CN107207591A - 血脑屏障受体抗体及使用方法 - Google Patents

血脑屏障受体抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与血脑屏障上表达的受体结合的抗体及其使用方法。

Description

血脑屏障受体抗体及使用方法
相关申请的交叉引用
依据35 USC§119(e)，本申请要求于2014年12月10日提交的美国临时申请号62/090295和于2015年11月6日提交的临时申请号62/251983的利益，它们的完整内容通过引用结合在本文中。
发明领域
本发明涉及与血脑屏障上表达的受体结合的抗体及其使用方法。
背景
大分子药物的脑穿透严重受限于在很大程度上不能透过的血脑屏障(BBB)。克服该障碍的一种策略是利用在脑部毛细血管内皮表达的内源受体的转胞吞作用(transcytosis)运输通路已经针对这些受体设计重组蛋白质如单克隆抗体，以使得能够向脑部进行大分子的受体介导的递送。由于这些受体进行重要的生物学功能，诸如必需氨基酸、葡萄糖和脑中需要的其他资源的转运，这些分子的转运不受此类靶向抗体的阻断是重要的。此外，由于表达在BBB上的抗体通常也在其他区室中表达，所述抗体不具有危险的、脱靶作用也是重要的。
概述
基于受体介导的转运(Receptor mediated transport，RMT)的双特异性靶向技术具有为宽泛的用于CNS疾病的潜在的治疗剂打开机会的潜力。过去的研究已经表明，在小鼠中单次系统性注射后，针对运铁蛋白受体的抗体能够以示踪和治疗相关的剂量递送包括抗体和小分子的治疗剂穿过BBB(参见，例如，WO 2012/075037)。如上文讨论的，在设计这些技术时重要的考虑包括保留靶标BBB受体(BBB receptors，BBB-Rs)的转运功能和安全性模式。本公开内容为基于RMT的靶向技术提供了新的靶标，并且提供了特异性针对这些靶标的抗体。
例如，如在下述实施例中所证明的，基于在BBB中的高水平表达和激昂特异性针对靶标的抗体转运穿过BBB的能力，鉴定了新型的BBB-R靶标。此外，产生了针对这些BBB-R靶标的单特异性和多特异性抗体。使用这些抗体，表明basigin、Glut1和CD98hc是BBB上用于转运药剂(例如，治疗剂和/或显像剂)穿过BBB的候选靶标。
在本公开内容的一个方面，本文提供将药剂转运穿过血脑屏障的方法。所述方法可以包括使血脑屏障暴露于抗体，所述抗体：(i)结合血脑屏障受体(BBB-R)；并且(ii)与所述药剂偶联；其中所述抗体通过与所述BBB-R结合将与其偶联的药剂转运穿过血脑屏障。在一些方面，所述BBB-R是CD98重链(CD98hc)。在一些方面，所述BBB-R是basigin。在该方法的一些方面，所述BBB-R是1型葡萄糖转运蛋白(Glucose Transporter Type 1，Glut1)。在该方法的一些方面，所述血脑屏障是在哺乳动物中的。在该方法的一些方面，所述哺乳动物具有神经疾病或病症。
在本公开内容的另一个方面，本文提供治疗哺乳动物中的神经疾病或病症的方法。所述方法可以包括向所述哺乳动物施用抗体，所述抗体：(i)结合BBB-R；并且(ii)与有效用于治疗所述神经疾病或病症的治疗剂偶联。在所述治疗方法的一些方面，所述BBB-R是CD98hc。在所述治疗方法的一些方面，所述BBB-R是basigin。在所述治疗方法的一些方面，所述BBB-R是Glut1。在所述治疗方法的一些方面，所述神经疾病或病症选自由下述组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，卒中(stroke)，痴呆(dementia)，肌营养不良(muscular dystrophy，MD)，多发性硬化(multiple sclerosis，MS)，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，囊性纤维化(cystic fibrosis)，安吉尔曼综合征(Angelman′s syndrome)，利德尔综合征(Liddle syndrome)，帕金森病(Parkinson′sdisease)，皮克病(Pick′s disease)，佩吉特病(Paget′s disease)，癌症，和外伤性脑损伤(traumatic brain injury)。
在上述方法的某些方面，所述哺乳动物可以是人。在上述方法的某些方面，所述药剂可以是显像剂。在上述多个方面的任一个中，所述药剂可以是神经病症药物。在上述方法的某些方面，抗体与BBB-R的结合不消弱所述BBB-R与一种或多种其天然配体的结合。在上述方法的某些方面，在所述抗体的存在下，所述BBB-R与一种或多种其天然配体的结合是在不存在所述抗体时的结合量的至少80％。在上述方法的某些方面，所述抗体与BBB-R的结合不消弱所述BBB-R的任一天然配体穿过血脑屏障的转运。在上述方法的某些方面，所述BBB-R的任一天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗体的转运量的至少80％。
在上述方法的某些方面，所述抗体已被改造具有低结合亲和力。
在上述方法的某些方面，所述抗体不抑制细胞增殖、细胞分裂、和/或细胞粘附。在上述方法的某些方面，所述抗体不诱导细胞死亡。在上述方法的某些方面，所述抗体具有约1nM至约100μM、约1nM至约10nM、约5nM至约100μM、约50nM至约100μM或约100nM至约100μM的针对所述BBB-R的IC50。
在上述方法的某些方面，所述抗体具有约1nM至约10μM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1nM至约50nM、约1nM至约100μM的针对所述BBB-R的亲和力。
在上述方法的某些方面，所述抗体以治疗剂量施用给哺乳动物。在一些方面，所述治疗剂量是使BBB-R饱和的剂量。
在上述方法的某些方面，所述抗体是多特异性的，并且与其偶联的药剂包含该多特异性抗体与脑抗原结合的抗原结合位点。在一些方面，所述多特异性抗体是双特异性的。在一些方面，所述脑抗原选自由下述组成的组：β-分泌酶1(BACE1)，Aβ，表皮生长因子受体(EGFR)，人表皮生长因子受体2(HER2)，Tau，载脂蛋白(例如，载脂蛋白E4(ApoE4))，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，朊病毒蛋白(PrP)，富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6(DR6)，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，p75神经营养蛋白受体(p75NTR)，和胱天蛋白酶6。在一些方面，所述多特异性抗体结合CD98hc和BACEI两者。在一些方面，所述多特异性抗体结合CD98hc和Aβ两者。在一些方面，所述多特异性抗体结合basigin和BACEI两者。在一些方面，所述多特异性抗体结合basigin和Aβ两者。在一些方面，所述多特异性抗体结合Glut1和BACEI两者。在一些方面，所述多特异性抗体结合Glut1和Aβ两者。在一些方面，所述BBB-R是CD98hc。在一些方面，所述BBB-R是basigin。
在一方面，本公开内容提供可溶的抗-basigin(抗-Bsg)抗体，其用在本文提供的转运药剂穿过血脑屏障的方法中。在一些实施方案中，提供一种抗-Bsg抗体，其中所述抗体与Bsg的结合不消弱basigin与其一种或多种天然配体的结合。在某些实施方案中，提供一种抗-Bsg抗体，其中在存在所述抗体时Bsg与其一种或多种天然配体的结合量为不存在所述抗体时Bsg与其一种或多种天然配体的结合量的至少80％。
在一些实施方案中，提供一种抗-Bsg抗体，其中所述抗体与Bsg的结合不消弱Bsg的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运。在某些实施方案中，提供一种抗-Bsg抗体，其中在存在所述抗体时Bsg的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运量是不存在所述抗体时一种或多种所述天然配体穿过血脑屏障的转运量的至少80％。
在一些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体特异性针对来自一种或多种物种的basigin。在一些实施方案中，本文提供的抗-Bsg抗体特异性结合鼠Bsg(mBsg)。在一些实施方案中，本文提供的抗-Bsg抗体特异性结合人Bsg(hBsg)。在一些实施方案中，本文提供的抗-Bsg抗体能够特异性结合hBsg和mBsg。
如下文进一步所述，这些是Bsg已知的多种同种型。因此，在一些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体是同种型特异性的。在一些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体特异性结合hBsg的同种型，例如，hBsg同种型1(hBsg1)，hBsg同种型2(hBsg2)。例如，本公开内容的抗-Bsg抗体是抗-hBsg2抗体。在一些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体特异性结合mBsg的同种型。在某些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体结合Bsg细胞外结构域内的表位。
在一些方面，本公开内容提供包含具有本文所述的氨基酸的互补决定区(CDRs)、构架区(FRs)和/或轻链和重链可变结构域的抗-Bsg抗体。在一些实施方案中，
在某些实施方案中，本公开内容的抗-Bsg抗体包含：选自SEQ ID NOs：3，19，35，51和67的轻链CDR1氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：4，20，36，52，和68的轻链CDR2氨基酸序列，和选自SEQ ID NOs：5，21，37，53，和69的轻链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含：选自SEQ ID NOs：6，22，38，54和70的重链CDR1氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：7，23，39，55，和71的重链CDR2氨基酸序列，和选自SEQID NOs：8，24，40，56，和72的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体进一步包含这样的轻链可变结构域构架区，所述轻链可变结构域构架区包含：选自SEQ ID NOs：9，25，41，57，和73的氨基酸序列的FR1，选自SEQ ID NOs：10.26，42，58，和74的氨基酸序列的FR2，选自SEQ ID NOs：11，27，43，59，和75的氨基酸序列的FR3，和选自SEQ ID NOs：12，28，44，60，和76的氨基酸序列的FR4。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体进一步包含这样的重链可变结构域构架区，所述重链可变结构域构架区包含：选自SEQ ID NOs：13，29，45，61，和77的氨基酸序列的FR1，选自SEQ ID NOs：14.30，46，62，和78的氨基酸序列的FR2，选自SEQ ID NOs：15，31，47，63，和79的氨基酸序列的FR3，和选自SEQ ID NOs：16，32，48，64，和80的氨基酸序列的FR4。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链，所述轻链包含含有选自SEQ IDNOs：1，17，33，49和65的氨基酸序列的可变结构域。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NOs：1，17，33，49和65的氨基酸序列至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的重链，所述重链包含含有选自SEQ IDNOs：2，18，34，50，和66的氨基酸序列的可变结构域。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NOs：2，18，34，50，和66的氨基酸序列至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体这样的轻链可变结构域和重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NOs：1，17，33，49，和65的氨基酸序列，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NOs：2，18，34，50，和66的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO：1相对应的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO：2相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgA。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO：17相对应的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO：18相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgB。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO：33相对应的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO：34相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgC。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO：49相对应的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO：50相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgD。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含这样的轻链和重链，所述轻链包含与SEQ IDNO：65相对应的氨基酸序列，所述重链包含与SEQ ID NO：66相对应的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgE。
在一方面，本公开内容提供适于用在本文提供的转运药剂穿过血脑屏障的方法中的抗-Glut1抗体。在一些实施方案中，提供一种抗-Glut1抗体，其中所述抗体与Glut1的结合不消弱Glut1与其一种或多种天然配体的结合。在某些实施方案中，提供一种抗-Glut1抗体，其中在存在所述抗体时Glut1与其一种或多种天然配体的结合量是在不存在所述抗体时Glut1与其一种或多种天然配体的结合量的至少80％。
在一些实施方案中，提供一种抗-Glut1抗体，其中所述抗体与Glut1的结合不消弱Glut1的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运。在某些实施方案中，提供一种抗-Glut1抗体，其中在存在所述抗体时Glut1的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运量是在不存在所述抗体时所述一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运量的至少80％。
在一些实施方案中，本公开内容的抗-Glut1抗体特异性针对来自一种或多种物种的basigin。在一些实施方案中，本文提供的抗-Glut1抗体特异性结合鼠Glut1(mGlut1)。在一些实施方案中，本文提供的抗-Glut1抗体特异性结合人Glut1(hGlut1)。在一些实施方案中，本文提供的抗-Glut1抗体能够特异性结合hGlut1和mGlut1。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含：含有SEQ ID NO：83的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：84的轻链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：85的轻链CDR3氨基酸序列和/或含有SEQ ID NO：86的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：87的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：88的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含这样的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO：89(FR1)、SEQ ID NO：90(FR2)、SEQ ID NO：91(FR3)、和SEQ IDNO：92(FR4)相对应的氨基酸序列的构架区。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含这样的重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO：93(FR1)、SEQ ID NO：94(FR2)、SEQ ID NO：95(FR3)和SEQ IDNO：96(FR4)相对应的氨基酸序列的构架区。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有与SEQ ID NO：81相对应的氨基酸序列的轻链可变结构域和含有与SEQ ID NO：82相对应的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些方面中，本公开内容提供能够结合BBB-R的多特异性抗体。在一些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含来自本文公开的任一种抗-BBB-R抗体的第一抗原结合位点。在一些实施方案中，本文公开的多特异性抗体还包含能够结合本文公开的脑抗原的第二抗原结合位点。在某些实施方案中，所述脑抗原选自由下述组成的组：BASCE1，Abeta，EGFR，HER2，Tau，载脂蛋白(例如，ApoE4)，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，PrP，LRRK2，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，DR6，APP，p75NTR，和胱天蛋白酶。
在另一方面，本公开内容提供编码本文公开的任一种多肽(包括提供的任一种抗体)的核酸。
在另一方面，本公开内容提供包含所述核酸的宿主细胞和制备本文公开的抗体的方法。因此，本文提供用于制备抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞，以产生本公开内容的抗体。
在另一方面，本公开内容提供包含本文公开的一种或多种抗体的药物组合物。
附图简述
图1A描述用于确定潜在的受体介导的转运靶标成功的筛查级联。
图1B通过流式细胞术描述首次用于免疫的噬菌体文库来源的抗-Lrp1和抗-胰岛素受体(InsR)抗体与它们转染在HEK293细胞中相对应的鼠受体的结合(在每个直方图中左侧峰是对照抗体(“二级Ab-PE”)，并且右侧峰是抗-Lrp1(左面的直方图)或抗-InsR(右面的直方图)抗体)。
图1C是定量示踪剂量的I125-标记的抗体(抗-运铁蛋白受体(TfRA)，抗-Lrp1，和抗-InsR)在野生型小鼠中静脉内施用后不同时间点的脑摄入的线条图，定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图1D是在20mg/kg剂量的所示抗体后1和24小时定量脑中抗体浓度的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝6只；*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001)。
图1E包含免疫组织化学染色后小鼠皮质组织切片的照片，并且显示在以5mg/kg静脉内注射所示抗体后1小时抗体的定位。比例尺，50μm。
图2A显示使用来自野生型小鼠的FACS-纯化的BBB和肝/肺内皮细胞的微阵列表达模式确定的在BBB富集的基因(记述在Tam等人，Dev Cell.2012年2月14日；22(2)：403-17中)。
图2B显示抗-Lrp8、抗-Ldlrad3和抗-CD320抗体的流式细胞术分析，并且显示抗体与其在HEK293细胞中表达的相对应抗原的结合。每个直方图中左侧的峰对应对照抗体，并且右侧的峰对应抗-Lrp8、抗-Ldlrad3和抗-CD320抗体(从左面到右面的直方图)。
图2C是在野生型小鼠中静脉内施用所示抗体后在给药后不同时间点定量示踪剂量的I125-标记的抗体的脑摄入的线条图。数据定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图2D和2E显示在20mg/kg剂量的所示抗体后1和24小时定量脑中抗体浓度的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝6只；****P≤0.001，*P≤0.05)；“n.s.”，不是统计学显著的。
图2F包含免疫组织化学染色后小鼠皮质组织切片的照片，并且显示在以5mg/kg静脉内注射所示抗体后1小时抗体的定位。比例条，50μm。
图2G是关于普遍研究的针对RMT的受体(即，Tfrc，Lrp1，Insr)和通过微阵列鉴定的BBB-富集的基因(即，Lrp8，Ldlrad3，CD320)定量由纯化的内皮细胞的RNA-seq数据产生的平均RPKM值(基因表达)的柱状图。数据集合揭示Lrp8、Ldlrad3和CD320在脑内皮细胞上的低绝对mRNA表达。
图3A描述用于通过之前所述的FACS(Tam等人，2012，同前所述)从野生型小鼠分离CD31-阳性的和CD45-阴性的脑内皮细胞(BEC)的方法。分离的BEC通过质谱法(MS)进行分析，并且结果显示在图3B和3C中。
图3B是与脑内皮细胞(BEC)(较之非-BEC)中其他脑细胞特异性蛋白(Fasn，Aldoc，Glul，Plp1)相比较，关于每个内皮细胞蛋白(PgP，Glut1，ZO-1，Esam，Claudin5)，定量通过MS确定的前三种最丰余的肽击中(peptide hits)的整合强度的柱状图。
图3C是关于所示的RMT靶标定量前三种最丰余的肽击中的整合强度的柱状图。
图3D是总结通过文献、微阵列、RNA-seq和质谱法鉴定的潜在的RMT靶标的表格。
图4A包含定量通过流式细胞术分析确定的与转染了鼠basigin的HEK293细胞结合的抗-BsgA和抗-BsgB的结合的直方图。在每个直方图中，左侧峰对应对照抗体，并且右侧峰对应抗-Basigin抗体。
图4B包含在免疫组织化学染色后小鼠皮质组织的照片，并且显示以5mg/kg静脉内注射抗-BsgA或抗-BsgB后1小时抗体的定位。比例尺，50μm。
图4C是在静脉内施用后在所示的给药后时间点(以小时(hr)为单位)定量野生型小鼠中对示踪剂量的所示I125-标记的抗-basigin抗体的脑摄入的直线图，定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图4D和图4E是在20mg/kg剂量的所示抗体后1和24小时分别定量所示抗体在脑和血浆中的水平的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝6只；*P≤0.05，**P≤0.01，****P≤0.0001)。
图4F显示二价(单特异性)抗-Bsg(实线)相对于双特异性(单价抗-Bsg)抗-Bsg/BACE1抗体(虚线)与鼠basigin结合的竞争性ELISA比较的结果(IC50：抗-BsgA-7.1nM，抗-BsgA/BACE1-105.5nM，抗-BsgB-17.5nM，抗-BsgB/BACE1-126.6nM)。
图4G-4I是在以50mg/kg静脉内施用抗-Bsg/BACE1抗体或对照IgG后24小时，分别定量脑抗体浓度(nM)、脑Aβ浓度(pg/g)和血浆抗体浓度(μM)的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝6只；**P≤0.01，****P≤0.0001)，“n.s.”，不是统计学显著的。
图5A是显示与稳定表达Glut1的HEK293细胞结合的抗-Glut1的结合的流式细胞术直方图。最左侧峰对应对照抗体。
图5B是在免疫组织化学染色后小鼠皮质组织切片的照片，并且显示在以5mg/kg静脉内注射抗-Glut1抗体后1小时抗体的定位。比例尺，50μm。
图5C是在野生型小鼠中静脉内施用后在给药后不同时间点定量示踪剂量的I125-标记的抗-Glut1的脑摄入的线条图，定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图5D和图5E是在20mg/kg剂量的所示抗体后数天分别定量脑中和血浆中的抗体水平的线条图。
图5F是定量通过与稳定表达Glut1的HEK293细胞的结合的二价(单特异性)抗-Glut1(实线)相对于双特异性(单价抗-Glut1)抗-Glut1/BACE1(虚线)的流式细胞术分析确定的平均荧光强度(MFI)的线条图。(EC50：抗-Glut1-0.6μg/mL，抗-Glut1/BACE1-＞10μg/mL)。
图5G，5H，5I和5J是在单次50mg/kg静脉内施用抗-Glut1/BACE1或对照IgG后数天分别定量血浆抗体浓度、脑抗体浓度、脑Aβ水平和血浆Aβ水平的线条图。
图5K和5L包含在20mg/kg剂量的所示抗体后1小时和24小时定量脑中抗体的量(表示为每克脑注射的剂量的百分数(％)(图5K))或脑抗体浓度(图5L)的柱状图。与在相同时间点的对照IgG相比较，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。
图6A是与稳定表达CD98hc的HEK293细胞结合的抗-CD98hc抗体的流式细胞术分析。在每个直方图中，对照抗体(二级Ab-PE)对应最左侧峰，抗-CD98hc抗体对应最右侧峰。
图6B包含在免疫组织化学染色后小鼠皮质组织切片的照片，并且显示在以5mg/kg静脉内注射抗-CD98hcA或抗-CD98hcB后1小时抗体的定位。比例尺，50μm。
图6C是在野生型小鼠中静脉内施用后在剂量后不同时间点定量示踪剂量的I125-标记的抗-CD98hc抗体(或IgG对照或抗-TfR抗体)的脑摄入(％注射的剂量/脑的克数)的线条图，定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图6D和6E是在20mg/kg剂量的所示抗体后1小时和24小时分别定量脑中抗体水平(％注射的剂量/脑的克数)和脑-与-血浆比例的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝6只；****P≤0.0001)；“n.s.”，不是统计学显著的。
图6F是定量亲本二价(单特异性)抗-CD98hc抗体相较于抗-CD98hc/BACE1双特异性抗体的亲和力(表示为标准化的OD650)的线条图，这通过使用表达鼠CD98hc的HEK293细胞的流式细胞术测量(IC50：抗-CD98hcA-1.5nM，抗-CD98hcA/BACE1-4.0nM抗-CD98hcB-4.6nM，抗-CD98hcB/BACE1-164.4nM)。
图6G，6H，6I，和6J，是在以50mg/kg静脉内使用所示的抗-CD98hc/BACE1抗体或对照IgG后所示的剂量后天数，分别定量血浆抗体浓度、脑抗体浓度、脑Aβ水平、和血浆Aβ水平的图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝5只，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001；“n.s”，不是统计学显著的)。在图6I中，每个时间点的柱(剂量后1和4天)，从左到右，对应：对照IgG，抗-CD98hcA/BACE1，和抗-CD98hcB/BACE1。
图6K是在野生型小鼠中静脉内施用后在剂量后不同时间点(小时(hr))定量示踪剂量的所示I125-标记的抗体的脑摄入的线条图，定量为平均值±SEM每克脑组织注射的剂量的百分数(每组和每个时间点n＝3只)。
图6L是在以50mg/kg静脉内施用抗-CD98hc/BACE1抗体、抗-TfRA抗体或对照IgG后在所示的剂量后时间点(1或24小时)定量脑抗体浓度的柱状图。柱状图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝5只；**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001；“n.s”，不是统计学显著的)。
图6M和6N是在单次50mg/kg静脉内施用所示的抗-CD98hc/BACE1抗体或对照IgG后在所示的剂量后天数定量相较于对照IgG Aβx-40减少的百分数(％)(图6M)和脑中的Aβx-40浓度(图6N)的图。
图6O和6P是在50mg/kg静脉内施用所示的抗-CD98hc/BACE1抗体或对照IgG后在所示的剂量后天数定量血浆抗体浓度(图6O)和脑抗体浓度(图6P)的图。误差条表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝5只)。
图7A是蛋白质印迹照片。将野生型IMCD3细胞用所述的抗体和浓度(μM)处理24小时。探测裂解物的内源性CD98hc，并且以肌动蛋白作为上样对照。
图7B是定量图7A所示的蛋白质印迹数据的柱状图。蛋白质印迹数据由3次分别一式三份进行的独立的实验平均。柱表示平均值±SEM(n＝3)。
图7C包含在37℃用1μM所示抗体处理1小时的稳定过表达小鼠CD98hc的IMCD3细胞的照片。将细胞固定，并且针对人IgG、小鼠CD98hc和溶酶体标记Lamp1染色。图片代表与Lamp1共染的对照IgG、抗-CD98hcA/BACE1和抗-CD98hcB/BACE1的细胞摄入。比例尺＝5μm。
图7D是定量CD98hc穿孔(puncta)的柱状图。关于与Lamp1共同定位而分析并定量所述穿孔。柱表示平均值±SEM(n＝5)。
图7E-H是蛋白质印迹结果的照片。关于在单次50mg/kg剂量的所示抗体后在剂量后不同天数脑裂解物中的CD98hc表达，分析所述印迹(每组和每个时间点n＝5)。
图7I是定量图7E-7H中所示的蛋白质印迹中的CD98hc水平的柱状图。所有的图表示平均值±SEM(每组和每个时间点n＝5)。
图7J是定量氨基酸摄入活性百分数(％)的柱状图。将稳定过表达小鼠CD98hc细胞的IMCD3细胞用1μM所示抗体处理24小时，并且通过总内在化HPG(甲硫氨酸类似物)的量评估氨基酸摄入活性。BCH(2-氨基-2-降莰烷-羧酸)，其为系统L氨基酸转运蛋白的抑制剂，用作阳性对照。甲硫氨酸摄入表示对对照IgG的百分数并且针对每个数据点绘图。柱表示平均值±SEM(n＝12)。
图8是定量用所示抗体注射的小鼠脑中主质抗体浓度(ng/mL)/mg总蛋白的柱状图。来自主质裂解物的抗体浓度通过人IgG ELISA进行评估并且针对总蛋白浓度标准化。n＝5/组，所示的柱状图是平均值±SEM。通过相对于对照IgG的ANOVA(通过Dunnett's post-hoc检验)，**p＜0.01，****p＜0.0001。
图9是总结所示的RMT抗体的亲和力的表格。除抗-Glut1抗体用FACS分析评估之外，所有的亲和力通过Biacore确定。
图10包含拍摄用来评估CD98hc亚细胞定位和运输的显微镜图像。将小鼠原代脑内皮细胞固定，并且用亚细胞囊泡标记(左图)和抗-小鼠CD98hc(中间图)染色。内源性CD98hc定位在质膜(箭状物)上，并且也在细胞内穿孔上发现(箭头)。通过用抗小窝蛋白1(A)、抗-TfR(B)或抗-EEA1(C)共染色检验共同定位。在质膜上，一亚组CD98hc与小窝蛋白1共同定位(在合并的图A中的箭状物)。一些细胞内穿孔与小窝蛋白1共同定位(图A中的箭状物)。很少的穿孔与TfR共同定位，如在(B)和合并的图像中所示。一些CD98hc细胞内穿孔与EEA1共同定位(在合并的图C中的箭头)。刻度尺＝5μM。
本发明实施方案的详述
I.定义
“血脑屏障”或者“BBB”是指外周循环与脑和脊髓(即，CNS)之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮质膜内的紧密连接形成，产生限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿))转运到脑中的紧密屏障。脑内的血脑屏障，脊髓内的血脊髓屏障，和视网膜内的血视网膜屏障是CNS内的相连的毛细血管屏障，并且在本文中被统称为血脑屏障或者BBB。BBB还包括血-CSF屏障(脉络丛)，其中屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞组成。
“血脑屏障受体”(本文中简写为“BBB-R”)是表达在脑内皮细胞上的跨膜受体蛋白，其能够将分子转运穿过血脑屏障。如上文所讨论的，增加大分子药物的脑穿透的一种策略是利用BBB-R的胞转运输途径，例如，使用靶向这些受体的抗体。本公开内容提供新型的BBB-R靶标和使用针对这些BBB-R的单克隆抗体转运药剂穿过BBB进入脑的方法。所述BBB-R包括CD98重链(CD989hc)，葡萄糖转运蛋白1(Glut1)，和basigin(Bsg)。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。在某些实施方案中，可以用本文公开的抗体给药和/或治疗的个体是尚未诊断患有癌症的个体。在某些实施方案中，可以用本文公开的抗体给药和/或治疗的个体是尚未诊断患有脑癌的个体。在某些实施方案中，可以用本文公开的抗体给药和/或治疗的个体是不具有癌症的个体。在某些实施方案中，可以用本文公开的抗体治疗和/或给药的个体是不具有脑癌的个体。“中枢神经系统”或“CNS”是指控制身体功能的神经组织的复合体，并且包括脑和脊髓。
术语“淀粉样蛋白beta”、“beta-淀粉样蛋白”、“Abeta”、“淀粉样蛋白β”和“Aβ”在本文中可互换使用，是指当β-分泌酶1(“BACE1”)切割APP时产生的淀粉样蛋白前体蛋白(“APP”)片段，以及其修饰、片段和任意功能等价物，包括，但不限于，Aβ1-40，和Aβ1-42。已知Aβ以单体形式存在，以及缔合形成寡聚体和原纤维结构，可能发现其作为淀粉样蛋白斑的组成成员。所述Aβ肽的结构和序列是本领域普通技术人员公知的，并且制备所述肽或从脑和其他组织中提取其的方法记述在，例如，Glenner和Wong，Biochem BiophysRes.Comm.129：885-890(1984)中。并且，Aβ肽也能以多种形式商购得到。
术语“大脑血管源性水肿(cerebral vasogenic edema)”是指脑细胞内或细胞外空间内血管内流体或蛋白的过量积聚。例如，大脑血管源性水肿可通过脑MRI检测，其包括，但不限于，FLAIR MRI，并且可以是无症状的(“无症状血管源性水肿(vasogenic edema)”)或与神经学症状相关，如意识错乱(confusion)、头晕(dizziness)、呕吐(vomiting)和昏睡(lethargy)(“症状性血管源性水肿(symptomatic vasogenic edema)”)(参见Sperling等人Alzheimer's&Dementia，7：367，2011)。
术语“大脑微出血(cerebral microhemorrhage)”是指直径小于约1cm的区域的颅内出血或脑中流血。例如，大脑微出血可通过脑MRI检测，其包括，但不限于，T2*-加权的GREMRI，并且可以是无症状的(“无症状微出血(asymptomatic microhemorrhage)”)或可以潜在地与诸如暂时或永久性局部运动或感觉损害、共济失调(ataxia)、失语症(aphasia)和发音困难(dysarthria)的症状相关(“症状性微出血(asymptomatic microhemorrhage)”)。参见，例如，Greenberg，等人，2009，Lancet Neurol.8：165-74。
术语“脑积液(sulcal effusion)”是指脑沟或脑槽中流体的溢出物。例如，脑积液可通过脑MRI检测，其包括但不限于FLAIR MRI。参见Sperling等人Alzheimer's&Dementia，7：367，2011。
术语“中枢神经系统的表面铁沉积症(superficial siderosis of the centralnervous system)”是指进入脑的蛛网膜下隙的流血或出血，并且例如，可通过脑MRI检测，包括但不限于T2*-加权的GRE MRI。指示中枢神经系统的表面铁沉积症的症状包括感觉神经性耳聋(sensorineural deafness)，小脑性共济失调(cerebellar ataxia)，和锥体束征(pyramidal signs)。参见Kumara-N，Am J Neuroradiol.31：5，2010。
术语“淀粉样变性(amyloidosis)”用在本文中是指一组由淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样蛋白引起或与其相关的疾病和病症，并且包括，但不限于，由单体、原纤维、或多聚体状态或这三种的任意组合的淀粉样蛋白样蛋白的存在或活性引起的疾病和病症，包括由淀粉样蛋白斑引起的疾病和病症。此类疾病包括，但不限于，继发性淀汾样变性(secondaryamyloidosis)和年龄有关的淀粉样变性(age-related amyloidosis)，诸如包括但不限于下述的疾病：神经病症，如阿尔茨海默病(“AD”)，以认知记忆能力丧失为特征的疾病或病况，诸如，例如，轻度认知损害(mild cognitive impairment，MCI)，雷维小体痴呆症(Lewybody dementia)，唐氏综合征(Down's syndrome)，伴有淀粉样变性的遗传性脑出血(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis)(荷兰型)，关岛帕金森-痴呆复合病(Guam Parkinson-Demential complex)和其他基于或与淀粉样蛋白样蛋白相关的疾病，如进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)，多发性硬化(multiplesclerosis)，克雅病(Creutzfeld Jacob disease)，帕金森病，HIV-相关的痴呆症，ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotropic lateral sclerosis))，包涵体肌炎(inclusion-bodymyositis，IBM)，成年发作型糖尿病(adult onset diabetes)，内分泌肿瘤(endocrinetumor)和老年性心脏淀粉样变性(senile cardiac amyloidosis)，和多种眼病，包括黄斑变性(macular degeneration)，玻璃疣相关的视神经病变(drusen-related opticneuropathy)，青光眼(glaucoma)，和由于β-淀粉样蛋白沉积导致的白内障(cataract)。
青光眼是一组以视神经病变为特征性模式的涉及视网膜神经节细胞(RGC)的损失的视神经疾病。RGC是将视觉信号从眼睛传递到脑的神经细胞。凋亡过程中的两种主要的酶，即，胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-8，在引起RGC凋亡的过程中被激活。胱天蛋白酶-3切割淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，以产生神经毒性片段，包括Aβ。没有APP的保护作用，Aβ在视网膜神经节细胞层中的积聚导致RGC的死亡和不可逆的视力损失。
青光眼通常，但不是总是伴有增加的眼压，其可能是阻断房水循环或其排出的结果。尽管升高的眼内压是发展青光眼的主要危险因素，但是不能定义对于引起青光眼起决定性作用的眼内压阈值。该损伤还可能由向重要的视神经纤维差的血液供应、神经结构中的弱点和/或神经纤维自身的健康性问题引起。不治疗的青光眼导致永久性的视神经损伤以及引起的视野损失，这可能进展成失明。
术语“轻度阿尔茨海默病”或“轻度AD”用在本文中(例如，“诊断患有轻度AD的患者”)是指以20-26的MMSE评分为特征的AD阶段。
术语“轻度至中度阿尔茨海默病”或“轻度至中度AD”用在本文中包括轻度和中度AD二者，并且以18-26的MMSE评分为特征。
术语“中度阿尔茨海默病”或“中度AD”用在本文中(例如，“诊断患有中度AD的患者”)是指以18-19的MMSE评分为特征的AD阶段。
“神经病症(neurological disorder)”当在本文中使用时是指影响CNS和/或具有在CNS中的病因的疾病或病症。示例性CNS疾病或病症包括但不限于，神经病，淀粉样变性，癌症，眼部疾病或病症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作(seizure)，行为障碍和溶酶体贮积症(lysosomal storage disease)。对于本申请的目的，应该理解，CNS包括眼睛，其通常通过血-视网膜屏障与身体的其他部分隔离。神经病症的具体实例包括但不限于，神经变性疾病(包括但不限于，雷维小体病，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitis syndrome)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Draeger syndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)，帕金森病，多系统萎缩(multiple systematrophy)，纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)，tau病变(tauopathies)(包括但不限于，阿尔茨海默病和核上性麻痹(supranuclear palsy))，朊病毒病(priondiseases)(包括但不限于，牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)，库鲁病(kuru)，格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)，慢性消耗性疾病(chronic wastingdisease)，和致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia))，延髓性麻痹(bulbarpalsy)，运动神经元病(motor neuron disease)，和神经系统异变性病症(nervous systemheterodegenerative disorders)(包括但不限于，卡纳范病(Canavan disease)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid-lipofuscinosis)，亚历山大病(Alexander′s disease)，图雷特综合征(Tourette′ssyndrome)，门克斯扭结发综合征(Menkes kinky hair syndrome)，科凯恩综合征(Cockayne syndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(Halervorden-Spatz syndrome)，拉福拉病(lafora disease)，雷特综合征(Rett syndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticulardegeneration)，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)，和翁-隆综合征(Unverricht-Lundborg syndrome))，痴呆(包括但不限于，皮克病(Pick′s disease)，和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia))，癌症(例如，CNS的癌症，包括源自身体其他位置的癌症的脑转移)。
“神经病症药物”是治疗一种或多种神经病症的药物或治疗剂。本发明的神经病症药物包括，但不限于，抗体，肽，蛋白质，一种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式，适体，抑制性核酸(即，小的抑制性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))，核酶，和小分子，或上述中任何一种的活性片段。本文中记载了本发明的示例性神经病症药物，并且包括但不限于：抗体，适体，蛋白质，肽，抑制性核酸和小分子和上述中任何一种的活性片段，它们是它们本身或者特异性识别和/或作用于(即，抑制，活化，或检测)CNS抗原或者靶标分子，如，但不限于，淀粉样蛋白前体蛋白或其部分，淀粉样蛋白β，β-分泌酶，γ-分泌酶，tau，α-突触核蛋白，帕金蛋白，亨廷顿蛋白，DR6，早老蛋白，ApoE，神经胶质瘤或其他CNS癌症标记物，和神经营养蛋白。神经病症药物以及可以使用它们治疗的病症的非限制性实例被提供在以下表A中：
表A：神经病症药物以及可以使用它们治疗的相应病症的非限制性实例
用于本文时，“药剂”，例如，通过本文公开的BBB-R特异性抗体(例如，抗-CD98hc，抗-Bsg，或抗-Glut1抗体)递送穿过血脑屏障的药剂是一种治疗剂或显像剂。在某些方面，治疗剂是抗体(例如，特异性针对CNS或脑抗原的抗体)。在某些方面，治疗剂是药物，例如，神经病症药物，例如，如上文所述。在某些方面，治疗剂是细胞毒性剂。在某些方面，治疗剂是抗体(例如，所述药剂(抗体)是多特异性抗体的一个臂)。
用于本文时，“显像剂”是这样的化合物，其具有允许它的存在和/或位置被直接或间接检测到的一种或多种性质。这样的显像剂的实例包括结合有允许检测的标记结构部分的蛋白质和小分子化合物。
“CNS抗原”或者“脑抗原”是表达在包括脑在内的CNS中的抗原，其可以被抗体或小分子所靶向。这样的抗原的实例包括，但不限于：β-分泌酶1(BACE1)，淀粉样蛋白β(Aβ)，表皮生长因子受体(EGFR)，人表皮生长因子受体2(HER2)，tau，载脂蛋白，例如载脂蛋白E4(ApoE4)，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，朊病毒蛋白(PrP)，富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6(DR6)，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，p75神经营养蛋白受体(p75NTR)，白介素6受体(IL6R)，TNF受体1(TNFR1)，白介素1β(IL1β)和胱天蛋白酶6。在一些实施方案中，抗原是BACE1。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且包括多种抗体结构，包括，但不限于，单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。
当用于本文中时，“特异性结合”或“特异地结合”是指抗体选择性地或优先地结合抗原。通常使用标准测定，如斯卡查德分析或表面等离子体共振技术(例如使用)确定结合亲和力。
“抗体片段”是指除完整抗体外包含完整抗体的一部分的分子，所述完整抗体的一部分与所述完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例在本领域中是公知的(参见例如Nelson，MAbs(2010)2(1)：77-83)，并且包括但不限于Fab，Fab′，Fab'-SH，F(ab′)2，和Fv；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，包括但不限于单链可变片段(scFv)、具有或不具有接头(并且任选串联)的轻链和/或重链抗原结合结构域的融合体；和由抗体片段形成的单特异性或多特异性抗原结合分子(包括但不限于由多个缺乏Fc区域的可变结构域构建的多特异性抗体)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体(例如，包含天然存在的突变，或者该变体可以在产生单克隆抗体的过程中出现，此类变体通常以较少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于，杂交瘤方法(例如，参见Kohler等人，Nature，256：495(1975))，重组DNA方法(例如，参见美国专利号4,816,567)，噬菌体展示方法(例如，使用Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中所述的技术)，和使用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中记述了所述方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。本文中的单克隆抗体的具体实例包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，包括它们的抗原-结合片段。
单克隆抗体在本文中具体地包括：“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
术语“多特异性抗体”以最广义使用，并且特别包括包含具有多表位特异性(即，能够特异性结合一个生物学分子上的两个或更多个不同的表位，或能够特异性结合两个或更多个不同生物学分子上的表位)的抗原-结合结构域的抗体。
“双特异性抗体”是包含能够特异性结合一个生物学分子上两个不同的表位或能够特异性结合两个不同生物学分子上的表位的抗原-结合结构域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可以称为具有“双重特异性”或称为是“双重特异性的”。
与参比抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参比抗体与其抗原50％以上的结合的抗体，并且反之，在竞争测定中，所述参比抗体阻断所述抗体与其抗原50％以上的结合。本文提供了一种示例性的竞争测定。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分是来源于谋者特定的来源或物种而所述重链和/或轻链的其余部分是来源于不同的来源或物种的抗体。
用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架或如下所定义的人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10以下，9以下，8以下，7以下，6以下，5以下，4以下，3以下，或2以下。在一些实施方案中，VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核酸水解酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的多种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂例如药物制剂的“有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
