバリアントは、免疫原性が低減したＰＥである。さらに他の例では、ＰＥは、ＰＥ－ＬＲ／８Ｍと名付けられたバリアントである（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０３２０２２号）。
ＰＥの改変は、ＰＥの細胞傷害性断片（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ－ＬＲおよびＰＥ－ＬＲ／８Ｍ）を含む、任意の以前に記載したバリアントにおいて生じ得る。改変されたＰＥは、例えばＰＥの１つもしくは複数のＴ細胞エピトープおよび／もしくはＢ細胞エピトープ内の１つもしくは複数のアミノ酸残基に対する任意の置換（複数可）、または１つもしくは複数のＴ細胞および／もしくはＢ細胞エピトープの欠失を含んでもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００９９７０７号を参照されたい）。
ＰＥの企図された形態は、ＰＥの脱免疫形態、例えば、ドメインＩＩが欠失したバージョン（例えば、ＰＥ２４）も含む。ＰＥの脱免疫形態は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５２００６号、同第ＷＯ２００７／０１６１５０号、同第ＷＯ２００７／０１４７４３号、同第ＷＯ２００７／０３１７４１号、同第ＷＯ２００９／３２９５４号、同第ＷＯ２０１１／３２０２２号、同第ＷＯ２０１２／１５４５３０号、および同第ＷＯ２０１２／１７０６１７号に記載される。
本明細書に記載の抗体を使用して、任意の数の様々な診断用または治療用化合物を、表面にＢ７Ｈ３を発現する細胞に対して標的とすることもできる。よって、本開示の抗体は、細胞表面にＢ７Ｈ３を発現する細胞に直接的に送達される薬物に、直接的にまたはリンカーを介して、結合され得る。これは、治療、診断または調査目的でなされ得る。治療剤は、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、光子吸収体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスなどの化合物を含む。核酸治療薬および診断部分は、アンチセンス核酸、一重鎖または二重鎖ＤＮＡと共有結合により架橋するための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドを含む。
あるいは、抗体に連結した分子は、好ましくは循環系への直接的曝露から遮蔽される薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または別の治療成分などの治療用組成物を含有するナノ粒子、リポソームまたはミセルなどの封入系であってもよい。抗体に結合したリポソームを調製する手段は当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒ． ２８：３４１－３６５， １９８５を参照されたい）。
本明細書に記載の抗体は、検出可能な標識に共有結合により連結されても、非共有結合により連結されてもよい。このような使用に好適な検出可能な標識は、分光法、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学または化学による手段によって検出可能な任意の組成物を含む。有用な標識としては、磁気ビーズ、蛍光色素（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるその他のものなど）、およびコロイド金もしくは着色ガラスなどの比色標識またはプラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。
このような標識を検出する手段は、当業者に周知である。よって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出されてもよく、蛍光マーカーは、照射された照明を検出するために光検出器を使用して検出されてもよい。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質上で酵素の作用によって生成した反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色した標識を単に可視化することによって検出される。
ＶＩ．抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ＡＤＣは、腫瘍抗原特異的抗体（単一ドメイン抗体または免疫グロブリンの抗原結合断片など）および薬物、典型的には微小管阻害剤または架橋剤などの細胞傷害剤から構成される化合物である。ＡＤＣは、がん細胞を特異的に標的とすることが可能であるため、薬物は、標準的化学療法に使用される薬剤よりもはるかに強力であり得る。現在、ＡＤＣと共に使用される最も一般的な細胞傷害性薬物は、従来の化学療法剤よりも１００～１０００倍強力であるＩＣ５０を有する。一般的な細胞傷害性薬物には、微小管阻害剤、例えば、メイタンシノイドおよびオーリスタチン（オーリスタチンＥおよびオーリスタチンＦなど）が含まれる。ＡＤＣと共に使用するための他の細胞毒素には、ＤＮＡの副溝に共有結合により結合して、鎖間架橋を形成するピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が含まれる。多くの事例では、ＡＤＣは、抗体の薬物に対する１：２～１：４の比を構成する（Ｂａｎｄｅｒ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０（８； ｓｕｐｐｌ １０）：３－７， ２０１２）。
抗体と薬物は、切断性または非切断性リンカーによって連結されてもよい。しかし、一部の事例では、循環中で安定であり、重大なオフターゲット毒性をもたらし得る細胞傷害性薬物の全身放出を防止するリンカーを有することが望ましい。非切断性リンカーは、ＡＤＣが標的細胞によって内部移行する前に、細胞傷害剤の放出を防止する。一旦リソソームに入ると、リソソームプロテアーゼによる抗体の消化によって細胞傷害剤の放出がもたらされる（Ｂａｎｄｅｒ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０（８； ｓｕｐｐｌ １０）：３－７， ２０１２）。
薬物のモノクローナル抗体への部位特異的かつ安定なコンジュゲーションのための一方法は、グリカン操作によるものである。モノクローナル抗体は、各重鎖のＣＨ２ドメインにおけるＡｓｎ２９７残基に１つの保存されたＮ結合型オリゴ糖鎖を有する（Ｑａｓｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２４：５２０－５２６， ２００８）。変異体β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素（Ｙ２８９Ｌ－Ｇａｌ－Ｔ１；参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／０２５８９８６号および同第２００６／００８４１６２号）を使用することにより、２－ケト－ガラクトースを抗体重鎖の遊離ＧｌｃＮＡｃ残基に転移させて、コンジュゲーションのためのケミカルハンドルをもたらす。
モノクローナル抗体に結合したオリゴ糖鎖は、末端のガラクトース残基－完全にガラクトシル化された（２つのガラクトース残基；ＩｇＧ－Ｇ２）、１つのガラクトース残基（ＩｇＧ－Ｇ１）または完全に脱ガラクトシル化された（ＩｇＧ－Ｇ０）残基に基づいて、３つの群に分類することができる。モノクローナル抗体のβ１，４－ガラクトシダーゼによる処置により、抗体がＩｇＧ－Ｇ０グリコフォームに変換される。変異体β１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は、２－ケト－ガラクトースまたは２－アジド－ガラクトースをそれらのそれぞれのＵＤＰ誘導体からＩｇＧ－Ｇ１およびＩｇＧ－Ｇ０グリコフォームにおけるＧｌｃＮＡｃ残基に転移させることが可能である。転移した糖に関するケミカルハンドルにより、グリカン残基による種々の分子のモノクローナル抗体へのコンジュゲーションが可能になる（Ｑａｓｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２４：５２０－５２６， ２００８）。
Ｂ７Ｈ３を結合する（例えば、特異的に結合する）モノクローナル抗体にコンジュゲートした薬物（細胞傷害剤など）を含むＡＤＣが本明細書において提供される。一部の実施形態では、薬物は低分子である。一部の例では、薬物は、架橋剤、微小管阻害剤および／もしくは抗有糸分裂剤、または腫瘍細胞の殺滅を媒介するのに好適な任意の細胞傷害剤である。例示的な細胞傷害剤としては、以下に限定されないが、ＰＢＤ、オーリスタチン、メイタンシノイド、ドラスタチン、カリケアマイシン、ネモルビシンおよびその誘導体、ＰＮＵ－１５９６８２、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カンプトテシン、エリナフィド、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｉｎ）、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、インドリノ－ベンゾジアゼピン二量体、ピューロマイシン、ツブリシン、ヘミアステリン、スプリセオスタチン、またはプラジエノライド、ならびに細胞傷害活性を有するその立体異性体、同配体、アナログ、および誘導体が挙げられる。
一部の実施形態では、ＡＤＣはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。天然物であるアントラマイシン（ＰＢＤ）は、１９６５年に最初に報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ８７：５７９３－５７９５， １９６５；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ８７：５７９１－５７９３， １９６５）。それ以来、天然に存在するものと合成による類似物の両方のいくつかのＰＢＤが報告されている（Ｇｅｒｒａｔａｎａ， Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ３２（２）：２５４－２９３， ２０１２；ならびに米国特許第６，８８４，７９９号；同第７，０４９，３１１号；同第７，０６７，５１１号；同第７，２６５，１０５号；同第７，５１１，０３２号；同第７，５２８，１２６号；および同第７，５５７，０９９号）。一例として、ＰＢＤ二量体は、特異的ＤＮＡ配列を認識し、それに結合し、細胞傷害剤として有用であることが示されている。ＰＢＤ二量体は抗体にコンジュゲートされ、得られたＡＤＣは抗がん特性を有することが示された（例えば、ＵＳ２０１０／０２０３００７を参照されたい）。ＰＢＤ二量体における例示的な連結部位として、５員のピロロ環、ＰＢＤ単位間のテザー、およびＮ１０－Ｃ１１イミン基が挙げられる（ＷＯ２００９／０１６５１６；ＵＳ２００９／３０４７１０；ＵＳ２０１０／０４７２５７；ＵＳ２００９／０３６４３１；ＵＳ２０１１／０２５６１５７；およびＷＯ２０１１／１３０５９８を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、１つまたは複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした抗体を含む。メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。次に、ある特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ－３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成のメイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２４８，８７０号；同第４，２５６，７４６号；同第４，２６０，６０８号；同第４，２６５，８１４号；同第４，２９４，７５７号；同第４，３０７，０１６号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１３，９４６号；同第４，３１５，９２９号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；同第４，３３１，５９８号；同第４，３６１，６５０号；同第４，３６４，８６６号；同第４，４２４，２１９号；同第４，４５０，２５４号；同第４，３６２，６６３号；および同第４，３７１，５３３号に開示される。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、ドラスタチンもしくはオーリスタチン、またはそのアナログもしくは誘導体にコンジュゲートした抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号；同第５，７８０，５８８号；同第５，７６７，２３７号；および同第６，１２４，４３１号を参照されたい）。オーリスタチンは、海生軟体動物の化合物ドラスタチン－１０の誘導体である。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５（１２）：３５８０－３５８４， ２００１）、抗がん（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４２：２９６１－２９６５， １９９８）を有することが示されている。例示的なドラスタチンおよびオーリスタチンとしては、以下に限定されないが、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ－メチルバリン－バリン－ドライソロイイン－ドラプロイン－フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ－メチルバリン－バリン－ドライソロイイン－ドラプロイン－ノルエフェドリン）、５－ベンゾイル吉草酸－ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、および他のオーリスタチン（例えば、米国公開第２０１３／０１２９７５３号を参照されたい）が挙げられる。
一部の実施形態では、ＡＤＣは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートした抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質、およびその類似物は、ピコモル濃度以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生じることが可能である（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３３３６－３３４２， １９９３；Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：２９２５－２９２８， １９９８）。カリケアマイシン薬物部分を含むＡＤＣを調製するための例示的な方法は、米国特許第５，７１２，３７４号；同第５，７１４，５８６号；同第５，７３９，１１６号；および同第５，７６７，２８５号に記載されている。
