CN117736319B - 一种针对肉毒毒素的纳米抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对肉毒毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的CDR1‑3序列如SEQ ID NO.2‑4所示。本发明的实验证明，该纳米抗体与肉毒素抗原具有较强亲和力，临床诊断肉毒毒素中毒提供了新的途径。

Description

一种针对肉毒毒素的纳米抗体

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种针对肉毒毒素的纳米抗体。

背景技术

肉毒毒素又被称为肉毒神经毒素, 是由厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生的一种毒素蛋白，是已知最强的毒素，根据其抗原性不同可分为七种类型，其中A型肉毒毒素中毒致死率最高。在小鼠中测得BoNTs的腹腔注射半数致死量（LD50）为0.5-5 ng/kg，在人体内的LD50大约为1 ng/kg。肉毒毒素中毒的潜伏期一般为数小时到数天，中毒者一般在2-3d死亡。中毒后可引起虚弱、眩晕、视物不清、骨骼肌麻痹、严重时引起呼吸衰竭导致死亡。食品污染，婴儿肠道感染及伤口感染是引起人类肉毒毒素中毒的主要原因。肉毒毒素生产工艺简单，稳定性良好，具有极强的致死性，是已知微生物毒素中毒性最强的。在日常生活中，由于食物污染肉毒毒素和美容行业不规范注射肉毒毒素导致的中毒事件时有发生，严重威胁人们的生命健康。因此，对于检测和防治肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意义。

纳米抗体是目前已知最小的活性抗原结合蛋白，1993年由Hamers团队在骆驼的血清中发现了一种仅由两条重链构成的新型抗体即重链抗体，而重链抗体的可变区片段就是纳米抗体。与常规IgG抗体相比，纳米抗体的优势在于其结构稳定、特异性强、产量高、易于表达，作为研究工具、诊断和治疗方法受到广泛关注。此外，在抗原识别过程中，由于纳米抗体有着较长的互补决定区，易于形成loop环结构与蛋白质空间构象上的裂隙和空腔结合，从而识别隐匿的凹型表位如酶活性位点和隐匿的病毒表位。因此在肉毒毒素治疗药物或诊断试剂的研发中，纳米抗体是良好的候选药物。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的纳米抗体。

本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包括本发明第二方面所述的核酸分子。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述重组细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的重组载体。

本发明第五方面提供了一种检测肉毒毒素的产品，所述产品包含本发明第一方面所述的纳米抗体。

本发明第六方面提供了一种检测、富集或纯化肉毒毒素的方法，所述方法包括将包含肉毒毒素的样品与本发明第一方面所述的纳米抗体接触。

本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的纳米抗体在制备检测、富集或纯化肉毒毒素的产品中的应用。

本发明第八方面提供了本发明第一方面所述的纳米抗体在制备诊断肉毒毒素引发的肉毒毒素中毒的产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了一种针对肉毒毒素的纳米抗体，所述抗体体积小、结构简单、易于表达、耐热、特异性强，具有较高的结合活性和中和活性。

附图说明

图1是Biacore分析结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组纳米抗体。具体地，本发明利用获取的天然骆驼VHH基因文库，构建VHH噬菌体文库，然后将抗原A型肉毒毒素（肉毒毒素特别是A型肉毒毒素）包被免疫管，利用抗原抗体结合筛选肉毒毒素特异性的纳米抗体。实验结果表明，本发明获得纳米抗体能够有效地与抗原结合。在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一种纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

纳米抗体也被称为单域抗体(Singledomain antibody，sdAb)，是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体，在本发明中，纳米抗体可以具有或不具有恒定区。在一些语境下，其可以与VHH区段通用。

本发明中涉及的纳米抗体的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al- Lazikani的约定来限定或鉴定。三个CDR插在被称为构架区（framework region；FR）的侧翼链段（stretch）之间。

在具体的实施例中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的具体实施方式中，纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