“天然序列”蛋白在本文中是指包含在自然中发现的蛋白的氨基酸序列的蛋白，包括所述蛋白的天然存在的变体。用于本文时，该术语包括从其天然来源分离的形式或重组产生的蛋白。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非本文另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统进行的，其也被称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
术语“FcRn受体”或“FcRn”用在本文中是指已知参与通过人或灵长类胎盘将母体IgG转移至胎儿或通过小肠将卵黄囊(兔)从初乳转移至新生动物的Fc受体(“n”表示新生的)。还已知FcRn通过结合IgG分子并将其再循环到血清中而参与维持恒定的血清IgG水平。“FcRn结合区”或“FcRn受体结合区”是指抗体与FcRn受体相互作用的部分。抗体FcRn结合区中的特定修饰增加所述抗体或其片段针对FcRn的亲和力，并且还增加该分子的体内半衰期。在下述氨基酸位置中的一个或多个中的氨基酸置换增加抗体与FcRn受体的相互作用：251256，285，290，308，314，385，389，428，434和436。在下述位置的置换也增加抗体与FcRn受体的相互作用：238，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，(美国专利号7,371,826)的置换。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整的抗体”和“完整抗体”在本文被可互换地用于指结构与天然抗体结构基本相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同的功能或生物学活性的突变体后代。用于生产重组抗体的“宿主细胞”的实例包括：(1)哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包括Y0和NS0细胞)，幼仓鼠肾细胞(BHK)，Hela细胞和Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如，sf9，sf21和Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属(genus Nicotiana)的植物(例如烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如，属于酵母属(genus Saccharomyces)的那些(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或属于曲霉属(genus Aspergillus)的那些(例如黑曲霉(Aspergillus niger))；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia.coli)细胞或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞等。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生成或来源于非人来源(其利用人抗体全部成员或其他人抗体编码序列)的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是指这样的构架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH构架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等人(见上文)中的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等人(见上文)中的亚型III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)对应非人抗体的那些，并且全部或基本上全部的FR对应人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如，非人抗体，是指已经进行了人源化的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指包含来源于非人抗体的最小限度的序列的嵌合抗体。对于主要部分，人源化抗体是人抗体(接受体抗体)，其中接受体高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区残基替换。例如，在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有构架区(FR)对应于人抗体的那些。在一些情形中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。此外，人源化的抗体可以包含在接受体抗体或在供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR是人抗体的那些，不同之处在于如上所述的FR置换。人源化抗体任选还将包含抗体恒定区的至少一部分，所述抗体恒定区典型地是人抗体的恒定区。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”，是指已经进行人源化的抗体。更多细节参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“人抗体”在本文中是包含这样的氨基酸序列结构的抗体，所述氨基酸序列结构对应于由人或人细胞生成或来源于非人来源(其利用人抗体全部成员或其他人抗体编码序列)的抗体的氨基酸序列结构。人抗体的这一定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以通过多种技术鉴定或制备这样的抗体，所述技术包括但不限于：通过在免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下生产人抗体的转基因动物(例如，小鼠)生产(见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；和美国专利号5,591,669，5,589,369和5,545,807))；从表达人抗体或人抗体片段的噬菌体展示文库选择(见，例如，McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)；Johnson等人，CurrentOpinion in Structural Biology 3：564-571(1993)；Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)；美国专利号5,565,332和5,573,905)；通过体外活化的B细胞生成(见美国专利5,567,610和5,229,275)；和自生产人抗体的杂交瘤分离。
本文中的抗体包括具有改变的抗原结合或生物学活性的“氨基酸序列变体”。这样的氨基酸变化的实例包括具有增强的对抗原的亲和力的抗体(例如“亲和力成熟”抗体)，和具有改变的Fc区(如果存在的话)的抗体，例如具有改变的(增加或减小的)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体(见，例如，WO 00/42072，Presta，L.和WO 99/51642，Iduosogie等人)；和/或具有增加的或减小的血清半衰期的抗体(见，例如，WO 00/42072，Presta，L.)。
“亲和力改变的变体”具有一个或多个被置换的亲本抗体(例如亲本嵌合的、人源化的或人抗体)的高变区或者构架残基，其改变(增加或减小)亲和力。产生这种置换变体的简便方式是使用噬菌体展示。简言之，将若干个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基置换。这样产生的抗体变体以单价形式由丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合体(fusion)。然后对噬菌体展示的变体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴别显著有助于抗原结合的高变区残基。备选地，或另外地，可能有利的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构，从而鉴别抗体与其靶标之间的接触点。根据本文所述的技术，这样的接触残基和邻近残基是置换的候选物。在这样的变体产生后，对一组变体进行筛选，并且可以选择具有改变的亲和力的抗体用于进一步的开发。
抗体在本文中可以与例如“异源分子”缀合，以增加半衰期或稳定性或者在其他方面改善抗体。例如，抗体可以与多种非蛋白聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)中的一种相连。与一个或多个PEG分子相连的抗体片段，如Fab’，是本发明的示例性实施方案。在另一个实例中，异源分子是治疗性化合物或可视化剂(即可检测的标记)，并且抗体用于将这种异源分子转运穿过BBB。异源分子的实例包括，但不限于，化学化合物、肽、聚合物、脂质、核酸和蛋白。
本文中的抗体可以是“糖基化变体”，以使与Fc区相连的任何糖(如果存在的话)被改变，在存在/不存在方面修饰或者在类型方面修饰。例如，具有缺乏与抗体的Fc区偶联的岩藻糖的成熟糖结构的抗体记载在美国专利申请号US 2003/0157108(Presta，L.)中。也参见US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。在WO 2003/011878，Jean-Mairet等人和美国专利号6,602,684，Umana等人中提到在与抗体的Fc区连接的糖中具有平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。在与抗体的Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体在WO 1997/30087，Patel等人中被报道。也参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)，其涉及具有改变的与其Fc区连接的糖的抗体。也参见US 2005/0123546(Umana等人)，其描述了具有修饰的糖基化的抗体。Fc区中的共有糖基化序列(在位置297-299处的Asn-X-Ser/Thr，其中X不能为脯氨酸)的突变(例如，通过将此序列的Asn突变为任何其他氨基酸，通过在位置298处放置Pro，或者通过将位置299修饰为除Ser或Thr外的任何氨基酸)应该消除在该位置处的糖基化(参见，例如，Fares Al-Ejeh等人，Clin.Cancer Res.(2007)13：5519s-5527s；Imperiali和Shannon，Biochemistry(1991)30(18)：4374-4380；Katsuri，Biochem J.(1997)323(Pt 2)：415-419；Shakin-Eshleman等人，J.Biol.Chem.(1996)271：6363-6366)。
术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上是高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构限定的环(“高变环”)和/或包含抗原-接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH(H1，H2，H3)中，三个在VL(L1，L2，L3)中。本文中示例性的HVR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版.Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)，和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
在一些实施方案中，HVR残基包含下表B中通过SEQ ID NOs鉴定出的那些(每一列是分离的克隆)。
表B：HVR序列
BSG-A BSG-B BSG-C BSG-D BSG-E GLUT1
LC CDR1 3 19 35 51 67 83
LC CDR2 4 20 36 52 68 84
LC CDR3 5 21 37 53 69 85
HC CDR1 6 22 38 54 70 86
HC CDR2 7 23 39 55 71 87
HC CDR3 8 24 40 56 72 88
“LC”，轻链；“HC”，重链；“BSG”，basigin
除非另外指明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中按照Kabat等人(同前所述)编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于标记或细胞毒性剂)缀合的抗体。任选地，这样的缀合是通过接头进行的。
“接头”当在本文中使用时是这样的结构，其将抗体共价或非共价地与异源分子相连。在某些实施方案中，接头是肽。在其他实施方案中，接头是化学接头。
“标记”是与本文中的抗体偶联并被用于检测或成像的标记物。这样的标记的实例包括：放射性标记、荧光团、生色团或亲和标签。在一个实施方案中，标记是用于医疗成像的放射性标记，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如，但不限于：碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰和铁。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr：B848：79-87(2007)。
术语“BACE1”，用在本文中，是指除非另外指明，来自任意脊椎动物来源(包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))的任意天然的β-分泌酶1(还称为β-位点淀粉样蛋白前体蛋白切割酶1，膜相关的天冬氨酸蛋白酶2，memapsin 2，天冬氨酰蛋白酶2或Asp2)。该术语包括“全长的”、未加工的BACE1以及由在细胞内加工产生的任意形式的BACE1。该术语还包括天然存在的BACE1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的BACE1多肽的氨基酸序列显示在下文的SEQ ID NO：111中，并且是人BACE1同种型A的序列，如在Vassar等人，Science 286：735-741(1999)中报道的，其通过引用完全结合在本文中：
MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLVSIPHGPNVTVRANIAAITESDKFFINGSNWEGILGLAYAEIARPDDSLEPFFDSLVKQTHVPNLFSLQLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWCCLRCLRQQHDDFADDISLLK(SEQ ID NO：111)。
存在人BACE1的数种其他同种型，包括同种型B、C和D。参见UniProtKB/Swiss-Prot条目P56817，其通过引用完整地结合于本文中。同种型B与同种型A的不同在于其不含氨基酸190-214(即SEQ ID NO：111的氨基酸190-214缺失)。同种型C与同种型A的不同在于其不含氨基酸146-189(即SEQ ID NO：111的氨基酸146-189缺失)。同种型D与同种型A的不同在于其不含氨基酸146-189和190-214(即SEQ ID NO：111的氨基酸146-189和190-214缺失)。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域知晓的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。在下文中记述了用于测量结合亲合力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有所述改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致所述抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗-Bsg抗体”、“抗-basigin抗体”、“与basigin结合的抗体”和“与Bsg结合的抗体”是指能够结合basigin而不消弱basigin与其一种或多种天然配体的结合的抗体。在一个实施方案中，抗-Bsg抗体与不相关的非Bsg蛋白的结合程度小于所述抗体与Bsg的结合的大约10％，例如，通过放射性免疫测定(RIA)测定的。在某些实施方案中，与Bsg结合的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗-Bsg抗体结合在来自不同物种的Bsg(例如，人Bsg和鼠Bsg)之间是保守的Bsg表位。在某些实施方案中，抗-Bsg抗体结合在不同Bsg同种型(例如，两种以上人Bsg同种型)之间保守的Bsg表位。
术语“抗-Glut1抗体”和“结合Glut1的抗体”是指能够结合Glut1而不消弱Glut1与其一种或多种天然配体的结合的抗体。在一个实施方案中，抗-Glut1抗体与不相关的非Glut1蛋白的结合程度小于所述抗体与Glut1的结合的大约10％，例如，通过放射性免疫测定(RIA)测定的。在某些实施方案中，与Glut1结合的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM的解离常数(Kd)(例如10-8M以下，例如，10-8M至10- 13M，例如，10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗-Glut1抗体结合在来自不同物种的Glut1(例如，人Glut1和鼠Glut1)之间是保守的Glut1表位。
根据本发明，“低亲和力”抗-BBB-R(例如抗-CD98hc，抗-Bsg，或抗-Glut1)抗体可以通过用于测量抗体亲和力的多种测定鉴定，例如，但不限于，斯卡查德测定和表面等离子体共振技术(例如使用)。按照本发明的一个实施方案，抗体具有的针对BBB-R抗原(例如，针对CD98hc，Bsg，或Glut1)的亲和力为从约5nM，或从约20nM，或从约100nM，至约10μM，或至约1μM，或至约500nM。因此，亲和力可以在约5nM至约10μM的范围内，或在约20nM至约1μM的范围内，或在约100nM至约500nM的范围内，例如，通过斯卡查德分析或测量的。
“分离的核酸”是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
用于本文时，“分离的编码抗体(例如，抗-CD98hc，抗-Bsg，或抗-Glut1抗体)的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。
“裸抗体”是指没有缀合异源结构部分(如细胞毒性结构部分或放射性标记)的抗体。所述裸抗体可以存在于药物制剂中。
抗体“效应子功能”指抗体引起除补体通路活化外的免疫系统活化的那些生物学活性。此类活性主要存在于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)。抗体效应子功能的实例包括，例如，Fc受体结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，本文中的抗体基本上缺少效应子功能。在另一个实施方案中，本文中的抗体保持最小的效应子功能。修饰或消除效应子功能的方法在本领域中是公知的，并且包括，但不限于，消除引起效应子功能的Fc区的全部或一部分(例如，以缺少Fc区的全部或一部分的形式(如但不限于如在本文中所描述的和如在本领域中已知的Fab片段、单链抗体等)使用抗体或抗体片段)；在一个或多个氨基酸位点处修饰Fc区以消除效应子功能(Fc结合影响：位置234，235，238，239，248，249，252，254，256，265，268，269，270，272，278，289，292，293，294，295，296，297，298，301，303，311，322，324，327，329，333，335，338，340，373，376，382，388，389，414，416，419，434，435，436，437，438，和439)；以及改变抗体的糖基化(包括但不限于，在不允许野生型哺乳动物糖基化的环境中产生抗体，从已经糖基化的抗体中移除一个或多个碳水化合物基团，并且在一个或多个氨基酸位置处修饰抗体以消除抗体在那些位置(包括但不限于N297G和N297A和D265A)处被糖基化的能力)。
抗体“补体活化”功能或者抗体允许或引发“补体通路的活化”的性质可互换地使用，并且是指抗体参与或刺激受试者中免疫系统的补体通路的那些生物学活性。此类活性包括，例如，C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且可以通过抗体的Fc部分和非Fc部分调节。修饰或消除补体活化功能的方法在本领域中是公知的，并且包括，但不限于：消除引起补体活化的Fc区的全部或一部分(例如，以缺少Fc区的全部或一部分的形式(如但不限于如在本文中所描述的和如在本领域中已知的Fab片段、单链抗体等)使用抗体或抗体片段，或者在一个或多个氨基酸位置处修饰Fc区以消除或降低与补体组分的相互作用或活化补体组分的能力，如已知参与C1q结合的位置270、322、329和321)，以及修饰或消除引起补体活化的非Fc区的一部分(即在位置132处修饰CH1区(参见，例如，Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223))。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体分配到不同的“类别”。有五个主要类别的全长抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的数个可以进一步被划分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的。
当在本文中使用时，术语“重组抗体”是指这样的抗体(例如嵌合、人源化或人抗体或其抗原-结合片段)，该抗体由包含编码所述抗体的核酸的重组宿主细胞表达。
“天然抗体”是指天然存在的具有变化的结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链和两个相同的重链构成，所述链通过二硫键键合。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，其也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，其也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配给被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个类型中的一个。
术语“包装插页”用于指常规地包含在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应证、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或关于使用此类治疗性产品的警告的信息。
相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以通过本领域技术内的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，％氨基酸序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech，Inc.，并且源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统、包括数字UNIXV4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。
在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可以这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘X/Y比值
其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另外具体说明，在本文用的所有％氨基酸序列同一性的值都是用ALIGN-2计算机程序如前段所描述的那样得到的。
术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中活性成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库而分离结合所述抗原的抗体。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
CD98重链
术语“CD98重链”或“CD98hc”用在本文中是指来自任意脊椎动物来源的任意天然CD98hc，除非另外指明，所述任意脊椎动物包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。CD98hc也已知具有下述名称，特别是SLC3A2，4F2，4F2hc，Mdu1，Ly10，Mdv1，Frp1，Mgp2，Mgp2hc，NACAE，4T2，4T2hc，和TROP4。该术语CD98hc包括“全长”未加工的CD98hc以及由在细胞中的加工产生的任意形式的CD98hc。该术语还包括天然存在的CD98hc变体，例如，剪接变体或等位基因变体。CD98hc是80kDa的II型跨膜蛋白，并且通过二硫键与6个约40kDa的L-型氨基转运蛋白家族(LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，Asc)的不同轻链(“lc”)成员或“结合配偶体”配对，以形成异型二聚体复合物(参见，Yanagida，等人.Biochim.Biophys.Acta 1514：291-302(2001)；Torrents等人J.Biol.Chem.273：32437-32445(1998)；Broeer等人Biochem.J.349：787-795(2000)；Broeer等人Biochem.J.355：725-731(2001)；Sato等人Antioxid Redox Signal.2000Winter；2(4)：665-71)。因此，当用于本文时，“CD98异型二聚体复合物”是指包含CD98重链的蛋白复合物(例如，LAT1/CD98hc，LAT2/CD98hc，y+LAT1/CD98hc，y+LAT2/CD98hc，xCT/CD98hc，和/或Asc/CD98hc)。CD98异型二聚体复合物作为氨基酸转运蛋白起作用。CD98hc是氨基酸转运蛋白复合物在极化的上皮细胞中表面表达和底外侧定位所需要的(Okubo等人J Neurooncol(2010)99：217-225；Palacin和Kanai.Pflügers Archiv；2004年2月，447(5)：490-494)。CD98hc还与β1整联蛋白相互作用，并且通过细胞质结构域和跨膜区调节它们的活化。研究表明，CD98hc过表达可能通过调节整联蛋白信号传导而有助于细胞生长和存活，并且因此可能在肿瘤发生中起重要作用。研究已经表明，CD98hc表达与细胞增殖紧密联系，并且某些针对CD98hc的抗体能够抑制细胞生长或者在特定细胞型中诱导凋亡(Yagita H.等人(1986)Cancer Res.46：1478-1484；WarrenA.P.，等人.(1996)Blood 87：3676-3687)。
人CD98hc的胞外结构域结构已经分别使用单晶(蛋白数据库编号2DH2)和斜方(蛋白数据库编号2DH3)晶型在2.1和进行了解析。其由(βα)(8)桶和反向平行的β(8)夹心构成，其与细菌的α-糖苷酶相关，但是缺少关键的催化残基并且因此没有催化活性。2DH3是一种二聚体，在界面处有Zn(2+)配位。CD98hc在表面上没有显著的疏水片(hydrophobicpatches)。CD98hc单体和同型二聚体具有极化的带电荷表面。解析结构的N端，包括位于距跨膜结构域四个残基处的Cys109残基的位置，邻近胞外结构域的正电荷表面。N端和Cys(109)-介入二硫键的这一位置产生了足以支持CD98hc胞外结构域与膜磷脂的静电相互作用的模型的空间位阻(参见，Fort等人J Biol Chem.2007Oct 26；282(43)：31444-52)。Cys109在CD98hc的跨膜结构域附近，并且产生与在跨膜结构域3与4之间的轻链细胞外环中的半胱氨酸的二硫键。Cys109和Cys330的突变破坏与轻链的共价缔合，但是没有消弱与整联蛋白的相互作用或对整联蛋白的影响。然而，据报道，C109S突变体仍然支持轻链的表面表达，并且展示出减小的速率的转运特征(Pfeiffer R.，等人.(1998)FEBS Lett.439：157-162)。
在一些实施方案中，本文公开的CD98hc是人CD98hc(“hCD98hc”)，其包含SEQ IDNO：97，99，101，或103所示的氨基酸序列，所示的氨基酸序列分别对应于登记号NP_001012680.1(同种型b)，NP_002385.3(同种型c)，NP_001012682.1(e)，和NP_001013269.1(同种型f)。同种型b，c，e和f分别由具有登记号：NM_001012662.2(SEQ ID NO：98)，NM_002394.5(SEQ ID NO：100)，NM_001012664.2(SEQ ID NO：102)，和NM_001013251.2(SEQ ID NO：104)的核酸编码。在另一个实施方案中，本文公开的CD98hc是灵长类CD98hc(“pCD98hc”)，其包含登记号：NP_001272171.1(SEQ ID NO：109)所示的氨基酸序列，其由登记号：NM_001285242.1(SEQ ID NO：110)所示的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本文公开的CD98hc是鼠CD98hc(“mCD98hc”)，其包含登记号：NP_001154885.1(同种型a)(SEQ ID NO：105)所示的氨基酸序列，其由登记号：NM_001161413.1(SEQ ID NO：106)所示的核酸序列编码。在另一个实施方案中，本文公开的CD98hc包含登记号：NP_032603.3(同种型b)(SEQ IDNO：107)所示的氨基酸序列，其由登记号：NM_008577.4(SEQ ID NO：108)所示的核酸序列编码。
在某些实施方案中，CD98hc被糖基化。在某些实施方案中，CD98hc被磷酸化。
在某些实施方案中，CD98hc的跨膜结构域由SEQ ID NO：97(同种型b)的氨基酸残基185-205组成，hCD98hc的细胞外结构域由SEQ ID NO：97(同种型b)的氨基酸残基206-630组成，并且CD98hc的细胞质结构域由SEQ ID NO：97(同种型b)的氨基酸残基102-184组成。在某些实施方案中，CD98hc的细胞外结构域由SEQ ID NO：103(同种型f)的氨基酸残基105-529组成。
术语“抗-CD98hc抗体”和“与CD98hc结合的抗体”是指能够结合CD98hc的抗体。在某些实施方案中，抗-CD98hc抗体与不相关的非CD98hc蛋白结合的程度小于所述抗体与CD98hc的结合的约10％，例如，如通过放射性免疫测定(RIA)所测量的。
Basigin
术语“Bsg”在用于本文时是指来自任意脊椎动物来源的任意天然的basigin(还称为CD147或EMMPRIN)，除非另外指明，所述任意脊椎动物包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。Bsg的其他同义名称包括5F7，OK，TCSF，HT7，5A11，gp42，neurothelin，OX-47，和HAb18。该术语包括“全长”未加工的Bsg以及由在细胞中的加工产生的任意形式的Bsg。该术语还包括天然存在的Bsg变体，例如，剪接变体或等位基因变体。天然存在的变体的实例包括人Bsg1(176个氨基酸)，Bsg2(269个氨基酸)，Bsg3(385个氨基酸)，和Bsg4(205个氨基酸)，其中Bsg2是在人中存在的主要形式。示例性的人Bsg2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：112中。示例性的鼠Bsg的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：113中。
Glut1
术语“Glut1”在用于本文时是指来自任意脊椎动物来源的任意天然葡萄糖转运蛋白1，除非另外指明，所述任意脊椎动物包括哺乳动物，如灵长类(例如，人)和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。Glut1的其他同义名称包括1型葡萄糖转运蛋白，溶质载体家族2，成员1，SLC2A1，HTLVR，和人T细胞白血病病毒受体。该术语包括“全长”未加工的Glut1以及由在细胞中的加工产生的任意形式的Glut1。该术语还包括天然存在的Glut1变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性的人Glut1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：114中。
II.组合物和方法
在某些方面，本发明提供用于将药剂转运穿过血脑屏障的组合物和/或方法。在一些方面，使用针对CD98hc、Glut1或basigin的抗体将药剂转运穿过血脑屏障。在一些实施方案中，提供抗-Basigin/BACE1抗体。在一些实施方案中，提供抗-Glut1/BACE1抗体。在某些实施方案中，提供抗-CD98hc/BACE1抗体，其用在转运药剂穿过血脑屏障的方法中。在某些实施方案中，本文涉及的抗体结合人和/或灵长类CD98hc、basigin或Glut1。例如，本发明的抗体也有效地用于影响CNS(例如，脑)的疾病或病症的治疗。
A.制备抗-BBB-R抗体及其缀合物
本发明的方法和制品使用或包括与BBB-R结合的抗体。例如，用于抗体制备或筛选的BBB-R抗原可以是其可溶形式或其包含需要的表位的一部分(例如，细胞外结构域)。备选地，或另外地，在其细胞表面上表达BBB-R的细胞可以用于产生或筛选抗体。用于产生抗体的其他形式的BBB-R对本领域技术人员是显而易见的。本文中BBB-R的实例包括CD98hc、Glut1和Basigin。
在一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其不抑制细胞生长。在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其不诱导凋亡。在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其不抑制BBB-R的一种或多种已知的功能。在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其不抑制BBB-R已知的功能中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，所述抗体结合CD98hc并且不抑制由CD98异型二聚体复合物转运的氨基酸。可以用于检测由CD98hc(例如，以与CD98轻链(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，和asc-1)的异型二聚体复合物形式)转运的氨基酸的体外测定在本领域中是已知的并有记载。参见，例如，Fenczik，C.A等人.(2001)J.Biol.Chem.276，8746-8752；还参见，US 2013/0052197。在另一方面，本发明提供用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其不抑制BBB-R与其一种或多种结合配偶体的相互作用(例如，不抑制CD98hc与轻链结合配偶体(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，和Asc-1)的相互作用)。
在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于，在存在所述抗体时，BBB-R与其一种或多种天然配体的结合是在不存在所述抗-BBB-R抗体时的结合量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。在一个具体的实施方案中，所述BBB-R是CD98hc。在另一个具体的实施方案中，所述BBB-R是Glut1。在另一个具体的实施方案中，所述BBB-R是Basigin。用于确定与天然配体的结合的方法在本领域中是已知的(例如，免疫沉淀测定，ELISA等)。
在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于在存在所述抗体时，BBB-R的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗体时转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。在另一个具体的实施方案中，所述BBB-R是CD98hc。在另一个具体的实施方案中，所述BBB-R是Glut1。在另一个具体的实施方案中，所述BBB-R是Basigin。
在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗-CD98hc抗体的方法，所述方法包括从一组针对CD98hc的抗体中选择抗体，原因在于，在存在所述抗体时，CD98hc与其轻链结合配偶体(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，或Asc-1)的结合是在不存在所述抗体时的结合量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。在一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是至少80％。在一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是至少90％。在一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是至少95％。
在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗-CD98hc抗体的方法，所述方法包括从一组针对CD98hc的抗体中选择抗体，原因在于，在存在所述抗体时，穿过BBB的氨基酸转运量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。在一个具体的实施方案中，穿过BBB的氨基酸转运量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的至少80％。在另一个具体的实施方案中，穿过BBB的氨基酸转运量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的至少90％。在另一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的至少95％。在另一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的至少99％。在另一个具体的实施方案中，CD98hc与其轻链结合配偶体的结合量是在不存在所述抗体时穿过BBB的氨基酸转运量的100％。
在另一方面，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法，所述方法包括从一组针对血脑屏障受体(BBB-R)的抗体中选择抗体，原因在于其具有在从约5nM，或从约20nM，或从约100nM，至约10μM，或至约1μM，或至约500mM的范围内的针对BBB-R的亲和力。因此，所述亲和力可以在从约5nM至约10μM的范围内，或在从约20nM至约1μM的范围内，或在从约100nM至约500nM的范围内，例如，如通过斯卡查德分析或测量的。本领域普通技术人员应该理解，向抗体上缀合异源分子/化合物通常将减小抗体对其靶标的亲和力，例如，由于空间位阻，或者，如果抗体被制成是多特异性的，具有一个或多个与抗体的原始靶标不同的抗原结合的臂，则甚至消除一个结合臂。
B.治疗方法和组合物
抗-CD98hc、抗-Bsg和抗-Glut1抗体，例如，如本文所述，可以用在治疗方法中。例如，抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体用作药物。在一些方面，抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体用于治疗神经疾病或病症，例如，通过将治疗剂(例如，治疗药，例如，抗体)递送至CNS位点(例如，脑)。本文公开的应用和方法所涵盖的神经疾病或病症的非限制性实例包括，例如，阿尔茨海默病(AD)，卒中，dementia，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌症(例如，脑癌，例如，胶质瘤(glioma)，例如，多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme))，和外伤性脑损伤。
在某些实施方案中，本发明提供治疗患有神经疾病或病症的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体，其中所述抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体递送治疗剂穿过血脑屏障。在某些实施方案中，有效量的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体是有效将治疗剂转运穿过BBB的量。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在一些实施方案中，所述受试者还没有被诊断患有癌症。在一些实施方案中，所述受试者还没有被诊断患有脑癌。在一些实施方案中，所述受试者没有患有癌症。在一些实施方案中，所述受试者没有患有脑癌。
在某些实施方案中，本发明提供抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体，其用于转运药剂穿过BBB。在某些实施方案中，本发明提供抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体，其用在转运药剂穿过个体的BBB的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体，从而转运所述药剂穿过BBB。例如，并且不限于，本文的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体可以是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，并且可以包含特异性针对目的脑抗原(例如，靶标)的治疗臂。不希望受到任意一种具体理论或作用机制的限制，预计所述多特异性抗体的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体部分与BBB上的靶标受体结合，并且被转运至BBB的近腔侧。然后，抗体的治疗臂(例如，特异性针对脑抗原的部分)能够结合所述靶标脑抗原。
在具体的实例中，CD98hc/BACE1双特异性抗体结合BBB上的CD98hc，然后被转运到BBB的近腔侧，然后BACE1抗体部分与脑中的BACE1结合。在另一个具体的实例中，CD98hc/BACE1双特异性抗体结合BBB上的CD98hc，然后通过CD98氨基酸转运蛋白被转运到BBB的近腔侧，然后BACE1抗体部分与BACE1结合。这将是有用的，例如，用于抑制BACE1，这将导致可溶性Aβ水平的下降。
在另一个具体的实例中，Basigin/BACE1双特异性抗体结合BBB上的basigin，然后通过basigin被转运到BBB的近腔侧，然后BACE1抗体部分与BACE1结合。这将是有用的，例如，用于抑制BACE1，这将导致可溶性Aβ水平的下降。
在另一个具体的实例中，Glut1/BACE1双特异性抗体结合BBB上的Glut1，然后通过Glut1被转运到BBB的近腔侧，然后BACE1抗体部分与BACE1结合。这将是有用的，例如，用于抑制BACE1，这将导致可溶性Aβ水平的下降。在一些实施方案中，抗体的Glut1-特异性部分不抑制通过Glut1向脑的葡萄糖转运。
在另一个方面，本发明提供抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体在制造或制备药物中的应用。在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经疾病或病症(例如，阿尔茨海默病(AD)，卒中，痴呆症，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌症(例如，脑癌，例如，胶质瘤，例如，多形性胶质母细胞瘤)，和外伤性脑损伤)。在另一个实施方案中，所述药物用在治疗神经疾病或病症的方法中，所述方法包括向患有神经疾病或病症的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一个实施方案中，例如，所述药物用于降低诸如BACE1、Aβ、EGFR、HER2、Tau、载脂蛋白(例如，ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、亨廷顿蛋白、PrP、LRRK2、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、DR6、APP、p75NTR和胱天蛋白酶6的蛋白的水平。在另一个实施方案中，所述药物用在转运药剂穿过个体的BBB的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物，从而转运所述药剂穿过BBB。
在上述治疗方法和应用的一些方面中，用于所述方法的抗-CD98hc抗体不消弱正常的和/或报道的CD98hc功能(例如，氨基酸转运)。在一些方面，抗-CD98hc抗体不消弱CD98hc与其一种或多种天然配体的结合。在一些方面，抗-CD98hc抗体不消弱CD98异型二聚体复合物(由CD98hc和轻链结合配偶体(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，和Asc-1)构成)与该异型二聚体复合物的一种或多种天然配体的结合。在一些方面，抗-CD98hc抗体不抑制CD98hc与其轻链结合配偶体(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，和Asc-1)的配对。
在所述治疗方法的一些方面中，在存在CD98hc抗体时，CD98hc和/或CD98异型二聚体复合物与其一种或多种天然配体的结合是在不存在抗-CD98hc抗体时的结合量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在所述治疗方法的一些方面中，在存在CD98hc抗体时，CD98异型二聚体复合物的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在抗-CD98hc抗体时的转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在所述治疗方法的一些方面中，抗-CD98hc抗体不诱导细胞死亡和/或凋亡。在另一方面，抗-CD98hc抗体不抑制细胞增殖。在另一方面，抗-CD98hc抗体不抑制细胞分裂。在另一方面，抗-CD98hc抗体不抑制细胞粘附。在一些方面，抗-CD98hc抗体不诱导细胞死亡或凋亡，并且不抑制细胞增殖。在一些方面，抗-CD98hc抗体不诱导细胞死亡或凋亡，并且不抑制细胞增殖、细胞分裂或细胞粘附。
在所述治疗方法的一些方面中，抗-CD98hc抗体结合CD98hc的细胞外结构域中的区域(例如，结合跨SEQ ID NO：103的氨基酸残基105-529的区域中的表位)。在一些方面，抗-CD98hc抗体结合不包括细胞外半胱氨酸Cys109的表位。在一些方面，抗-CD98hc抗体结合不包括细胞外半胱氨酸Cys210的表位。在一些实施方案中，抗-CD98hc抗体结合不包括标准630个氨基酸的CD98hc序列(同种型c，SEQ ID NO：99)的细胞外半胱氨酸Cys330的表位。
在一些方面，抗-CD98hc抗体以足够的亲和力结合CD98hc，以使所述抗体可用于转运治疗剂穿过BBB。在某些实施方案中，用在所述方法中的抗-CD98hc抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗-CD98hc抗体结合在来自不同物种的CD98hc之间是保守的CD98hc表位。
在任一上述方面中，抗-CD98hc抗体可以是人源化的抗体。
在所述治疗方法的一些方面中，在存在本文公开的抗-Bsg抗体时，basigin的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗-Bsg抗体时的转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在任一上述实施方案中，抗-Bsg抗体可以是人源化的抗体。
在所述治疗方法的一些方面中，在存在本文公开的抗-Glut1抗体时，Glut1的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗-Glut1抗体时的转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在任一上述实施方案中，抗-Glut1抗体可以是人源化的抗体。
如上文讨论的，本文公开的方法包括用于治疗脑和/或CNS的疾病和病症的方法。
例如，并且不限于，神经病病症可以按照所述治疗方法并且使用本文公开的组合物进行治疗。神经病病症是神经系统的疾病或异常，特征在于不恰当的或不受控制的神经信号传导或缺少信号传导，并且包括，但不限于，慢性疼痛(包括伤害性疼痛(nociceptivepain))，由对身体组织的损伤引起的疼痛，包括癌症相关的疼痛，神经性疼痛(neuropathicpain)(由神经、脊髓或脑中的异常引起的疼痛)，和精神性疼痛(psychogenic pain)(完全或主要与心理障碍相关)，头疼，偏头痛(migraine)，神经病(neuropathy)，和经常伴随此类神经病症(诸如眩晕或恶心)的症状和综合征。