一部の実施形態では、ＡＤＣはアントラサイクリンを含む。アントラサイクリンは、細胞傷害活性を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンが、薬物分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーションと、それによるＤＮＡ依存性核酸合成の阻害；後に細胞高分子と反応して、細胞に損傷をもたらす、フリーラジカル生成の誘導；および／または薬物分子の細胞膜との相互作用を含むいくつかの異なるメカニズムによって細胞を死滅させるよう作用し得ると考えられる。非限定的な例示的アントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ネモルビシン、バルルビシンおよびミトキサントロン、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。例えば、ＰＮＵ－１５９６８２は、ネモルビシンの有力な代謝物（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１（４）：１６０８－１６１７， ２００５）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノにおいて２－メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成アナログである（Ｇｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ １７：１３３， １９９０；Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６５：７０３－７０７， １９９２）。
一部の実施形態では、ＡＤＣはリンカーをさらに含んでもよい。一部の例では、リンカーは、１つまたは複数の薬物部分を抗体に連結させて、ＡＤＣを形成するために使用することができる二官能または多官能の部分である。一部の実施形態では、ＡＤＣは、薬物および抗体に共有結合により付着するための反応性官能基を有するリンカーを使用して調製される。例えば、抗体のシステインチオールは、リンカーまたは薬物－リンカー中間体の反応性官能基と結合を形成して、ＡＤＣを作製することができる。
一部の例では、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して、共有結合を形成することが可能である官能基を有する。このような反応性官能基を有する例示的なリンカーとしては、マレイミド、ハロアセトアミド、α－ハロアセチル、スクシンイミドエステルなどの活性化エステル、４－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
一部の例では、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応することが可能である官能基を有する。このような求電子基の例としては、以下に限定されないが、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられる。一部の場合には、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子は、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位との共有結合を形成することができる。非限定的な例としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジンおよびアリールヒドラジドが挙げられる。
一部の例では、リンカーは、薬物の放出を容易にする切断性リンカーである。切断性リンカーの例としては、酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性リンカー（例えば、ペプチダーゼ感受性）、光分解性リンカー、およびジスルフィド含有リンカーが挙げられる（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：１２７－１３１， １９９２；米国特許第５，２０８，０２０号）。
本明細書に開示されるＡＤＣは、単独もしくは別の治療剤と組み合わせて、および／またはがんの処置のための任意の標準的治療（腫瘍の外科的切除、化学療法または放射線治療など）と組み合わせて、Ｂ７Ｈ３陽性がんの処置のために使用することができる。
ＶＩＩ．多特異性抗体
多特異性抗体は、２つもしくはそれより多くのモノクローナル抗体（単一ドメイン抗体など）または２つもしくはそれより多くの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片から構成される組換えタンパク質である。例えば、二特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片から構成される。よって、二特異性抗体は２つの異なる抗原を結合し、三特異性抗体は３つの異なる抗原を結合する。多特異性抗体は、例えば、ＣＴＬ（ＣＤ３などのＣＴＬ受容体構成成分など）またはエフェクターナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、少なくとも１つの腫瘍抗原の両方を同時に標的とすることによって、がん免疫療法のために使用することができる。本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的単一ドメインモノクローナル抗体を使用して、Ｂ７Ｈ３とＣＴＬの両方を標的とするか、またはＢ７Ｈ３とＮＫ細胞の両方を標的とする多特異性（例えば、二特異性または三特異性）抗体を生成し、それによって、Ｂ７Ｈ３を発現するがんを処置する手段を提供することができる。
二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、腫瘍抗原（Ｂ７Ｈ３など）を標的とする第１のモノクローナル抗体（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体など）と、Ｔ細胞、例えばＴ細胞上のＣＤ３を結合する第２の抗体との融合体である一種の二特異性モノクローナル抗体である。本明細書における一部の実施形態では、ＢｉＴＥの結合部分のうちの１つは、Ｂ７Ｈ３に対して特異的である。
二特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）は、腫瘍抗原（Ｂ７Ｈ３など）を標的とする第１のモノクローナル抗体（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体など）と、ＮＫ細胞活性化受容体、例えばＣＤ１６を結合する第２のｓｃＦｖとの融合体である一種の二特異性モノクローナル抗体である。
Ｂ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体を含む多特異性、例えば三特異性または二特異性のモノクローナル抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、多特異性モノクローナル抗体は、Ｔ細胞受容体の構成成分、例えばＣＤ３を特異的に結合するモノクローナル抗体をさらに含む。他の実施形態では、多特異性モノクローナル抗体は、ＮＫ細胞活性化受容体、例えばＣＤ１６、Ｌｙ４９、またはＣＤ９４を特異的に結合するモノクローナル抗体をさらに含む。多特異性抗体をコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびに核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。Ｂ７Ｈ３特異的抗体を含む多特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３を発現するがんの処置のために使用することができる。よって、Ｂ７Ｈ３を発現するがんを有する対象を選択し、対象に、Ｂ７Ｈ３を標的とする多特異性抗体の治療有効量を投与することによって、がんを有する対象を処置する方法が本明細書において提供される。
ＶＩＩＩ．抗体－ナノ粒子コンジュゲート
本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、種々の異なる種類のナノ粒子にコンジュゲートされて、細胞傷害剤または他の抗がん剤を、抗体を腫瘍細胞の表面で発現されるＢ７Ｈ３に結合させることによって、腫瘍細胞に直接的に送達され得る。ナノ粒子の使用によってオフターゲット副作用が低減され、薬物のバイオアベイラビリティーも改善され、治療効果を達成するために必要とされる薬物の用量も低減され得る。ナノ粒子製剤は、ナノ粒子内に保有または封入される薬物に好適であるように適合され得る。例えば、疎水性分子はナノ粒子のコア内に組み込まれてもよく、一方、親水性の薬物はポリマーシェルまたは脂質シェルによって保護された水性コア内に保有されてもよい。ナノ粒子の例としては、以下に限定されないが、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、ニオソーム、およびポリマーナノ粒子が挙げられる（Ｆａｙ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３（３）：３８１－３９４， ２０１１）。
リポソームは、薬物送達に使用される一般的な種類のナノ粒子である。リポソームにコンジュゲートした抗体は、「イムノリポソーム」と称されることが多い。イムノリポソームのリポソーム構成成分は、典型的には、１つまたは複数の同心性リン脂質二重層の脂質ベシクルである。一部の場合には、リン脂質は、疎水性薬物と親水性薬物の両方の封入を可能にする、親水性の頭部基および２つの疎水性の鎖から構成される。従来のリポソームは、細網内皮系（ＲＥＳ）のマクロファージによって循環から迅速に除去される。長期循環するリポソームを生成するために、リポソームの組成、サイズおよび電荷がモジュレートされ得る。リポソームの表面はまた、例えば、糖脂質またはシアル酸で改変されてもよい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことにより、循環半減期が有意に増加する。イムノリポソームの調製のためを含め、薬物送達剤としての使用のためのリポソームについては、当技術分野において説明されている（例えば、Ｐａｓｚｋｏ ａｎｄ Ｓｅｎｇｅ， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９（３１）５２３９－５２７７， ２０１２；Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １（３）：２９７－３１５， ２００６；米国特許出願公開第２０１１／０２６８６５５号；同第２０１０／００３２９９８１号を参照されたい）。
ニオソームは、リポソームに類似する構造を有する非イオン性界面活性剤をベースとするベシクルである。ニオソームの膜は、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリグリセリル－アルキルエーテルまたはＮ－パルミトイルグルコサミンのみから構成される。ニオソームは、小さな単層の粒子から大きな多層の粒子まで多岐にわたる。これらのナノ粒子は、単分散性で、水溶性で、化学的に安定であり、毒性が低く、生分解性かつ非免疫原性であり、封入された薬物のバイオアベイラビリティーを増加させる。
デンドリマーは、様々な分岐ポリマー複合体を含む。これらのナノ粒子は、水溶性で、生体適合性であり、ヒトへの使用に関して十分に非免疫原性である。一般に、デンドリマーは、分岐した巨大分子複合体を形成するイニシエーターコア（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｒｅ）（コアに移植された選択されたポリマーの層によって囲まれている）からなる。デンドリマーは、典型的には、ポリ（アミドアミン）またはポリ（Ｌ－リジン）などのポリマーを使用して生成される。デンドリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、生体イメージング造影剤および化学療法剤の送達のためを含め、種々の治療適用および診断適用のために使用されている。
ポリマーミセルは、水性環境に曝露された親水性ポリマー鎖の輪（ｃｏｒｏｎａ）によって囲まれた、疎水性コア中にアセンブルされた両親媒性コポリマー（親水性モノマー単位と疎水性モノマー単位の両方からなる）の凝集物から構成されている。多くの場合には、ポリマーミセルを調製するために使用されるポリマーは、ＰＥＧ、ポリ（ビニルピロリドン）の親水性ブロックおよび粒子コアを形成する疎水性ポリ（Ｌ－ラクチド）またはポリ（Ｌ－リジン）から構成されたヘテロ二官能コポリマーである。ポリマーミセルは、可溶性に乏しい薬物を保有するために使用することができる。これらのナノ粒子は、ドキソルビシンおよびカンプトテシンを含むいくつかの抗がん薬を封入するために使用されている。カチオン性ミセルも、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を保有するために開発されている。
ポリマーナノ粒子は、ナノスフェアとナノカプセルの両方を含む。ナノスフェアはポリマーの固体マトリックスからなる一方、ナノカプセルは水性コアを含有する。選択される製剤は、典型的には、保有／封入される治療剤の溶解度に依存し；水溶性に乏しい薬物はナノスフェア内により容易に封入される一方、水溶性で不安定な薬物、例えばＤＮＡおよびタンパク質は、ナノカプセル内により容易に封入される。これらのナノ粒子を生成するために使用されるポリマーとしては、例えば、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、およびポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。
抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法に従って、好適なナノ粒子にコンジュゲートされ得る。例えば、コンジュゲーションは、共有結合であっても非共有結合であってもよい。ナノ粒子がリポソームである一部の実施形態では、抗体は、ＰＥＧ鎖によって、立体的に安定化された、長期循環リポソームに結合される。抗体または抗体断片のリポソームへのカップリングはまた、例えば、チオールとマレイミド基の反応によるチオエステル結合にも関与し得る。架橋剤を使用して、抗体のナノ粒子への結合のためのスルフヒドリル基を作出することができる（Ｐａｓｚｋｏ ａｎｄ Ｓｅｎｇｅ， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９（３１）５２３９－５２７７， ２０１２）。
ＩＸ．組成物および使用方法
担体中で、Ｂ７Ｈ３を結合する（例えば、特異的に結合する）開示されるモノクローナル抗体のうちの１つまたは複数を含む組成物が提供される。ＡＤＣ、ＣＡＲ（およびＣＡＲを含むＣＴＬまたは他の細胞）、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームおよびイムノコンジュゲートを含む組成物も提供される。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製することができる。投与の量およびタイミングは、所望の転帰を達成するために処置を行う医師の裁量である。抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する細胞、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームまたはイムノコンジュゲートは、全身または局所（腫瘍内など）投与のために製剤化され得る。一例では、抗体は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。