在一种可选的实施方式中，纳米抗体为单价纳米抗体、多价纳米抗体、多特异性抗体和融合型纳米抗体中的至少一种。

单价纳米抗体：是用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。

多价纳米抗体：多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比对应的单价纳米抗体具有更高的抗原亲和力。多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起，从而转换成多价和多特异性的形式。

融合型纳米抗体：纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。在临床，医生希望药物能在体内停留足够长的时间，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

在本发明的一个具体实施例中，所述纳米抗体是单价纳米抗体。

在具体实施例中，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

纳米抗体的修饰形式也在本发明的保护范围内，例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价附着修饰的。纳米抗体的变体也在本发明范围内，其中所述CDR1～CDR3的变体与SEQ ID NO.2～4所示互补决定区组合中的任一组相比，可以分别包含至多3个氨基酸的突变(例如1个、2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述突变为保守突变。“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。

通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的纳米抗体。

在本发明中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，亦包括通过密码子优化以在期望的宿主细胞中更高效表达的变体。核酸通常是RNA或DNA，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA核酸。

本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包含前面所述的核酸分子。

在一些实施方式中，重组载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。

其中一种类型的载体是质粒，即环状双链DNA分子，可将目的DNA片段连接至质粒环中。另一种类型的载体为病毒载体，其可将目的DNA片段连接包装至病毒基因组中(如腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，慢病毒，溶瘤病毒)。这些载体进入宿主细胞后，可以进行目的基因的表达。

本发明提供了一种宿主细胞，其包含前面所述的核酸分子或前面所述的重组载体。

宿主细胞可以是任何合适的(真菌、原核或真核)细胞或细胞系或者任何合适的真菌、原核或真核生物体，例如细菌菌株，包括但不限于革兰氏阴性菌株，例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株；和革兰氏阳性菌株，例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)；链霉菌属(Streptomyces)菌株，例如变青链霉菌(Streptomyces lividans)；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)；真菌细胞，包括但不限于来自木霉属(Trichoderma)物种的细胞，例如来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的细胞；或来自其它丝状真菌；酵母细胞，包括但不限于来自酵母属(Saccharomyces)物种的细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；两栖动物细胞或细胞系，例如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)；昆虫衍生的细胞或细胞系，例如衍生自鳞翅目(lepidoptera)的细胞/细胞系，包括但不限于夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞，或衍生自果蝇(Drosophila)的细胞/细胞系，例如Schneider和Kc细胞；植物或植物细胞，例如烟草植物；和/或哺乳动物细胞或细胞系，例如，衍生自人、哺乳动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO细胞、BHK细胞(例如，BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，例如HeLa、COS(例如COS-7)和PER.C6细胞；以及已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞。

本发明还公开了一种检测、富集或纯化肉毒毒素的产品，所述产品包含前面所述的纳米抗体。

所述产品可以是任何形式，包括但不限于试剂、试剂盒或芯片。

进一步，所述试剂是抗体，其含有前面所述的纳米抗体。

在一些实施例中，抗体可以为全长抗体、重链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等)、鼠源抗体、人源化抗体或抗原结合片段中的任意一种。抗原结合片段包括所述抗原结合片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。

本发明所述的“人源化抗体”是将非人源性抗体的可变区与人抗体的恒定区或骨架区融合而成的抗体，可以减轻非人源性抗体诱发的免疫应答反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。

上述抗原结合片段也即抗体的功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在一些实施方式中，所述试剂是纳米颗粒，其含有前面所述的纳米抗体或其前面所述的抗体。

纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的任意一种。

在一些实施方式中，所述产品是试剂盒，所述试剂盒包含前面所述的纳米抗体、前面所述的抗体或前面所述的纳米颗粒。

在一种实施方式中，包被有纳米抗体或抗体的纳米颗粒作为捕获抗体，标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体作为检测抗体。

在另外一种实施方式中，当试剂盒仅包括：标记有可被检测的标记物的纳米抗体或抗体；此时的纳米抗体或抗体可用于捕获或检测抗体。

在一些实施方式中，可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。

荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。

在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱和过氧草酸盐中的至少一种。

胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在一种可选的实施方式中，富集或纯化肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的产品包括载体以及载体上的纳米抗体或抗体。