对于神经病病症，可以选择作为下述的神经学药物：镇痛药，其包括，但不限于，麻醉剂/阿片样镇痛药(例如，吗啡(morphine)，芬太尼(fentanyl)，氢可酮(hydrocodone)，哌替啶(meperidine)，美沙酮(methadone)，羟吗啡酮(oxymorphone)，喷他佐辛(pentazocine)，丙氧芬(propoxyphene)，曲马朵(tramadol)，可待因(codeine)和羟可酮(oxycodone))，非甾类抗炎药(NSAID)(例如，布洛芬(ibuprofen)，萘普生(naproxen)，双氯芬酸(diclofenac)，二氟尼柳(diflunisal)，依托度酸(etodolac)，非诺洛芬(fenoprofen)，氟比洛芬(flurbiprofen)，吲哚美辛(indomethacin)，酮咯酸(ketorolac)，甲芬那酸(mefenamic acid)，美洛昔康(meloxicam)，萘丁美酮(nabumetone)，奥沙普秦(oxaprozin)，吡罗昔康(piroxicam)，舒林酸(sulindac)，和托美丁(tolmetin))，皮质类甾醇(corticosteroid)(例如，可的松(cortisone)，泼尼松(prednisone)，泼尼松龙(prednisolone)，地塞米松(dexamethasone)，甲泼尼龙(methylprednisolone)和曲安西龙(triamcinolone))，抗偏头痛剂(例如，sumatriptin，阿莫曲普坦(almotriptan)，夫罗曲普坦(frovatriptan)，舒马普坦(sumatriptan)，利扎曲普坦(rizatriptan)，依来曲普坦(eletriptan)，佐米曲普坦(zolmitriptan)，双氢麦角胺(dihydroergotamine)，依来曲普坦(eletriptan)和麦角胺(ergotamine))，醋氨酚(acetaminophen)，水杨酸盐(例如，阿司匹林(aspirin)，水杨酸胆碱(choline salicylate)，水杨酸镁(magnesium salicylate)，二氟尼柳(diflunisal)和双水杨酯(salsalate))，抗惊厥药(例如，卡马西平(carbamazepine)，氯硝西泮(clonazepam)，加巴喷丁(gabapentin)，拉莫三嗪(lamotrigine)，普瑞巴林(pregabalin)，噻加宾(tiagabine)和托吡酯(topiramate))，麻醉药(例如，异氟醚(isoflurane)，三氯乙烯(trichloroethylene)，氟烷(halothane)，七氟烷(sevoflurane)，苯佐卡因(benzocaine)，氯普鲁卡因(chloroprocaine)，可卡因(cocaine)，环美卡因(cyclomethycaine)，二甲卡因(dimethocaine)，丙氧卡因(propoxycaine)，普鲁卡因(procaine)，奴佛卡因(novocaine)，丙美卡因(proparacaine)，丁卡因(tetracaine)，阿替卡因(articaine)，布比卡因(bupivacaine)，卡替卡因(carticaine)，辛可卡因(cinchocaine)，依替卡因(etidocaine)，左布比卡因(levobupivacaine)，利多卡因(lidocaine)，甲哌卡因(mepivacaine)，哌罗卡因(piperocaine)，丙胺卡因(prilocaine)，罗哌卡因(ropivacaine)，三甲卡因(trimecaine)，蛤蚌毒素(saxitoxin)和河豚毒素(tetrodotoxin))，和cox-2-抑制剂(即，塞来昔布(celecoxib)，罗非昔布(rofecoxib)和伐地考昔(valdecoxib))。对于伴有眩晕的神经病病症，可以选择作为抗眩晕剂的神经药物，其包括但不限于，美克洛嗪(meclizine)，苯海拉明(diphenhydramine)，异丙嗪(promethazine)和地西泮(diazepam)。对于伴有恶心的神经病病症，可以选择作为抗恶心剂的神经药物，其包括但不限于，异丙嗪(prolnethazine)，氯丙嗪(chlorpromazine)，丙氯拉嗪(prochlorperazine)，曲美苄胺(trimethobenzamide)和甲氧氯普胺(metoclopramide)。
例如，并不限于，淀粉样变性(amyloidoses)可以按照本文公开的治疗方法和使用所述组合物进行治疗。淀粉样变性是一组与CNS中细胞外蛋白质样沉积相关的疾病和病症，其包括，但不限于，继发性淀粉样变性(secondary amyloidosis)，年龄相关的淀粉样变性(age-related amyloidosis)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知损害(MCI)，雷维小体痴呆症，唐氏综合征，伴有淀粉样变性的遗传性脑出血(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复合病，脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy)，亨廷顿病(Huntington’s disease)，进行性核上性麻痹，多发性硬化；克-雅病，帕金森病，传递性海绵状脑病(transmissiblespongiform encephalopathy)，HIV相关痴呆，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，包涵体肌炎(IBM)，和涉及β-淀粉样蛋白沉积的眼病(例如，黄斑变性，玻璃疣相关的视神经病变，和白内障)。
对于淀粉样变性，可以选择这样的神经学药物，其包括但不限于，特异性地结合选自：β分泌酶、tau、早老蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白或其部分、淀粉样蛋白β肽或其低聚物或原纤维(fibril)、死亡受体6(DR6)、高度糖基化终产物受体(RAGE)、帕金蛋白和亨廷顿蛋白的靶标的抗体或其他结合分子(包括但不限于小分子，肽，适体，或其他蛋白质结合物)；胆碱酯酶抑制剂(例如，加兰他敏(galantamine)，多奈哌齐(donepezil)，利斯的明(rivastigmine)和他克林(tacrine))；NMDA受体拮抗剂(例如，美金刚(memantine))，单胺耗竭剂(monoamine depletor)(例如，丁苯那嗪(tetrabenazine))；甲磺酸二氢麦角碱(ergoloid mesylate)；抗胆碱能抗帕金森病药(例如，丙环定(procyclidine)，苯海拉明，trihexylphenidyl，苯扎托品(benztropine)，比哌立登(biperiden)和苯海索(trihexyphenidyl))；多巴胺能抗帕金森病药(即，恩他卡朋(entacapone)，司来吉兰(selegiline)，普拉克索(pramipexole)，溴隐亭(bromocriptine)，罗替高汀(rotigotine)，司来吉兰(selegiline)，罗匹尼罗(ropinirole)，雷沙吉兰(rasagiline)，阿扑吗啡(apomorphine)，卡比多巴(carbidopa)，左旋多巴(levodopa)，培高利特(pergolide)，托卡朋(tolcapone)和金刚烷胺(amantadine))；丁苯那嗪(tetrabenazine)；抗炎药(包括但不限于，非甾类抗炎药(例如，吲哚美辛(indomethicin)和以上列出的其他化合物)；激素(例如，雌激素，孕酮和亮丙立德(leuprolide))；维生素(例如，叶酸和烟酰胺)；dimebolin；高牛磺酸(homotaurine)(例如，3-氨基丙磺酸；3APS)；5-羟色胺受体活性调节剂(例如，扎利罗登(xaliproden))；干扰素和糖皮质激素。
例如，并不限于，癌症可以按照本文公开的治疗方法和使用所述组合物进行治疗。CNS的癌症特征在于一个或多个CNS细胞(例如，神经细胞)的异常增殖，并且包括但不限于，胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤，脑膜瘤(meningioma)，星细胞瘤(astrocytoma)，听神经瘤(acoustic neuroma)，软骨瘤(chondroma)，少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)，成神经管细胞瘤(medulloblastomas)，神经节神经胶质瘤(ganglioglioma)，神经鞘瘤(Schwannoma)，神经纤维瘤(neurofibroma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，和硬膜外、髓内或硬膜内肿瘤。
对于癌症，可以选择是化疗剂的神经学药物(例如，并且与抗-CD98hc、Glut1或Bsg抗体缀合或与它们共同施用)。化疗剂的实例包括烷基化试剂，如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酸胺(triethiylenethiophosphor-amide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酸类(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；△-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)、)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物KW-2189和CBl-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosoureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin)，包括烯二炔蒽环类抗生素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素类(maytansinoids)，如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products(JHS天然产品)，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类化合物(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、不含Cremophor的ABRAXANETM(ABRAXANETM Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和多西他赛(docetaxel)(Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；长春瑞滨(vinorelbine)诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)以上任何一种的药用盐、酸或衍生物；以及以上各项中的两个以上的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和泼尼松龙(prednisolone)的组合疗法的缩写；以及FOLFOX，即与5-FU和leucovovin组合的奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)的治疗方案的缩写。
同样包括在对化疗剂的该定义中的是抗激素剂，其作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果，并且通常为系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括，例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫西芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(toremifene))；抗黄体酮；雌激素受体下调剂(ERDs)；起作用抑制或关闭卵巢的药剂，例如，促黄体生成激素释放素(leutinizinghormone-releasing hormone)(LHRH)激动剂，如和醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)，醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和tripterelin；其他抗雄激素类，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素生产，诸如例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)，法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole)。此外，对化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，如氯膦酸盐(clodronate)(例如，或)、依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、唑来膦酸(zoledronicacid)/唑来膦酸盐(zoledronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制在涉及异常细胞增殖的信号传导途径中基因的表达的那些，诸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如疫苗和基因治疗疫苗，例如，疫苗、疫苗和疫苗：拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也已知为GW572016)；和以上任一种的药用盐、酸或衍生物。
可以被选作为用于癌症治疗或预防的神经学药物的另一组化合物是抗癌免疫球蛋白(包括但不限于，曲妥珠单抗(trastuzumab)，帕妥珠单抗(pertuzumab)，贝伐珠单抗(bevacizumab)，阿仑单抗(alemtuxumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)，替尼莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，帕尼单抗(panitumumab)和利妥昔单抗(rituximab))。在一些情况中，与有毒的标记或缀合物结合的抗体可以用于靶向并杀死目的细胞(例如，癌症细胞)，所述抗体包括但不限于，具有131I放射性标记的托西莫单抗(tositumomab)，或曲妥珠单抗emtansine(trastuzumabemtansine)。
例如，并不限于，眼部疾病和病症可以按照本文公开的治疗方法并使用所述组合物进行治疗。眼部疾病或病症是眼睛的疾病或病症，为本文的目的，眼睛被视为受制于BBB的CNS器官。眼部疾病或病症包括但不限于，巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症(例如，巩膜炎(scleritis)、角膜炎(keratitis)、角膜溃疡(corneal ulcer)，角膜擦伤(cornealabrasion)，雪盲(snow blindness)，电光性眼炎(arc eye)，Thygeson浅层点状角膜病变(Thygeson’s superficial punctate keratopathy)，角膜新生血管化(cornealneovascularisation)，富克斯营养不良(Fuchs’dystrophy)，圆锥形角膜(keratoconus)，干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)，虹膜炎(iritis)和葡萄膜炎(uveitis))，晶状体的病症(即，白内障(cataract))，脉络膜和视网膜的病症(即，视网膜脱离(retinal detachment)，视网膜劈裂症(retinoschisis)，高血压性视网膜病变(hypertensive retinopathy)，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)，视网膜病(retinopathy)，早产儿视网膜病，老年性黄斑变性(age-related maculardegeneration)，黄斑变性(湿性或干性)，视网膜外膜(epiretinal membrane)，色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)和黄斑水肿(macular edema))，青光眼(glaucoma)，悬浮物(floaters)，视神经和视觉通路的病症(即，莱伯遗传性视神经病变(Leber’s hereditaryoptic neuropathy)和视觉盘玻璃疣(optic disc drusen))，眼肌/双眼移动调节/折射的病症(即，斜视(strabismus)，眼肌瘫痪(ophthalmoparesis)，进行性外部眼肌麻痹(progressive external opthalmoplegia)，内斜视(esotropia)，外斜视(exotropia)，远视(hypermetropia)，近视(myopia)，散光(astigmatism)，屈光不正(anisometropia)，老花眼(presbyopia)和眼肌麻痹(ophthalmoplegia))，视觉障碍和失明(即，弱视(amblyopia)，莱伯先天性黑矇(Lever’s congenital amaurosis)，暗点(scotoma)，色盲(colorblindness)，全色盲(achromatopsia)，夜盲症(nyctalopia)，失明，河盲(riverblindness)和微眼炎/缺损(micro-opthalmia/coloboma))，红眼，阿盖耳罗伯逊瞳孔(Argyll Robertson pupil)，角膜真菌病(keratomycosis)，干眼病(xerophthalmia)和无虹膜(aniridia)。
对于眼疾病或病症，可以选择是以下各项的神经学药物：抗新生血管眼科剂(例如，贝伐珠单抗，雷珠单抗(ranibizumab)和培加尼布(pegaptanib))，眼科青光眼药(即，卡巴胆碱(carbachol)，肾上腺素(epinephrine)，地美溴铵(demecarium bromide)，阿可乐定(apraclonidine)，溴莫尼定(brimonidine)，布林唑胺(brinzolamide)，左布诺洛尔(levobunolol)，噻吗洛尔(timolol)，倍他洛尔(betaxolol)，多佐胺(dorzolamide)，比马前列素(bimatoprost)，卡替洛尔(carteolol)，美替洛尔(metipranolol)，地匹福林(dipivefrin)，曲伏前列素(travoprost)和拉坦前列素(latanoprost))，碳酸酐酶抑制剂(例如，醋甲唑胺(methazolamide)和乙酰唑胺(acetazolamide))，眼科抗组胺剂(例如，萘甲唑啉(naphazoline)，去氧肾上腺素(phenylephrine)和四氢唑啉(tetrahydrozoline))，眼用润滑剂，眼科甾类化合物(即，氟米龙(fluorometholone)，泼尼松龙(prednisolone)，氯替泼诺(loteprednol)，地塞米松(dexamethasone)，二氟泼尼酯(difluprednate)，利美索龙(rimexolone)，醋酸氟轻松(fluocinolone)，甲羟松(medrysone)和去炎松(triamcinolone))，眼科麻醉剂(例如，利多卡因(lidocaine)，丙美卡因(proparacaine)和丁卡因(tetracaine))，眼科抗感染剂(即，左氧氟沙星(levofloxacin)，加替沙星(gatifloxacin)，环丙沙星(ciprofloxacin)，莫西沙星(moxifloxacin)，氯霉素(chloramphenicol)，杆菌肽/多粘菌素b(bacitracin/polymyxin b)，磺胺醋酰(sulfacetamide)，妥布霉素(tobramycin)，阿奇霉素(azithromycin)，贝西沙星(besifloxacin)，诺氟沙星(norfloxacin)，磺胺异唑(sulfisoxazole)，庆大霉素(gentamicin)，碘苷(idoxuridine)，红霉素(erythromycin)，那他霉素(natamycin)，短杆菌肽(gramicidin)，新霉素(neomycin)，氧氟沙星(ofloxacin)，曲氟尿苷(trifluridine)，更昔洛韦(ganciclovir)，阿糖腺苷(vidarabine))，眼科抗炎剂(例如，奈帕芬胺(nepafenac)，酮咯酸(ketorolac)，氟比洛芬(flurbiprofen)，舒洛芬(suprofen)，环孢菌素(cyclosporine)，去炎松(triamcinolone)，双氯芬酸(diclofenac)和溴芬酸(bromfenac))，和眼科抗组胺剂或解充血药(例如，酮替芬(ketotifen)，奥洛他定(olopatadine)，依匹斯汀(epinastine)，萘甲唑啉(naphazoline)，色甘酸钠(cromolyn)，四氢唑啉(tetrahydrozoline)，吡嘧司特(pemirolast)，贝他斯汀(bepotastine)，萘甲唑啉(naphazoline)，去氧肾上腺素(phenylephrine)，奈多罗米(nedocromil)，洛度沙胺(lodoxamide)，去氧肾上腺素，依美斯汀(emedastine)和氮卓斯汀(azelastine))。
CNS的病毒或微生物感染包括但不限于由以下引起的感染：病毒(例如，流感，HIV，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，风疹(rubella))，细菌(例如，奈瑟氏球菌属(Neisseriasp.)，链球菌属(Streptococcus sp.)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，变形菌属(Proteussp.)，大肠杆菌(E.coli)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，肺炎球菌属(Pneumococcus sp.)，脑膜炎球菌属(Meningococcus sp.)，嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)，和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))和其他微生物，如真菌(例如，酵母，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))，寄生虫(例如，弓形虫(toxoplasma gondii))或变形虫(amoebas)，导致CNS病理生理学，包括但不限于，脑膜炎，脑炎，脊髓炎，血管炎和脓肿(abscess)，其可以是急性的或慢性的。
对于病毒或微生物疾病，可以选择这样的神经学药物，其包括但不限于，抗病毒化合物(包括但不限于，金刚烷抗病毒药(例如，金刚乙胺(rimantadine)和金刚烷胺(amantadine))，抗病毒干扰素(即，聚乙二醇干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b))，趋化因子受体拮抗剂(例如，马拉韦罗(maraviroc))，整合酶链转移抑制剂(例如，raltegravir)，神经氨酸酶(neuraminidase)抑制剂(例如，奥塞米韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir))，非核苷逆转录酶抑制剂(例如，依法韦仑(efavirenz)，依曲韦林(etravirine)，地拉韦啶(delavirdine)和奈韦拉平(nevirapine))，核苷逆转录酶抑制剂(去羟肌苷加(tenofovir)，阿巴卡韦(abacavir)，拉米夫定(lamivudine)，齐多夫定(zidovudine)，司他夫定(stavudine)，恩替卡韦(entecavir)，恩曲他滨(emtricitabine)，阿德福韦(adefovir)，扎昔他宾(zalcitabine)，替比夫定(telbivudine)和去羟肌苷(didanosine))，蛋白酶抑制剂(例如，达芦那韦(darunavir)，阿扎那韦(atazanavir)，呋山那韦(fosamprenavir)，替拉那韦(tipranavir)，利托纳韦(ritonavir)，奈芬纳韦(nelfinavir)，氨普那韦(amprenavir)，茚地那韦(indinavir)和沙奎那韦(saquinavir))，嘌呤核苷(即，伐昔洛韦(valacyclovir)，泛昔洛韦(famciclovir)，阿昔洛韦(acyclovir)，利巴韦林(ribavirin)，更昔洛韦(ganciclovir)，缬更昔洛韦(valganciclovir)和西多福韦(cidofovir))，和杂类抗病毒药(例如，恩夫韦肽(enfuvirtide)，膦甲酸(foscarnet)，帕利珠单抗(palivizumab)和福米韦生(fomivirsen))，抗生素(包括但不限于，氨基青霉素(aminopenicillin)(例如，羟氨苄青霉素(amoxicillin)，氨苄青霉素(ampicillin)，苯唑西林(oxacillin)，萘夫西林(nafcillin)，氯唑西林(cloxacillin)，双氯西林(dicloxacillin)，flucoxacillin，替莫西林(temocillin)，阿洛西林(azlocillin)，羧苄西林(carbenicillin)，替卡西林(ticarcillin)，美洛西林(mezlocillin)，哌拉西林(piperacillin)和巴氨西林(bacampicillin))，头孢菌素(cephalosporin)(例如，头孢唑林(cefazolin)，头孢氨苄(cephalexin)，头孢噻吩(cephalothin)，头孢孟多(cefamandole)，头孢曲松(cefiriaxone)，头孢噻肟(cefotaxime)，头孢达肟(cefpodoxime)，头孢他啶(cefiazidime)，头孢羟氨苄(cefadroxil)，头孢拉定(cephradine)，氯碳头孢(loracarbef)，头孢替坦(cefotetan)，头孢唑肟(cefuroxime)，头孢丙烯(cefprozil)，头孢克洛(cefaclor)和头孢西丁(cefoxitin))，碳青霉烯/培南(carbapenem/penem)(例如，亚胺培南(imipenem)，美罗培南(meropenem)，厄他培南(ertapenem)，法罗培南(faropenem)和多利培南(doripenem))，单酰胺菌素(monobactam)(例如，胺曲南(aztreonam)，替吉莫南(tigemonam)，norcardicin A和烟毒素-β-内酰胺(tabtoxinine-β-lactam))，与另一种p-内酰胺抗生素联合的p-内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸(clavulanic acid)，三唑巴坦(tazobactam)和舒巴克坦(sulbactam))，氨基葡糖苷(例如，阿米卡星(amikacin)，庆大霉素(gentamicin)，卡那霉素(kanamycin)，新霉素(neomycin)，奈替米星(netilmicin)，链霉素，托普霉素(tobramycin)和巴龙霉素(paromomycin))，安沙霉素(ansamycin)(例如，格尔德霉素(geldanamycin)和除莠霉素(herbimycin))，碳头孢烯(carbacephem)(例如，氯碳头孢(loracarbef))，糖肽(例如，替考拉宁(teicoplanin)和万古霉素(vancomycin))，大环内酯(例如，阿奇霉素(azithromycin)，克拉霉素(clarithromycin)，地红霉素(dirithromycin)，红霉素(erythromycin)，罗红霉素(roxithromycin)，醋竹桃霉素(troleandomycin)，泰利霉素(telithromycin)和壮观霉素(spectinomycin))，单酰胺菌素(monobactam)(例如，胺曲南(aztreonam))，喹诺酮(quinolone)(例如，环丙沙星(ciprofloxacin)，依诺沙星(enoxacin)，加替沙星(gatifloxacin)，左氧氟沙星(levofloxacin)，利莫沙星(lomefloxacin)，莫西沙星(moxifloxacin)，诺氟沙星(norfloxacin)，氧氟沙星(ofloxacin)，曲伐沙星(trovafloxacin)，格帕沙星(grepafloxacin)，司帕沙星(sparfloxacin)和替马沙星(temafloxacin))，磺酰胺(例如，磺胺米隆(mafenide)，sulfonamidochrysoidine，乙酰磺胺(sulfacetamide)，磺胺嘧啶(sulfadiazine)，磺胺甲二唑(sulfamethizole)，磺胺(sulfanilamide)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，磺胺异唑(sulfisoxazole)，甲氧苄啶(trimethoprim)，甲氧苄啶(trimethoprim)和磺胺甲唑(sulfamethoxazole))，四环素(tetracycline)(例如，四环素(tetracycline)，地美环素(demeclocycline)，多西环素(doxycycline)，米诺环素(minocycline)和土霉素(oxytetracycline))，抗肿瘤药或细胞毒性抗生素(例如，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，博来霉素(bleomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，更生霉素(dactinomycin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，普利霉素(plicamycin)，丝裂霉素(mitomycin)，喷司他丁(pentostatin)和戊柔比星(valrubicin))和杂类抗菌化合物(例如，杆菌肽(bacitracin)，粘菌素(colistin)和多粘菌素B(polymyxin B))，抗真菌剂(例如，甲硝唑(metronidazole)，硝唑尼特(nitazoxanide)，替硝唑(tinidazole)，氯喹(chloroquine)，双碘喹啉(iodoquinol)和巴龙霉素(paromomycin))，和抗寄生虫药(包括但不限于，奎宁(quinine)，氯喹(chloroquine)，阿莫地喹(amodiaquine)，乙胺嘧啶(pyrimethamine)，磺胺多辛(sulphadoxine)，百乐君(proguanil)，甲氟喹(mefloquine)，阿托伐醌(atovaquone)，伯氨喹(primaquine)，青蒿素(artemesinin)，卤泛群(halofantrine)，多西环素(doxycycline)，克林霉素(clindamycin)，甲苯达唑(mebendazole)，双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)，噻苯哒唑(thiabendazole)，乙胺嗪(diethylcarbamazine)，伊维菌素(ivermectin)，利福平(rifampin)，两性霉素B(amphotericin B)，美拉胂醇(melarsoprol)，efornithine和阿苯达唑(albendazole))。
CNS炎症也可以按照本文公开的方法治疗。CNS的炎症包括，但不限于，其由对CNS的损伤引起的炎症，所述损伤可以是物理损伤(例如，由于事故，手术，脑创伤，脊髓损伤，脑震荡(concussion)所致的)或由于或相关于一种或多种CNS的其他疾病或病症(例如，脓肿，癌症，病毒或微生物感染)的损伤。
对于CNS炎症，可以选择治疗炎症自身的神经学药物(例如，非甾类抗炎剂如布洛芬或萘普生(naproxen))，或治疗炎症的潜在原因的神经学药物(例如，抗病毒或抗癌症药剂)。
当用于本文中时，CNS的缺血是指一组病症，其相关于脑部的异常血流或血管行为或其病因，并且包括但不限于，局部脑缺血(focal brain ischemia)，全局脑缺血(globalbrain ischemia)，卒中(例如，蛛网膜下出血(subarachnoid hemorrhage)和脑内出血(intracerebral hemorrhage))，和动脉瘤(aneurysm)。
对于缺血，可以选择这样的神经学药物，其包括但不限于，溶血栓药(例如，尿激酶，阿替普酶(alteplase)，瑞替普酶(reteplase)和替奈普酶(tenecteplase))，血小板凝集抑制剂(例如，阿司匹林(aspirin)，西洛他唑(cilostazol)，氯吡格雷(clopidogrel)，普拉格雷(prasugrel)和双嘧达莫(dipyridamole))，他汀(statin)(即，洛伐他汀(lovastatin)，普伐他汀(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，罗舒伐他汀(rosuvastatin)，阿托伐他汀(atorvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，西立伐他汀(cerivastatin)和匹伐他汀(pitavastatin))，和改善血液流动或血管弹性的化合物，包括例如血压药物。
神经变性疾病是一组与CNS中神经细胞丧失功能或死亡相关的疾病和病症，并且其包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)，亚历山大病(Alexander’s disease)，阿尔珀斯病(Alper’s disease)，肌萎缩性侧索硬化，运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)，Batten病(Batten disease)，科凯恩综合征(cockayne syndrome)，基层皮质变性(corticobasal degeneration)，由淀粉样变性引起或与其相关的变性，弗里德赖希共济失调症(Friedreich’s ataxia)，额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration)，Kennedy病(Kennedy’s disease)，多系统萎缩，多发性硬化，原发性侧素硬化，进行性核上性麻痹，脊髓性肌萎缩，横贯性脊髓炎(transverse myelitis)，雷夫叙姆病(Refsum’s disease)，和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)。
对于神经变性疾病，可以选择是生长激素或神经营养因子的神经学药物；实例包括但不限于，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，神经营养蛋白-4/5，成纤维细胞生长因子(FGF)-2和其他FGF，神经营养蛋白(NT)-3，促红细胞生成素(EPO)，肝细胞生长因子(HGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，血管内皮生长因子(VEGF)，白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，睫状神经营养因子(CNTF)，神经胶质源性神经营养因子(GDNF)，neurturin，血小板源性生长因子(PDGF)，调蛋白(heregulin)，神经调节蛋白，artemin，persephin，白介素，神经胶质细胞系源性神经营养因子(GFR)，粒细胞集落刺激因子(CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF，导蛋白(netrins)，心肌营养蛋白-1，刺猬分子(hedgehogs)，白血病抑制因子(LIF)，中期因子，多效营养因子，骨形成蛋白(BMP)，导蛋白，皂化蛋白，脑信号蛋白(semaphorins)和干细胞因子(SCF)。
CNS的癫痫发作(seizure)疾病和病症涉及CNS中的不适当和/或异常电导，并且包括但不限于，癫痫(例如，失神型发作(absence seizures)，无张力性癫痫发作(atonicseizures)，良性运动性癫痫(benign Rolandic epilepsy)，儿童期失神(childhoodabsence)，阵挛发作(clonic seizures)，复杂部分性癫痫发作(complex partialseizures)，额叶性癫痫(frontal lobe epilepsy)，发热性癫痫发作(febrile seizures)，婴儿痉挛(infantile spasms)，青少年期肌阵挛性癫痫(juvenile myoclonic epilepsy)，青少年期失神型癫痫(iuvenile absence epilepsy)，伦-格综合征(Lennox-Gastautsyndrome)，兰-克综合征(Landau-Kleffner Syndrome)，Dravet综合征(Dravet’ssyndrome)，Otahara综合征(Otahara syndrome)，West综合征(West syndrome)，肌阵挛性癫痫发作(myoclonic seizures)，线粒体病(mitochondrial disorders)，进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonic epilepsies)，精神性癫痫发作(psychogenic seizures)，反射性癫痫(reflex epilepsy)，Rasmussen综合征(Rasmussen′s Syndrome)，简单部分性癫痫发作(simple partial seizures)，继发性全身性癫痫发作(secondarilygeneralized seizures)，颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy)，强直阵挛性癫痫发作(toniclonic seizures)，强直性癫痫发作(tonic seizures)，精神运动癫痫发作(psychomotor seizures)，边缘叶癫痫(limbic epilepsy)，部分发作性癫痫发作(partial-onset seizures)，全身发作性癫痫发作(generalized-onset seizures)，癫痫持续状态(status epilepticus)，腹型癫痫(abdominal epilepsy)，无动性发作(akineticseizures)，植物神经性发作(autonomic seizures)，大量双侧肌阵挛(massive bilateralmyoclonus)，月经性癫痫(catamenial epilepsy)，跌倒发作(drop seizures)，情绪性发作(emotional seizures)，病灶性发作(focal seizures)，发笑发作(gelastic seizures)，贾克森扩布(Jacksonian March)，拉福拉病(Lafora Disease)，运动性发作(motorseizures)，多病灶性发作(multifocal seizures)，夜间发作(nocturnal seizures)，光敏性发作(photosensitive seizure)，假性发作(pseudo seizures)，感觉性发作(sensoryseizures)，微小发作(subtle seizures)，sylvan发作(sylvan seizures)，戒断发作(withdrawal seizures)，和视反射发作(visual reflex seizures))。
对于癫痫发作病症，可以选择是抗惊厥药或抗癫痫药的神经学药物，其包括但不限于，巴比妥酸盐(barbiturate)抗惊厥药(例如，扑米酮(primidone)，美沙比妥(metharbital)，甲苯比妥(mephobarbital)，阿洛巴比妥(allobarbital)，异戊巴比妥(amobarbital)，阿普比妥(aprobarbital)，苯烯比妥(alphenal)，巴比妥(barbital)，溴烯比妥(brallobarbital)和苯巴比妥(phenobarbital))，苯并二氮类(benzodiazepine)抗惊厥药(例如，地西泮(diazepam)，氯硝西泮(clonazepam)和劳拉西泮(lorazepam))，氨基甲酸酯(carbamate)抗惊厥药(例如，非尔氨酯(felbamate))，碳酸酐酶(carbonicanhydrase)抑制剂抗惊厥药(例如，乙酰唑胺(acetazolamide)，托吡酯(topiramate)和唑尼沙胺(zonisamide))，二苯并氮(dibenzazepine)抗惊厥药(例如，卢非酰胺(rufinamide)，卡马西平(carbamazepine)和奥卡西平(oxcarbazepine))，脂肪酸衍生物抗惊厥药(例如，双丙戊酸钠(divalproex)和丙戊酸(valproic acid))，γ-氨基丁酸类似物(例如，普瑞巴林(pregabalin)，加巴喷丁(gabapentin)和氨己烯酸(vigabatrin))，γ-氨基丁酸再摄取抑制剂(例如，噻加宾(tiagabine))，γ-氨基丁酸转氨酶抑制剂(例如，氨己烯酸(vigabatrin)，乙内酰脲(hydantoin)抗惊厥药(例如，苯妥英(phenytoin)，乙苯妥英(ethotoin)，磷苯妥英(fosphenytoin)和美芬妥英(mephenytoin))，杂类抗惊厥药(例如，拉科酰胺(lacosamide)和硫酸镁)，孕酮类(例如，黄体酮(progesterone))，唑烷二酮(oxazolidinedione)抗惊厥药(例如，甲乙双酮(paramethadione)和三甲双酮(trimethadione))，吡咯烷抗惊厥药(例如，左乙拉西坦(levetiracetam))，琥珀酰亚胺抗惊厥药(例如，乙琥胺(ethosuximide)和甲琥胺(methsuximide))，三嗪抗惊厥药(例如，拉莫三嗪(lamotrigine))，和尿素抗惊厥药(例如，苯乙酰脲(phenacemide)和苯丁酰脲(pheneturide))。
行为障碍是一种CNS的病症，其特征为就受折磨的受试者而言的异常行为，并且包括但不限于：睡眠障碍(sleep disorders)(例如，失眠(insomnia)，深眠状态(parasomnias)，夜惊(night terrors)，昼夜节律睡眠障碍(circadian rhythm sleepdisorders)，和发作性睡病(narcolepsy))，情绪障碍(mood disorders)(例如，抑有(depression)，自杀性抑有(suicidal depression)，焦虑(anxiety)，慢性情感障碍(chronic affective disorders)，恐怖病(phobias)，惊恐发作(panic attacks)，强迫性障碍(obsessive-compulsive disorder)，注意力缺陷伴多动障碍(attention deficithyperactivity disorder，ADHD)，注意缺陷障碍(attention deficit disorder，ADD)，慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)，广场恐怖症(agoraphobia)，创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder)，双相性精神障碍(bipolar disorder))，进食障碍(例如，厌食症(anorexia)或贪食症(bulimia))，重性精神病(psychoses)，发育行为障碍(developmental behavioral disorders)(例如，自闭症(autism)，雷特综合征(Rett’ssyndrome)，Aspberger综合征(Aspberger’s syndrome))，人格障碍(personalitydisorders)和精神障碍(psychotic disorders)(例如，精神分裂症(schizophrenia)，妄想障碍(delusional disorder)等)。
对于行为障碍，神经学药物可以选自行为修正化合物，其包括但不限于，非典型抗精神病药(例如，利哌立酮(risperidone)，奥氮平(olanzapine)，apripiprazole，喹硫平(quetiapine)，帕潘立酮(paliperidone)，阿塞那平(asenapine)，氯氮平(clozapine)，伊潘立酮(iloperidone)和齐拉西酮(ziprasidone))，吩噻嗪抗精神病药(例如，丙氯拉嗪(prochlorperazine)，氯丙嗪(chlorpromazine)，氟奋乃静(fluphenazine)，奋乃静(perphenazine)，三氟拉嗪(trifluoperazine)，硫利达嗪(thioridazine)和美索达嗪(mesoridazine))，噻吨(thioxanthene)(例如，氨砜噻吨(thiothixene))，杂类抗精神病药(例如，匹莫齐特(pimozide)，锂(lithium)，吗茚酮(molindone)，氟哌啶醇(haloperidol)和洛沙平(loxapine))，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(例如，西酞普兰(citalopram)，依他普仑(escitalopram)，帕罗西汀(paroxetine)，氟西汀(fluoxetine)和舍曲林(sertraline))，5-羟色胺-去甲肾上腺素(norepinephrine)再摄取抑制剂(例如，度洛西汀(duloxetine)，文拉法辛(venlafaxine)，地文拉法辛(desvenlafaxine))，三环抗抑郁药(例如，多塞平(doxepin))，氯米帕明(clomipramine)，阿莫沙平(amoxapine)，去甲替林(nortriptyline)，阿米替林(amitriptyline)，曲米帕明(trimipramine)，丙咪嗪(imipramine)，普罗替林(protriptyline)和地昔帕明(desipramine))，四环抗抑郁药(例如，米氮平(mirtazapine)和麦普替林(maprotiline))，苯基哌嗪抗抑郁药(例如，曲唑酮(trazodone)和奈法唑酮(nefazodone))，单胺氧化酶抑制剂(例如，异卡波肼(isocarboxazid)，苯乙肼(phenelzine)，司来吉兰(selegiline)和反苯环丙铵(tranylcypromine))，苯并二氮(例如，阿普唑仑(alprazolam)，艾司唑仑(estazolam)，氟西泮(flurazeptam)，氯硝西泮(clonazepam)，劳拉西泮(lorazepam)和地西泮(diazepam))，去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(例如，安非他酮(bupropion))，CNS兴奋剂(例如，芬特明(phentermine)，安非拉酮(diethylpropion)，甲基苯丙胺(methamphetamine)，右旋安非他命(dextroamphetamine)，安非他命(amphetamine)，哌醋甲酯(methylphenidate)，右哌甲酯(dexmethylphenidate)，利右苯丙胺(lisdexamfetamine)，莫达非尼(modafinil)，匹莫林(pemoline)，苯甲曲秦(phendimetrazine)，苄非他明(benzphetamine)，苯甲曲秦(phendimetrazine)，阿莫非尼(armodafinil)，安非拉酮(diethylpropion)，咖啡因(caffeine)，阿托西汀(atomoxetine)，多沙普仑(doxapram)和马吲哚(mazindol))，抗焦虑药/镇静药/催眠药(包括但不限于，巴比妥酸盐(barbiturate)(例如，司可巴比妥(secobarbital)，苯巴比妥(phenobarbital)和甲苯比妥(mephobarbital))，苯并二氮(如上所述)，和杂类抗焦虑药/镇静药/催眠药(例如，苯海拉明(diphenhydramine)，羟丁酸钠(sodium oxybate)，扎来普隆(zaleplon)，羟嗪(hydroxyzine)，水合氯醛(chloral hydrate)，aolpidem，丁螺环酮(buspirone)，多塞平(doxepin)，左旋佐皮克隆(eszopiclone)，雷美尔通(ramelteon)，甲丙氨酯(meprobamate)和乙氯维诺(ethclorvynol)))，分泌素(参见，例如，Ratliff-Schaub等人，Autism 9：256-265(2005))，阿片样肽(参见，例如，Cowen等人，J.Neurochem.89：273-285(2004))，和神经肽(参见，例如，Hethwa等，Am.J.Physiol.289：E301-305(2005))。
溶酶体贮积症是一种代谢病症，在一些情况中其与CNS相关或具有CNS特异性症状；这样的病症包括但不限于：泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)，戈谢病(Gaucher’sdisease)，法布里病(Fabry disease)，粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis)(I，II，III，IV，V，VI和VII型)，糖原贮积病(glycogen storage disease)，GM1神经节苷脂贮积症(GM1-gangliosidosis)，异染性脑白质病变(metachromatic leukodystrophy)，法伯病(Farber’s disease)，卡纳范脑白质营养不良(Canavan’s leukodystrophy)，和神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses)1型和2型，尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，庞皮病(Pompe disease)，和克拉伯病(Krabbe’s disease)。
对于溶酶体贮积症，可以选择这样的神经学药物，其自身或以其他方式模拟在该疾病中受损的酶的活性。用于治疗溶酶体贮存病的示例性重组酶包括但不限于，例如在美国专利申请公开号2005/0142141中描述的那些(例如，α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，N-硫酸酯酶，α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，N-乙酰-半乳糖胺-6-硫酸酯酶，β-半乳糖苷酶，芳基硫酸酯酶B，β-葡糖醛酸糖苷酶，酸性α-葡糖苷酶，葡糖脑苷脂酶，α-半乳糖苷酶A，己糖胺酶A，酸性神经磷脂酶，β-半乳糖脑苷脂酶，β-半乳糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，酸性酰胺酶，天冬氨酸酰酶(aspartoacylase)，棕榈酰-蛋白硫酯酶1和三肽酰氨肽酶1)。
在一方面，本发明的抗体被用于在症状发作前检测神经病症和/或评估疾病或病症的严重性或持续时间。在一方面，抗体允许对神经病症进行检测和/或成像，包括通过放射照相术、断层摄影术或磁共振成像(MRI)进行成像。
本发明的抗体可以单独使用或与其他治疗剂组合用在治疗中。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂。在另一个实施方案中，抗体与一种或多种上文所述的神经病症药物一起施用。
这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，在所述情形中，本发明抗体的给药可以发生在另外的一种或多种治疗剂的给药之前、同时和/或之后。在一个实施方案中，抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体的给药和另外的治疗剂的给药彼此在约一个月内、或在约一周、两周或三周内、或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内发生。本发明的抗体也可以与放射性疗法组合使用。