投与のための組成物は、水性担体などの薬学的に許容される担体中に、抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する細胞（ＣＴＬなど）、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームまたはイムノコンジュゲートの溶液を含んでもよい。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などが使用されてもよい。これらの溶液は、無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌されてもよい。組成物は、生理的条件に近付くために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤中の抗体の濃度は、広範囲で変化してもよく、選択される特定の投与方式および対象のニーズに従って、流体の体積、粘度、体重などに基づいて主に選択される。
静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、１日当たり対象当たり約０．１～１０ｍｇの抗体（またはＡＤＣ、ＣＡＲ、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、もしくはイムノコンジュゲート）を含む。特に、薬剤が隔離された部位に投与され、体腔中または器官の内腔中などの循環またはリンパ系へと投与されない場合には、１日当たり対象当たり０．１～最大約１００ｍｇの投薬量が使用されてもよい。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるかまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００５）などの刊行物により詳細に記載されている。
本明細書に開示されるモノクローナル抗体はまた、吸入、経口、局所または眼内を介することを含む他の経路によって投与されてもよい。一部の例では、モノクローナル抗体（またはそのコンジュゲート）は、微細針によって投与される。
抗体（または他の治療用分子）は、凍結乾燥形態で提供され、投与前に滅菌水で再水和されてもよいが、これらは公知の濃度の滅菌溶液中でも提供される。次いで、抗体溶液を０．９％の塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加し、一部の場合には、０．５～１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与する。１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（商標）の承認以来、米国で市販されている抗体薬物の投与では、当技術分野でかなりの経験が得られている。抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ（またはＣＡＲを発現する細胞）、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームまたはイムノコンジュゲートは、静注またはボーラスでではなく、ゆっくりとした注入によって投与されてもよい。一例では、より多量の負荷用量が投与され、次に、より低いレベルの維持用量が投与される。例えば、約９０分の期間にわたり、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量が注入され、その後、以前の用量が十分に忍容性であった場合、３０分の期間にわたり、２ｍｇ／ｋｇの維持用量が４～８週間毎週注入されてもよい。
制御放出非経口製剤は、埋め込み剤、油性注射剤として、または微粒子系としてなされてもよい。タンパク質送達系の概要については、Ｂａｎｇａ， Ａ．Ｊ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， ＰＡ， （１９９５）を参照されたい。微粒子系には、例えば、ミクロスフェア、ミクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、セントラルコアとして、細胞毒素または薬物などの治療用タンパク質を含有する。ミクロスフェアにおいて、治療薬は粒子全体に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは、一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルと称される。毛細管は、およそ５μｍの直径を有するため、ナノ粒子のみが静脈内に投与される。ミクロ粒子は、典型的には、およそ１００μｍの直径であり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ， Ｊ．， Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｋｒｅｕｔｅｒ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐｐ． ２１９－３４２ （１９９４）；およびＴｉｃｅ ＆ Ｔａｂｉｂｉ， Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ａ． Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐｐ． ３１５－３３９， （１９９２）を参照されたい。
ポリマーは、本明細書に開示される抗体ベースの組成物のイオン制御放出のために使用され得る。制御された薬物送達において使用するための種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは当技術分野において公知である（Ｌａｎｇｅｒ， Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２６：５３７－５４２， １９９３）。例えば、ブロックコポリマーであるポロクサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温度で粘性であるが流動性の液体として存在するが、体温では半固体ゲルを形成する。これは、製剤化および組換えインターロイキン－２およびウレアーゼの持続送達に有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ９：４２５－４３４， １９９２；およびＰｅｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈ． ４４（２）：５８－６５， １９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５－２２４， １９９４）。さらに別の態様では、リポソームは、制御放出および脂質でカプセル化された薬物の薬物標的化のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， ＰＡ （１９９３））。治療用タンパク質の制御送達のための多数の追加の系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；同第５，１８８，８３７号；同第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；同第４，９５７，７３５号；同第５，０１９，３６９号；同第５，０５５，３０３号；同第５，５１４，６７０号；同第５，４１３，７９７号；同第５，２６８，１６４号；同第５，００４，６９７号；同第４，９０２，５０５号；同第５，５０６，２０６号；同第５，２７１，９６１号；同第５，２５４，３４２号および同第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
Ａ．治療方法
本明細書に開示される抗体、組成物、ＣＡＲ（およびＣＡＲを発現するＣＴＬなどの細胞）、ＡＤＣ、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームおよびイムノコンジュゲートは、Ｂ７Ｈ３陽性固形腫瘍などの、腫瘍細胞の成長を遅延させるかもしくは阻害する、または腫瘍細胞の転移を阻害するために投与され得る。これらの適用において、組成物の治療有効量は、がん細胞の成長、複製もしくは転移を阻害するか、またはがんの兆候もしくは症状を阻害するのに十分な量で対象に投与される。好適な対象は、以下に限定されないが、肝臓がん（肝細胞癌など）、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、脳がん（神経芽腫または神経膠芽腫など）、小児がん（骨肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫またはユーイング肉腫など）、黒色腫または中皮腫などのＢ７Ｈ３を発現する固形腫瘍を有すると診断されたものを含んでもよい。
対象に、本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的抗体、イムノコンジュゲート、ＣＡＲ（またはＣＡＲを発現する細胞）、ＡＤＣ、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームまたは組成物の治療有効量を投与することによって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんを処置する方法が本明細書において提供される。対象に、本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的抗体、イムノコンジュゲート、ＣＡＲ（ＣＡＲを発現する細胞など）、ＡＤＣ、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームまたは組成物の治療有効量を投与することによって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの腫瘍成長または転移を阻害する方法も本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｂ７Ｈ３陽性がんは、肝臓がん（肝細胞癌など）、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、脳がん（神経芽腫または神経膠芽腫など）、小児がん（骨肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫またはユーイング肉腫など）、黒色腫または中皮腫である。
本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ（例えばＣＡＲを発現するＣＴＬ）、多特異性（二特異性または三特異性など）抗体、イムノコンジュゲート、イムノリポソームまたは組成物の治療有効量は、疾患の重症度、疾患の種類、および患者の健康の全身状態に応じて変わる。抗体ベースの組成物の治療有効量は、症状（複数可）の主観的軽減または医師もしくは他の資格のあるオブザーバーによって言及されるとおりの客観的に特定可能な改善を提供する量である。
一例では、本明細書において提供されるＢ７Ｈ３特異的抗体は、ＩＲ７００にコンジュゲートされ、Ｂ７Ｈ３陽性がんを処置するために光免疫療法が使用される。例えば、このような方法は、Ｂ７Ｈ３陽性がんを有する対象に、１つまたは複数のＢ７Ｈ３特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの治療有効量を投与することであって、Ｂ７Ｈ３特異的抗体が、がん細胞上のＢ７Ｈ３に特異的に結合する、投与することを含み得る。コンジュゲートの投与後に、がんは、６６０～７４０ｎｍ（例えば、６６０～７１０ｎｍ、例えば６８０ｎｍ）の波長および少なくとも１Ｊｃｍ－２の線量で照射され、それによって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんを処置する。一部の例では、Ｂ７Ｈ３陽性がんは、少なくとも１Ｊｃｍ－２（例えば、少なくとも１Ｊｃｍ－２、少なくとも４Ｊｃｍ－２、少なくとも１０Ｊｃｍ－２、少なくとも５０Ｊｃｍ－２、または少なくとも１００Ｊｃｍ－２）の線量で、６６０～７４０ｎｍ（例えば、６６０～７１０ｎｍ、例えば６８０ｎｍ）の波長で照射され、それによって、対象における腫瘍を処置する。一部の例では、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回の処置サイクルなどの複数回の処置が実施される。特定の例では、Ｂ７Ｈ３特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの治療有効用量は、例えば、ｉｖ投与される場合、６０キログラム当たり少なくとも０．５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、０．５～５０ｍｇ／６０ｋｇ、例えば、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量である。別の例では、Ｂ７Ｈ３特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの治療有効用量は、例えば、腫瘍内またはｉ．ｐ．投与される場合、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇ、または少なくとも５００μｇ／ｋｇ、例えば、１０μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇ、例えば１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量である。一例では、Ｂ７Ｈ３特異的抗体－ＩＲ７００コンジュゲートの治療有効用量は、局所溶液中で投与されると、少なくとも１μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも５００μｇ／ｍｌ、例えば２０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間、例えば１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌである。
本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ（またはＣＡＲを発現する細胞）、イムノコンジュゲート、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームおよび組成物の投与はまた、他の抗がん剤の投与または治療処置（例えば、腫瘍の外科的切除）を伴っていてもよい。任意の好適な抗がん剤は、本明細書に開示される抗体、組成物およびイムノコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。例示的な抗がん剤としては、以下に限定されないが、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝薬、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生体応答調節剤、抗ホルモン薬（例えば、抗アンドロゲン薬）および抗血管新生剤などが挙げられる。他の抗がん処置には、放射線治療およびがん細胞を特異的に標的とする他の抗体（例えば、生物製剤）が含まれる。
アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。
抗代謝薬の非限定的な例としては、葉酸アナログ（メトトレキセートなど）、ピリミジンアナログ（５－ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリンアナログ、例えばメルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。