在一种可选的实施方式中，载体选自磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。例如将活化后的磁珠与抗体进行孵育，使得磁珠上包被抗体。

本发明还公开了一种检测、富集或纯化肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的方法，所述方法包括将包含肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的样品与前面所述的纳米抗体或前面所述的抗体接触。

本发明还公开了前面所述的纳米抗体或前面所述的抗体在制备检测、富集或纯化肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的产品中的应用。

本发明还公开了前面所述的纳米抗体或前面所述的抗体在制备诊断肉毒毒素特别是A型肉毒毒素引发的肉毒毒素中毒的产品中的应用。

本发明还公开了前面所述的纳米抗体或前面所述的抗体在制备治疗肉毒毒素特别是A型肉毒毒素引发的肉毒毒素中毒的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当药物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。

实施例一 天然骆驼VHH文库的获取

一、材料

骆驼L9的外周血 100 mL；骆驼淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒和FastKing cDNA 第一链合成试剂盒为天根生化科技有限公司产品；PCR Primer Max酶为TAKARA公司产品；基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其它相关试剂均为市购。

二、方法和结果

1、骆驼L9外周血的获取

采用EDTA涂层的采血管从骆驼颈静脉收集100 mL血液，倒置两次防止凝血，将血液样本转移到实验室。

2、淋巴细胞的分离

采用15 ml离心管，按照分离液5 mL，血液5 mL，室温600 g离心25 min。离心后，离心管由上至下分为四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色骆驼淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。小心吸取骆驼淋巴细胞，加入新的50 mL离心管中，加入清洗液，250 g离心15 min，弃去上清。重复清洗两遍，重悬所得细胞为骆驼淋巴细胞。

3、天然VHH文库的调取

取上述淋巴细胞6×10⁷按照RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书操作获得总RNA，按照FastKing cDNA 第一链合成试剂盒说明书，获得cDNA文库。

利用引物CALL001（5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’）和CALL002（5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’）扩增来自cDNA的所有免疫球蛋白重链（VH，VHH）的可变区结构域，经琼脂糖凝胶电泳，约1000bp的片段代表常规重链抗体，约750bp的片段代表仅重链抗体即纳米抗体；胶回收750bp处的片段，获得纯化的DNA片段。利用引物VHH-Back（5’- CCGTGGCCCAGGCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACA -3’ ）和VHH-For（5’-TGCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGAYGGTGACCWGGGT -3’ ）进行巢式PCR，最终获得纳米抗体的基因文库。

实施例二 天然骆驼VHH噬菌体文库的构建

一、材料

天然纳米抗体的基因文库；PCR Primer Max酶为TAKARA公司产品；T4 DNA连接酶为NEB公司产品；基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其它相关试剂均为市购。

二、方法和结果

1、纳米抗体库构建

a）纳米抗体文库片段酶切，连接pComb3XTT载体：

纳米抗体库PCR产物 10 μL

Shif I 1 μL

Cutstmart 5 μL

无菌水补足总体积为 50 μL

上述体系在37℃孵育6 h，经普通DNA产物纯化试剂盒进行回收。

b) 上述酶切产物，连接pComb3XTT载体：

纳米抗体库PCR产物 1 μL

pComb3XTT载体 5 μL

T4连接酶 1 μL

T4 Buffer 1 μL

无菌水补足总体积为 10 μL

16℃连接过夜，连接产物电转化TG1大肠杆菌，涂布在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）和2%葡萄糖的2YT琼脂培养基上。同时进行梯度稀释，获得滴定板计算库容量，挑取单克隆菌落进行测序。获得的噬菌体纳米抗体库菌在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的2%葡萄糖的2YT液体培养基中培养过夜，用PEG沉淀的方法获得噬菌体纳米抗体库。

纳米抗体文库经过酶切，酶连等分子生物学技术构建至噬菌体载体上，噬菌体纳米抗体库菌落经过测序鉴定多序列比对，鉴定库质量；噬菌体库经扩增、PEG沉淀，成功获得噬菌体纳米抗体库，用于后续筛选。