本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式给药，或者本发明的方法可以包括通过任意合适的方式给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果需要局部治疗，进行病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期还是长期而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种剂量给药方案，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
本发明的抗体以与良好医疗实践相一致的方式配制、剂量给药和施用。在这方面考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、给药方法、给药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述抗体不需要，而是任选地，与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的给药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99％，或以通过经验/临床确定为合适的任意剂量和任何途径来使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者施用的最初候选剂量，例如，无论是通过一次或多次分别施药还是通过连续输注。一个典型的日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现理想的疾病症状抑制。所述抗体的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用(例如，以使得患者接受约2-约20个或例如约6个剂量的所述抗体)。可以施用最初较高的负荷剂量，接着是一个或多个较低的剂量。一个示例性的剂量方案包括施用例如约4mg/kg的“初始负载剂量”，然后是约2mg/kg抗体的每周维持剂量。然而，其他治疗方案可以是有用的。这一疗法的进展容易通过常规技术和测定监测。
应该理解，任何以上制剂或治疗方法可以使用本发明的免疫缀合物进行以代替抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体或作为抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体的补充。
C.示例性的抗体
1.示例性的抗-Basigin抗体
在一些实施方案中，本文提供的用于转运药剂穿过血脑屏障的方法可以包括使血脑屏障暴露于结合basigin(Bsg)的抗体。用于产生抗体的方法，例如，产生结合basigin的抗体的方法，在本领域中是已知的，并且在本文中详细描述。因此，在一方面，本发明提供与Bsg结合的分离的抗体。在某些实施方案中，提供与basigin细胞外结构域中的区域结合的抗-Bsg抗体。在某些实施方案中，提供与鼠Bsg和/或人Bsg结合的抗-Bsg。
在某些实施方案中，提供抗-Bsg抗体，其中所述抗体与basigin的结合不消弱basigin与其一种或多种天然配体的结合，例如，所述天然配体为整联蛋白α3，整联蛋白α6，整联蛋白β1，亲环素(cyclophilin)A，亲环素B，膜联蛋白II，和小窝蛋白1，和/或不消弱BBB-R的任意天然配体穿过血脑屏障的转运。用于本文时，“不消弱”意指所述一种或多种天然配体以如同没有抗体存在一样的方式(例如，量，速率等)结合和/或被转运穿过BBB(即，在任意结合特性方面都没有变化)。
在某些实施方案中，提供抗-Bsg抗体，其中，在存在所述抗体时，Bsg与其一种或多种天然配体的结合是在不存在所述抗体时的结合量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在某些实施方案中，提供抗-Bsg抗体，其中在存在所述抗体时Bsg的任一天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗体时的转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含选自SEQ ID NOs：3，19，35，51和67的轻链CDR1氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：4，20，36，52和68的轻链CDR2氨基酸序列，和选自SEQ IDNOs：5，21，37，53和69的轻链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含选自SEQ ID NOs：6，22，38，54和70的重链CDR1氨基酸序列，选自SEQ ID NOs：7，23，39，55和71的重链CDR2氨基酸序列，和选自SEQ IDNOs：8，24，40，56和72的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有SEQ ID NO：3的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：4的轻链CDR2氨基酸序列，含有SEQ ID NO：5的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：6的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：7的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQID NO：8的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有SEQ ID NO：19的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：20的轻链CDR2氨基酸序列，含有SEQ ID NO：21的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：22的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：23的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：24的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有SEQ ID NO：35的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：36的轻链CDR2氨基酸序列，含有SEQ ID NO：37的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：38的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：39的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：40的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有SEQ ID NO：51的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：52的轻链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：53的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：54的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：55的重链CDR2氨基酸序列和含有SEQ ID NO：56的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含选自SEQ ID NOs：67的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：68的轻链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：69的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：70的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：71的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：72的重链CDR3氨基酸。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体还包含这样的轻链可变结构域构架区，所述轻链可变结构域构架区含有选自SEQ ID NOs：9，25，41，57和73的氨基酸序列的FR1，选自SEQ IDNOs：10.26，42，58和74的氨基酸序列的FR2，选自SEQ ID NOs：11，27，43，59和75的氨基酸序列的FR3，和选自SEQ ID NOs：12，28，44，60和76的氨基酸序列的FR4。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体还包含这样的重链可变结构域构架区，所述重链可变结构域构架区含有选自SEQ ID NOs：13，29，45，61和77的氨基酸序列的FR1，选自SEQID NOs：14.30，46，62和78的氨基酸序列的FR2，选自SEQ ID NOs：15，31，47，63和79的氨基酸序列的FR3，和选自SEQ ID NOs：16，32，48，64和80的氨基酸序列的FR4。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有这样的可变结构域的轻链，所述可变结构域包含选自SEQ ID NOs：1，17，33，49和65的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与选自SEQ ID NOs：1，17，33，49和65的氨基酸序列至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有选自SEQ ID NOs：2，18，34，50，66和66的氨基酸序列的可变结构域的重链。在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与选自SEQ IDNOs：2，18，34，50和66的氨基酸序列至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变结构域。
在某些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有选自SEQ ID NOs：1，17，33，49和65的氨基酸序列的轻链可变结构域和包含选自SEQ ID NOs：2，18，34，50和66的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与SEQ ID NO：1相对应的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO：2相对应的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgA。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与SEQ ID NO：17相对应的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO：18相对应的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgB。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与SEQ ID NO：33相对应的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO：34相对应的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgC。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与SEQ ID NO：49相对应的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO：50相对应的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgD。
在一些实施方案中，抗-Bsg抗体包含含有与SEQ ID NO：65相对应的氨基酸序列的轻链和含有与SEQ ID NO：66相对应的氨基酸序列的重链。在一个实施方案中，所述抗-Bsg抗体是抗-BsgE。
2.示例性的抗-Glut抗体
在一些实施方案中，本文提供的用于转运药剂穿过血脑屏障的方法可以包括使血脑屏障暴露于结合Glut1的抗体。用于产生抗体的方法，例如，产生结合Glut1的抗体的方法，在本领域中是已知的，并且在本文中详细描述(参见，例如，部分C，见下文)。在一方面，本发明提供与Glut1结合的分离的抗体。在某些实施方案中，提供与人Glut1结合的抗-Glut1。在某些实施方案中，提供与鼠Glut1(mGlut1)结合的抗-Glut1抗体。在某些实施方案中，提供与人Glut1(hGlut1)结合的抗-Glut1抗体。在某些实施方案中，提供与hGlut1和mGlut1结合的抗-Glut1抗体。
在某些实施方案中，提供抗-Glut1抗体，其中所述抗体与Glut1的结合不消弱Glut1与其一种或多种天然配体的结合，和/或不消弱BBB-R的任意天然配体穿过血脑屏障的转运。用于本文时，“不消弱”意指所述一种或多种天然配体以如同没有抗体存在一样的方式(例如，量，速率等)结合和/或被转运穿过BBB(即，在任意结合特性方面都没有变化)。
在某些实施方案中，提供抗-Glut1抗体，其中，在存在所述抗体时，Glut1与其一种或多种天然配体的结合是在不存在所述抗体时的结合量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在某些实施方案中，提供抗-Glut1抗体，其中在存在所述抗体时BBB-R的任一天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗体时的转运量的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有SEQ ID NO：83的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：84的轻链CDR2氨基酸序列和含有SEQ ID NO：85的轻链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有SEQ ID NO：86的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：87的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：88的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有SEQ ID NO：83的轻链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：84的轻链CDR2氨基酸序列，含有SEQ ID NO：85的轻链CDR3氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：86的重链CDR1氨基酸序列，含有SEQ ID NO：87的重链CDR2氨基酸序列，和含有SEQ ID NO：88的重链CDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有这样的构架区的轻链可变结构域，所述构架区包含与SEQ ID NO：89相对应的氨基酸序列的FR1，SEQ ID NO：90的FR2，SEQ IDNO：91的FR3，和SEQ ID NO：92的FR4。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有这样的构架区的重链可变结构域，所述构架区包含与SEQ ID NO：93相对应的氨基酸序列的FR1，SEQ ID NO：94的FR2，SEQ IDNO：95的FR3，和SEQ ID NO：96的FR4。
在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有与SEQ ID NO：81相对应的氨基酸序列的轻链可变结构域和/或含有与SEQ ID NO：82相对应的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有与SEQ ID NO：81至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗-Glut1抗体包含含有与SEQ IDNO：82至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列的重链可变结构域。
D.抗体的特征
在本发明的另一方面中，按照任一上述实施方案所述的抗-CD98hc、抗-basigin或抗-Glut1抗体是单克隆抗体，包括嵌合的、人源化的或人抗体。在一个实施方案中，抗-CD98hc、抗-basigin或抗-Glut1抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或本文定义的其他抗体种类或同种型。
在另一个方面中，按照任意上述实施方案所述的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体可以结合下述方面1-7中所述的任意特征(单独的或组合的)：
1.抗体亲合力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)进行测量。在一个实施方案中，RIA用目的抗体的Fab形式及其抗原进行。例如，Fab对抗原的溶液结合亲合力通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况下，用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，接着用抗-Fab抗体-包被的平板捕获结合的抗原来测量(参见，例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。为了确定测定的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的捕获抗-Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)封闭二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如，与在Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中的抗-VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。接着，将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的阶段(例如，约65小时)从而确保达到平衡。随后，将混合物转移到捕获板中以在室温进行温育(例如，持续一小时)。接着，去除溶液，并将所述板用在PBS中的0.1％聚山梨醇酯20洗涤八次。当所述板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将所述板在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上计数十分钟。选择提供少于或等于20％的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定中。
根据另一个实施方案，Kd是使用表面等离子体共振测定测量的。例如，使用或(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃使用以～10个响应单位(RU)的固定的抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，依照供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。用10mM乙酸钠(pH4.8)将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入，以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/min的流速注入在具有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定，on-速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光淬灭技术确定on-速率，所述荧光淬灭技术在25℃在增加浓度的抗原的存在下测量在PBS(pH 7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带宽)，如在分光计中测量的，所述分光计诸如截流配制的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000-系列的SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，请参见Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)中，卷113，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含拯救受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516 B1)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体于例如美国专利号4,816,567；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴的非人灵长类的可变区)及人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是种类或亚类已经自亲本抗体的种类或亚类发生变化的“种类转变”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，非人抗体经人源化以降低对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，且FR(或其部分)是源自人抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中评述，且进一步于例如Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移接)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述“表面重整”)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述“FR重组(shuffling)”)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述FR重组(shuffling)的“导向选择”方法)中描述。
可用于人源化的人构架区包括，但不限于：使用“最佳拟合”法选择的构架区(例如，参见Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；源自特定亚群的轻链或重链可变区的人抗体共有序列的构架区(例如，参见Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自筛选FR文库的构架区(例如，参见Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可以通过向已经经过修饰的转基因动物施用免疫原以响应抗原攻击刺激产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体来制备人抗体。这些动物通常含有全部或一部分人免疫球蛋白基因座，其替代了内源免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合于动物染色体内。在这些转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M技术的美国专利号7,041,870，及描述技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。这些动物产生的完整抗体的人可变区可进一步修饰，例如通过与不同人恒定区组合进行修饰。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法制得。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤及小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeoma)细胞系。(例如，参见Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(单克隆抗体产生技术及应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci..USA，103：3557-3562(2006)中描述。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)及Ni，XiandaiMianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中所述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也于Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)，及Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中描述。
也可通过分离选自源自人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。随后可将这些可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。下文描述从抗体文库选择人抗体的技术。
5.源自文库的抗体
可通过在组合文库中筛选具有所需的一种或多种活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，在Methods in MolecularBiology 178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，2001)中综述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackso等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，在Methods in MolecularBiology 248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示方法中，VH及VL全体成员(repertoire)是通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆并且随机重组于噬菌体文库中，随后可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994)中所述在其中筛选结合抗原的噬菌体。噬菌体通常展示单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式的抗体片段。来自免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。或者，天然的全体成员可经克隆(例如自人)以在无任何免疫的情况下提供针对多种非自体抗原以及自体抗原的抗体单一来源，如Griffiths等人，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物来编码高变性CDR3区，并且实现体外重排来合成制得天然文库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。例如，描述人抗体噬菌体文库的专利公开物包括：美国专利号5,750,373，及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对CD98hc而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对basigin而另一种是针对任何其他抗原。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对Glut1而另一种是针对任何其他抗原。双特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段形式。
在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原-结合结构域包含两个VH/VL单位，其中第一VH/VL单位特异性结合第一表位，并且第二VH/VL单位特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单位包含一个重链可变结构域(VH)和一个轻链可变结构域(VL)。所述多特异性抗体包括，但不限于，全长抗体，具有两个以上VL和VH结构域的抗体，抗体片段，如Fab，Fv，dsFv，scFv，双抗体，双特异性双抗体和三抗体，已经共价连接或非共价连接的抗体片段。进一步包含至少一部分重链可变区和/或至少一部分轻链可变区的VH/VL单位还可以称为“臂”或“半体(hemimer)”或“半抗体”。在一些实施方案中，半体包含充分部分的重链可变区，足以允许与第二个半体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半体包含凸起突变或孔洞突变，例如，以允许与包含互补的孔洞突变或凸起突变的第二半体或半抗体的异型二聚体化。凸起突变和孔洞突变在下文中进一步描述。
制造多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及“凸起-入-孔洞(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利号5,731,168)。术语“凸起-进入-孔洞”或“KnH”技术用在本文中是指通过在一条多肽中引入隆起(凸起)而在另一条多肽中在它们相互作用的界面处引入孔穴(孔洞)而在体外或体内指导两条多肽配对在一起的技术。例如，已经将KnHs引入在抗体的Fc：Fc结合界面处、CL：CH1界面处或VH/VL界面处(参见，例如，US 2011/0287009，US2007/0178552，WO 96/027011，WO 98/050431，和Zhu等人，1997，Protein Science6：781-788)。在一些实施方案中，在制备多特异性抗体的过程中，KnHs驱动两条不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或进一步包含与相似的或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术也可以用于将两个不同的受体细胞外结构域配对在一起或配对任意其他包含不同靶标识别序列的多肽序列(例如，包括亲合体(affibodies)，肽体(peptibodies)和其他Fc融合体)。
术语“凸起突变”用在本文中是指在一条多肽中在该多肽与另一条多肽相互作用的界面处引入隆起(凸起)的突变。在一些实施方案中，另一条多肽具有孔洞突变。
术语“孔洞突变”用在本文中是指在一条多肽中在该多肽与另一条多肽相互作用的界面处引入孔穴(孔洞)的突变。在一些实施方案中，另一条多肽具有凸起突变。
也可通过以下方法制得多特异性抗体：工程改造用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电导引效应(WO 2009/089004A1)；将两种或更多种抗体或片段交联(参见例如美国专利号4,676,980，和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术来制得双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；及如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。
改造的具有三个以上功能性抗原结合位点的抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与CD98hc、basigin或Glut1以及另一种不同的抗原(例如，参见US 2008/0069820)结合的抗原结合位点。
在某些实施方案中，本文公开的抗体，例如，抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体是包含特异性针对“CNS抗原”或“脑抗原”的治疗臂的多特异性抗体。例如，本文公开的多特异性抗体具有特异性针对CD98hc或Bsg或Glut1的第一臂，和特异性针对脑抗原的第二臂。所述抗原的实例包括，但不限于：BACE1，Aβ，EGFR，HER2，tau，Apo，例如，ApoE4，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，PrP，LRRK2，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，DR6，APP，p75NTR，IL6R，TNFR1，IL1β，和胱天蛋白酶6。在一个实施方案中，所述抗原是BACE1。在另一个实施方案中，所述抗原是Aβ。
因此，在某些实施方案中，一种结合特异性是针对CD98hc而另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对basigin而另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对Glut1而另一种是针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合CD98hc的两种不同表位。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合basigin的两种不同表位。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合Glut1的两种不同表位。此外，多特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到表达CD98hc、Glut1和/或basigin的细胞。
特异性针对脑抗原的抗体，例如，上述示例的那些，在本领域中是已知的。例如，抗-BACE1抗体是已知的，并且示例性的抗体序列记述在例如国际专利公布号WO 2012/075037中。在一个实施方案中，抗-BACE1抗体与不相关的非-BACE1蛋白结合的程度小于所述抗体与BACE1的结合的约10％，例如，如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，与BACE1结合的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗-BACE1抗体结合在来自不同物种和同种型的BACE1之间是保守的BACE1表位。
在一个实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1被抗-BACE1抗体YW 412.8.31结合的表位。在另一些实施方案中，提供这样的抗体，其结合BACE1内位于BACE1的催化结构域中的外部。在一个实施方案中，提供这样的抗体，其与Kornacker等人，Biochem.44：11567-11573(2005)(该文献通过引用完全结合在本文中，即，肽1，2，3，1-11，1-10，1-9，1-8，1-7，1-6，2-12，3-12，4-12，5-12，6-12，7-12，8-12，9-12，10-12，4，5，6，5-10，5-9，杂乱的，Y5A，P6A，Y7A，F8A，I9A，P10A和L11A)中鉴定的肽竞争与BACE1结合。
进一步举例，特异性结合人Aβ的抗-Aβ抗体是已知的。抗-Aβ抗体的非限制性实例是crenezumab。抗-Aβ抗体的其他非限制性实例是solanezumab，bapineuzumab，gantenerumab，aducanumab，ponezumab，和在下述公布中公开的任意的抗-Aβ抗体：WO2000162801，WO2002046237，WO2002003911，WO2003016466，WO2003016467，WO2003077858，WO2004029629，WO2004032868，WO2004032868，WO2004108895，WO2005028511，WO2006039470，WO2006036291，WO2006066089，WO2006066171，WO2006066049，WO2006095041，WO2009027105。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中所提供抗体的氨基酸序列变体。举例来说，提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性可能是合乎需要的。可通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基缺失和/或插入其中和/或对其进行置换。可进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换性诱变的目的位点包括HVR和FR。保守性置换显示在表C中在“优选的置换”的标题下。更多实质性变化于表C中的“示例性置换”的标题下提供且如下文关于氨基酸侧链种类进一步描述。可将氨基酸置换引入目的抗体中并筛选具有所需活性(例如保持/提高的抗原结合、降低的免疫原性、或提高的ADCC或CDC)的产物。
表C：保守的氨基酸置换
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Iys
Asn(N) Gln；His；Asp，Iys；Arg Gln
Asp(D) Glu：Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Iys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Ihr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
可根据常见侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香性：Trp，Tyr，Phe。
非保守性置换将需要将这些种类中的一种的成员换成另一种类。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体的某些生物学特性相对于亲本抗体改变(例如提高)(例如亲和力增加、免疫原性降低)和/或将实质上保持亲本抗体的某些生物学特性。示例性的置换变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文中所述的那些，方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变，且变异抗体被展现在噬菌体上，并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)对其进行筛选。
可在HVR中进行改变(例如置换)，例如以提高抗体亲和力。这些改变可在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基)中进行(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))；和/或在接触抗原的残基中进行，其中测试所得到的变异VH或VL的结合亲和力。通过构建并且自次级文库重新选择而获得的亲和力成熟已记述在例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人编，Human Press，Totowa，NJ，(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR(error-prone PCR)、链改组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)中任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。另一引入多样性的方法涉及HVR定向方法，其中数个HVR残基(例如每次4-6个残基)被随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特定地鉴别抗原结合中所涉及的HVR残基。特定地，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要这些改变不实质上降低抗体结合抗原的能力即可。举例来说，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力的保守性改变(例如如本文中所提供的保守性置换)。例如，这些改变可在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变异VH及VL序列的某些实施方案中，各HVR是未经改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
适用于鉴别可靶向以供诱变的抗体的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham及Wells(1989)Science，244：1081-1085所述。在此方法中，残基或靶残基的组(例如，诸如Arg，Asp，His，Lys和Glu的带电残基)经鉴定且由中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在对初始置换显示功能敏感性的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基及邻近残基可以作为置换候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定其是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个以上残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合体。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体被糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。
若抗体包含Fc区，则与其连接的糖类可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N-连接与Fc区CH2结构域的Asn297连接的分支链双触角寡糖。参见例如Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏与Fc区连接(直接或间接)的岩藻糖的糖结构的抗体变体。举例来说，该抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于根据MALDI-TOF质谱法所测量的所有与Asn 297连接的糖结构(例如复合型、杂合型及高甘露糖型结构)的总和，计算糖链内Asn297处岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量，例如如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。与“去岩藻糖基”或“岩藻糖缺乏”抗体变体有关的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺乏的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO 2003/085107)。
进一步提供具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体变体，例如，其中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖经GlcNAc平分。这些抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这些抗体变体的实例例如于WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这些抗体变体可具有改善的CDC功能。这些抗体变体于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO1999/22764(Raju，S.)中描述。
c)Fc区域变体
在某些实施方案中，可在本文中所提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，由此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为某些应用的理想候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(例如补体及ADCC)是不必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn结合能力。介导ADCC的初级细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464页上的表3中总结。评定目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中描述。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)及自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，目的分子的ADCC活性可于体内评定，例如在例如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示的动物模型中评定。也可进行C1q结合测定以证明抗体无法结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c结合ELISA。为评定补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；及Cragg，M.S.及M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。也可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合及体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有减小的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中一个或多个置换的那些抗体(美国专利号6,737,056)。这些Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个以上位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述某些与FcR的结合提高或减少的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2)：6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处置换。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变的(即，提高的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如美国专利号6,194,551，WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述具有增加的半衰期及改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其中FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换提高Fc区与FcRn的结合。所述Fc变体包括在下述Fc区残基中的一个或多个处具有置换的那些：238，252，254，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。已经描述了FcRn结合结构域突变M252Y、S254T和T256E(YTE)增加FcRn结合，并且由此增加抗体的半衰期。参见美国公布的专利申请号2003/0190311和Dall’Acqua等人，J.Biol.Chem.281：23514-23524(2006)。另外地，已经记述了FcRn结合结构域突变N434A和Y436I(AI)也增加FcRn结合。参见Yeung等人，J.Immunol.182：7663-7671(2009)。还参见Duncan&Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351，其涉及Fc区变体的其他实例。
d)经半胱氨酸工程改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一个或多个残基经半胱氨酸残基置换。在特定实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点处且可用于将抗体结合至其他结构部分，例如药物结构部分或接头-药物结构部分，以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，任一或多个以下残基可经半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述，产生经半胱氨酸工程改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且容易获得的其他非蛋白质结构部分。适合抗体衍生作用的结构部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性可能具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可有分支或无分支。与抗体连接的聚合物的数目可以变化，且若连接一种以上聚合物，则其可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生作用的聚合物的数目和/或类型可以基于包括，但不限于，以下的考虑因素来确定：要改善的抗体的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用在确定条件下的疗法中等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白性结构部分的缀合物，所述非蛋白性结构部分可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一个实施方案中，非蛋白性结构部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长：其不伤害普通细胞，但是其将非蛋白性结构部分加热至杀伤在抗体-非蛋白性结构部分附近的细胞的温度。