天然物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ－アスパラギナーゼなど）が挙げられる。
各種の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知のシス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン薬（タモキシフェンなど）、ならびにアンドロゲン（プロピオン酸テステロン（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。最も一般的に使用されている化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボブラチナム、シスプラチナム、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン類、例えば、ドセタキセル）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６が挙げられるが、いくつかのより新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）およびカルチトリオールが挙げられる。
使用することができるイムノモジュレーターの非限定的な例としては、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
開示されるＢ７Ｈ３特異的抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ（またはＣＡＲを発現する細胞）、イムノコンジュゲート、多特異性抗体、抗体－ナノ粒子コンジュゲート、イムノリポソームと組み合わせて使用することができる生物製剤の非限定的な例としては、治療用モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブペンテテート、アナツモマブマフェナトクス、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベジレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブタフェナトクス、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブペンデチド、シブロツズマブ、ソネプシズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タプリツモマブパプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、およびザルツムマブのうちの１つまたは複数が挙げられる。一部の例では、治療用抗体は、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ－９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＭＥＤＩ－０６８０、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＭＧＡ－２７１、Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ、Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ、ＢＭＳ－９８６０１６、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＥＤＩ－４７３７、ＭＫ－４１６６、ＢＭＳ－６６３５１３、ＰＦ－０５０８２５６６（ＰＦ－２５６６）、リリルマブ、およびデュルバルマブのうちの１つまたは複数などのＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を特異的に結合し、アンタゴナイズする。
一部の例では、投与される追加の治療剤は、Ｔ細胞アゴニスト、例えば４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、および／またはＧＩＴＲのアゴニストである。一例では、投与される追加の治療剤は、ＯＸ４０アゴニスト、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、ＰＦ－０４５１８６００、ＭＥＤＩ－６４６９、ＭＥＤＩ－０５６２、ＭＥＤＩ－６３８３、ＭＯＸＲ－０９１６、ＢＭＳ ９８６１７８、またはＧＳＫ３１７４９９８）などの抗体である。一部の例では、投与される追加の治療剤は、４－１ＢＢアゴニスト、例えば、ｍＡｂなどの４－１ＢＢアゴニスト抗体である。開示される方法を用いて使用することができる具体的なアゴニストｍＡｂとしては、ＰＦ－０５０８２５６６（ウトミルマブ）、およびＢＭＳ－６６３５１３（ウレルマブ）が挙げられる。一例では、４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、例えば天然の４－１ＢＢＬ（ヒト４－１ＩＢＢＬなど）またはストレプトアビジン化４－１ＢＢＬ（ＳＡ－４－１ＢＢＬ）複合体である。一部の例では、投与される追加の治療剤は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイドに誘導される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、またはＴＮＦＲＳＦ１８）アゴニスト、例えばｍＡｂなどのＧＩＴＲアゴニスト抗体である。開示される方法を用いて使用することができる具体的なＧＩＴＲアゴニストｍＡｂとしては、ＤＴＡ－１、ＴＲＸ５１８、ＭＫ－４１６６、ＭＫ－１２４８、ＡＭＧ ２２８、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＧＷＮ３２３（Ｎｏｖａｒｔｉｓより）、ＣＫ－３０２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより）およびＢＭＳ－９８６１５６が挙げられる。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、例えば天然のＧＩＴＲＬまたは多価ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質である。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する六量体のＧＩＴＲＬ分子であるＭＥＤＩ１８７３である。一部の例では、投与される追加の治療剤は、免疫治療薬である。使用することができるイムノモジュレーターの非限定的な例としては、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
一例では、追加の治療は、外科的処置、例えば、がんまたはその一部の外科的切除である。処置の別の例は、放射線療法、例えば、外科的切除の前に、腫瘍を根絶するかまたは腫瘍を退縮させる助けとなるための、腫瘍部位への放射性物質またはエネルギー（外部ビーム治療など）の投与である。
Ｂ．診断および検出のための方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＢ７Ｈ３タンパク質を検出するための方法が、本明細書において提供される。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍イメージングに使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏで診断試薬として開示される抗体を使用するために、抗体は、検出可能な部分、例えば、放射性同位体、蛍光標識、または陽電子放出放射性核種で標識される。一例として、本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）において使用するために、陽電子放出放射性核種にコンジュゲートされ得る；この診断プロセスは、イムノＰＥＴと称されることが多い。全長抗体は、良好なイムノＰＥＴ剤を作製し得るが、これらの生物学的半減期は、イメージングの前に数日間待つ必要があり、関連する非標的放射線量を増加させる。より小さい単一ドメイン抗体／ナノボディは、同日イメージングに適した生物学的半減期を有する。
他の事例では、Ｂ７Ｈ３発現は生体試料中で検出される。試料は、以下に限定されないが、生検、剖検および病理検体由来の組織を含む任意の試料であってもよい。生体試料は、組織の切片、例えば、組織学的な目的で採取された凍結切片も含む。生体試料は、血液、血清、血漿、痰、脊髄液または尿などの体液をさらに含む。一部の例では、試料はエキソソームを含有する血清試料である。生体試料は、典型的には、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳動物から得られる。
対象由来の試料を本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体と接触させ、抗体の試料への結合を検出することによって、対象がＢ７Ｈ３陽性がんを有するかどうかを決定する方法が本明細書において提供される。抗体の対照試料への結合と比較した、抗体の試料への結合の増加によって、対象がＢ７Ｈ３陽性がんを有するものとして特定される。
別の実施形態では、Ｂ７Ｈ３陽性がんを有すると診断された対象由来の試料を本明細書に開示されるＢ７Ｈ３特異的モノクローナル抗体と接触させ、抗体の試料への結合を検出することによって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの診断を確認する方法が提供される。抗体の対照試料への結合と比較した、抗体の試料への結合の増加によって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの診断が確認される。
開示される方法の一部の例では、モノクローナル抗体は直接的に標識される。
他の例では、方法は、モノクローナル抗体を特異的に結合する第２の抗体（検出抗体）を試料と接触させ、第２の抗体の結合を検出することをさらに含む。第２の抗体の対照試料への結合と比較した、第２の抗体の試料への結合の増加によって、対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんが検出されるか、または対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの診断が確認される。
一部の場合には、がんは、肝臓がん（肝細胞癌など）、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、脳がん（神経芽腫または神経膠芽腫など）、小児がん（骨肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫またはユーイング肉腫など）、黒色腫または中皮腫である。
一部の例では、対照試料は、がんを有さない対象由来の試料である。特定の例では、試料は血液または組織試料である。
診断および検出の方法の一部の実施形態では、Ｂ７Ｈ３を結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は、検出可能な標識で直接的に標識される。別の実施形態では、Ｂ７Ｈ３（第１の抗体）を結合する（例えば、特異的に結合する）抗体は標識されず、第２の抗体またはＢ７Ｈ３を特異的に結合する抗体を結合することができる他の分子が標識される。当業者にとって周知であるように、第１の抗体の特定の種および分類を特異的に結合することができる第２の抗体が選択される。例えば、第１の抗体がヒトＩｇＧである場合には、二次抗体は抗ヒトＩｇＧであってもよい。抗体に結合することができる他の分子としては、限定されないが、その両方が市販されているプロテインＡおよびプロテインＧが挙げられる。
抗体または二次抗体に対して好適な標識としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、磁性剤および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子団複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的発光物質はルミノールであり、非限定的な例示的磁性剤はガドリニウムであり、非限定的な例示的放射性標識は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
代替の実施形態では、Ｂ７Ｈ３は、検出可能な物質で標識されたＢ７Ｈ３タンパク質標準物質およびＢ７Ｈ３を特異的に結合する未標識抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生体試料中でアッセイされ得る。このアッセイでは、生体試料、標識されたＢ７Ｈ３タンパク質標準物質およびＢ７Ｈ３を特異的に結合する抗体が組み合わされ、未標識抗体に結合した標識されたＢ７Ｈ３タンパク質標準物質の量が決定される。生体試料中のＢ７Ｈ３の量は、Ｂ７Ｈ３を特異的に結合する抗体に結合した標識されたＢ７Ｈ３タンパク質標準物質の量に反比例する。
本明細書に開示されるイムノアッセイおよび方法は、いくつかの目的で使用することができる。一実施形態では、特異的に結合する抗体を使用して、細胞培養物中の細胞におけるＢ７Ｈ３の生成を検出することができる。別の実施形態では、抗体を使用して、生体試料、例えば、組織試料、または血液もしくは血清試料中のＢ７Ｈ３の量を検出することができる。一部の例では、Ｂ７Ｈ３は細胞表面のＢ７Ｈ３である。他の例では、Ｂ７Ｈ３タンパク質は可溶性である（例えば、細胞培養上清中、または体液試料、例えば血液もしくは血清試料中）。
一実施形態では、生体試料、例えば血液試料または組織試料中のＢ７Ｈ３を検出するためのキットが提供される。例えば、対象におけるがんの診断を確認するために、生検を実施して、組織学的調査のための組織試料を得ることができる。ポリペプチドを検出するためのキットは、典型的には、本明細書に開示されるモノクローナル抗体のいずれかなどの、Ｂ７Ｈ３を特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。さらなる実施形態では、抗体は標識されている（例えば、蛍光、放射性、または酵素標識で）。
一実施形態では、キットは、Ｂ７Ｈ３を結合する抗体の使用手段を開示する指示資料を含む。指示資料は、書面であっても、電子形態（フロッピー（登録商標）ディスクまたはコンパクトディスクなど）であってもよく、または映像（ビデオファイルなど）であってもよい。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためにさらなる構成成分も含んでもよい。よって、例えば、キットは、標識を検出する手段をさらに含有してもよい（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）。キットは、特定の方法の実践のために日常的に使用されるバッファーおよび他の試薬をさらに含んでもよい。このようなキットおよび適切な内容物は当業者に周知である。
一実施形態では、診断キットはイムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、用いられる特定の形式によって変更され得るが、生体試料中のＢ７Ｈ３を検出する方法は、一般に、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下で、Ｂ７Ｈ３と特異的に反応する抗体と接触させるステップを含む。抗体は、免疫学的に反応性の条件下で、免疫複合体を形成するために特異的に結合することが可能であり、免疫複合体（結合した抗体）の存在は直接的または間接的に検出される。