实施例三 抗A型肉毒毒素纳米抗体的噬菌体天然纳米抗体库筛选

一、材料

噬菌体天然纳米抗体库；A型肉毒毒素抗原(BoNT/A-HC)；PBS；Tween-20；TG1；辣根酶标记的抗M13抗体；其他试剂为市购产品。

二、方法

1、淘洗

1.1 10 μg/mL无菌PBS稀释BoNT/A-HC抗原包被免疫管，500 μL每管，4℃包被过夜（抗原总量为5 μg）。

1.2 弃去抗原溶液，加入无菌PBST配置的4%牛奶，室温封闭1 h。同时准备500 μL4%牛奶稀释的噬菌体抗体库5×10¹²cfu室温孵育1 h。

1.3 在封闭的同时，接种200 μL TG1至50 mL 2YT液体培养基中，培养至OD600为0.8。

1.4 弃去牛奶, 在免疫管中加入500 μL 封闭后的噬菌体溶液，室温孵育1 h。

1.5 PBST洗管15次，然后用PBS洗管10次。

1.6 500 μL 0.1 M HCL-Gly洗脱噬菌体，室温洗脱10 min（中间轻微晃动以检查）。加入100 μL 1 M Tris-HCl，以调整洗脱液pH值至pH 7.5。

1.7 再次使用500 μL 0.1 M HCL-Gly洗脱噬菌体，室温10 min，将二次洗脱液加入第一次洗脱液和Tris的混合溶液中。

1.8 将上述获得的噬菌体取500 μL加入10 mL对数生长期的TG1中，37℃静置培养0.5 h。

1.9 4000 rpm 20℃离心15 min。

1.10 弃去上清，将所有沉淀涂布于2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL+ 2%葡萄糖）平板（15 cm大平板）上，37℃培养过夜。

1.11 将所有TG1菌株从平板上刮下后加入至50 mL 2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL +2%葡萄糖）培养中，37℃，220 rpm培养2.5 h使OD值达到约0.1。

1.12菌株生长到达对数期后取10 mL，在其中加入20~200 μL M13KO7辅助噬菌体，37℃静置培养0.5h。

1.13 4000 rpm 20℃离心15 min。

1.14 弃去上清，50 mL 2YTAK（2YT+Amp 100 μg/mL+Kana 70 μg/mL）培养基重悬，28℃震荡培养过夜。

1.15 如上所述沉淀噬菌体进行下一轮淘洗，共进行3轮淘洗，富集挑取单克隆进行ELISA验证。

2、ELISA方法分析单克隆噬菌体

2.1 在96深孔板中生产单克隆噬菌体

2.1.1 40 μL TG1接种于10 mL新鲜 2YT 培养基中, 37℃ 220 rpm 培养3 h。

2.1.2 将洗脱后的噬菌体500 μL加入10 mL TG1中，37℃ 孵育0.5 h。

2.1.3 将感染后的菌液十倍倍比稀释(10^-1，10^-2…10^-8)于2YT培养基中，每个稀释样品取50 μL，涂布于2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL）固体培养基上，37℃过夜。

2.1.4 96孔深板中每孔加入900 μL 2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL）培养基，每个平板挑取单克隆，在96孔深板中37℃，220 rpm，培养4 h。