E.重组方法和组合物
使用重组方法和组合物(例如，如在美国专利号4,816,567中所述)可以生产抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体的分离的核酸。所述核酸可以编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和/或包含所述抗体的VH的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含所述核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下载体(例如，已经用以下载体转化)：(1)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达所述抗体的条件下培养上述提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地，从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，Methods inMolecular Biology(分子生物学中的方法)，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以在可溶级分中与细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
F.测定
本文中提供的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来鉴定、筛选或表征。
1.结合测定和其他测定
在一方面，测试本发明的抗体的抗原结合活性，例如，通过已知的方法，如ELISA、蛋白质印迹、FACS等测试。
在另一方面，可以使用竞争测定以鉴定与本文公开的抗-basigin抗体(例如，抗-BsgAc抗-BsgB，抗-BsgC，抗-BsgD，和抗-BsgE)竞争结合Bsg的抗体。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgA竞争。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgB竞争。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgC竞争。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgD竞争。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgC和抗-BsgD竞争。在一些实施方案中，本公开内容所述的抗体与抗-BsgE竞争。
在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合被本文公开的抗-BsgA、抗-BsgB、抗-BsgC、抗-BsgD和抗-BsgE中的一种结合的相同的表位(例如，线性或构象表位)。
在另一方面，可以利用竞争测定来鉴定与本文公开的抗-Glut1抗体(例如，具有SEQ ID NO：81的轻链可变区序列和SEQ ID NO：82的重链可变区序列的抗-Glut1抗体)竞争结合Glut1的抗体。
在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合被本文公开的Glut1抗体(例如，具有SEQID NO：81的轻链可变区序列和SEQ ID NO：82的重链可变区序列的抗-Glut1抗体)结合的相同的表位(例如，线性或构象表位)。
用于定位一个抗体结合哪个表位的详细的示例性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols(表位绘图流程)，”Methods in Molecular Biology卷66(HumanaPress，Totowa，NJ)中提供。
在示例性竞争测定中，在溶液中温育固定的Bsg，所述溶液包含与Bsg结合的第一标记抗体(例如，本文公开的抗-BsgA、抗-BsgB、抗-BsgC、抗-BsgD和抗-BsgE中的任一种)和被测试其与所述第一抗体竞争结合Bsg的能力的第二未标记抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定的Bsg。在允许所述第一抗体与Bsg结合的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定的Bsg结合的标记的量。如果相对于对照样品在测试样品中与固定的Bsg结合的标记的量显著降低，则说明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合Bsg。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
在示例性竞争测定中，在溶液中温育固定的Glut1，所述溶液包含与本文中的Glut1结合的第一标记抗体(例如，具有SEQ ID NO：81的轻链可变区序列和SEQ ID NO：82的重链可变区序列的抗-Glut1抗体)和被测试其与所述第一抗体竞争结合Glut1的能力的第二未标记抗体。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定的Glut1。在允许所述第一抗体与Glut1结合的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定的Glut1结合的标记的量。如果相对于对照样品在测试样品中与固定的Glut1结合的标记的量显著降低，则说明所述第二抗体与所述第一抗体竞争结合Glut1。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratory Manual(抗体：实验室手册)ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)。
2.活性测定
在一方面，提供用于鉴别具有生物学活性的抗-CD98hc抗体的测定。在一方面，提供用于鉴别具有生物学活性的抗-Bsg抗体的测定。在一方面，提供用于鉴别具有生物学活性的抗-Glut1抗体的测定。
CD98hc活性测定
生物学活性可以包括，例如，关于CD98hc的氨基酸转运。还提供在体内和/或体外具有所述生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，可以针对所述生物学活性检测本文公开的抗体。
在一些实施方案中，用于本文公开的方法所述的应用(例如，使用抗-CD98hc抗体)的抗体不抑制细胞增殖或分裂。在一些实施方案中，用于本文公开的方法所述的应用的抗体(例如，抗-CD98hc抗体)不抑制细胞粘附。例如，但不限于，用于测量CD98hc-结合抗体对细胞增殖、细胞分裂、凋亡和细胞粘附的影响的测定可以按照美国专利申请公布号2013/0052197中所述的方法进行。还参见Yagita H.等人(1986)Cancer Res.46：1478-1484；和Warren A.P.，等人(1996)Blood 87：3676-3687。也可以使用本领域已知的任意其他适当的方法来检测CD98hc-结合抗体的活性。
在一些实施方案中，抗-CD98hc抗体不抑制氨基酸转运。可以用来检测CD98hc(例如，以与CD98轻链(例如，LAT1，LAT2，y+LAT1，y+LAT2，xCT，和Asc-1)的异型二聚体复合物形式)的氨基酸转运的体外测定在本领域中是已知的并有记载。参见，例如，Fenczik，C.A等人.(2001)J.Biol.Chem.276，8746-8752；还参见，US 2013/0052197。
在一个具体的实施方案中，在存在所述抗-CD98hc抗体时，CD98异型二聚体复合物的任意天然配体穿过血脑屏障的氨基酸转运的动力学是在不存在所述抗体时的转运动力学的至少10％(例如，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％)，其中在不不存在所述抗体时的动力学是下述中的一种或多种：
关于谷氨酰胺，KM＝295μM(在存在NaCl时)；
关于亮氨酸，KM＝236μM(在存在NaCl时)；
关于精氨酸，KM＝120μM(在存在NaCl时)；以及
关于精氨酸，KM＝138μM(在不存在NaCl时)。
CD98氨基酸反向转运体的氨基酸转运动力学可以以例如等人BiochemJ.2000年8月1日；349Pt 3：787-95所述的测定进行测量。
在一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-CD98hc/BACE1多特异性抗体的测定。在另一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-Bsg/BACE1多特异性抗体的测定。在另一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-Glut1/BACE1多特异性抗体的测定。生物学活性可以包括，例如，抑制BACE1天冬氨酰蛋白酶活性。还提供在体内和/或体外具有所述生物学活性的抗体，例如，如通过均相时间分辨荧光HTRF测定或微流体毛细管电泳(MCE)测定使用合成的底物肽评价或在表达BACE1底物如APP的细胞系中体内评价。
在另一方面，提供用于测量本文公开的抗体(例如，抗-CD98hc，Bsg，或Glut1抗体)的脑摄取的测定。例如，所述测定记述在下述实施例中。
在另一方面，提供用于测量脑和血浆中淀粉样蛋白β的测定，包括用于确定脑淀粉样蛋白β增加或减少和血浆淀粉样蛋白β增加或减少的测定。例如，所述测定记述在下述实施例中。
例如，本文公开的抗体可以与显像剂缀合。在施用抗体缀合物后，可以检测所述显像剂，例如，在分离的脑组织中检测，和/或使用体内脑成像技术(例如，使用生物发光或荧光)(参见，例如，J.R.Martin.J Neurogenet.2008；22(3)：285-307)。
3.亲和力测定
在某些实施方案中，本发明提供制备用于将药剂(例如，神经病症药物或显像剂)转运穿过血脑屏障的抗体的方法所述方法包括从一组针对BBB-R的抗体中选择抗体，原因在于其具有针对BBB-R的低亲和力，例如，针对BBB-R的亲和力在从约5nM，或从约20nM，或从约100nM，至约10μM，或至约1μM，或至约500mM的范围内。因此，亲和力可以在从约5nM至约10μM的范围内或在从约20nM至约1μM的范围内，或在从约100nM至约500nM的范围内，例如，如通过斯卡查德分析或测量的。本领域普通技术人员应该理解，向抗体上缀合异源分子/化合物通常将减小抗体对其靶标的亲和力，例如，由于空间位阻，或者，如果抗体被制成是多特异性的，具有一个或多个与抗体的原始靶标不同的抗原结合的臂，则甚至消除一个结合臂。在一个实施方案中，本发明的缀合到BACE1上的特异性针对CD98hc、basigin或Glut1的低亲和力抗体具有约30nM的针对CD98hc、basigin或Glut1的Kd，如通过BIACORE测量的。在另一个实施方案中，本发明的缀合到BACE1上的特异性针对CD98hc、basigin或Glut1的低亲和力抗体具有约600nM的针对CD98hc、basigin或Glut1的Kd，如通过BIACORE测量的。
用于评价抗体亲和力的一种示例性的测定是通过斯卡查德分析。例如，目的抗-BBB-R抗体可以使用乳过氧化物酶法(Bennett和Horuk，Methods in Enzymology 288第134-148页(1997))进行碘化。使用NAP-5柱通过凝胶过滤纯化放射性标记的抗-BBB-R抗体以使其与游离的125I-Na分开，并测量其比活性。将50μl含有固定浓度的碘化抗体和递减浓度的连续稀释的未标记抗体的竞争反应混合物放置在96-孔板中。在37C在5％CO2中在生长培养基中培养瞬时表达BBB-R的细胞，所述生长培养基由补充以10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和1×青霉素-链霉素的Dulbecco改良eagle氏培养基(DMEM)(Genentech)组成。使用Sigma细胞解离溶液(Sigma Cell Dissociation Solution)将细胞与培养皿脱离，并用结合缓冲液(含有1％牛血清白蛋白，50mM HEPES，pH 7.2，和0.2％叠氮化钠的DMEM)洗涤。将洗涤的细胞以200,000个细胞/0.2mL结合缓冲液的近似密度添加到含有50μl竞争反应混合物的96-孔板中。未标记的抗体在含有细胞的竞争反应中的终浓度是变化的，开始为1000nM，然后通过1∶2倍稀释递减达10个浓度，并且包括零添加、仅有缓冲液的样品。测定每个浓度的未标记抗体的含有细胞的竞争反应，一式三份。将含有细胞的竞争反应在室温温育2小时。在2小时温育后，将竞争反应液转移至滤板，并用结合缓冲液洗涤四次以将游离的与结合的碘化抗体分离。通过γ计数器对过滤器进行计数，并使用Munson和Rodbard的拟合算法(1980)评估结合数据以确定抗体的结合亲和力。
按照另一个实施方案，Kd是使用表面等离子体共振测定法使用-2000装置(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使用抗-人Fc试剂盒(BiAcore Inc.，Piscataway，NJ)测量的。简言之，依照供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。用10mM乙酸钠(pH 4.0)将抗-人Fc抗体稀释至50μg/ml，然后以5/分钟的流速注入，以获得约10000个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注入抗体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量，注入在HBS-P中的抗-BBB-R抗体变体达到约220RU，然后在25℃以约30/分钟的流速注入在HBS-P中的BBB-R-His的两倍连续稀释液(0.61nM至157nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol 293：865-881(1999)。
一种或多种抗体对BBB-R的亲和力的替代测量是其半最大抑制浓度(IC50)，其是一种抑制50％的已知的BBB-R配体与BBB-R结合需要多少抗体的量度。确定给定化合物的IC50的一些方法在本领域中是已知的；常见的方法是进行竞争结合测定。通常，高IC50指示需要更多的抗体以抑制已知配体的结合，并且因此该抗体对所述配体的亲和力相对较低。反之，低IC50指示需要较少的抗体以抑制已知配体的结合，并且因此该抗体对所述配体的亲和力相对较高。
测量IC50的示例性竞争性ELISA测定是这样的测定，其中将递增浓度的抗-CD98hc或抗-CD98hc/脑抗原(例如，抗-CD98hc/BACE1，抗-CD98hc/Aβ等)变体抗体用于与生物素化的抗-CD98hc抗体竞争结合CD98hc。抗-CD98hc竞争ELISA在包被以2.5μg/ml纯化的鼠CD98hc胞外结构域(在PBS中)的Maxisorp板(Neptune，N.J.)中在4℃过夜进行。将平板用PBS/0.05％＞Tween 20洗涤，并使用在PBS中的Superblock封闭缓冲液(ThermoScientific，Hudson，NH)封闭。将每种个体抗-CD98hc或抗-CD98hc/脑抗原(例如，抗-CD98hc/BACE1或抗-CD98hc/Aβ)的滴定液(1∶3连续稀释)与生物素化的抗-CD98hc(0.5nM终浓度)组合并加入到平板，在室温1小时。将平板用PBS/0.05％Tween 20洗涤，并将HRP-链霉抗生物素蛋白(Southern Biotech，Birmingham)加入到平板中，并在室温温育1小时。用PBS/0.05％Tween 20洗涤平板，并且使用TMB底物(BioFX Laboratories，Owings Mills)检测与平板结合的生物素化的抗-CD98hc。例如，对于抗-Glut1和抗-basigin抗体，可以进行相同类型的测定。
G.免疫缀合物
本发明也提供包含本文公开的抗-CD98hc抗体或抗-Bsg抗体或抗-Glut1抗体与一或多种细胞毒性剂，例如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素缀合的免疫缀合物。
在一个实施方案中，本文的抗体与神经病症药物、化疗剂和/或显像剂偶联，以将所述药物、化疗剂和/或显像剂更有效地转运穿过BBB。
共价缀合可以是直接的或是通过接头来实现的。在某些实施方案中，直接缀合是通过构建蛋白融合体(例如，通过编码抗体和例如神经病症药物的两个基因的遗传融合并且作为单个蛋白质表达)来实现的。在某些实施方案中，直接缀合是通过在抗体的两个部分中的一个上的反应基团和例如神经学药物上的相应基团或接受体之间形成共价键来实现的。在某些实施方案中，直接缀合是通过将要被缀合的两个分子中的一个修饰(例如，遗传修饰)成包含反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)来实现的，该基团与要被缀合的另一个分子在合适的条件下形成共价连接。作为一个非限制性实例，可以将具有所需反应基团(例如，半胱氨酸残基)的分子(例如，氨基酸)引入到抗体中，并与例如神经学药物形成二硫键。将核酸与蛋白质共价缀合的方法也是本领域中已知的(例如，光致交联，参见，例如，Zatsepin等，Russ.Chem.Rev.74：77-95(2005))。
非共价缀合可以是通过任何非共价连接方式，包括疏水键、离子键、静电相互作用等，如本领域普通技术人员容易理解的。
缀合也可以使用多种接头进行。例如，可以使用多种双功能蛋白偶联剂缀合抗体和神经学药物，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸己二亚酰胺二甲酯物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合到抗体上的示例性螯合剂。参见WO94/11026。也可以使用由通过肽键相连的一至二十个氨基酸组成的肽接头。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在某些其他的这样的实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头可以是促进神经学药物在递送到脑后释放的“可切割接头”。举例来说，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本发明清楚地预期，但不限于，利用交联剂试剂制备的缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，硫代-EMCS，硫代-GMBS，硫代-KMUS，硫代-MBS，硫代-SIAB，硫代-SMCC，和硫代-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联剂试剂可商购获得(例如购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括，但不限于，美登素类(maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020，5,416,064及欧洲专利EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)如单甲基澳瑞他汀药物结构部分De和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，以及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；以及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素(anthracycline)，如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)及奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括、但不限于，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含如本文中所述的抗体与放射性原子缀合形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212及Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，同样如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
H.用于诊断和检测的方法和组合物
在一些方面，提供检测血脑屏障上的CD98hc的方法。因此，在一些方面，抗-CD98hc抗体以充分的亲和力与CD98hc结合，足以使所述抗体用作靶向CD98hc中的检测剂。在某些实施方案中，抗-CD98hc抗体用于检测CD98hc在生物样品中的存在。在某些方面中，本文提供的任一种抗-Bsg抗体用于检测Bsg在生物样品中的存在。在某些实施方案中，本文提供的任一种抗-Glut1抗体用于检测Glut1在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如脑细胞，例如，脑毛细血管内皮细胞。
在一个实施方案中，提供用在检测方法中的抗-CD98hc抗体。在另一个方面中，提供检测CD98hc在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-CD98hc抗体在允许抗-CD98hc抗体与CD98hc结合的条件下接触，并检测在抗-CD98hc抗体与CD98hc之间是否形成复合物。
在一个实施方案中，提供用在检测方法中的抗-Bsg抗体。在另一个方面中，提供检测Bsg在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-Bsg抗体在允许抗-Bsg抗体与Bsg结合的条件下接触，并检测在抗-Bsg抗体与Bsg之间是否形成复合物。所述方法可以是体外的或体内的方法。
在一个实施方案中，提供用在检测方法中的抗-Glut1抗体。在另一个方面中，提供检测Glut1在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的抗-Glut1抗体在允许抗-Glut1抗体与Glut1结合的条件下接触，并检测在抗-Glut1抗体与Glut1之间是否形成复合物。所述方法可以是体外的或体内的方法。
在一个实施方案中，完整抗体缺少效应子功能。在另一个实施方案中，完整抗体具有降低的效应子功能。在另一个实施方案中，改造完整抗体以具有降低的效应子功能。在一方面，所述抗体是Fab。在另一个方面中，所述抗体具有一个或多个降低或消除效应子功能的Fc突变。在另一个方面中，所述抗体具有修饰的糖基化，例如，由于在缺少正常的人糖基化酶的系统中产生所述抗体导致。在另一个方面中，将Ig骨架修饰成天然具有有限的或没有效应子功能的骨架。
有多种技术可用于确定抗体与CD98hc、Bsg和/或Glut1的结合。一种这样的测定是用于验证结合人CD98hc、Bsg和/或Glut1的能力的酶联免疫吸附测定(ELISA)。按照这一测定，将用抗原(例如，重组CD98hc、Bsg或Glut1)包被的平板与包含抗体的样品一起温育，并且确定所述抗体与目的抗原的结合。
用于评价系统施用的抗体的摄取和抗体的其他生物学活性的测定可以按照实施例中公开的或按照关于目的抗-CNS抗原抗体已知的那样进行。
在一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-CD98hc/BACE1多特异性抗体的测定。在另一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-Bsg/BACE1多特异性抗体的测定。在另一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗-Glut1/BACE1多特异性抗体的测定。生物学活性可以包括，例如，抑制BACE1天冬氨酰蛋白酶活性。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的抗体，例如，如通过均相时间分辨荧光HTRF测定或微流体毛细管电泳(MCE)测定使用合成的底物肽评价或在表达BACE1底物如APP的细胞系中体内评价。
在另一方面，提供用于测量本文公开的抗体(例如，抗-CD98hc，Bsg，或Glut1抗体)的脑摄取的测定。所述测定在下述实施例中描述。
在某些实施方案中，标记的抗-CD98hc抗体可以用在本文公开的方法中。在某些实施方案中，提供标记的抗-Bsg抗体。在某些实施方案中，提供标记的抗-Glut1抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或结构部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的结构部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用间接检测。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
I.药物制剂
在另一方面，本发明提供包含本文提供的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体中的任一种的药物制剂，例如，以用于本文所述的任一种治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体中的任一种和药用载体(例如，以用在本文公开的治疗方法中)。在另一个实施方案中，药物制剂包含抗-CD98hc抗体和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗-Bsg或抗-Glut1抗体中的任一种和至少一种另外的治疗剂，例如，如下文所述。
本文所述的抗-CD98hc、抗-Glut1或抗-Bsg抗体(例如，多特异性抗体或抗体缀合物)的药物制剂通过将具有需要程度的纯度的所述抗体与一种或多种任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编.(1980))混合而制备，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体、赋型剂或稳定剂通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性的sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一些方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，可以合乎需要地另外提供用于治疗神经病症、神经变性疾病、癌症、眼病病症、癫痫发作病症、溶酶体贮积症、淀粉样变性、病毒或微生物疾病、缺血、行为障碍或CNS炎症的一种或多种活性成分。示例性的此类药物在本文的下文中进行讨论。所述活性成分以对于需要的目的有效的量合适地组合存在。
可以将活性成分截留在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊中，例如，分别是在羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中。例如，这些技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980)中。一种或多种活性成分可以包封在与本文所述的抗体偶联的脂质体中(例如，参见美国专利申请公开号20020025313)。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如薄膜或微囊形式。缓释基质的非限制性实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物与乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3羟基丁酸。
欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地实现无菌性，例如，通过借助无菌过滤膜过滤而实现。
J.制品
在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装插页。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物组合，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉输注液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装插页标明该组合物是用于治疗选择的病症。此外，所述制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装插页，所述包装插页指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏液(Ringer’s solution)和葡萄糖溶液。从商业和使用者立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
应该理解，任何以上制品可以包括本发明的免疫缀合物以代替抗-CD98hc、抗-Bsg或抗-Glut1抗体或作为所述抗体的补充。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，依据上文提供的一般描述，可以实施多种其他的实施方案。
A.材料和方法
用于下述实施例的材料和方法描述如下。
1.抗体产生
Lrp1细胞外结构域(ECD)在大肠杆菌中作为His-标记的重组蛋白表达。His-标记的CD320 ECD和CD98hc ECD在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且鼠basigin(mBsg)的ECD在CHO细胞中表达为鼠Fc标记的蛋白。然后，将所有这些重组蛋白在镍或蛋白质A柱上纯化。重组Lrp8和InsR购自R&D systemsTM((目录分别为#3520-AR-050和#1544-IR-050)。重组Ldlrad3也购自Novus Biologicals LLC(Littleton，CO)(目录#H00143458-P01)。抗-Lrp1、抗-InsR、抗-Lrp8和抗-Ldlrad3抗体通过天然噬菌体文库分选方法(下文所述)产生。抗-CD320、抗-Bsg和抗-CD98hc抗体使用标准流程用相应蛋白的鼠细胞外结构域免疫小鼠、大鼠或仓鼠而产生。抗-Glut1抗体通过使用编码全长Glut的质粒在小鼠中进行DNA免疫而产生。对产生的杂交瘤进行筛选，通过ELISA筛选抗原结合，并且通过流式细胞术筛选在HEK细胞上瞬时表达的抗原的识别。所有的抗体重新格式化成包含人Fc的嵌合体用于所有的研究。亲和力在图9中列出。抗-Bsg抗体A-E在实施例中描述。
2.天然噬菌体文库分选
将10μg/mL重组抗原在NUNC 96孔Maxisorp免疫平板上包被过夜，并且用PBST[PBS和1％牛血清白蛋白(BSA)和0.05％Tween 20]预先封闭。然后将用PBST预先封闭的天然合成的多样性噬菌体抗体文库(参见，C.V.Lee，等人.J.Mol.Biol.340，1073-1093(2004)；和W.C.Liang，等人.J.Mol.Biol.366，815-829(2007))添加到平板中并在室温温育过夜。将平板用PBST洗涤，并且将结合的噬菌体用50mM HCl和500mM NaCl洗脱30分钟，并且用1M Tris碱中和。将回收的噬菌体颗粒在大肠杆菌XL-1Blue细胞(Agilent Technologies，SantaClara，CA)中扩增。在后续选择轮次中，温育时间减少至2-3小时，并且洗涤的严格性逐渐增加。选择特异性结合抗原的独特的噬菌体抗体，并且通过分别将个体克隆的VL和VH区克隆到LPG3和LPG4载体中，并在哺乳动物CHO细胞中瞬时表达而重新格式化成全长IgG。
3.针对RMT靶标的抗体的发展
将Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International，Inc.，Wilmington，MA)，Lewis大鼠(Charles River，Hollister，CA)，或美国仓鼠(CytogenResearch and Development，Inc.，West Roxbury，MA)用纯化的抗原细胞外结构域或编码人抗原的DNA(在Glut1情形中)通过足垫或腹膜内以3-4天的时间间隔在Ribi佐剂(Sigma)中进行免疫，或用编码全长抗原的质粒DNA(在存在稀释在林格氏溶液的GM-CSF的条件下)通过水动力学尾静脉递送(HTV)每周注射进行免疫。6-12次注射后，通过直接ELISA和与瞬时转染的293细胞结合的FACS评价免疫血清滴度。将来自表现出FACS结合的动物的脾细胞和/或淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；American Type Culture CollectionManassas，VA，USA)通过电融合(HybrimmuneTM；HarvardApparatus，Inc.，Holliston，MA)而融合。10-14天后，收集杂交瘤上清，并且通过直接ELISA或FACS筛选IgG分泌。将表现出FACS结合的最后的杂交瘤重新格式化成人IgG1或无效应子的κ骨架。表达重新格式化的抗体，并且使用MabSelect SuReTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)通过亲和层析纯化上清，洗脱在50mM磷酸，pH 3.0加20X PBS，pH 11中，并且保存在4℃。
4.流式细胞术分析
在转染了相应抗原的293细胞上筛选纯化的抗体。将细胞从烧瓶/培养皿收集，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并且以1,000,000个细胞/孔添加到96-孔U型底平板(BDFalcon 353077，BD，Franklin Lakes，NJ)中。将样品添加到细胞(100μL/孔)中，并在4℃温育30-60分钟。然后，将平板离心(1200rpm，5分钟，4℃)并用PBS/1％FBS(200μl/孔)洗涤两次。然后添加R-藻红蛋白-缀合的Ziege抗-人IgG Fc(Jackson ImmunoReseachLaboratories Inc.(West Grove，PA)；109-116-098；100μl，稀释在PBS中)，并且将平板在4℃(遮盖)温育30分钟。最后洗涤后，将细胞固定在包含1％福尔马林的PBS中，使用FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)读取。然后使用FlowJo软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)测量每种样品的平均荧光强度(MFI)。
5.竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)
将Nunc 96-孔Maxisorp免疫平板用抗原(2μg/ml)在4℃包被过夜，并用封闭缓冲液PBST在室温封闭1小时。随后向具有亚饱和浓度的生物素化双特异性抗体的平板中添加二价或双特异性抗体的连续稀释液，在室温1小时。将平板用洗涤缓冲液(具有0.05％Tween20的PBS)洗涤，并且用辣根过氧化酶(HRP)-缀合的链霉抗生物素蛋白温育30分钟，并且用四甲基联苯胺(TMB)底物显色。在650nm以分光光度法测量吸光度。
6.放射性标记示踪剂量给药
放射性碘化。如之前所述(Chizzonite等人，J Immunol，1991；147(5)：1548-56)，研究中所用的所有抗体都用碘-125(125I)使用间接非水溶性碘化试剂添加法进行放射性碘化。放射性碘化的蛋白用预先在PBS中平衡的NAP5TM柱纯化。通过大小排阻HPLC证明它们是完整的。
7.在C57BL/6雌鼠中的体内生物分布
所有的体内流程、笼养和麻醉都得到Genentech实验室动物资源的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees of GenentechLaboratory Animal Resources)的核准，符合实验室动物护理的评估和认可协会(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)的管理规定。约6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(17-22g)获自Charles River Laboratories(Hollister，CA)。通过静脉内推注给它们施用5μCi的放射性碘化的抗体。在剂量给药后1，4，24和48小时，采集血液(加工血浆)、脑、肝、肺、脾、骨髓和肌肉(腓肠肌)(n＝3/抗体)，并且冷冻保存直到在γ计数器(2480Automatic Gamma Counter，PerkinElmer，Waltham，MA)上分析总放射性。计算每种样品的放射性水平，并且表示为每克或毫升样品的注射的剂量的百分数(％ID/g或％ID/mL)。使用GraphPad(Version 6.05)将％ID/g-时间数据绘图，并且确定浓度时间曲线下面积(AUC)。使用Bailer(Bailer，Journal ofPharmacokinetics and Biopharmaceutics，1988；16(3)：303-309)所述的方法计算关于AUC估测的标准误差(SD)。
8.免疫组织化学
将野生型小鼠静脉内注射5mg/kg的抗体，然后剂量后1小时进行PBS灌注。将脑以滴状在4％低聚甲醛(PFA)中在4℃固定过夜，然后在4℃用30％蔗糖过夜。将脑组织样品在滑动切片机上以35μm的厚度切片，在5％BSA，0.3％Triton中封闭1-3小时，用在1％BSA，0.3％Triton中的1∶200Alexa488抗-人二级抗体(Life Technologies，GrandIsland，NY)在室温温育2小时。然后通过Leica荧光显微镜(Leica Microsystems Inc.，Buffalo Grove，IL)分析封固的载玻片。
9.测量脑与血浆中的抗体浓度和小鼠Aβx-40
动物护理按照Genentech IACUC指导进行。用于治疗剂量给药研究的所有小鼠都是雌性C57BL/6野生型小鼠，6-8周龄。将小鼠静脉内注射抗体，并且在所示的注射后时间记录。在用PBS灌注之前，将全血采集在血浆微容器管(BD Diagnostics，Franklin Lakes，NJ)中，并且以14000rpm离心2分钟。分离血浆上清，适当时用于抗体和小鼠Aβx-40测量。摘下脑，并将组织在包含cOmplete Mini不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)的PBS中的1％NP-40(Cal-Biochem，Billerica，MA)中匀浆。在以14000rpm离心20分钟之前，将匀浆的脑样品在4℃旋转1小时。分离上清用于脑抗体测量。对于PK/PD研究，分离一个半脑用于Aβx-40测量，并且在5M盐酸胍缓冲液中匀浆。在稀释(1∶10)在含有刚添加的抑肽酶(20μg/mL)和亮抑酶肽(10μg/mL)的PBS中的0.25％酪蛋白，5mM EDTA(pH 8.0)中之前，将样品在室温旋转3小时。将稀释的匀浆物以14000rpm离心20分钟，并且分离上清用于Aβx-40测量。
10.PK测定
小鼠血清和脑样品中的抗体浓度使用ELISA进行测量。将NUNC 384孔MaxisorpTM免疫平板(Thomas Scientific，Swedesboro，NJ)用驴抗-人IgG，Fc片段特异性多克隆抗体的F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)包被。封闭平板后，每种抗体用作标准物来定量各种抗体浓度。将标准物和样品在平板上在室温下轻度振荡温育2小时。结合的抗体用HRP-缀合的F(ab’)2山羊抗-人IgG，Fc特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc)检测。使用四参数非线性回归程序由标准曲线确定浓度。测定具有的定量下限(LLOQ)值在血清中为3.12ng/ml，在脑中为1.56ng/ml。对于抗-CD98hc脑样品，小鼠血清和脑样品中的抗体浓度在GYROS平台(Gyros Ab，Sweden)上用ELISA测量。Gyros珠子首先用驴抗-人IgG，Fc片段特异性多克隆抗体的生物素-缀合的F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc)包被。每种抗体用作标准物定量各种抗体浓度。按照供应商提议的流程，将标准物和样品在珠子上在室温温育。结合的抗体用Alexa 647-缀合的F(ab’)2山羊抗-人IgG，Fc特异性多克隆抗体(JacksonImmunoResearch)检测。使用四参数非线性回归程序由标准曲线确定浓度。测定具有的定量下限(LLOQ)值在血清中为5ng/ml，在脑中为5ng/ml。
11.PD测定
以与上文PK分析方法相似，使用ELISA测量小鼠神经元培养物上清、血浆和脑样品中的Aβx-40浓度。简言之，将特异性针对Aβ40C端的兔多克隆抗体(Millipore，Bedford，MA)包被在平板上，并且使用生物素化的抗-小鼠Aβ单克隆抗体M3.2(Dedham，MA)进行检测。测定具有的LLOQ至在血浆中为1.96pg/ml，在脑中为39.1pg/g。
12.原代小鼠脑内皮细胞分离
通过FACS从40只成年雌性C57B16小鼠(6-8周龄)分离脑内皮细胞(BEC；CD31+/CD45-)。平行收集阴性分选的群体(CD31-/CD45-)用于比较。总之，分选约5x 105个，以得到纯度为～92％的BEC群体。在蛋白酶抑制剂的存在下，将分离的BEC和阴性选择的对照细胞在RIPA缓冲液中裂解，并且在4-12％Bis-Tris凝胶上通过SDS-PAGE分离。在BEC裂解物中，10％用于银染凝胶，10％用于针对运铁蛋白受体(TfR)的蛋白质印迹，并且其余的上样在单个泳道中并用SimplyBlueTM SafeStain(Life Technologies)染色。在与BEC裂解物相邻的平行泳道中，来自～5000个CD31+/CD45-和～40000个阴性选择的群体的CD31-/CD45-细胞的裂解物运行分别进行银染、抗-TfR蛋白质印迹和染色。
13.质谱法
对于质谱分析，将与BEC裂解物(CD31+/CD45-)和阴性对照(CD31-/CD45-)裂解物相对应的染色的凝胶泳道分别从顶端到底端切成15个切片。使用标准方法，基本上如在Zhang，等人，2014，Sci Trans Med 34(36)：11929-11947；和在Phu等人，2011，Mol Cell Proteomics，10(5)：M110中所述，对每个凝胶泳道进行凝胶内胰蛋白酶消化。将凝胶切片切成1mm的立方体，并且通过分别用10X凝胶体积的50mM碳酸氢铵，50％乙腈(pH8.0)，然后10X凝胶体积的100％CAN连续洗涤15分钟而去染色。分别使用25mM二硫苏糖醇/100mM碳酸氢铵(30分钟，50℃)，和50mM碘乙酰胺/100mM碳酸氢铵(20分钟，室温下在暗处)进行凝胶内还原和烷基化。然后将凝胶块洗涤，并用另外的10X凝胶体积的100％乙腈脱水。以10ng/μL胰蛋白酶的浓度在含有5％乙腈的50mM碳酸氢铵(pH 8.0)中制备胰蛋白酶溶液，并添加到在冰上的凝胶块中。将凝胶块在冰上在胰蛋白酶溶液中浸没1小时，并且在37℃进行凝胶内消化过夜。收集消化的肽，并且用50％乙腈/5％甲酸再将凝胶块提取一次。将样品在SpeedVacTM中干燥至完全，然后重悬在3％乙腈/5％甲酸中进行分析。
使用nanoACQUITY UPLC柱(Waters)，将肽以1.5μl/分钟的流速注入到填装了1.7μm BEH-130树脂(Waters，Milford MA)的0.1mm x 100em C18柱中，注入10分钟。肽使用两阶段线性梯度分离，其中溶剂B(98％乙腈/2％水/0.1％甲酸)在20分钟内从5％升至25％然后在2分钟内从25％升至50％。缓冲液A由98％水/2％乙腈/0.1％甲酸构成。使用the ADVANCE捕获喷雾电离源(Microm-Bruker，Auburn，CA)，将肽引入到Orbitrap Velos hybrid iontrap-Orbitrap质谱仪(ThermoFisher Scientific，San Jose，CA)上。以60,000-分辨率收集Orbitrap full-MS(MS1)数据，并且用于在前八个最致密的离子上的线性离子阱中引发数据依赖性的MS2扫描。使用针对来自UniProt的小鼠蛋白的串联靶标-诱饵数据库的Mascot，检索MS2光谱。使用线性判别分析，连续滤除肽光谱匹配至5％肽假发现率(peptidefalse discovery rate，pepFDR)，然后至2％蛋白假发现率(最终pepFDR＜0.5％)。AUC(曲线下面积)表示关于前三个最丰富的肽击中的整合强度的两次技术重复的平均值，如之前所述(Ahrné等人，2013；Proteomics.17，2567-2578)。
14.体内两质子显微镜检
如之前所述(Holtmaat等人，2009；Nat Protoc.2009；4(8)：1128-44)，将混合性别的2-4月龄的野生型小鼠在右半球植入颅骨窗口，并且在手术后≥2周拍照。在拍照过程中，将小鼠用七氟烷(2.5-3％，0.7L/分钟)麻醉。通过尾静脉导管注射100μLIVM680(Perkin Elmer，Waltham，MA)，以显现脉管系统，并且通过两质子显微镜检捕获抗体前的照片。通过尾静脉导管注射50mg/kg Alexa594标记的CD98hc/BACE1抗体，并且立即(时间0)和在6，24和48小时后捕获照片。所述两质子激光扫描显微镜系统(Ultima InVivo Multiphoton Microscopy System，Prairie Technologies)使用调频至860nm的Ti：蓝宝石激光(DeepSeeTM Spectra Physics)，传送～15mW至60x NA 1.1水浸没物体的病灶后面(back-focal plane)。在对每只动物的拍照日子中，激光源保持恒定。以1μmz-步骤尺寸，对于每个区域采集35-65μm量度(volumes)的512x 512像素分辨率的堆叠(stacks)。
15.杆状病.毒(Baculovirus，BV)ELISA
详细方法在之前已有记载(参见，I.等人.mAbs，4∶6，753-760(2012))。简言之，将纯化的BV颗粒在384孔ELISA平板(Nunc MaxisorpTM)上在4℃固定过夜。将孔用封闭缓冲液(包含0.5％BSA的PBS)在室温封闭1小时。在用PBS润洗平板后，将纯化的抗体连续稀释在封闭缓冲液中，一式两份向ELISA孔中加入25μl等分试样，并在室温温育1小时。然后洗涤平板，并向每个孔中加入10ng/mL缀合到辣根过氧化酶上的山羊抗-人IgG，(Fcγ-片段-特异性的)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)。将所述平板在室温温育1小时，洗涤然后向每个孔中加入TMB底物。15分钟后通过向每个孔中加入1M磷酸而终止反应。在620nm参比，在450nm读取吸光度。由6个光学密度确定的平均值计算BV得分，其中每一个光学密度确定已经通过除以对未包被的孔观察到的平均信号进行了标准化。
16.免疫组织化学
将稳定过表达小鼠CD98hc的IMCD3细胞涂布在384孔光学平板(Perkin)上并生长至汇合后1-2天。将细胞用1μM的抗-CD98hc双特异性抗体处理1小时，用PBS洗涤，在室温(RT)用4％PFA/4％蔗糖/PBS固定5-10分钟，然后通过冰冷的100％甲醇固定20分钟。将细胞用含有1％驴血清，2％BSA，0.1％Triton-X100的PBS在室温(RT)封闭30分钟。所用的一级抗体是小鼠抗-Lamp1(BD，1∶200)和山羊抗-CD98hc(Santa Cruz 1∶200)，它们稀释在封闭液中，并且在4℃温育过夜。使用下述二级抗体：驴抗-人IgG Alexa405，驴抗-山羊Cy3，和驴抗-兔Alexa647(Jackson Immunoresearch)。
17.图像捕获和共同定位分析
在带有40X NA1.1水镜头(water lens)的Opera PhenixTM高容量系统(Perkin)上以共聚焦模式拍摄图片。使用激光线375，488，550和640。每个孔拍摄四张图片，并且每个图片中150-200个细胞。每种条件下对五个孔成像，由此每次处理分析多于3000个细胞。将图像转移到5.1中进行分析。对于要分析的每个单个通道，使用TopHat功能去除背景，然后使用“适应阈值(adapted threshold)”功能对用于分析的原始通道图像产生染色的对象掩蔽(stained object masks)。为了仅定量染色的细胞内穿孔，基于尺寸在分析中排除CD98hc膜染色。从由约150-200个细胞组成的整个图像定量CD98hc穿孔的总数。为了鉴定与Lamp1共同定位的内在化的CD98hc染色，使用“保持标记的对象(keep marked object)”功能鉴定来自两个不同的通道的重叠对象。由整个图像定量共同定位的CD98hc穿孔的总数，并且通过程序记录每个孔的总和，并输出到MicrosoftExcel中。共同定位的CD98hc穿孔百分数计算为：与Lamp1共同定位的CD98hc穿孔的数目/总CD98hc穿孔的总数。计算5个孔的平均数并且在GraphPad Prism(GraphPad，La Jolla，CA)中绘图。
18.氨基酸摄入测定
一天前，将稳定过表达CD98hc的IMCD3细胞涂布在384孔平板(Perkin)上。次日早上将抗体添加到细胞中，并在生长培养基中以1μM温育24小时。每种条件使用四个孔，并且实验重复3次。24小时后，将细胞用不含Met的DMEM在37℃平衡30分钟。为了测量细胞对氨基酸的摄入，向细胞中加入终浓度为50μM的氨基酸甲硫氨酸类似物，即高炔丙基甘氨酸(homopropargylglycine，HPG，Life Technolgies C10186)。使用10mM BCH(Sigma)作为阳性对照，并且与HPG同时加入。在37℃30分钟温育后，加入另外的生长培养基再温育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并在含有cOmpleteTM蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液中裂解。所有的液体处理都使用Agilent Bravo自动化系统(Agilent Technologies，SantaClara，CA)用384尖端头进行。将细胞裂解物转移至384孔平板中并在4℃温育过夜。通过经由在HPG上的click标签的生物素化检测转运的甲硫氨酸。将平板洗涤3次，并且按照制造商的使用说明(Life Technologies，Grand Island，NY，B10184)进行click反应。生物素化的甲硫氨酸的总量使用ELC检测进行检测。结果在GraphPad中绘图。
19.蛋白质印迹分析
在PBS灌注后，将小鼠脑组织分离，并在如上述所述的(参见测量脑与血浆中的抗体浓度和小鼠Aβx-40)含蛋白酶抑制剂的1％NP-40中匀浆。将大约20μg蛋白上样到4-12％Bis-Tris Novex凝胶(Life Technologies)上。使用iBlot系统(Life Technologies)将凝胶转移到硝基纤维素膜上，并且使用封闭缓冲试剂和二级抗体(LI-Lincoln，NE)进行蛋白质印迹。使用小鼠交叉反应的山羊抗-CD98hc(Santa CruzBiotechnology Inc.(Dallas，TX)，M-20，1∶200)检测脑裂解物中的CD98hc。兔抗-β肌动蛋白(abcam8227，1∶2000)作为上样对照。将Western膜成像，并且使用制造商供应的软件和系统(/LI-)进行定量。