本明細書に開示される抗体を、以下に限定されないが、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、または免疫組織化学アッセイなどのイムノアッセイにおいて利用することもできる。抗体はまた、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）に使用されてもよい。ＦＡＣＳは、他のより洗練されたレベルの検出の中でも、複数のカラーチャネル、低アングルおよび鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを用いて、細胞を分離または選別する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照されたい）。本明細書に開示される、Ｂ７Ｈ３を結合するモノクローナル抗体のいずれかをこれらのアッセイにおいて使用することができる。よって、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織の免疫組織化学、ウエスタンブロットまたは免疫沈降を含む従来のイムノアッセイにおいて抗体を使用することができる。
以下の実施例は、ある種の特定の特色および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を記載された特定の特色や実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
材料および方法
この実施例は、実施例２において記載される研究に使用される材料および実験手順について記載する。
細胞系
８つの癌細胞系（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＩＭＲ３２、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３＋、Ａ４３１、ＩＭＲ３２－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ、およびＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ）を１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１％のＬ－グルタミン、および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養し、残部が空気の５％ＣＯ２中で３７℃にてインキュベートした。神経芽腫細胞系ＮＢＥＢを、ＤＭＥＭと同じ補充物を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。培地は週に２回新しくした。
タンパク質の発現および精製
Ｂ７Ｈ３の細胞外ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０１９９０７、アミノ酸２９～４６６；配列番号１３）をｈＦｃタグと融合させた。Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃを２９３Ｆ細胞中で発現させた。ｈＦｃタグ対照であるＩＡＢ－ｈＦｃ（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２８４， ３７３９－３７４９， ２００９）を同じ方法で生成した。タンパク質精製は、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実現した。ウサギＶＨドメイン抗体をＶＨ－Ｈｉｓ－ＦＬＡＧ融合様式においてＥ．ｃｏｌｉで発現させた。６×ＨｉｓタグをＮｉｃｋｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による親和性精製に使用し、ＦＬＡＧタグをＥＬＩＳＡによるタンパク質結合アッセイおよびフローサイトメトリーによる細胞結合アッセイに使用した。
ＤＮＡオリゴおよびウサギＶＨファージライブラリーの構築
ウサギＶＨ ｃＤＮＡ断片を増幅させるために、ＶＨ ｃＤＮＡの５’末端と３’末端にアニーリングするフォワードプライマーとリバースプライマーを文献（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ４２９， ２９５４－２９７３， ２０１７）に従って合成した。プライマーを表１に列挙し、下線を付したヌクレオチドはＳｆｉＩ制限酵素部位に対応する。
表１：ウサギＶＨファージライブラリーの構築のためのプライマー
Figure 2022552875000027
Figure 2022552875000028
ウサギＶＨ ｃＤＮＡを、製造業者の指示（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃１８０９１０５０）に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用して、免疫した脾臓から単離した総ＲＮＡから合成した。各フォワードプライマーを２つのリバースプライマー（Ｒ１またはＲ２）のうちの１つと対合させ、２２個の組合せのフォワード／リバースプライマーを使用して、ＶＨ ｃＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ、カタログ＃Ｒ０１２３Ｓ）で消化し、その後、同じ酵素で予め消化させたｐＣｏｍｂ３ｘプラスミドとライゲーションさせた。１０マイクログラムのライゲーション産物を使用して、製造業者の指示に従って、電気穿孔によって、０．６ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１コンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ＃６０５０２－２）を形質転換させた。形質転換されたＴＧ１細胞を、１５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で４５分間回収し、次いで１Ｌの２ＸＹＴ培地中に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃でさらに１時間培養した。その後、１×１０１０個のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ、カタログ＃Ｎ０３１５Ｓ）を細胞培養物に添加し、３７℃で４時間インキュベーションを継続した。細胞培養物を３３００ｇで３０分間遠心分離して、細胞デブリをペレット化させ、ファージ粒子を含有した上清を採取し、３／１０体積のＰＥＧ８０００／ＮａＣｌ溶液（使用前にオートクレーブした２．５ＭのＮａＣｌ溶液中の２０％のＰＥＧ）と混合した。ファージ／ＰＥＧ溶液混合物を氷上で４時間インキュベートし、３３００ｇで３０分間遠心分離した。最終のファージペレットを２０％のグリセロールを含有するＰＢＳ緩衝液１００ｍｌ中に再懸濁させ、１ｍｌ体積のサイズにアリコートし、－８０℃で保存した。
ファージパニング方法
固定したＢ７Ｈ３－ｈＦｃタンパク質を使用して、ファージパニングを行った。ｈＦｃタグ結合剤を排除するために、ＩＡＢ－ｈＦｃ対照も並行して固定した。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）にＢ７Ｈ３－ｈＦｃおよびＩＡＢ－ｈＦｃタンパク質（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍＬ）を５０μｌ／ウェルでコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。コーティングしたタンパク質溶液を廃棄した後、プレートおよびファージ溶液を、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液と混合することによって予めブロッキングし、３７℃で３０分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を廃棄した後に、予めブロッキングしたファージ溶液をＩＡＢ－ｈＦｃプレートに添加して、３７℃で１時間インキュベートすることによってｈＦｃ結合剤を枯渇させた。その後、未結合ファージ溶液をＢ７Ｈ３－ｈＦｃプレートに移し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｂ７Ｈ３特異的ファージ結合剤を、ｐＨ２．０のクエン酸緩衝液でインキュベートすることによってプレートから溶出し、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で直ちに中和した。溶出したアウトプットファージを新鮮なＴＧ１細胞の再感染によって再増幅させ、再増幅されたファージを次の回のパニングのためのインプットとして使用した。３回のパニング後に、単一のコロニーをアウトプットファージに感染したＴＧ１細胞から無作為に選び、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを行って、Ｂ７Ｈ３特異的結合剤を同定した。
ファージＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）をＢ７Ｈ３－ｈＦｃおよびＩＡＢ－ｈＦｃタグ対照でコーティングした。２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液でブロッキングした後、５０マイクロリットルの予めブロッキングしたファージ溶液をプレートに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ緩衝液でプレートを２回洗浄した後に、ＨＲＰにコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ＃１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ）によってファージ結合を検出した。
抗体結合ＥＬＩＳＡのために、様々な濃度の抗体（１００μｇ／ｍＬから開始して１：２の段階希釈）を上記のようにＢ７Ｈ３－ｈＦｃでコーティングしたプレート上でインキュベートし、ＨＲＰにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ａ８５９２）によって抗体結合を検出した。
フローサイトメトリー方法
トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ＃２５２００１１４）で剥離することによって細胞を回収し、遠心分離してペレットを形成し、氷冷したＰＢＳ中に再懸濁させた。１ｍｌ当たり１００万個の細胞を１０μｇ／ｍＬのＢ７Ｈ３ドメイン抗体と共にインキュベートした。ＡＰＣにコンジュゲートした抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ６３７３０８）によって、抗体結合を検出した。生細胞に関連する蛍光をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して測定した。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してすべての統計分析を行った。
（実施例２）
タンパク質免疫およびファージディスプレイによるＢ７Ｈ３に対するウサギナノボディの生成
この実施例は、２つのＢ７Ｈ３特異的ウサギ単一ドメインＶＨモノクローナル抗体の選択および特徴付けについて記載する。
組換えＢ７Ｈ３タンパク質の調製
Ｂ７Ｈ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＮＰ＿００１０１９９０７、アミノ酸２９～４６６；配列番号１３）をヒトＩｇＧ１ Ｆｃと融合させ、分泌によってＨＥＫ２９３細胞において発現させた。プロテインＡカラムで精製した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでランすることによって純度をチェックした（図１）。還元Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃの理論的サイズは約７５ｋＤであり、Ｂ７Ｈ３が６つのＮ－グリコシル化部位を有するため、おそらくグリコシル化に起因して、ゲル上での見かけの移動位置は約１００ｋＤである。Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃの一過性の発現レベルは極端に低く、約０．５ｍｇ／Ｌである。
組換えＢ７Ｈ３－ｈＦｃによるウサギの免疫
ＰＢＳ緩衝液中１００マイクログラムのＢ７Ｈ３－ｈＦｃを等しい体積のフロイントアジュバントと混合し、雌のニュージーランド白色家兎に筋肉内注射した。１４日間の間隔を空けた３回の免疫後に、ｈＦｃ対照としてＩＡＢ－ｈＦｃを使用して、抗Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃの力価をＥＬＩＳＡによって測定した（図２Ａ）。ＩＡＢはメソテリン（Ｑ１３４２１、アミノ酸２９６～３５９）の断片である（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２８４， ３７３９－３７４９， ２００９）。２回目（Ｍ２）および３回目（Ｍ３）の免疫の血清は、ＩＡＢ－ｈＦｃタグ対照と比較して増加したＢ７Ｈ３－ｈＦｃへの結合をはっきりと示した。ポリクローナル血清の細胞結合活性をフローサイトメトリーによってチェックした（図２Ｂ）。最終免疫のポリクローナル血清は、Ｂ７Ｈ３陽性である肝細胞癌細胞系Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２への明確な細胞結合を示し（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ， ３２， ２６２－２７１， ２０１４；Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ， ４８５， １０３－１０５， ２０１８）、一方、免疫前の血清は極端に低いバックグラウンド結合を有した。ＥＬＩＳＡとフローサイトメトリーの両方の結果は、このタンパク質が特にヒトとウサギの間で高度に保存的であるにもかかわらず、Ｂ７Ｈ３がウサギにおいて良好な免疫原性を有することを示した。
Ｂ７Ｈ３特異的結合剤のスクリーニング
免疫の成功の確認後に、免疫されたウサギの脾臓を回収し、縮重プライマーを使用してＶＨ遺伝子断片をクローニングし（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ４２９， ２９５４－２９７３， ２０１７）、その後、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３ｘでライゲーションした。１０マイクログラムのライゲーションを使用して、電気穿孔によってＴＧ１コンピテントセルを形質転換し、７×１０９個のサイズの個々のクローンによりＶＨライブラリーを作製した。ライブラリーファージ生成とその後の抗原パニングの両方を３７℃で行った。