2.1.5 每孔吸出100 μL与96孔板保存，用于后续测序。

2.1.6 每孔加入10倍稀释的M13KO7 100 μL （1.2 mL M13KO7辅助噬菌体+12 mL2YT培养基），37℃静置孵育0.5 h。

2.1.7 96孔深板1800 rmp 4℃离心15 min。

2.1.8 弃去上清，板子置于28℃摇动10 min。

2.1.9 每孔加入1 mL新鲜的2YTAK（2YT+Amp 100 μg/mL + Kana 70 μg/mL）培养基，28℃培养过夜。

2.1.10 96孔深板1800 rmp 4℃离心15 min，获得单克隆噬菌体上清。

2.2 ELISA验证

2.2.1 板条中包被A型肉毒毒素抗原、阴性对照和阳性对照，4℃包被过夜。

2.2.2 每孔加入200 μL PBSM（PBS配置的4%脱脂牛奶）室温封闭1 h。

2.2.3 弃去孔内溶液后每孔加入100 μL 噬菌体，室温孵育1 h。

2.2.4 0.1% Tween-20去离子水配置洗液洗板3次。

2.2.5 每孔加入100 μL anti-M13/HRP抗体（1:5000 稀释），室温孵育45 min。

2.2.6 0.1% Tween-20去离子水配置洗液洗板5次。

2.2.7 每孔加入100 μL TMB显色。

2.2.8 加入中止液后酶联仪测OD450 nm。

筛选与抗原结合的抗体，命名为2-22；对纳米抗体2-22进行测序，测序鉴定结果如下：

经测序鉴定，纳米抗体2-22的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中 CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示。FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。

实施例四 抗A型肉毒毒素纳米抗体的表达及性质评价

一、材料

真核表达载体pFRT-IgG1由本室保存；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；转染试剂为Invitrogen公司产品，羊抗人IgG、及辣根酶标记的羊抗人IgG购自Thermo；内切酶为NEB公司产品；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；CHO细胞购自ATCC；CD-1小鼠购自维通利华，其他试剂为市购产品。

二、方法

1、抗体的表达

1.1 抗体真核表达载体的构建

pFRT-IgG1是含有人IgG1抗体恒定区基因的高效表达载体。将实施例二所述获得的纳米抗体基因克隆载体用相应的内切酶消化（纳米抗体基因用Nhe I和Xho I消化）后，依次与经相同内切酶消化的载体连接，获得真核表达载体。具体实施如下：

1.1.1 如实施例二所述，获得的纳米抗体2-22基因经PCR获得带有酶切位点的目的片段；

1.1.2 取 PCR产物用Nhe I 和XhoI消化；

1.1.3 取1 μg pFRT-IgG1载体，用Nhe I和XhoI消化。用DNA连接酶T4连接所得的经Nhe I及XhoI消化的pFRT-IgG1载体和用Nhe I及XhoI消化的 PCR产物。连接产物转化TOP10大肠杆菌，涂布在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取质粒。所提取的质粒经Nhe I和Xho I消化后，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有抗体基因的克隆。

作为上述程序的结果，获得的携带A型肉毒毒素纳米抗体2-22基因的质粒。

1.2 纳米抗体的表达

将获得的携带A型肉毒毒素纳米抗体2-22基因的质粒，通过脂质体介导的方法瞬时转染至CHO细胞，8天后收获上清，利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量。利用Mabselect Sure亲和层析柱纯化抗体。利用SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体，结果表明抗体表达成功。

Biacore检测纳米抗体2-22的亲和力

2.1步骤：

a） 开机

Biacore T200按照操作手册进行开机。

b） 样品稀释

将10·HBS-EP+（pH7.4）用去离子水稀释10倍，配制200mL。用运行缓冲溶液稀释抗体至0.3μg/mL，样品BoNT/A-HC稀释浓度为10nM，5nM，2.5 nM，1.25 nM，0.625 nM，0.3125nM。

c） 样品检测并分析

运行Kinetics/Affinity程序进行测定并分析结果。

2.2结果

结果如图1所示，纳米抗体2-22与抗原结合的KD（M）为5.2 E-11。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种抗肉毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-2任一项所述的纳米抗体。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体。

6.一种检测肉毒素的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-2任一项所述的纳米抗体。

7.权利要求1-2任一项所述的纳米抗体在制备检测、富集或纯化肉毒素的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测、富集或纯化肉毒素的方法包括将包含肉毒素的样品与权利要求1-2任一项所述的纳米抗体接触。

9.权利要求1-2任一项所述的纳米抗体在制备诊断肉毒毒素引发的肉毒毒素中毒的产品中的应用。