将野生型IMCD3细胞涂布在48孔平板中过夜，用抗体温育24小时，用PBS洗涤，然后用补充了蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液裂解。每种条件使用三个孔，并且实验重复3次。使用山羊抗-CD98hc(Santa Cruz Biotechnology Inc.)和肌动蛋白通过如上文所述的蛋白质印迹探测裂解物的CD98hc。
20.统计学分析
除非另外指明，所有值表示为平均值±SEM，并且p-值通过带有Dunnett多比较检验的普通的单向ANOVA评估。脑TfR与抗体水平之间的相关性分析使用GraphPadVersion 6进行。
B.Lrp1和InsR的受体-介导的胞转筛选揭示缺少显著的脑摄入
本实施例证明，在关于受体介导的转运抗体穿过BBB的更广泛研究的受体(TfR，Lrp1和InsR)中，仅针对TfR的抗体表现出显著的脑摄入。
为了系统性筛选用于BBB穿透的针对潜在的RMT靶标的抗体，设计一般的筛选级联，其涉及在系统性体内剂量给药药物动力学研究之前在体外证实鼠抗原结合(图1A)。该方法首先用于确定针对两种普遍研究的RMT靶标，即低密度脂蛋白受体-相关蛋白1(Lrp1)和胰岛素受体(InsR)的抗体是否能够穿过BBB并且在小鼠脑中显著累积。从首次用于免疫的抗体噬菌体文库产生针对Lrp1和InsR的单克隆人抗-小鼠-抗体。使用表达鼠Lrp1或鼠InsR的HEK293细胞的流式细胞术分析证实这些抗体与膜展示的靶标的阳性结合(图1B)。
为了确定系统性施用的抗-Lrp1和抗-InsR能否被转运到脑中，我们使用示踪和治疗剂量评价抗体的脑浓度。由于之前证实了在示踪和治疗剂量之间与针对BBB-R TfR的结合亲和力的反向关系，研究示踪和治疗剂量二者。具体地，结合TfR的高亲和力表现出经由示踪剂量给药的强摄入，但是经由治疗剂量给药的减少的摄入。对于低亲和力TfR抗体证明了相反的事实。因此，推论针对RMT靶标的抗体必须经由示踪或治疗剂量给药起作用，否则，该靶标不可能作为穿过BBB的转运蛋白。
TfR是强RMT靶标，在系统施用后，针对TfR的抗体能够穿过BBB，并且在脑中积聚。因此，高亲和力抗-TfR抗体(抗-TfRA)用作脑摄入的阳性对照，用于后续示踪和治疗剂量给药研究中(参见，Yu等人，Sci Transl Med.2011年5月25日；3(84)：84ra44；Couch等人，SciTransl Med.2013年5月1日；5(183)：183ra57，1-12；Yu等人，Sci Transl Med.2014年11月5日；6(261)：261ra154)。将单一放射性标记的示踪剂量的I125-对照IgG、I125-抗-TfRA、I125-抗-Lrp1或I125-抗-InsR静脉内注射到野生型小鼠中，并且在给药后不同的时间点测量脑中的放射性。对于I125-抗-TfRA，观察到脑摄入的显著增加，如通过每克脑组织注射的剂量的百分数测量的，而I125-抗-Lrp1和I125-抗-InsR二者的脑摄入与I125-对照IgG类似(图1C)。
接着询问这些抗体的治疗剂量是否将导致脑摄入。对野生型小鼠注射20mg/kg(较高的治疗相关剂量)的对照IgG，抗-TfRA，抗-Lrp1，或抗-InsR，并且在剂量给药后1和24小时测量抗体的脑浓度，然后用PBS灌注。与之前的观察一致，在脑中观察到抗体摄入，但是，与对照IgG相比，在剂量给药后1和24小时对于抗-TfRA的脑摄入都是适度的(图1D)。相反，没有观察到抗-Lrp1的脑积聚。在这两个时间点，抗-InsR都表现出显著的、但是适度的脑摄入增加。
在5mg/kg剂量后1小时的小鼠皮质组织免疫组织化学染色揭示抗-TfRA的明显的血管定位，而对于抗-Lrp1或抗-InsR没有观察到抗体定位，这表明缺少系统施用的靶向Lrp1和InsR的抗体在脑内皮细胞上的定位(图1E)。这些结果表明，在这些广泛研究的受体中，仅针对TfR的抗体表现出强的脑摄入。
C.在BBB的基因(mRNA)富集不足以将抗体转运到CNS中
本实施例证明在BBB的基因(mRNA)富集不是确定在脑内皮细胞上表达的质膜受体是否是用于穿过BBB的抗体转运的成功的RMT靶标的充分标准。
理想地，RMT靶标在BBB上高度表达，但是在周围器官中具有较低的表达。这种特性可能通过减少在脑之外的器官中的靶标介导的清除而改善安全性和抗体药物代谢动力学。之前，与来自野生型小鼠的肝和肺内皮细胞相比，使用FACS-纯化的内皮细胞的微阵列表达模式鉴定在BBB上富集的基因(Tam等人，2012，Devt.Cell 22：403-417)。一些编码单通跨膜受体的候选基因基于它们在BBB上的高度富集被鉴定为潜在的RMT靶标：Lrp8，Ldlrad3，和CD320(图2A)。有趣的是，尽管对于Tfrc，在BBB上观察到较高的mRNA表达，但是，与肝和肺内皮细胞相比，Lrp1和Insr都没有表现出更高的BBB表达，这表明这些普遍研究的RMT靶标缺少在BBB的富集。
为了确定在BBB上富集的基因的抗体靶向产品是否将导致显著的抗体摄入，产生针对Lrp8、Ldlrad3和CD320的单克隆抗-小鼠抗体。使用表达鼠抗原的HEK293细胞的流式细胞术分析证实对所有三种抗体的阳性结合(图2B)。对野生型小鼠静脉内注射单一放射标记的示踪剂量的I125-对照IgG、I125-抗-TfRA、I125-抗-Lrp8、I125-抗-Ldlrad3或I125-抗-CD320。在所述注射的抗体中，仅有I125-抗-TfRA表现出显著的脑摄入，而I125-抗-Lrp8、I125-抗-Ldlrad3和I125-抗-CD320表现出与I125-对照IgG相似的脑水平(图2C)。当对野生型小鼠静脉内剂量给药20mg/kg的治疗相关剂量时，观察到相似的结果(图2D和2E)。在5mg/kg剂量后1小时的皮质脑组织的免疫组织化学染色揭示，对于抗-Lrp8和抗-CD320，缺少抗体在BBB的定位，而抗-Ldlrad3表现出适度的免疫反应性(图2F)。
尽管微阵列分析鉴定Lrp8、Ldlrad3和CD320mRNA表达在脑内皮细胞上高度富集，但是针对这些跨膜受体的抗体不能以任何可察觉的量穿过BBB。最近，Zhang等人(2014，同前所述)制作了一个可用的数据集，其具有小鼠脑中不同细胞群体的综合RNA-seq转录体组分析，包括提供定量mRNA表达数据的脑内皮细胞(在web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.hmtl可用)。申请人检查该数据集内的失败的RMT靶标候选物揭示Lrp8、Ldlrad3和CD320在脑内皮细胞上的低绝对mRNA表达(图2G)，而Lrp1和Insr在这一细胞群体中表现出非常低的mRNA表达。相反，Tfrc的转录水平比其余候选基因在脑内皮细胞中的转录水平高～12-倍(与Lrp8相比)至～500-倍(与Lrp1相比)(图2G)。这一分析表明，在不存在抗体脑摄入实验时，单独的mRNA表达数据不足以鉴定适当的RMT靶标。
D.BBB上高度表达的跨膜蛋白的蛋白质组鉴定
本实施例描述了使用蛋白质组方法鉴定在BBB上高度表达并且可能是潜在的新型RMT靶标的质膜蛋白。
尽管Ldlrad3和CD320的相对转录水平在脑内皮细胞(BECs)中选择性富集，但是假设它们在BBB上的绝对蛋白表达水平可能是防止任何潜在的抗体穿过BBB摄入的限制性因素，如由差的脑免疫组织化学染色表明的。为了研究绝对蛋白水平是否将更好地预测潜在的RMT受体，使用蛋白质组方法来鉴定在脑内皮细胞中高度报道的跨膜蛋白。
与之前关于BBB脉管系统的基因表达模式所述的方法(Tam等人2012，同前所述)相似，使用流式细胞术从野生型小鼠分离CD31-阳性的和CD45-阴性的脑内皮细胞(BEC)(图3A)。通过鉴定之前表征的内皮细胞特异性的蛋白，如Pg-p，Glut1，ZO-1和Esam，验证流式细胞术纯化的BEC的质谱(MS)分析(图3B)。来自阴性选择的非BEC裂解物(即，CD31-阴性的/CD45-阴性的)的肽计数揭示大量的神经胶质特异性蛋白(Fasn，Aldoc，Glu1，Plp1)。
与其强RMT特性一致，发现TfR在BEC群体中大量表达(图3C)。事实上，肽计数揭示TfR是BEC群体中最高的单通跨膜蛋白。与mRNA表达一致，Lrp1、InsR、Lrp8、Ldlrad3和CD320的蛋白水平低于检测，尽管在非BEC群体中检测到Lrp1的一些肽计数(图3C)。
因此，这些结果与上述结果一致，上述结果证明缺少靶向之前所述的RMT靶标(Lrp1和InsR)和与肝/肺mRNA相比在脑内皮细胞中具有优先的基因表达的靶标(Lrp8，Ldlrad3和CD320)的抗体的显著摄入。
重要的是，给蛋白质组分析揭示了一些之间没有作为穿过BBB的RMT的抗体靶标研究的大量的跨膜蛋白。这些包括葡萄糖转运蛋白Glut1(图3B)，细胞外基质金属蛋白酶诱导剂basigin(CD147)(图3C)，和溶质载体CD98重链(图3C)。基于微阵列表达和RNA测序模式数据，这些RMT靶标也在BBB上富集(图3D)，因此被选择作为潜在的新RMT候选靶标用于进一步的研究。
E.针对basigin的抗体的脑摄入
本实施例描述在野生型小鼠脑中的抗-basigin抗体摄入的表征。
通过用鼠basigin蛋白的细胞外结构域进行小鼠免疫产生针对basigin的单克隆抗体，并且纯化一系列的抗体克隆，在本文中鉴定为抗-BsgA，抗-BsgB，抗-BsgC，抗-BsgD，和抗-BsgE。使用瞬时表达鼠basigin的HEK293细胞，通过流式细胞术证实抗-BsgA和抗-BsgB与靶标的结合(图4A)。为了确定这些抗体在体内是否结合basigin，对野生型小鼠静脉内注射5mg/kg的抗-BsgA或抗-BsgB。在剂量给药后1小时的小鼠皮质组织的免疫组织化学染色揭示抗-BsgA和抗-BsgB二者显著的血管定位，这与之前关于抗-TfRA观察到的相似(图4B，与图1E比较)。还检测了三种另外的克隆，即，抗-BsgC，抗-BsgD和抗-BsgE，并且产生了与抗-BsgA和抗-BsgB相似的结果。
接着，通过示踪和治疗剂量给药方案二者研究这些抗体是否能够被吸收到脑中。对野生型小鼠系统性施用单一放射标记示踪剂量的I125-对照IgG、I125-抗-BsgA或I125-抗-BsgB。与I125-对照IgG相比，对于研究的持续时间，在脑中观察到I125-抗-BsgA的显著增加，而I125-抗-BsgB存在适度增加(图4C)。还检测了三个另外的克隆，BsgC，BsgD和BsgE。对于该另外的克隆，没有观察到经由示踪剂量给药的显著的脑摄入。
接着，使用20mg/kg的更治疗相关的剂量检测basigin抗体是否能够在脑中积聚。将野生型小鼠静脉内注射20mg/kg的对照IgG，抗-TfRA，抗-BsgA，或抗-BsgB，并且在剂量给药后1和24小时确定血浆和脑中的抗体浓度。与对照IgG相比，在这两个时间点，两种Bsg抗体的脑浓度显著更好(图4D)。将抗-Bsg克隆的脑摄入与抗-TfRA的脑摄入比较。抗-BsgB的脑浓度与抗-TfRA相似，但是，与抗-TfRA的脑浓度相比，抗-BsgA的浓度与剂量给药后24小时显著更高。
为了进一步检验抗-Bsg穿过BBB转运到脑实质中，产生结合Bsg与淀粉样蛋白前体蛋白(APP)切割酶β-分泌酶(BACE1)二者的双特异性抗-Bsg/BACE1抗体(Atwal等人，SciTransl Med.2011年5月25日；3(84)：84ra43)。认为BACE1是在阿尔茨海默病患者的脑中的蚀斑中发现的淀粉样蛋白β(Aβ)形成的主要贡献者(Vassar等人，Science.1999年10月22日；286(5440)：735-41)。与申请人之前使用抗-TfR/BACE1的方法类似，双特异性抗-Bsg/BACE1允许抗体穿过BBB进入脑实质的药效学读取(Yu等人2011，同前所述；Atwa1等人2011，同前所述)。关于二价(单特异性)抗-Bsg和双特异性(单价抗-Bsg)抗-Bsg/BACE1抗体的亲和力通过竞争性ELISA确定。所有的抗体表现出双特异性(单价)格式的basigin结合亲和力减少。见图4F。
为了评估这些双特异性抗体的脑摄入，将野生型小鼠静脉内注射单次50mg/kg剂量的对照IgG，抗-BsgA/BACE1，或抗-BsgB/BACE1。在剂量给药后24小时，与对照IgG相比，在注射了抗-BsgA/BACE1的小鼠的脑中，存在抗体浓度的显著增加(图4G)。脑中抗-BsgA/BACE1浓度的这一增加与脑中Aβ水平～23％的减少相关(图4H)。相反，用抗-BsgB/BACE1处理的小鼠没有表现出中脑中抗体浓度增加，并且，如预测的，没有观察到Aβ减少。抗-BsgD/BACE1页表现出显著的摄入，然而，没有观察到BsgC/BACE1和BsgE/BACE1的显著摄入。
尽管抗-BsgA/BACE1和抗-BsgB/BACE1具有相似的单价结合亲和力，但是二价(单特异性)Bsg抗体在示踪和治疗剂量给药两种方案中在脑摄入的程度方面不同(图4C和4D)。基于竞争数据，这些抗体结合不同的表位，其可能在Bsg运输和BBB转运方面起作用，并且解释在脑摄入方面观察到的差异。为了确定表现出与细胞膜非特异性结合的任一种抗体是否能够有助于靶标-不依赖性的组织摄入，使用ELISA测定确定与杆状病毒(BV)颗粒的脱靶结合(Hotzel等人，MAbs.2012年11-12月；4(6)：753-60)。抗-BsgB具有在正常范围内的BV得分，如抗-BsgC、抗-BsgD和抗-BsgE一样，而抗-BsgA表现出高BV颗粒结合。此外，与抗-BsgB相比，观察到二价和双特异性抗-BsgA二者更快速的清除(图4E和4I)。
F.针对Glut1的抗体的脑摄入
本实施例描述作为单价和双特异性抗体的抗-Glut抗体在BBB的摄入的表征。
尽管多通受体不常考虑用于RMT，但是葡萄糖转运蛋白Glut1在BBB的高度富集和蛋白表达(见图3B和3D)值得将该质膜蛋白评价为潜在的转运靶标。通过用hGlutl cDNA免疫产生针对Glut1的单克隆抗体。使用瞬时表达鼠Glut1的HEK293细胞，通过流式细胞术证实阳性抗原结合(图5A)。
为了确定该抗体在体内是否结合Glut1，对野生型小鼠静脉内注射5mg/kg的抗-Glut1。剂量给药后1小时的小鼠皮质组织的免疫组织化学染色揭示抗-Glut1的血管定位(图5B)。
接着，通过示踪和治疗剂量给药方案二者研究抗-Glut1是否能够被吸收到脑中。对野生型小鼠静脉内注射单一放射标记示踪剂量的I125-对照IgG或I125-抗-Glut1。在剂量给药后所有时间点，与I125-对照IgG相比，在脑中观察到I125-抗-Glut1的显著增加(图5C)。由于在示踪剂量给药研究中，I125-抗-Glut1的脑浓度似乎是随时间稳定增加，决定延长治疗剂量给药研究的时程，以包括2和4天的剂量给药后时间点。当以20mg/kg剂量给药时，在剂量给药后1和2天，抗-Glut1的脑浓度与抗-TfRA相当，但是在剂量给药后4天，达到高得多的脑浓度(图5D)。在使用20mg/kg抗-Glut1剂量的相似的实验中，在两个时间点，抗-Glut1的脑浓度比对照IgG高～1.5-3倍，并且与抗-TfRA相当(图5K和图5L)。
在示踪和治疗剂量给药两个方案中，与抗-TfRA相比，在脑中的抗-Glut1摄入的药物代谢动力学中，观察到显著的差异。尽管抗-TfRA的浓度在剂量给药后几个小时(以示踪剂量，见图1C和图2C)或约1天(以治疗剂量)达到峰值，而抗-Glut1的脑浓度随着时间增加(图5C和5D)。这至少部分归因于抗-Glut1较抗-TfRA在外周中低得多的清除速率(图5E)，并且与周围组织相比，与在BBB的Glut1表达富集一致(图3C)。总之，这些数据表明，在系统注射后，不仅存在显著的抗-Glut1脑摄入，而且其也具有理想的药物代谢动力学特征。
为了确定抗-Glut1是否穿过BBB被转运到脑实质中，产生双特异性抗-Glut1/BACE1抗体。在单价/双特异性抗-Glut1/BACE1抗体中，Glut1结合亲和力显著减小，如通过流式细胞术测定的(图5F)。由于单价抗-Glut1表现出与对照IgG相似的周围药物代谢动力学(图5E)，使用双特异性抗体进行更广泛的PK/PD研究。
对野生型小鼠静脉内注射单次50mg/kg剂量的对照IgG或抗-Glut1/BACE1，并且在剂量给药后1，2，4和7天确定脑和血浆中的抗体浓度。与对照IgG相比，抗-Glut1/BACE1表现出相当的药物代谢动力学，与使用二价抗体观察到的相似(图5G)。在剂量给药后所有时间点观察到抗-Glut1/BACE1的脑摄入的适度增加(图5H)。
与脑中抗体积聚的有限程度相一致，观察到Aβ的少量减少(图5I)。抗-BACE1臂的完全功能通过血浆Aβ的显著减少得到证实(图5J)。总之，这些数据提供证明表明二价抗-Glut1能够穿过BBB并且在脑中显著积聚。
G.针对CD98hc的抗体的脑摄入
本实施例描述作为二价(单特异性)和作为双特异性抗体的抗-CD98hc抗体在BBB的摄入的表征。
来自蛋白质组数据集的最高的单通跨膜蛋白击中之一是溶质载体CD98hc。为了确定CD98hc在BBB的高表达是否能够允许大分子转运，产生两种CD98hc抗体(抗-CD98hcA和抗-CD98hcB)。
使用稳定表达鼠CD98hc的HEK293细胞进行流式细胞术分析证实两种抗体结合鼠CD98hc(图6A)。5mg/kg抗-CD98hcA和抗-CD98hcB的静脉内注射导致小鼠脑组织中明显的血管染色(图6B)。CD98hc抗体的结合亲和力显示在图9中。
接着，研究这些抗体是否能够被吸收到脑中。对野生型小鼠静脉内注射单次放射标记示踪剂量的I125-对照IgG，I125-抗-TfRA，I125-抗-CD98hcA，或I125-抗-CD98hcB。与对照IgG和I125-抗-TfRA相比，对于I125-抗-CD98hcA和I125-抗-CD98hcB二者，观察到显著更高的脑水平(图6C)。显著地，示踪剂量的I125-抗-CD98hc的脑摄入程度比峰值浓度的I125-抗-TfRA高～4-5倍。当以20mg/kg的治疗剂量施用时，在剂量给药后24小时，对于抗-CD98hcA和抗-CD98hcB二者还观察到显著的脑摄入，这与使用抗-TfRA观察到的相当(图6D)。
抗体的血浆浓度表明，在剂量给药后24小时，增加的抗-CD98hcA清除，和适度的抗-CD98hcB清除(图6E)。似乎靶标-不依赖性的清除对更快速的清除没有帮助，如通过杆状病毒颗粒结合评估的，但是相反，可能是由于CD98hc在周围细胞上的表达(参见，Parmacek等人，Nucleic Acids Res.1989年3月11日；17(5)：1915-31；Nakamura等人，J BiolChem.1999年1月29日；274(5)：3009-16)。
在这三种RMT候选物(CD98hc，Glut1和Bsg)中，CD98hc抗体的系统注射显示最高的脑浓度。在剂量给药后24小时，抗-CD98hcA和抗-CD98hcB的脑浓度分别比对照IgG高～9和11-倍(图6D和6L)。此外，在24小时，抗-CD98hcA的脑水平显著高于抗-TfRA的脑水平。尽管所有三种RMT候选物通过示踪和治疗剂量给药表现出脑摄入，但是这些体内研究揭示，基于在示踪和治疗剂量给药两个方案中得到的更高的脑浓度，相对于Bsg和Glut1，CD98hc是最强的RMT候选物。
为了进一步证实剂量给药的抗体确实穿过BBB并且透入实质，通过ELISA评估在脑匀浆物微血管消耗后在实质部分中剩余的抗体量。与对照抗体相比，对于所有三种靶标清楚地检测到剂量给药的抗体，这表明存在显著的抗体穿过BBB的流通，所述抗体结合实质分离物(图8)。与失踪和治疗剂量研究相一致，在实质部分中的抗-CD98hc抗体表现出最高的脑浓度(图8)。抗-Glut1的最低程度的摄入可能是Glut1(Slc2a1)在脑内皮中的特异性表达的结果。与也在小胶质细胞和星形角质细胞中表达的CD98hc(Slc3a2)不同，消耗微血管的流程可能不允许准确定量在没有抗原表达的实质部分中剩余的抗体。然而，由于多线证据表明在脑中的最强的摄入，选择针对CD98hc的抗体作为双特异性抗体用于进一步的体内验证。
H.产生双特异性抗-CD98hc/BACE1抗体
本实施例描述结合CD98hc和BACE1的双特异性抗体的产生和表征。
为了确定抗-CD98hc是否穿过BBB转运到脑实质中，产生两种双特异性抗-CD98hc/BACE1抗体。所述双特异性抗体在一个臂上结合CD98hc并且在另一个臂上结合淀粉样蛋白前体蛋白(APP)切割酶β-分泌酶(BACE1)。BACE1是这样的一种酶：认为其是在阿尔茨海默病患者脑中发现的脑β-淀粉样蛋白(Aβ)的主要产生剂。已经设计了针对BACE1的抗体，以抑制酶活性并且由此减少Aβ产生(Atwal等人，2011)。然而，该抗体具有差的BBB穿透，并且因此在减少脑Aβ方面是无效的，除非其以非常高的浓度给药，或者与抗-TfR配对成为双特异性抗体。将抗-CD98hcA和抗-CD98hcB二者重新格式化成为双特异性抗体，以允许通过测量脑Aβ水平而直接药效学测量脑中的抗体积聚(作为CD98hc-介导的穿过BBB进入实质的转运的结果)。通过竞争性ELISA确定针对二价抗-CD98hc和双特异性抗-CD98hc/BACE1抗体的亲和力。在单价(即，双特异性)形式，观察到抗-CD98hcA结合亲和力的适度损失，而对于抗-CD98hcB观察到亲和力的增显著的上升(图6F)。尽管抗-CD98hcA的亲和力仅减少～2-倍，但是抗-CD98hcB的亲和力减少～100-倍，这表明抗体亲抗原性在该特定抗体的二价结合中起重要作用。放射标记示踪剂量给药显示，与对照IgG和抗-TfRA/BACE1相比，在剂量给药后1小时，抗-CD98hcA/BACE1显著更高的峰值脑摄入(图6K，P＜0.0001)。与对照IgG相比，较低亲和力抗-CD98hcB/BACE1表现出增加的脑摄入，但是低于抗-CD98hcA/BACE1的脑摄入，这可能是由于作为双特异性抗体对CD98hc的结合亲和力的实质性减少所致。为了确定抗-CD98hc/BACE1脑摄入和药效学反应的程度和持续时间，在野生型小鼠中施用对照IgG或抗-CD98hc/BACE1的单次50mg/kg的静脉内注射。由于靶标-介导的清除，与较低亲和力的抗-CD98B/BACE1相比，在血浆中，较高亲和力的抗-CD98hcA/BACE1的药物代谢动力学更快速(图6G和图6O)。
在脑中，在剂量给药后1，2和4天，与对照IgG相比，两种CD98hc/BACE1抗体的摄入显著增加(图6H和图6P)。在剂量给药后7天，较低亲和力的抗-CD98hcB/BACE1的脑浓度保持升高，而较高亲和力的抗-CD98hcA/BACE1的脑浓度与对照IgG相当，这可能是由于在周围组织中的暴露损失所致。总之，与较高亲和力的抗-CD98hcA/BACE1相比，较低亲和力的抗-CD98hcB/BACE1随时间产生更好的周围和脑暴露(图6G和6H)。有趣的是，在抗体亲和力与脑暴露持续时间之间的这种反向关系之前也对抗-TfR/BACE1抗体观察到(Couch等人，2013，同前所述)。在剂量给药后1天，两种CD98hc/BACE1双特异性抗体显著减少Aβ水平，在使用抗-CD98hcB/BACE1治疗的剂量给药后4天，其保持减少(图6I)，这指示这些抗体成功的转运到脑实质中(还参见图6M和图6N)。在所有时间点，血浆Aβ保持显著减少(图6J)。总之，这些数据提供了强证据表明CD98hc作为用于抗体治疗剂穿过BBB摄入的新型RMT靶标。
还进行了体内两质子显微镜检，以实时显现荧光标记的CD98hc/BACE1双特异性变体在治疗剂量给药的小鼠的实质和皮质下脉管系统中的运输。与用对照IgG和抗-CD98hcB/BACE1剂量给药的小鼠相比，检测到抗-CD98hcA/BACE1血管清除的独特的差异，如通过较高亲和力变体的更快速的血浆药物动力学预测的。另外，到48小时观察到在用荧光标记的抗-CD98hcB/BACE1剂量给药的小鼠的实质中更大的传播信号，以及较少程度的抗-CD98hcA/BACE1，这表明增加的抗体穿过BBB。
I.抗体治疗没有改变内源性CD98hc表达和功能
本实施例证明CD98hc是能够递送抗体治疗剂穿过BBB而不扰乱CD98hc生物学的新型高能力RMT途径。
对原代小鼠脑内皮细胞的免疫细胞化学显示大部分CD98hc定位在质膜上，一些与小窝蛋白1-和EEA1-阳性穿孔共同定位(图10)。非常少的穿孔与TfR(其为再循环内体的标记)共同定位。之前观察到针对TfR的抗体以亲和力依赖性方式驱动TfR的溶酶体降解，在体外和体内都导致减少的TfR水平。因此，检验用对照抗体或抗-CD98hc双特异性变体处理的IMCD3细胞(形成屏障的小鼠肾上皮，具有均一的CD98hc表达水平)中的内源性CD98hc水平。用增加浓度的抗-CD98hc双特异性抗体温育不改变CD98hc的表达水平或稳定性(图7A和7B)。并且，还检验抗体处理是否诱导CD98hc亚细胞定位的变化。与蛋白质印迹结果一致，大部分CD98hc保留在质膜上，并且没有观察到增加的CD98hc向Lamp1-阳性的溶酶体的运输(图7C和7D)。并且，在1-7天之间，CD98hc双特异性亲和力变体都不影响来自用50mg/kg的抗-CD98hc/BACE1剂量给药的小鼠的脑裂解物中总脑CD98hc表达(图7E-7I)。
还评价了在存在或不存在所述抗-CD98hc抗体的条件下的CD98hc氨基酸转运水平。作为阳性对照，观察通过系统-L-特异性底物BCH(2-氨基-2-降莰烷-羧酸)的转运抑制。使用抗-CD98hc抗体处理，没有观察到抑制(图7J)。总之，这些数据表明，CD98hc是能够递送抗体治疗剂穿过BBB而不扰乱CD98hc生物学的新型高能力RMT途径。在所有时间点，血浆Aβ保持显著减少(图7J)。
下述表格提供本文中引用的序列。
尽管为了清楚理解的目的，前述发明已经通过举例说明和实施例非方式详细地进行了描述，但是所述描述和实施例不应该解释为限制本发明非范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完全结合在本文中。
序列表
<110> 健泰科生物技术公司等
<120> 血脑屏障受体抗体及使用方法
<130> P32473-WO
<140>
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<150> 62/251,983
<151> 2015-11-06
<150> 62/090,295
<151> 2014-12-10
<160> 114
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 52
Asp Ala Ser Ser Leu Gln Val
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 53
Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 54
Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Tyr Met
1 5
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 55
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 56
Ala Arg Ser Leu Ile Asn Tyr Arg Asn Tyr Gly Asp Tyr Val Met Asp
1 5 10 15
Ala
<210> 57
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys
20
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 58
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 59
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 60
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 62
Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 63
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Leu Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
20 25 30
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 64
Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 65
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 65
Gln Phe Thr Leu Thr Gln Pro Lys Ser Val Ser Gly Ser Leu Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ile Thr Ile Pro Cys Glu Arg Ser Ser Gly Asp Ile Gly His Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Leu Gly Arg Pro Pro Ile Asn Val
35 40 45
Ile Tyr Ala Asp Asp Gln Arg Pro Ser Glu Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Asn Val Asp Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 66
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 66
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ser
20 25 30
Ser Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Trp Ser Lys Gly Gly Thr Glu Tyr Asn Ser Pro Ile Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Gly Val Tyr His Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 67
Glu Arg Ser Ser Gly Asp Ile Gly His Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 68
Ala Asp Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 69
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Val Asp Ile Val
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 70
Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 71
Gly Ile Trp Ser Lys Gly Gly Thr Glu Tyr Asn Ser Pro Ile Lys Ser
1 5 10 15
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 72
Ala Arg Asn Gly Val Tyr His Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 73
Gln Phe Thr Leu Thr Gln Pro Lys Ser Val Ser Gly Ser Leu Arg Ser
1 5 10 15
Thr Ile Thr Ile Pro Cys
20
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 74
Trp Tyr Gln Gln His Leu Gly Arg Pro Pro Ile Asn Val Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 75
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 75
Glu Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser
1 5 10 15
Ala Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Gln Met Asp Asp Glu Ala Asp Tyr
20 25 30
Phe Cys
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 76
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
1 5 10
<210> 77
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 77
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser
20 25
<210> 78
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 78
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 79
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 79
Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Ile Phe Leu Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 80
Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 81
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Leu His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Gly Trp Phe Leu Arg Ile Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 83
His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 84
Lys Ala Ser Asn Leu His Ser
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 85
Gln Gln Gly Gln Thr Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 86
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Leu His
1 5 10
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 87
Glu Ile His Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 88
Ala Lys Glu Gly Gly Trp Phe Leu Arg Ile Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 89
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 89
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys
20
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 90
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 91
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 92
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 94
Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 95
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
多肽"
<400> 95
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Pro Ser Ser Thr Ala Tyr Val Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列说明: 合成的
肽"
<400> 96
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 97
<211> 621
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 97
Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asp Asp Ser Glu Thr Gly Ser Asp Cys Val Thr Gln Ala Gly
35 40 45
Leu Gln Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Ala Leu Ala Ser Lys Asn
50 55 60
Ala Glu Val Thr Val Glu Thr Gly Phe His His Val Ser Gln Ala Asp
65 70 75 80
Ile Glu Phe Leu Thr Ser Ile Asp Pro Thr Ala Ser Ala Ser Gly Ser
85 90 95
Ala Gly Ile Thr Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys
100 105 110
Glu Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala
115 120 125
Ala Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu
130 135 140
Val Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Lys Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser
165 170 175
Pro Gly Trp Val Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val
180 185 190
Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys
195 200 205
Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe
210 215 220
Gln Gly His Gly Ala Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His
245 250 255
Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp
260 265 270
Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala
275 280 285
Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg
290 295 300
Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys
305 310 315 320
Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe
325 330 335
Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala
340 345 350
Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile
355 360 365
Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu
370 375 380
Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly
385 390 395 400
Ser Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala
405 410 415
Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu
420 425 430
Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu
435 440 445
Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly
450 455 460
Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met
465 470 475 480
Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala
485 490 495
Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser
500 505 510
Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu
515 520 525
His Gly Asp Phe His Ala Phe Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr
530 535 540
Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe
545 550 555 560
Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala
565 570 575
Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro
580 585 590
Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu
595 600 605
Pro His Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
610 615 620
<210> 98
<211> 2350
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
agttccaggg aaggagggcg tagacaaagc gccacctgaa cttgcggcgc gaaaaaggcg 60
cgcatgcgtc ctacgggagc gtgctggctc accgaccgca ttgcggcttg gttttctcac 120
ccagtgcatg tggcaggagc ggtgagatca ctgcctcacg gcgatcctgg actgacggtc 180
acgactgcct accctctaac cctgttctga gctgcccctt gcccacacac cccaaacctg 240
tgtgcaggat ccgcctccat ggagctacag cctcctgaag cctcgatcgc cgtcgtgtcg 300
attccgcgcc agttgcctgg ctcacattcg gaggctggtg tccagggtct cagcgcgggg 360
gacgactcag agacggggtc tgactgtgtt acccaggctg gtcttcaact cttggcctca 420
agtgatcctc ctgccttagc ttccaagaat gctgaggtta cagtagaaac ggggtttcac 480
catgttagcc aggctgatat tgaattcctg acctcaattg atccgactgc ctcggcctcc 540
ggaagtgctg ggattacagg caccatgagc caggacaccg aggtggatat gaaggaggtg 600
gagctgaatg agttagagcc cgagaagcag ccgatgaacg cggcgtctgg ggcggccatg 660
tccctggcgg gagccgagaa gaatggtctg gtgaagatca aggtggcgga agacgaggcg 720
gaggcggcag ccgcggctaa gttcacgggc ctgtccaagg aggagctgct gaaggtggca 780
ggcagccccg gctgggtacg cacccgctgg gcactgctgc tgctcttctg gctcggctgg 840
ctcggcatgc ttgctggtgc cgtggtcata atcgtgcgag cgccgcgttg tcgcgagcta 900
ccggcgcaga agtggtggca cacgggcgcc ctctaccgca tcggcgacct tcaggccttc 960
cagggccacg gcgcgggcaa cctggcgggt ctgaaggggc gtctcgatta cctgagctct 1020
ctgaaggtga agggccttgt gctgggtcca attcacaaga accagaagga tgatgtcgct 1080
cagactgact tgctgcagat cgaccccaat tttggctcca aggaagattt tgacagtctc 1140
ttgcaatcgg ctaaaaaaaa gagcatccgt gtcattctgg accttactcc caactaccgg 1200
ggtgagaact cgtggttctc cactcaggtt gacactgtgg ccaccaaggt gaaggatgct 1260
ctggagtttt ggctgcaagc tggcgtggat gggttccagg ttcgggacat agagaatctg 1320
aaggatgcat cctcattctt ggctgagtgg caaaatatca ccaagggctt cagtgaagac 1380
aggctcttga ttgcggggac taactcctcc gaccttcagc agatcctgag cctactcgaa 1440
tccaacaaag acttgctgtt gactagctca tacctgtctg attctggttc tactggggag 1500
catacaaaat ccctagtcac acagtatttg aatgccactg gcaatcgctg gtgcagctgg 1560
agtttgtctc aggcaaggct cctgacttcc ttcttgccgg ctcaacttct ccgactctac 1620
cagctgatgc tcttcaccct gccagggacc cctgttttca gctacgggga tgagattggc 1680
ctggatgcag ctgcccttcc tggacagcct atggaggctc cagtcatgct gtgggatgag 1740
tccagcttcc ctgacatccc aggggctgta agtgccaaca tgactgtgaa gggccagagt 1800
gaagaccctg gctccctcct ttccttgttc cggcggctga gtgaccagcg gagtaaggag 1860
cgctccctac tgcatgggga cttccacgcg ttctccgctg ggcctggact cttctcctat 1920
atccgccact gggaccagaa tgagcgtttt ctggtagtgc ttaactttgg ggatgtgggc 1980
ctctcggctg gactgcaggc ctccgacctg cctgccagcg ccagcctgcc agccaaggct 2040
gacctcctgc tcagcaccca gccaggccgt gaggagggct cccctcttga gctggaacgc 2100
ctgaaactgg agcctcacga agggctgctg ctccgcttcc cctacgcggc ctgacttcag 2160
cctgacatgg acccactacc cttctccttt ccttcccagg ccctttggct tctgattttt 2220
ctctttttta aaaacaaaca aacaaactgt tgcagattat gagtgaaccc ccaaataggg 2280
tgttttctgc cttcaaataa aagtcacccc tgcatggtga agtcttccct ctgcttctct 2340
cataaaaaaa 2350
<210> 99
<211> 630
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asp Asp Ser Glu Leu Gly Ser His Cys Val Ala Gln Thr Gly
35 40 45
Leu Glu Leu Leu Ala Ser Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Glu Met Ile Glu Thr Gly Ser Asp Cys Val Thr Gln Ala Gly Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Ala Leu Ala Ser Lys Asn Ala
85 90 95
Glu Val Thr Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu
100 105 110
Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala
115 120 125
Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val
130 135 140
Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro
165 170 175
Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly
180 185 190
Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro
195 200 205
Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu
210 215 220
Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val
245 250 255
Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val
260 265 270
Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu
275 280 285
Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val
290 295 300
Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser
305 310 315 320
Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe
325 330 335
Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn
340 345 350
Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys
355 360 365
Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu
385 390 395 400
Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys
405 410 415
Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser
420 425 430
Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln
435 440 445
Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro
450 455 460
Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro
465 470 475 480
Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe
485 490 495
Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln
500 505 510
Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp
515 520 525
Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe
530 535 540
Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn
545 550 555 560
Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala
565 570 575
Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys
580 585 590
Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro
595 600 605
Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu
610 615 620
Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
625 630
<210> 100
<211> 2347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
agttccaggg aaggagggcg tagacaaagc gccacctgaa cttgcggcgc gaaaaaggcg 60
cgcatgcgtc ctacgggagc gtgctggctc accgaccgca ttgcggcttg gttttctcac 120
ccagtgcatg tggcaggagc ggtgagatca ctgcctcacg gcgatcctgg actgacggtc 180
acgactgcct accctctaac cctgttctga gctgcccctt gcccacacac cccaaacctg 240
tgtgcaggat ccgcctccat ggagctacag cctcctgaag cctcgatcgc cgtcgtgtcg 300
attccgcgcc agttgcctgg ctcacattcg gaggctggtg tccagggtct cagcgcgggg 360
gacgactcag agttggggtc tcactgtgtt gcccagactg gtctcgaact cttggcctca 420
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gttacccagg ctggtcttca actcttggcc tcaagtgatc ctcctgcctt agcttccaag 540
aatgctgagg ttacaggcac catgagccag gacaccgagg tggatatgaa ggaggtggag 600
ctgaatgagt tagagcccga gaagcagccg atgaacgcgg cgtctggggc ggccatgtcc 660
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gcggcagccg cggctaagtt cacgggcctg tccaaggagg agctgctgaa ggtggcaggc 780
agccccggct gggtacgcac ccgctgggca ctgctgctgc tcttctggct cggctggctc 840
ggcatgcttg ctggtgccgt ggtcataatc gtgcgagcgc cgcgttgtcg cgagctaccg 900
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ttgtctcagg caaggctcct gacttccttc ttgccggctc aacttctccg actctaccag 1620
ctgatgctct tcaccctgcc agggacccct gttttcagct acggggatga gattggcctg 1680
gatgcagctg cccttcctgg acagcctatg gaggctccag tcatgctgtg ggatgagtcc 1740
agcttccctg acatcccagg ggctgtaagt gccaacatga ctgtgaaggg ccagagtgaa 1800
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tttctgcctt caaataaaag tcacccctgc atggtgaagt cttccctctg cttctctcat 2340
aaaaaaa 2347
<210> 101
<211> 568
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asp Asp Ser Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met
35 40 45
Lys Glu Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn
50 55 60
Ala Ala Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly
65 70 75 80
Leu Val Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly
100 105 110
Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp
115 120 125
Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg
130 135 140
Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly
145 150 155 160
Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala
165 170 175
Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu
180 185 190
Lys Val Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp
195 200 205
Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser
210 215 220
Lys Glu Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile
225 230 235 240
Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp
245 250 255
Phe Ser Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu
260 265 270
Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile
275 280 285
Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile
290 295 300
Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser
305 310 315 320
Ser Asp Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu
325 330 335
Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His
340 345 350
Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp
355 360 365
Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro
370 375 380
Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly
385 390 395 400
Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala
405 410 415
Leu Pro Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser
420 425 430
Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys
435 440 445
Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu
450 455 460
Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His
465 470 475 480
Ala Phe Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp
485 490 495
Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu
500 505 510
Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro
515 520 525
Ala Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly
530 535 540
Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu
545 550 555 560
Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
565
<210> 102
<211> 2161
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
agttccaggg aaggagggcg tagacaaagc gccacctgaa cttgcggcgc gaaaaaggcg 60
cgcatgcgtc ctacgggagc gtgctggctc accgaccgca ttgcggcttg gttttctcac 120
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tgtgcaggat ccgcctccat ggagctacag cctcctgaag cctcgatcgc cgtcgtgtcg 300
attccgcgcc agttgcctgg ctcacattcg gaggctggtg tccagggtct cagcgcgggg 360
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ggagccgaga agaatggtct ggtgaagatc aaggtggcgg aagacgaggc ggaggcggca 540
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tcgtggttct ccactcaggt tgacactgtg gccaccaagg tgaaggatgc tctggagttt 1080
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tccctagtca cacagtattt gaatgccact ggcaatcgct ggtgcagctg gagtttgtct 1380
caggcaaggc tcctgacttc cttcttgccg gctcaacttc tccgactcta ccagctgatg 1440
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gacccactac ccttctcctt tccttcccag gccctttggc ttctgatttt tctctttttt 2040
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ccttcaaata aaagtcaccc ctgcatggtg aagtcttccc tctgcttctc tcataaaaaa 2160
a 2161
<210> 103
<211> 529
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu Val Glu Leu Asn Glu
1 5 10 15
Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala Ser Gly Ala Ala Met
20 25 30
Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala
35 40 45
Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser
50 55 60
Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr
65 70 75 80
Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu
85 90 95
Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu
100 105 110
Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp
115 120 125
Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys
130 135 140
Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu
145 150 155 160
Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu
165 170 175
Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Ser Leu
180 185 190
Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr
195 200 205
Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Thr
210 215 220
Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly
225 230 235 240
Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser
245 250 255
Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp
260 265 270
Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Leu
275 280 285
Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu
290 295 300
Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln
305 310 315 320
Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln
325 330 335
Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr
340 345 350
Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly
355 360 365
Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Met Glu
370 375 380
Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly
385 390 395 400
Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly
405 410 415
Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu
420 425 430
Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe Ser Ala Gly Pro Gly
435 440 445
Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val
450 455 460
Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser
465 470 475 480
Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys Ala Asp Leu Leu Leu
485 490 495
Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro Leu Glu Leu Glu Arg
500 505 510
Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu Arg Phe Pro Tyr Ala
515 520 525
Ala
<210> 104
<211> 1938
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
cagaggccgc gcctgctgct gagcagatgc agtagccgaa actgcgcgga ggcacagagg 60
ccggggagag cgttctgggt ccgagggtcc aggtaggggt tgagccacca tctgaccgca 120
agctgcgtcg tgtcgccggt tctgcaggca ccatgagcca ggacaccgag gtggatatga 180
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cggccatgtc cctggcggga gccgagaaga atggtctggt gaagatcaag gtggcggaag 300
acgaggcgga ggcggcagcc gcggctaagt tcacgggcct gtccaaggag gagctgctga 360
aggtggcagg cagccccggc tgggtacgca cccgctgggc actgctgctg ctcttctggc 420
tcggctggct cggcatgctt gctggtgccg tggtcataat cgtgcgagcg ccgcgttgtc 480
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aggccttcca gggccacggc gcgggcaacc tggcgggtct gaaggggcgt ctcgattacc 600
tgagctctct gaaggtgaag ggccttgtgc tgggtccaat tcacaagaac cagaaggatg 660
atgtcgctca gactgacttg ctgcagatcg accccaattt tggctccaag gaagattttg 720
acagtctctt gcaatcggct aaaaaaaaga gcatccgtgt cattctggac cttactccca 780
actaccgggg tgagaactcg tggttctcca ctcaggttga cactgtggcc accaaggtga 840
aggatgctct ggagttttgg ctgcaagctg gcgtggatgg gttccaggtt cgggacatag 900
agaatctgaa ggatgcatcc tcattcttgg ctgagtggca aaatatcacc aagggcttca 960
gtgaagacag gctcttgatt gcggggacta actcctccga ccttcagcag atcctgagcc 1020
tactcgaatc caacaaagac ttgctgttga ctagctcata cctgtctgat tctggttcta 1080
ctggggagca tacaaaatcc ctagtcacac agtatttgaa tgccactggc aatcgctggt 1140
gcagctggag tttgtctcag gcaaggctcc tgacttcctt cttgccggct caacttctcc 1200
gactctacca gctgatgctc ttcaccctgc cagggacccc tgttttcagc tacggggatg 1260
agattggcct ggatgcagct gcccttcctg gacagcctat ggaggctcca gtcatgctgt 1320
gggatgagtc cagcttccct gacatcccag gggctgtaag tgccaacatg actgtgaagg 1380
gccagagtga agaccctggc tccctccttt ccttgttccg gcggctgagt gaccagcgga 1440
gtaaggagcg ctccctactg catggggact tccacgcgtt ctccgctggg cctggactct 1500
tctcctatat ccgccactgg gaccagaatg agcgttttct ggtagtgctt aactttgggg 1560
atgtgggcct ctcggctgga ctgcaggcct ccgacctgcc tgccagcgcc agcctgccag 1620
ccaaggctga cctcctgctc agcacccagc caggccgtga ggagggctcc cctcttgagc 1680
tggaacgcct gaaactggag cctcacgaag ggctgctgct ccgcttcccc tacgcggcct 1740
gacttcagcc tgacatggac ccactaccct tctcctttcc ttcccaggcc ctttggcttc 1800
tgatttttct cttttttaaa aacaaacaaa caaactgttg cagattatga gtgaaccccc 1860
aaatagggtg ttttctgcct tcaaataaaa gtcacccctg catggtgaag tcttccctct 1920
gcttctctca taaaaaaa 1938
<210> 105
<211> 565
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 105
Met Asp Pro Glu Pro Thr Glu His Ser Thr Asp Gly Val Ser Val Pro
1 5 10 15
Arg Gln Pro Pro Ser Ala Gln Thr Gly Leu Asp Val Gln Val Val Ser
20 25 30
Ala Ala Gly Asp Ser Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met
35 40 45
Lys Asp Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn
50 55 60
Ala Ala Asp Gly Ala Ala Ala Gly Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile
65 70 75 80
Lys Val Ala Glu Asp Glu Thr Glu Ala Gly Val Lys Phe Thr Gly Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg
100 105 110
Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met
115 120 125
Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu
130 135 140
Leu Pro Val Gln Arg Trp Trp His Lys Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly
145 150 155 160
Asp Leu Gln Ala Phe Val Gly Arg Asp Ala Gly Gly Ile Ala Gly Leu
165 170 175
Lys Ser His Leu Glu Tyr Leu Ser Thr Leu Lys Val Lys Gly Leu Val
180 185 190
Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Glu Ile Asn Glu Thr Asp
195 200 205
Leu Lys Gln Ile Asn Pro Thr Leu Gly Ser Gln Glu Asp Phe Lys Asp
210 215 220
Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile His Ile Ile Leu Asp Leu
225 230 235 240
Thr Pro Asn Tyr Gln Gly Gln Asn Ala Trp Phe Leu Pro Ala Gln Ala
245 250 255
Asp Ile Val Ala Thr Lys Met Lys Glu Ala Leu Ser Ser Trp Leu Gln
260 265 270
Asp Gly Val Asp Gly Phe Gln Phe Arg Asp Val Gly Lys Leu Met Asn
275 280 285
Ala Pro Leu Tyr Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys Asn Leu Ser
290 295 300
Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Glu Ser Ser Asp Leu Gln Gln
305 310 315 320
Ile Val Asn Ile Leu Glu Ser Thr Ser Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser
325 330 335
Tyr Leu Ser Asn Ser Thr Phe Thr Gly Glu Arg Thr Glu Ser Leu Val
340 345 350
Thr Arg Phe Leu Asn Ala Thr Gly Ser Gln Trp Cys Ser Trp Ser Val
355 360 365
Ser Gln Ala Gly Leu Leu Ala Asp Phe Ile Pro Asp His Leu Leu Arg
370 375 380
Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser
385 390 395 400
Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Leu Gln Gly Ala Leu Pro Gly Gln Pro Ala
405 410 415
Lys Ala Pro Leu Met Pro Trp Asn Glu Ser Ser Ile Phe His Ile Pro
420 425 430
Arg Pro Val Ser Leu Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Asn Glu Asp Pro
435 440 445
Gly Ser Leu Leu Thr Gln Phe Arg Arg Leu Ser Asp Leu Arg Gly Lys
450 455 460
Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Leu Ser Ser Ser Pro
465 470 475 480
Asp Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Tyr Leu
485 490 495
Val Val Leu Asn Phe Arg Asp Ser Gly Arg Ser Ala Arg Leu Gly Ala
500 505 510
Ser Asn Leu Pro Ala Gly Ile Ser Leu Pro Ala Ser Ala Lys Leu Leu
515 520 525
Leu Ser Thr Asp Ser Ala Arg Gln Ser Arg Glu Glu Asp Thr Ser Leu
530 535 540
Lys Leu Glu Asn Leu Ser Leu Asn Pro Tyr Glu Gly Leu Leu Leu Gln
545 550 555 560
Phe Pro Phe Val Ala
565
<210> 106
<211> 2813
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 106
gtgggtagag gaatccgccc aaaggggcgt gcggagagct ccgcctctga ttttgcagcg 60
cgaaaaagag gcgcaggcgc tttaggggag tgcgacgcta cgcctttggc gctgcggcta 120
ggcggttctt actcactgcg ggtaaaacgt catcgctgga gattttggtt cgcgacccat 180
acagctcgac tgtctgggtc acaactacca atatccatac gttgaggcga tttctcaccc 240
tcactcacgc taagccgcgt gttgatccat ctctatggat cctgaaccta ctgaacactc 300
caccgacggt gtctcggttc cccgccagcc gcccagcgcg cagacggggc ttgatgtcca 360
ggttgtcagc gcagcgggcg actcaggcac catgagccag gacaccgaag tggacatgaa 420
agatgtggag ctgaacgagc tagaaccgga gaagcagccc atgaatgcag cggacggggc 480
ggcggccggg gagaagaacg gtctggtgaa gatcaaggtg gcggaggacg agacggaggc 540
cggggtcaag ttcaccggct tatccaagga ggagctactg aaggtagcgg gcagccctgg 600
ctgggtgcgc acccgctggg cgctgctgct gctcttctgg ctcggttggc tgggcatgct 660
ggcgggcgcc gtggttatca tcgttcgggc gccgcgctgc cgtgagctgc ctgtacagag 720
gtggtggcac aagggcgccc tctaccgcat cggcgacctt caggcctttg taggccggga 780
tgcgggaggc atagctggtc tgaagagcca tctggagtac ttgagcaccc tgaaggtgaa 840
gggcctggtg ttaggcccaa ttcacaagaa ccagaaggat gaaatcaatg aaaccgacct 900
gaaacagatt aatcccactt tgggctccca ggaagatttt aaagaccttc tacaaagtgc 960
caagaaaaag agcattcaca tcattttgga cctcactccc aactaccagg gccagaatgc 1020
gtggttcctc cctgctcagg ctgacattgt agccaccaaa atgaaggaag ctctgagttc 1080
ttggttgcag gacggtgtgg atggtttcca attccgggat gtgggaaagc tgatgaatgc 1140
acccttgtac ttggctgagt ggcagaatat caccaagaac ttaagtgagg acaggctttt 1200
gattgcaggg actgagtcct ctgacctgca gcaaattgtc aacatacttg aatccaccag 1260
cgacctgctg ttgaccagct cctacctgtc aaattccact ttcactgggg agcgtactga 1320
atccctagtc actaggtttt tgaatgccac tggcagccaa tggtgcagct ggagtgtgtc 1380
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tcacatccca agacctgtaa gcctcaacat gacagtgaag ggccagaatg aagaccctgg 1620
ctccctcctt acccagttcc ggcggctgag tgaccttcgg ggtaaggagc gctctctgtt 1680
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tagtaccgac agtgcccggc aaagccgtga ggaggacacc tccctgaagc tggaaaacct 1920
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atgcagaacc taccaccctc ctttgttctc cccaggcctt ttggattcta gtcttcctct 2040
ccttgttttt aaacttttgc agattacata cgaattctta tactgggtgt ttttgtcttc 2100
aaataaaaac atcacccctg cctcatgaga ttgtgacttt catccttcct tccttctaga 2160
agaactttct cttgctcctg atctcttttg ctcctccctg cccctgccat agtcgcagcc 2220
agttgtagac agctattcca gctctctttt tttttttttt tttttttttt tttttggttt 2280
ttcgagacag ggtttctctg tatagccctg gctgtcctgg aactcacttt gtagaccagg 2340
ctggcctcga actcagaaat ccacctgcct ctgcctccca agtgctggga ttaaaggcgt 2400
gcgccaccac gcccggccgc tattccagct cttaaattaa tcatttagag accaaggcta 2460
gagaagggcc cttccatggt taacagcaaa gtgtcttggc tggagtaacc acacctcctc 2520
gctctggccc aagaatcttg ggaattgcca actcttcctt atctctctta gcacagtctt 2580
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<210> 107
<211> 526
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 107
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1 5 10 15
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Gly Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Phe Trp Leu Gly Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile
85 90 95
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100 105 110
His Lys Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Val Gly
115 120 125
Arg Asp Ala Gly Gly Ile Ala Gly Leu Lys Ser His Leu Glu Tyr Leu
130 135 140
Ser Thr Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn
145 150 155 160
Gln Lys Asp Glu Ile Asn Glu Thr Asp Leu Lys Gln Ile Asn Pro Thr
165 170 175
Leu Gly Ser Gln Glu Asp Phe Lys Asp Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys
180 185 190
Lys Ser Ile His Ile Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Gln Gly Gln
195 200 205
Asn Ala Trp Phe Leu Pro Ala Gln Ala Asp Ile Val Ala Thr Lys Met
210 215 220
Lys Glu Ala Leu Ser Ser Trp Leu Gln Asp Gly Val Asp Gly Phe Gln
225 230 235 240
Phe Arg Asp Val Gly Lys Leu Met Asn Ala Pro Leu Tyr Leu Ala Glu
245 250 255
Trp Gln Asn Ile Thr Lys Asn Leu Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala
260 265 270
Gly Thr Glu Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Val Asn Ile Leu Glu Ser
275 280 285
Thr Ser Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Thr Gly Glu Arg Thr Glu Ser Leu Val Thr Arg Phe Leu Asn Ala Thr
305 310 315 320
Gly Ser Gln Trp Cys Ser Trp Ser Val Ser Gln Ala Gly Leu Leu Ala
325 330 335
Asp Phe Ile Pro Asp His Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Leu Leu Phe
340 345 350
Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Leu
355 360 365
Gln Gly Ala Leu Pro Gly Gln Pro Ala Lys Ala Pro Leu Met Pro Trp
370 375 380
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405 410 415
Arg Arg Leu Ser Asp Leu Arg Gly Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly
420 425 430
Asp Phe His Ala Leu Ser Ser Ser Pro Asp Leu Phe Ser Tyr Ile Arg
435 440 445
His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Tyr Leu Val Val Leu Asn Phe Arg Asp
450 455 460
Ser Gly Arg Ser Ala Arg Leu Gly Ala Ser Asn Leu Pro Ala Gly Ile
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Ser Leu Pro Ala Ser Ala Lys Leu Leu Leu Ser Thr Asp Ser Ala Arg
485 490 495
Gln Ser Arg Glu Glu Asp Thr Ser Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ser Leu
500 505 510
Asn Pro Tyr Glu Gly Leu Leu Leu Gln Phe Pro Phe Val Ala
515 520 525
<210> 108
<211> 2572
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 108
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acgggacgcc tctctgaacg gggatccagg caggattaga gctgcctcac tgactacagg 120
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ggggtcaagt tcaccggctt atccaaggag gagctactga aggtagcggg cagccctggc 360
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gaactttctc ttgctcctga tctcttttgc tcctccctgc ccctgccata gtcgcagcca 1980
gttgtagaca gctattccag ctctcttttt tttttttttt tttttttttt ttttggtttt 2040
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<210> 109
<211> 529
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 109
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Ala Val Val Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Lys Val Ala
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Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys Phe Thr Gly Leu Ser
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Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro Gly Trp Val Arg Thr
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Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro Arg Cys Arg Glu Leu
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Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu Tyr Arg Ile Gly Asp
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Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ser Gly Asn Leu Ala Gly Leu Lys
130 135 140
Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val Lys Gly Leu Val Leu
145 150 155 160
Gly Pro Leu His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val Ala Gln Thr Asp Leu
165 170 175
Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu Asp Phe Asp Asn Leu
180 185 190
Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val Ile Leu Asp Leu Thr
195 200 205
Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Leu Trp Phe Ser Thr Gln Val Asp Ser
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Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe Trp Leu Gln Ala Gly
225 230 235 240
Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ala Ser
245 250 255
Ser Phe Leu Ala Glu Trp Glu Asn Ile Thr Lys Gly Phe Ser Glu Asp
260 265 270
Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp Leu Gln Gln Ile Val
275 280 285
Ser Pro Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ser Ser Tyr Leu
290 295 300
Ser Asp Ser Ser Phe Thr Gly Glu His Thr Lys Ser Leu Val Thr Gln
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Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser Trp Ser Leu Ser Gln
325 330 335
Ala Gly Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Tyr
340 345 350
Gln Leu Met Leu Ser Thr Leu Pro Gly Thr Pro Val Phe Ser Tyr Gly
355 360 365
Asp Glu Ile Gly Leu Lys Ala Ala Ala Leu Pro Gly Gln Pro Val Glu
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Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe Pro Asp Ile Pro Gly
385 390 395 400
Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln Ser Glu Asp Pro Gly
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Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Gln Leu Ser Asp Gln Arg Ser Lys Glu
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Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Thr Phe Ser Ser Gly Pro Gly
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Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn Glu Arg Phe Leu Val
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Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala Gly Leu Gln Ala Ser