パニングを固定したＢ７Ｈ３－ｈＦｃ上で実施した。Ｂ７－Ｈ６－ｈＦｃとＩＡＢ－ｈＦｃの両方を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、Ｂ７Ｈ３特異的ファージ粒子を、ＩＡＢ－ｈＦｃをコーティングしたプレート上に予め吸収させることによって富化し、次いで、Ｂ７Ｈ３－ｈＦｃをコーティングしたプレート上で捕捉した。３回のパニング後に、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施して、Ｂ７Ｈ３特異的結合剤を同定した。９６個の無作為に選んだクローンのうち、４１個がＢ７Ｈ３特異的結合剤であり、シーケンシング分析によって、ＲＦＡ１およびＲＦＢ１という名称の２つの代表的な結合剤を同定した（図３Ａ）。これら２つの結合剤は、ウサギ抗ハイプシンｍＡｂ（ＧｅｎＢａｎｋ構造データベースに寄託された、ＰＤＢ＃５ＤＵＢ）由来のＶＨとも類似している、非常に類似する生殖系列配列を共有した。
オンラインツールを使用するＡ１およびＢ１の構造モデリングは、それらが、ウサギ抗ハイプシンＶＨ（ＰＤＢ＃５ＤＵＢ）の結晶構造にも類似している、類似するＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループ立体構造を有し得ることを示したが、それらのＣＤＲ３ループは異なっているように見えた（図３Ｂ）。
Ｂ７Ｈ３結合剤の結合特性
結合剤Ａ１およびＢ１のＶＨコード配列を、それらのＣ末端でＨｉｓ－ＦＬＡＧタグと融合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローニングした。可溶性ＶＨドメインを、研究室のプロトコールに従って、ワンステップＮｉ－親和性クロマトグラフィーによって精製した（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂ Ｔｈｅｒ， ２， １－１１， ２０１９）。精製収量は、それぞれ、２ｍｇ／Ｌ（Ａ１）および１０ｍｇ／Ｌの発酵（Ｂ１）であった。純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離したとおり、高かった（図４Ａ）。ＲＦＡ１およびＲＦＢ１のタンパク質結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定し、ＥＣ５０の計算値は、４０３ｎＭ（Ａ１）および１８９ｎＭ（Ｂ１）であり（図４Ｂ）、これらは比較的低いが、ＶＨのみのドメイン抗体について共通している。細胞結合能もまた、フローサイトメトリーによって試験し（図４Ｃ）、Ａ１およびＢ１結合剤が、Ｂ７Ｈ３陽性細胞系（ＩＭＲ３２、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３＋、Ａ４３１、およびＮＢＥＢ）に対して良好な細胞結合を有するが、Ｂ７Ｈ３ノックアウト細胞系ＩＭＲ３２－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ、ＭＣ３８－Ｂ７Ｈ３ ＫＯには有さなかったことを示した。
治療適用
ウサギは、研究ツールとして、診断、および治療目的で使用される優れたモノクローナル抗体を生成するための傑出した供給源である（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ４９， ｅ３０５， ２０１７）。ウサギ抗体を使用するためのいくつかの主要な利点が存在する。第１に、ウサギは、系統発生的に、マウスよりもヒトからより離れており、したがって、マウスにおいて免疫原性に乏しい保存タンパク質は、ウサギにおいてより良好な免疫原性を有し得る（Ｐｏｐｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ３２５， ３２５－３３５， ２００３）。第２に、ウサギモノクローナル抗体は、一般に、高親和性、具体的には２０～２００ｐＭの親和性範囲を有する（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ４９， ｅ３０５， ２０１７；Ｌａｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ４１７， ８６－９６， ２０１５）。第３に、ウサギモノクローナル抗体は上手くヒト化することができ（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｏ， ＭＡｂｓ， ９， ４１９－４２９， ２０１７）、したがって、免疫原性は、その治療適用に対する障壁であるべきではない。多くの利点にもかかわらず、わずかなウサギモノクローナル抗体しか、臨床適用に関して調査されていない。
ウサギモノクローナル抗体全体は、優れた研究試薬として長年にわたり広く使用されているが、ウサギＶＨドメイン抗体の潜在的利点は活用されていない。最近、あるグループが、高親和性ウサギＶＨドメイン抗体が低温（すなわち、１６℃）のファージディスプレイ方法によって生成され得ることを実証し（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ７， ５７９４， ２０１７）、このことは、ウサギＶＨドメイン抗体の研究を大いに加速させるであろう。しかし、低温ファージディスプレイ方法は、不安定かつ発現しにくい結合剤のかなりの部分を富化する傾向があり、このことは、物理化学特性、特に発現および熱安定性を改善するのにかなりの努力を必要とするかもしれない（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ， １２５， ６５４－６６１， ２０１８）。現在の研究は、高温ファージディスプレイ方法を使用して、熱安定性で十分に発現される結合剤をスクリーニングする可能性を調査した。
概念実証として、Ｂ７Ｈ３を標的として選択した。Ｂ７Ｈ３は多くのがん型で過剰発現され、これはＴ細胞活性化を阻害し得るため、Ｂ７Ｈ３は、Ｂ７およびＣＤ２８ファミリーの重要な免疫チェックポイントのメンバーとみなされる（Ｐｉｃａｒｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２２， ３４２５－３４３１， ２０１６）。Ｂ７Ｈ３はまた、多くの固形腫瘍においても広範囲にわたって過剰発現され、治療標的とされる（Ｓｅａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ， ３１， ５０１－５１５ ｅ５０８， ２０１７）。Ｂ７Ｈ３の細胞外ドメインは２９３Ｆ細胞において発現されたが、発現レベルは非常に低かった（＜０．５ｍｇ／Ｌ）。Ｂ７Ｈ３は、ヒト、マウス、およびウサギの間で高度に保存されているが、組換えＢ７Ｈ３－ｈＦｃタンパク質は、組換えタンパク質とＢ７Ｈ３陽性細胞の両方を結合することができる免疫ポリクローナル血清によって示されるように、ウサギにおいて適当な免疫原性を有した。高温（３７℃）ファージディスプレイ方法を使用して、ウサギＶＨファージライブラリー粒子を作製し、パニングを実施した。Ｂ７Ｈ３タンパク質およびＢ７Ｈ３陽性がん細胞に対して中程度の親和性を有する２つの代表的な結合剤を得た。ＲＦＡ１およびＲＦＢ１結合剤は、Ｂ７Ｈ３陽性細胞に対して良好な細胞結合を有するが、Ｂ７Ｈ３ノックアウト細胞には有さない。この研究は、中程度の親和性および発現レベルを有するウサギＶＨドメイン抗体が通常温度（３７℃）でのファージディスプレイによって生成され得ることを実証した。Ｔ細胞機能を調節する際のＢ７Ｈ３の重要な役割を考慮すると、生成した２つのＢ７Ｈ３ドメイン抗体をがん免疫療法適用に使用することができる。
（実施例３）
ファージディスプレイによるＢ７Ｈ３を標的とするラクダナノボディ（ＣＤ２７６）の単離
この実施例は、ファージディスプレイライブラリーからの１０個のラクダＶＨＨナノボディの選択およびそれらの結合特性の特徴付けについて記載する。ＶＨＨナノボディから構成されるキメラ抗原受容体についても記載される。
Ｂ７Ｈ３結合剤に関する８つのラクダＶＨＨライブラリーでのファージパニング
Ｂ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質を生成して、Ｂ７Ｈ３結合剤のために選択した。組換えＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ－２９３細胞中で発現させ、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。精製したＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＤＡ－ＰＡＧＥゲル上で示されるように９９％を超える純度であり、非還元条件下で１５４ｋＤａおよび還元条件下で７７ｋＤａの分子量を有した（図５）。Ｂ７Ｈ３－Ｆｃの収量は２ｍｇ／Ｌであった。
８個体のラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｅｓ）から作製された８つのＶＨＨ単一ドメイン抗体ライブラリーを使用して、組換えＢ７Ｈ３－Ｆｃタンパク質でのファージパニングを３回行った。各回のファージ力価を図６に示す。３回目のファージパニングにおけるファージ力価の増加は、Ｂ７Ｈ３への高親和性ＶＨＨ結合剤の富化を示した。Ｂ７Ｈ３－Ｆｃでのファージ結合もＥＬＩＳＡによって評価した；結果を表２に示す。選択したファージのすべては、Ｂ７Ｈ３－Ｆｃに結合することができたが、ＩｇＧ対照には結合できなかった。
表２： ＥＬＩＳＡによるＢ７Ｈ３－Ｆｃでの選択されたファージ結合
Figure 2022552875000029
Figure 2022552875000030
サル、マウス、ラットおよびヒトＢ７Ｈ３への選択したＢ７Ｈ３特異的ファージの結合をＥＬＩＳＡによって試験した。表３に示されるように、選択したファージのうちの９つがサルＢ７Ｈ３に結合することができ、５つのファージがマウスＢ７Ｈ３に結合することができ、９つのファージがラットＢ７Ｈ３に結合することができ、８つのファージがヒトＢ７Ｈ３に結合することができた（太字の数は正の結合を示す）。
表３： ＥＬＩＳＡによる選択したＢ７Ｈ３ファージの異種間の結合
Figure 2022552875000031
 ＶＨＨの精製および結合
ＶＨＨナノボディを選択したファージから精製した。ＲＷＣ４、ＲＷＧ８およびＲＷＢ１２ナノボディの精製を図７～９に示す。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から溶出したＶＨＨラクダナノボディ画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した（図７Ａ、８Ａおよび９Ａを参照されたい）。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から溶出したナノボディのクロマトグラフを図７Ｂ、８Ｂおよび９Ｂに示す。ＲＷＣ４、ＲＷＧ８およびＲＷＢ１２の収量は、それぞれ、３３．８ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌおよび１３２ｍｇ／Ｌであった。
ｈＢ７Ｈ３－Ｆｃ、ｈＢ７Ｈ３－Ｈｉｓ、マウスＢ７Ｈ３－Ｈｉｓ、サルＢ７Ｈ３－ＨｉｓおよびラットＢ７Ｈ３－Ｈｉｓ融合タンパク質での選択したＶＨＨナノボディの結合をＥＬＩＳＡによって測定した。結果を表４および図２２に示す。ＲＷＢ２を除いて、ＶＨＨは、Ｂ７Ｈ３－ＦｃおよびＢ７Ｈ３－Ｈｉｓ融合タンパク質に結合することが可能であった。ＲＷＧ８は、マウスＢ７Ｈ３への交差反応性を示した（図２２）。さらに、ＲＷＡ１２は、ＰＢＳおよびＰＤ－Ｌ１との交差反応性を示し、残りのＶＨＨは、ＰＤＬ１と交差反応しなかった（表５）。
表４： ＥＬＩＳＡによるＢ７Ｈ３融合タンパク質での選択したＶＨＨの結合
Figure 2022552875000032
 表５： ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１での選択したＢ７Ｈ３結合剤の交差反応
Figure 2022552875000033
 Ｂ７Ｈ３発現細胞への選択したＢ７Ｈ３標的化ＶＨＨの結合
選択Ｂ７Ｈ３標的化（ｔａｒａｇｅｔｅｄ）ＶＨＨナノボディのＮＢＥＢ神経芽腫細胞への結合をＦＡＣＳ解析によって評価した（図１０）。試験抗体（ＲＷＣ４、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＡ１２、ＲＷＧ４およびＲＷＤ５）のうちの６つはＮＢＥＢ細胞を結合することが可能であった。
選択Ｂ７Ｈ３標的化（ｔａｒａｇｅｔｅｄ）ＶＨＨナノボディのＡ４３１類表皮癌細胞への結合をＦＡＣＳ解析によって評価した（図１１）。試験抗体（ＲＷＣ４、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＡ１２、ＲＷＧ４およびＲＷＤ５）のうちの６つはＡ４３１細胞を結合することが可能であった。
Ｂ７Ｈ３標的化抗体（ＲＷＣ４、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、ＲＷＧ４およびＲＷＤ５）のうちの５つを、ＭＣ３８－ＣＤ２７６＋およびＭＣ３８－ＣＤ２７６ＫＯ細胞を結合するそれらの能力についても評価した。すべての試験抗体は、Ｂ７Ｈ３陽性細胞に結合したが、Ｂ７Ｈ３陰性細胞には結合しなかった（表６を参照されたい）。
表６： ５つのＶＨＨの細胞結合能の概要
Figure 2022552875000034
 結合動態
ＲＷＣ４およびＲＷＧ４の会合／解離特性を、組換えヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃタンパク質または組換えマウスＢ７Ｈ３－Ｈｉｓタンパク質のいずれかを使用して、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）で測定した。
ヒトＢ７Ｈ３－ＦｃへのＲＷＣ４の結合の動態を図１２に示し、表７にまとめる。ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＣ４のＫＤは３．８×１０－９であった。
表７：ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＣ４の動態
Figure 2022552875000035
ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＧ４の動態を図１３に示し、表８にまとめる。ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＧ４のＫＤは６．９４×１０－９であった。
表８：ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに関するＲＷＧ４の動態
Figure 2022552875000036
 種々のがん細胞系でのＢ７Ｈ３の発現
ＦＡＣＳによって、Ｂ７Ｈ３の発現に関して、いくつかのがん細胞系を評価した。１４種の細胞系では発現を検出したが、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）をノックアウトされた２種の細胞系では検出されなかった（表９を参照されたい）。
表９： Ｂ７Ｈ３発現細胞の概要
Figure 2022552875000037
Figure 2022552875000038
 Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲの生成
第１に、ＰＣＲを実施してナノボディ配列を増幅し、プラスミドＰｗｐｔの骨格およびＰＣＲ産物をそれぞれ、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで消化し、消化した骨格を消化したＰＣＲ産物とライゲーションした。形質転換後に、アンピシリンプレート上で細菌を選択した。
Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲを発現するレンチウイルスのＴ細胞トランスフェクション効率をＦＡＣＳによって測定した。結果を図１４および表１０に示す。
表１０： ＣＡＲ－Ｔ細胞のトランスフェクション効率
Figure 2022552875000039
 Ｂ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性
Ｂ７Ｈ３標的ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｂ７Ｈ３陽性およびＢ７Ｈ３ノックアウト細胞に対する細胞傷害性について試験した。図１５は、Ｂ７Ｈ３陽性ヒト神経芽腫ＮＢＥＢ細胞（図１５Ａ）、ヒト神経芽腫ＬＡＮ－１細胞（図１５Ｂ）、ヒト腺癌ＢＸＰＣ－３細胞（図１５Ｃ）、およびヒト膵癌Ｍｉａｃａｐａ２細胞（図１５Ｄ）を使用する細胞傷害性アッセイの結果を示す。このアッセイでは、ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８およびＲＷＣ４のＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的溶解を誘導するのに最も効果的であった。
第２のアッセイでは、Ｂ７Ｈ３陽性およびＢ７Ｈ３ノックアウト細胞におけるＢ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。図１６は、ヒト神経芽腫ＩＭＲ３２細胞（図１６Ａ）、マウス結腸腺癌ＭＣ３８－ＣＤ２７６＋細胞（図１６Ｂ）、ヒト神経芽腫ＩＭＲ３２－ＣＤ２７６－／－細胞（図１６Ｃ）、およびマウス結腸腺癌ＭＣ３８－ＣＤ２７６－／－細胞（図１６Ｄ）を使用する細胞傷害性アッセイの結果を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞のうちの３つ（ＲＷＢ１２、ＲＷＧ８およびＲＷＣ４）は、Ｂ７Ｈ３陽性細胞での強力な細胞傷害性を示したが、Ｂ７Ｈ３陰性細胞では示さなかった。
（実施例４）
Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで膵腫瘍細胞を死滅させる
ヒトＢ７Ｈ３標的化ナノボディ由来のＣＡＲ Ｔ細胞（本明細書においてＢ１２、Ｇ８、およびＣ４と短縮したＲＷＢ１２、ＲＷＧ８、およびＲＷＣ４）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性を、ルシフェラーゼを発現する２種のＢ７Ｈ３陽性膵臓がん細胞系：Ｐａｎｃ－１ ＧＦＰ－Ｌｕｃ（ＧＬ）およびＢｘＰＣ－３ ＧＬを使用して評価した。第１に、フローサイトメトリーを実施して、Ｐａｎｃ－１細胞とＢｘＰＣ－１細胞の両方がＢ７Ｈ３を発現することを確認した（図１７Ａ）。それぞれＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ、およびＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現するレンチウイルス構築物の形質導入効率もまた、フローサイトメトリーによって決定した。図１７Ｂに示されるように、Ｇ８、Ｃ４およびＢ１２ ＣＡＲの形質導入効率は、それぞれ、６０．４％、５８．６％、および６８．４％であったが、無関係のＣＡＲ（ＣＤ１９）を有するＴ細胞の形質導入効率は３２％であった。細胞傷害性を評価するために、Ｂ７Ｈ３標的化（Ｃ４、Ｇ８およびＢ１２）ＣＡＲ Ｔ細胞および対照（ＣＤ１９）ＣＡＲ Ｔ細胞を、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間、Ｐａｎｃ－１ ＧＬ細胞またはＢｘＰＣ－３ ＧＬ細胞と共にインキュベートした。Ｐａｎｃ－１ ＧＬ細胞とＢｘＰＣ－３ ＧＬ細胞の両方は、３種のＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞のすべてによって、用量依存的に効果的に溶解された一方、対照ＣＡＲ Ｔ細胞から最小限の殺滅が観察された。これらの結果は、Ｂ７Ｈ３標的化ナノボディベースのＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｂ７Ｈ３陽性膵臓がんの細胞系を効率的に溶解させることができたことを実証する。
Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｐａｎｃ－１マウス異種移植モデルにおいてさらに評価した。１つの研究は高用量のＣＡＲ Ｔ細胞（１０００万個）を利用し、第２の研究はより低用量（５００万個のＣＡＲ Ｔ細胞）を利用した。高用量研究に関する実験設計の概略図を図１８Ａに示す。１００万個のＰａｎｃ－１ ＧＦＰ／Ｌｕｃ腫瘍細胞をＮＳＧマウスにｉ．ｖ．移植して、腫瘍モデルを確立した。２０日後（０日目）に、マウスに１０００万個のＣ４、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞（または対照のＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞）をｉ．ｖ．注入し、イメージングを毎週実施した。Ｐａｎｃ－１腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージを図１８Ｂに示す。１０００万個のＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｃ４、Ｇ８またはＢ１２）で処置したマウスは、ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて１秒当たりの光子として測定した、腫瘍バイオルミネセンスの低下によって証明されるように、対照ＣＡＲ Ｔ細胞の注入と比較して、腫瘍成長の有意な低下を示した（図１８Ｃ）。Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生存期間も決定した。図１８Ｄは、１０００万個のＣ４、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞による処置後の腫瘍保有マウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。結果は、Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、高用量（１０００万個）で投与された場合に、Ｇ８またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞よりもマウスの生存を促進するのに有力であることを実証し、１０００万個のＣＡＲ Ｔ細胞の投与がマウスにとって安全であることを示す。
第２のｉｎ ｖｉｖｏ研究は、腫瘍再負荷後に注入したより低用量のＢ７Ｈ３特異的ＣＡＲ Ｔ細胞によるＰａｎｃ－１腫瘍保有マウスの処置について評価した。この研究の実験設計の概略図を図１９Ａに示す。Ｐａｎｃ－１異種移植マウスに、１００万個のＰａｎｃ－１－Ｌｕｃ細胞の接種の２０日後（０日目）に、５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、５００万個のＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞、５００万個の形質導入されていないＴ細胞（モック）またはＰＢＳをｉ．ｖ．注入した。検出可能な腫瘍を示さなかったＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスに、３５日目に、１００万個のＰａｎｃ－１細胞をｉ．ｖ．移植した。対照として、ナイーブマウスにＰａｎｃ－１細胞を移植した。イメージングを毎週実施した。ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスにおけるＰａｎｃ－１腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージを図１９Ｂに示す。５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞または５００万個のＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、モックＴ細胞またはＰＢＳを投与したマウスと比較して、有意に低下した腫瘍成長を示した。対照マウスでは腫瘍が急速に成長したが、Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞で以前に処置したマウスの１００％は、Ｐａｎｃ－１腫瘍を再負荷した後も腫瘍を有さないままであり、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で以前に処置したマウスの６０％は、処置の１０週間後まで腫瘍を有さないままであった。腫瘍バイオルミネセンスの定量を図１９Ｃに示す。Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生存期間も決定した。図１９Ｄは、処置後の腫瘍保有マウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。５００万個のＣ４またはＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞を受けたマウスは、７０日目にも依然として生存していた。対照的に、ＰＢＳまたはモックＴ細胞で処置したマウスは、注入後３０日を超えて生存しなかった。
（実施例５）
Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで神経芽腫腫瘍細胞を死滅させる
神経芽腫細胞系ＩＭＲ５に対するＢ７Ｈ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性について試験した。この研究は、本明細書に開示されるＢ７Ｈ３標的化ナノボディを使用して生成したＣＡＲ Ｔ細胞を、市販の抗ヒトＢ７Ｈ３ハイブリドーマ抗体３７６．９６に基づくＣＡＲ Ｔ細胞（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３５（２）： ２２１－２３７， ２０１９）と比較した。Ｇ８、Ｂ１２、Ｃ４および３７６．９６ ＣＡＲ Ｔ細胞をＩＭＲ５ ＧＬ細胞と共に、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間インキュベートした。すべてのＣＡＲ Ｔ細胞が、モックＴ細胞と比較して、用量依存的にＩＭＲ５腫瘍細胞を効果的に溶解させたが、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験した他のＣＡＲ Ｔ細胞よりもわずかに効果的であった（図２０Ａ）。
次に、ＣＡＲ Ｔ細胞をＩＭＲ５異種移植モデルにおいて評価した（図２０Ｂの概略図を参照されたい）。ＩＭＲ５異種移植マウスに、腫瘍接種の３５日後（０日目）に、５００万個のＣ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｂ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｇ８ ＣＡＲ Ｔ細胞、３７６．９６ ＣＡＲ Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞（モック）をｉ．ｖ．注入した。異種移植モデルにおけるＩＭＲ５腫瘍成長の代表的なバイオルミネセンスイメージを図２０Ｃに示し、腫瘍バイオルミネセンスの定量を図２０Ｄに示す。５００万個のＢ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、３７６．９６ ＣＡＲ Ｔ細胞およびモックＴ細胞と比較して有意に低下した腫瘍成長を示した。Ｃ４ ＣＡＲ Ｔ細胞も中程度の抗腫瘍活性を示した。
（実施例６）
Ｇ８のマウスＢ７Ｈ３に対する交差反応性
抗Ｂ７Ｈ３ナノボディＧ８、Ｃ４およびＢ１２のマウスＢ７Ｈ３への結合活性をフローサイトメトリーによって測定した。Ｇ８は、３つのＫＰＣ細胞系（ＣＲＥＰ１２８０９６、ＣＲＥＰ１３３２３９、およびＰＤＡ９５７７５；膵管腺癌細胞）およびマウス黒色腫細胞系Ｂ１６で発現されるマウスＢ７Ｈ３への正の結合を示したが、Ｃ４もＢ１２も示さなかった。Ｂ７Ｈ３標的化ＣＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性を、Ｂ１６黒色腫細胞およびＢ７Ｈ３（ＣＤ２７６）ノックアウト細胞を使用して評価した。Ｇ８ ＣＡＲ Ｔ細胞のみが、マウスＢ７Ｈ３陽性Ｂ１６細胞の特異的殺滅を示した（図２１Ｂ）。
（実施例７）
Ｂ７Ｈ３ナノボディのエピトープマッピング
抗Ｂ７Ｈ３ナノボディおよび市販の抗体３７６．９６のエピトープマッピングを実施した。ヒトＢ７Ｈ３タンパク質由来の合計４８個のペプチドを設計し、合成した。各ペプチドは、１８個のアミノ酸からなり、隣接するペプチドと９アミノ酸重複していた。ＥＬＩＳＡ技術を使用して、抗体の各ペプチドへの結合能を試験した（図２１Ｃ）。結果は、Ｇ８および３７６．９６が、いずれもペプチド１０、１１、および１５（配列番号３５～３７）を結合したため、類似するエピトープを結合することを実証する。Ｃ４およびＢ１２は、直鎖化されたペプチドのライブラリーによって予測することができなかった立体構造エピトープを有し得る。
開示される主題の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態が本開示の例に過ぎず、本開示の範囲の限定と解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および趣旨の範囲内にあるすべてについて権利を主張する。

Claims (60)

  1. Ｂ７Ｈ３を特異的に結合する単一ドメインモノクローナル抗体であって、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、抗体。
  2. 前記ＣＤＲ配列が、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴもしくはＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキーム、または前記Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴおよびＰａｒａｔｏｍｅ番号付けスキームの組合せを使用して規定される、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号３の残基３１～３５、５０～６６および９７～１１４；
    配列番号３の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１５；または
    配列番号３の残基２６～３５、５０～６１および９８～１１４
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  4. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号１の残基３１～３５、５０～６６および９７～１１８；
    配列番号１の残基２６～３３、５１～５８および９７～１１９；または
    配列番号１の残基２７～３５、４７～６２および９８～１１８
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  5. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号２の残基３１～３５、５０～６６および９７～１０５；
    配列番号２の残基２６～３３、５１～５８および９７～１０６；または
    配列番号２の残基２７～３５、４７～６１および９７～１０６