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Ala
<210> 110
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<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 110
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caacttggcg ggtctgaagg ggcgtctcga ttacctgagc tctctgaagg tgaagggcct 600
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ctccacccag gttgacagtg tggccaccaa ggtgaaggat gctctggagt tttggctgca 840
agctggcgtg gatgggttcc aggttcggga catagagaat ctgaaggatg catcctcatt 900
cttggctgag tgggaaaaca tcaccaaggg cttcagtgaa gataggctct tgattgcagg 960
gactaactcc tccgaccttc agcagatcgt gagcccactc gaatccaaca aagacttgct 1020
gttgaccagc tcatacctgt ctgattccag ctttactggg gagcatacaa aatccctagt 1080
cacacagtat ttgaatgcca ctggcaatcg ctggtgcagc tggagtttgt ctcaggcagg 1140
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cctgccaggg acccctgtgt tcagctacgg ggatgagatt ggcctgaagg cagctgccct 1260
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cctttccttg ttccggcagc tgagtgacca gcggagtaag gagcgctccc tattgcatgg 1440
ggacttccat acgttctcct ctgggcctgg actcttctcc tatatccgcc actgggacca 1500
gaatgagcgt tttctggtag tgcttaactt tggggatgtg ggcctctcgg ctgggctgca 1560
ggcctccgac ctgcccgcca gcgccagcct gccaaccaag gctgaccctg tgctcagcac 1620
ccagccaggc cgtgaggagg gctccccgct tgagctggaa cgcctgaaac tggagcctca 1680
cgaagggctg ctgctccgct tcccctatgt ggcctgaccc cagcctgacg tggacccact 1740
gccctccttt ccttcctaga ccctttgggt tctggttttt ctctttttcc ccctttttta 1800
aaaaacaaca acaaaacggt tgcagattat aaatgaaccc ccaaataggg tgttttctgc 1860
cttcaaataa aagtcacccc tgcctggtga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aa 1922
<210> 111
<211> 501
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
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50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
180 185 190
Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro
195 200 205
Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
305 310 315 320
Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
405 410 415
Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala
450 455 460
Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp
465 470 475 480
Cys Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp
485 490 495
Ile Ser Leu Leu Lys
500
<210> 112
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp
20 25 30
Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr
35 40 45
Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu
50 55 60
Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp
65 70 75 80
Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr
85 90 95
Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser
100 105 110
Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser
115 120 125
Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp
130 135 140
Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met
165 170 175
Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly
180 185 190
Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser Val Leu Val Leu
195 200 205
Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val
210 215 220
Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln
225 230 235 240
His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser
245 250 255
<210> 113
<211> 454
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 113
Met Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ala Phe Thr Leu Leu Ser Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ile Gln Thr Ser Val Gln Glu
20 25 30
Val Asn Ser Lys Thr Gln Leu Thr Cys Ser Leu Asn Ser Ser Gly Val
35 40 45
Asp Ile Val Gly His Arg Trp Met Arg Gly Gly Lys Val Leu Gln Glu
50 55 60
Asp Thr Leu Pro Asp Leu His Thr Lys Tyr Ile Val Asp Ala Asp Asp
65 70 75 80
Arg Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Ile Phe Leu Pro Glu Pro Val Gly Arg
85 90 95
Ser Glu Ile Asn Val Glu Gly Pro Pro Arg Ile Lys Val Gly Lys Lys
100 105 110
Ser Glu His Ser Ser Glu Gly Glu Leu Ala Lys Leu Val Cys Lys Ser
115 120 125
Asp Ala Ser Tyr Pro Pro Ile Thr Asp Trp Phe Trp Phe Lys Thr Ser
130 135 140
Asp Thr Gly Glu Glu Glu Ala Ile Thr Asn Ser Thr Glu Ala Asn Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Val Val Val Ser Thr Pro Glu Lys Ser Gln Leu Thr Ile Ser
165 170 175
Asn Leu Asp Val Asn Val Asp Pro Gly Thr Tyr Val Cys Asn Ala Thr
180 185 190
Asn Ala Gln Gly Thr Thr Arg Glu Thr Ile Ser Leu Arg Val Arg Ser
195 200 205
Arg Gly Asn Ser Arg Ala Gln Val Thr Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg
210 215 220
Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp
245 250 255
Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
275 280 285
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys
355 360 365
Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn
385 390 395 400
Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys
420 425 430
Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe
435 440 445
Ser Arg Thr Pro Gly Lys
450
<210> 114
<211> 492
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val
20 25 30
Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp
35 40 45
Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu
50 55 60
Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser
65 70 75 80
Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met
85 90 95
Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe
100 105 110
Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile
115 120 125
Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val
130 135 140
Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His
145 150 155 160
Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile
180 185 190
Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro
195 200 205
Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala
210 215 220
Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp
225 230 235 240
Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys
245 250 255
Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile
260 265 270
Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn
275 280 285
Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln
290 295 300
Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe
305 310 315 320
Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu
325 330 335
His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr
340 345 350
Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser
355 360 365
Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly
370 375 380
Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg
385 390 395 400
Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe
405 410 415
Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr
420 425 430
Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr
435 440 445
Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala
450 455 460
Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu
465 470 475 480
Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val
485 490

Claims (122)

1.一种转运药剂穿过血脑屏障的方法，其中所述方法包括使所述血脑屏障暴露于抗体，所述抗体：(i)结合血脑屏障受体(BBB-R)；并且(ii)与所述药剂偶联；其中：
所述抗体通过与所述BBB-R结合将与其偶联的所述药剂转运穿过血脑屏障；并且
所述BBB-R是选自由下述组成的组的成员：CD98重链(CD98hc)，basigin和1型葡萄糖转运蛋白(Glut1)。
2.权利要求1的方法，其中所述血脑屏障在哺乳动物中。
3.权利要求2的方法，其中所述哺乳动物患有神经疾病或病症。
4.一种治疗哺乳动物中的神经疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用抗体，所述抗体：(i)结合选自由下述组成的组的BBB-R：CD98hc，basigin和Glut1；并且(ii)与有效用于治疗所述神经疾病或病症的治疗剂偶联。
5.权利要求4的方法，其中所述神经疾病或病症选自由下述组成的组：阿尔茨海默病(AD)，卒中，痴呆，肌营养不良(MD)，多发性硬化(MS)，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌症，和外伤性脑损伤。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述药剂是显像剂。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述药剂是神经病症药物。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述抗体与所述BBB-R的结合不消弱所述BBB-R与其一种或多种天然配体的结合。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中，在存在所述抗体时所述BBB-R与其一种或多种天然配体的结合是在不存在所述抗体时的结合量的至少80％。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述抗体与所述BBB-R的结合不消弱所述BBB-R的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述BBB-R的一种或多种天然配体穿过血脑屏障的转运是在不存在所述抗体时的转运量的至少80％。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述抗体已被改造具有低结合亲和力。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述抗体不抑制细胞增殖和/或细胞分裂和/或细胞粘附。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述抗体不诱导细胞死亡。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述抗体具有约1nM至约100μM的针对所述BBB-R的IC50。
17.权利要求16的方法，其中所述IC50为约1nM至约10nM。
18.权利要求17的方法，其中所述IC50为约5nM至约100μM。
19.权利要求18的方法，其中所述IC50为约50nM至约100μM。
20.权利要求16的方法，其中所述IC50为约100nM至约100μM。
21.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述抗体具有约1nM至约10μM的针对所述BBB-R的亲和力。
22.权利要求21的方法，其中所述抗体具有约1nM至约1μM的针对所述BBB-R的亲和力。
23.权利要求22的方法，其中所述抗体具有约1nM至约500nM的针对所述BBB-R的亲和力。
24.权利要求23的方法，其中所述抗体具有约1nM至约50nM的针对所述BBB-R的亲和力。
25.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述抗体具有约1nM至约100μM的针对所述BBB-R的亲和力。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述抗体以治疗剂量施用给所述哺乳动物。
27.权利要求26的方法，其中所述治疗剂量是BBB-R-饱和的。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述抗体是多特异性的，并且与其偶联的所述药剂包含所述多特异性抗体的与脑抗原结合的抗原结合位点。
29.权利要求28的方法，其中所述多特异性抗体是双特异性的。
30.权利要求28或29的方法，其中所述脑抗原选自由下述组成的组：β-分泌酶1(BACE1)，Aβ，表皮生长因子受体(EGFR)，人表皮生长因子受体2(HER2)，Tau，载脂蛋白(例如，载脂蛋白E4(ApoE4))，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，朊病毒蛋白(PrP)，富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6(DR6)，淀粉样蛋白前体蛋白(APP)，p75神经营养蛋白受体(p75NTR)，和胱天蛋白酶6。
31.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合CD98hc和BACEI两者。
32.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合CD98hc和Aβ两者。
33.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合basigin和BACEI两者。
34.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合basigin和Aβ两者。
35.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合Glut1和BACEI两者。
36.权利要求28或29的方法，其中所述多特异性抗体结合Glut1和Aβ两者。
37.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述BBB-R是CD98hc。
38.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述BBB-R是basigin。
39.权利要求38的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：6，7和8的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：3，4和5的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
40.权利要求39的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：9的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：10的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：11的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：12的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
41.权利要求39或40的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：13的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：14的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：15的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：16的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
42.权利要求38-41中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的重链可变区(VH)序列；(b)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的轻链可变区(VL)序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
43.权利要求38-42中任一项的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：2的VH序列和SEQID NO：1的VL序列。
44.权利要求38的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：22，23和24的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：19，20和21的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：25的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：26的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：27的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：28的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
46.权利要求44或45的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：29的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：30的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：31的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：32的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
47.权利要求38和44-46中任一项的方法，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
48.权利要求47的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：18的VH序列和SEQ ID NO：17的VL序列。
49.权利要求38的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：38，39和40的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：35，36和37的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
50.权利要求49的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：41的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：42的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：43的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：44的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
51.权利要求49或50的方法，其中所述抗体进一步包含：(a)SEQ ID NO：45的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：46的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；(c)SEQ ID NO：47的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或(d)SEQ ID NO：48的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
52.权利要求38和49-51中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：33的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
53.权利要求38和49-51中任一项的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：34的VH序列和SEQ ID NO：33的VL序列。
54.权利要求38的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：54，55和56的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：51，52和53的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
55.权利要求54的方法，其中所述抗体进一步包含：(a)SEQ ID NO：57的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：58的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；(c)SEQID NO：59的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或(d)SEQ ID NO：60的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
56.权利要求54或55的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：61的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：62的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：63的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：64的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
57.权利要求38和54-56中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：49的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
58.权利要求38和54-57中任一项的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：50的VH序列和SEQ ID NO：49的VL序列。
59.权利要求38的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：70，71和72的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：67，68和69的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
60.权利要求59的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：73的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：74的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：75的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：76的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
61.权利要求59或60的方法，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：77的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：78的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：79的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：80的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
62.权利要求38和59-61中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：65的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
63.权利要求38和59-61中任一项的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：66的VH序列和SEQ ID NO：65的VL序列。
64.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述BBB-R是Glut1。
65.权利要求64的方法，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：86，87和88的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：83，84和85的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
66.权利要求64或65的方法，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：89的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：90的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：91的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：92的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
67.权利要求64-66中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO：93的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：94的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：95的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：96的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
68.权利要求64-67中任一项的方法，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ IDNO：81的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
69.权利要求64-67中任一项的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO：82的VH序列和SEQID NO：81的VL序列。
70.一种分离的结合basigin的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：6，7和8的氨基酸序列的重链互补性决定区(CDR)1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：3，4和5的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
71.权利要求70的抗体，其还包含下述中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：9的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：10的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：11的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：12的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
72.权利要求70或71的抗体，其还包含下述中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：13的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：14的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：15的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：16的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
73.权利要求70-72中任一项的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
74.权利要求70-73中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：2的VH序列和SEQID NO：1的VL序列。
75.一种分离的结合basigin的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：22，23和24的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：19，20和21的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
76.权利要求75的抗体，其还包含下述中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：25的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：26的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：27的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：28的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
77.权利要求75或76的抗体，其还包含下述中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：29的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：30的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：31的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：32的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
78.权利要求75-77中任一项的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ IDNO：17的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
79.权利要求75-77中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：18的VH序列和SEQID NO：17的VL序列。
80.一种分离的结合basigin的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：38，39和40的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：35，36和37的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
81.权利要求80的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：41的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：42的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：43的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：44的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
82.权利要求80或81的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：45的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：46的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：47的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：48的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
83.权利要求80-82中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：33的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
84.权利要求80-82中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：34的VH序列和SEQID NO：33的VL序列。
85.一种分离的结合basigin的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：54，55和56的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：51，52和53的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
86.权利要求85的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：57的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：58的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：59的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：60的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
87.权利要求85或86的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：61的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：62的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：63的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：64的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
88.权利要求85-87中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：49的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
89.权利要求85-87中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：50的VH序列和SEQID NO：49的VL序列。
90.一种分离的结合basigin的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：70，71和72的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：67，68和69的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
91.权利要求90的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：73的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：74的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：75的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：76的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
92.权利要求90或91的抗体，其中所述抗体进一步包含：
(a)SEQ ID NO：77的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：78的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：79的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和/或
(d)SEQ ID NO：80的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
93.权利要求90-92中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：65的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
94.权利要求90-92中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：66的VH序列和SEQID NO：65的VL序列。
95.一种分离的结合Glut1的抗体，其中所述抗体包含：
(a)分别包含SEQ ID NOs：86，87和88的氨基酸序列的重链CDR 1，2和3序列中的一种或多种；和/或
(b)分别包含SEQ ID NOs：83，84和85的氨基酸序列的轻链CDR 1，2和3序列中的一种或多种。
96.权利要求95的抗体，其进一步包含下述中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：89的轻链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：90的轻链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：91的轻链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：92的轻链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
97.权利要求95或96的抗体，其进一步包含下述的一种或多种：
(a)SEQ ID NO：93的重链可变结构域构架FR1氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：94的重链可变结构域构架FR2氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO：95的重链可变结构域构架FR3氨基酸序列；和
(d)SEQ ID NO：96的重链可变结构域构架FR4氨基酸序列。
98.权利要求95-97中任一项的抗体，其包含：
(a)与SEQ ID NO：82的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)与SEQ IDNO：81的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)(a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
99.权利要求95-97中任一项的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：82的VH序列和SEQID NO：81的VL序列。
100.权利要求1-99中任一项的抗体，其是单克隆抗体。
101.权利要求1-100中任一项的抗体，其是人、人源化或嵌合抗体。
102.权利要求1-101中任一项的抗体，其是全长IgG1或IgG4抗体。
103.权利要求1-101中任一项的抗体，其是Fab片段。
104.一种分离的核酸，其编码权利要求1-103中任一项的抗体。
105.包含权利要求104的核酸的宿主细胞。
106.一种制备抗体的方法，所述方法包括培养权利要求105的宿主细胞，由此制备所述抗体。
107.一种免疫缀合物，其包含权利要求70-103中任一项的抗体和细胞毒性剂。
108.一种多特异性抗体，其包含含有权利要求70-103中任一项的抗体的抗原结合位点的第一臂。
109.权利要求108的多特异性抗体，其还包含含有结合脑抗原的抗原结合位点的第二臂。
110.权利要求109的多特异性抗体，其中所述脑抗原选自由下述组成的组：BACE1，Aβ，EGFR，HER2，Tau，载脂蛋白(例如，ApoE4)，α-突触核蛋白，CD20，亨廷顿蛋白，PrP，LRRK2，帕金蛋白，早老蛋白1，早老蛋白2，γ分泌酶，DR6，APP，p75NTR，和胱天蛋白酶6。
111.权利要求110的多特异性抗体，其中所述脑抗原是BACE1。
112.权利要求110的多特异性抗体，其中所述脑抗原是Aβ。
113.一种药物制剂，其包含权利要求70-112中任一项的抗体和药用载体。
114.权利要求113的药物制剂，其进一步包含另外的治疗剂。
115.权利要求70-112的抗体，其用作药物。
116.权利要求70-112中任一项的抗体，其用于治疗神经疾病或病症。
117.权利要求70-112中任一项的抗体，其用于转运药剂穿过血脑屏障，其中所述应用包括：使血脑屏障暴露于所述抗体。
118.权利要求70-112中任一项的抗体在制备用于治疗神经疾病或病症的药物中的应用。
119.权利要求70-112中任一项的应用，其中所述神经疾病或病症选自由下述组成的组：AD，卒中，痴呆，MD，MS，ALS，囊性纤维化，安吉尔曼综合征，利德尔综合征，帕金森病，皮克病，佩吉特病，癌症，和外伤性脑损伤。
120.权利要求70-112中任一项的抗体，其用于经由与BBB-R结合而将药剂转运穿过血脑屏障。
121.权利要求70-112中任一项的抗体，其中所述BBB-R是人BBB-R。
122.权利要求70-112中任一项的抗体，其与神经病症药物偶联。
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