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  6. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号４の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１０；
    配列番号４の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１０；または
    配列番号４の残基２７～３５、４７～６０および９６～１０９
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  7. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号５の残基２７～３０、４５～６１および９０～１０９；
    配列番号５の残基２６～２８、４６～５３および９０～１１０；または
    配列番号５の残基２７～３０、４３～５５および９０～１１０
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  8. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号６の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１１；
    配列番号６の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または
    配列番号６の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  9. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号７の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１１；
    配列番号７の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または
    配列番号７の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  10. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号８の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１１；
    配列番号８の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または
    配列番号８の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  11. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号９の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１１；
    配列番号９の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１２；または
    配列番号９の残基２７～３５、４７～６０および９６～１１１
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  12. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号１０の残基３１～３５、５０～６５および９６～１１３；
    配列番号１０の残基２６～３３、５１～５７および９６～１１４；または
    配列番号１０の残基２７～３５、４７～６０および９７～１１４
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  13. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号１１の残基３０～３４、５０～６４および９３～１０５；
    配列番号１１の残基２５～３２、５０～５６および９３～１０４；または
    配列番号１１の残基２６～３４、４６～５９および９３～１０５
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  14. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列がそれぞれ、
    配列番号１２の残基３２～３５、５１～６５および９４～１０７；
    配列番号１２の残基２６～３３、５１～５７および９４～１０７；または
    配列番号１２の残基２７～３５、４７～６０および９４～１０８
    を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体。
  15. 前記抗体の前記アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２と少なくとも９０％同一である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
  16. 前記抗体の前記アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２を含むかまたはそれからなる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. ヒト化抗体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
  18. キメラ抗体である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  20. ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達部分、シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組合せをさらに含む、請求項１９に記載のＣＡＲ。
  21. 前記ヒンジ領域がＣＤ８αヒンジ領域を含み；
    前記膜貫通ドメインがＣＤ８α膜貫通ドメインを含み；
    前記共刺激シグナル伝達部分が４－１ＢＢシグナル伝達部分を含み；および／または
    前記シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、
    請求項２０に記載のＣＡＲ。
  22. 請求項１９から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する単離された細胞。
  23. 細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２２に記載の単離された細胞。
  24. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体およびエフェクター分子を含むイムノコンジュゲート。
  25. 前記エフェクター分子が毒素である、請求項２４に記載のイムノコンジュゲート。
  26. 前記毒素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはそのバリアントである、請求項２５に記載のイムノコンジュゲート。
  27. 前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のバリアントがＰＥ３８である、請求項２６に記載のイムノコンジュゲート。
  28. 前記エフェクター分子が光子吸収体である、請求項２４に記載のイムノコンジュゲート。
  29. 前記エフェクター分子が検出可能な標識である、請求項２４に記載のイムノコンジュゲート。
  30. 前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素または放射性同位体を含む、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
  31. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートした薬物を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
  32. 前記薬物が低分子である、請求項３１に記載のＡＤＣ。
  33. 前記薬物が、微小管阻害剤、抗有糸分裂剤および／または細胞傷害剤である、請求項３１または請求項３２に記載のＡＤＣ。
  34. 請求項１から１８のいずれかに記載の抗体および少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む多特異性抗体。
  35. 二特異性抗体である、請求項３４に記載の多特異性抗体。
  36. 三特異性抗体である、請求項３４に記載の多特異性抗体。
  37. 前記少なくとも１つの追加のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、Ｔ細胞受容体またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化受容体の構成成分を特異的に結合する、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  38. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体にコンジュゲートしたナノ粒子を含む、抗体－ナノ粒子コンジュゲート。
  39. 前記ナノ粒子が、ポリマーナノ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーミセル、またはニオソームを含む、請求項３８に記載の抗体－ナノ粒子コンジュゲート。
  40. 前記ナノ粒子が細胞傷害剤を含む、請求項３８または請求項３９に記載の抗体－ナノ粒子コンジュゲート。
  41. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体および異種タンパク質またはペプチドを含む融合タンパク質。
  42. 前記異種タンパク質が、Ｆｃタンパク質またはロイシンジッパーである、請求項４１に記載の融合タンパク質。
  43. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の多特異性抗体または請求項４１もしくは請求項４２に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子。
  44. プロモーターに作動可能に連結した、請求項４３に記載の単離された核酸分子。
  45. 請求項４３または請求項４４に記載の核酸分子を含むベクター。
  46. 請求項４４に記載の核酸分子または請求項４５に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  47. 薬学的に許容される担体および請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２２、２３および４６のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の多特異性抗体、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の抗体－ナノ粒子コンジュゲート、または請求項４１もしくは請求項４２に記載の融合タンパク質を含む組成物。
  48. 試料中のＢ７Ｈ３の発現を検出する方法であって、
    前記試料を、請求項１から１８のいずれかに記載の抗体と接触させることと、
    前記抗体の前記試料への結合を検出し、それによって、前記試料中のＢ７Ｈ３の発現を検出することと
    を含む方法。
  49. Ｂ７Ｈ３陽性がんを有するものとして対象を診断する方法であって、
    前記対象から得られた試料を、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体と接触させることと、
    前記抗体の前記試料への結合を検出し、それによって、Ｂ７Ｈ３陽性がんを有するものとして前記対象を診断することと
    を含む方法。
  50. 前記抗体が直接的に標識されている、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
  51. 前記抗体を検出抗体と接触させることと、
    前記検出抗体の前記抗体への結合を検出し、それによって、前記試料中のＢ７Ｈ３の発現を検出するか、またはＢ７Ｈ３陽性がんを有するものとして前記対象を診断することと
    をさらに含む、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
  52. 前記試料が、Ｂ７Ｈ３陽性がんを有すると疑われる対象から得られる、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記試料が腫瘍生検である、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんを処置する方法であって、前記対象に、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の多特異性抗体、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の抗体－ナノ粒子コンジュゲート、請求項４１もしくは請求項４２に記載の融合タンパク質、または請求項４７に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  55. 対象におけるＢ７Ｈ３陽性がんの腫瘍成長または転移を阻害する方法であって、前記対象に、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、請求項３１から３３のいずれか一項に記載のＡＤＣ、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の多特異性抗体、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の抗体－ナノ粒子コンジュゲート、請求項４１もしくは請求項４２に記載の融合タンパク質、または請求項４７に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  56. 前記Ｂ７Ｈ３陽性がんが固形腫瘍である、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
  57. 前記固形腫瘍が、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、食道がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、脳がん、小児がん、黒色腫または中皮腫である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記肝臓がんが肝細胞癌である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記脳がんが神経芽腫または神経膠芽腫である、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記小児がんが、骨肉腫、神経芽腫、横紋筋肉腫またはユーイング肉腫である、請求項５７に記載の方法。
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