CN102791292A - 用于诊断剂和治疗剂的递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种穿梭试剂和利用该穿梭试剂促进治疗分子或诊断分子转运到CNS中的方法。

Description

用于诊断剂和治疗剂的递送系统
发明领域
本发明涉及LRP8-结合穿梭试剂和使用该穿梭试剂的方法。本发明还涉及促进治疗分子或诊断分子转运到CNS中的方法。
背景
神经病症代表全球死亡和残疾的主要原因。尽管有广泛的进展，目前的治疗选择在许多方面保持受到限制。这种局限性的一个原因在于脑仅允许特定类型的分子进入。尽管这种限制性的进入有助于脑的保护，但是这也意味着多种潜在有用的化合物不能渗入中枢神经系统(CNS)，因此不能在某些神经病症或其他CNS疾病中发挥治疗活性或者不能用于某些神经病症或其他CNS疾病的诊断。本发明代表了在提供所需要的分子靶向进入CNS方面的进展(在其他情况下该分子穿过血脑屏障(BBB)的能力是有限的)。此外，本发明描述了在递送这样的分子时获得高的脑选择性的方法。
概述
本发明提供促进治疗性化合物和诊断性化合物穿过血脑屏障递送到CNS中的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供包含LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物的组合物。在一个方面中，所述LRP8-结合分子缀合到所述至少一种CNS-活性化合物上。在一个这样的方面中，所述缀合是所述LRP8-结合分子与所述至少一种CNS-活性化合物之间的共价连接。在另一个这样的方面中，所述缀合通过接头进行。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子选自LRP8的天然配体、LRP8的天然配体的片段、LRP8的天然配体的修饰形式和LRP8的天然配体的修饰形式的片段。在一个这样的方面中，所述LRP8的天然配体选自颤蛋白(reelin)和含硒蛋白质P(selenoprotein P)。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子是抗体。在一个这样的方面中，所述抗体是多特异性抗体。在另一个这样的方面中，所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和结合LRP8的抗体片段。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子不与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子结合LRP8的细胞外结构域。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子优先结合在脑中表达的LRP8。
在另一个方面中，所述CNS-活性化合物选自治疗性化合物和诊断性化合物。在一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自神经营养因子和化合物以治疗或预防下列各项中的一种或多种：神经病(neuropathy)，淀粉样变性(amyloidosis)，癌症，眼科疾病或病症(ocular disease or disorder)，病毒或微生物感染(viral or microbial infection)，炎症(inflammation)，缺血(ischemia)，神经变性疾病(neurodegenerative disease)，发作(seizure)，行为障碍(behavioral disorder)和溶酶体贮积病(lysosomal storagedisease)。在一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自治疗帕金森病(Parkinson’s disease)的化合物和治疗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)的化合物。在另一个这样的方面中，所述诊断性化合物是特异性结合CNS靶标的标记的肽或抗体。在另一个方面中，所述LRP-结合分子与LRP8的结合实现所述CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物制剂，其包含含有LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物的组合物和药用载体。在一个方面中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供通过调节LRP8的表达、稳定性或活性而调节哺乳动物中CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运的方法。在一个方面中，靶向通过LRP8-结合分子的方式进行并且增加所述CNS-活性化合物的转运。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子和所述CNS-活性化合物同时施用给哺乳动物。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子缀合到所述CNS-活性化合物上。在一个这样的方面中，所述LRP8-结合分子与所述CNS-活性化合物之间的缀合选自共价缔合、利用接头的缔合以及在同一多特异性抗体中作为不同的结合结构部分。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子选自LRP8的天然配体、LRP8的天然配体的片段、LRP8的天然配体的修饰形式和LRP8的天然配体的修饰形式的片段。在一个这样的方面中，所述LRP8的天然配体选自颤蛋白和含硒蛋白质P。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子是抗体。在一个这样的方面中，所述抗体是多特异性抗体。在另一个这样的方面中，所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和结合LRP8的抗体片段。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子不与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子结合LRP8的细胞外结构域。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子优先结合在脑中表达的LRP8。
在另一个方面中，所述CNS-活性化合物选自治疗性化合物和诊断性化合物。在一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自神经营养因子和化合物以治疗或预防下列各项中的一种或多种：神经病，淀粉样变性，癌症，眼科疾病或病症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。在另一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自治疗帕金森病的化合物和治疗阿尔茨海默病的化合物。在另一个这样的方面中，所述诊断性化合物是特异性结合CNS靶标的标记的肽或抗体。在另一个方面中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子和所述CNS-活性化合物与一种或多种另外的治疗剂联合施用。在一个这样的方面中，所述LRP8-结合分子和所述CNS-活性化合物与药用载体联合施用。
在另一个实施方案中，本发明提供通过靶向LRP8调节CNS-活性化合物穿过包括紧密连接的血管内皮细胞层转运的方法。在另一个实施方案中，本发明提供治疗患有CNS疾病或CNS病症的个体的方法，其包括给所述个体施用有效量的组合物或任意前述组合物的一种药物制剂或多种药物制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供一种在患有CNS疾病或CNS病症的个体中减少或预防CNS疾病或CNS病症的严重性、持续时间或症状的方法，其包括给所述个体施用有效量的所述组合物或任意前述组合物的一种药物制剂或多种药物制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供诊断个体中的CNS疾病或CNS病症的方法，其包括给所述个体施用有效量的所述组合物或任意前述组合物的一种药物制剂或多种药物制剂，显现或定量在所述个体脑中的所述CNS-活性化合物，并且将该结果与来自具有已知的CNS疾病或病症实例的个体或不具有CNS疾病或病症的个体的对照结果进行比较。
在另一个实施方案中，本发明提供对个体中的CNS疾病或CNS病症分期(staging)的方法，其包括给所述个体施用有效量的所述组合物或任意前述组合物的一种药物制剂或多种药物制剂，显现或定量在所述个体脑中的所述CNS-活性化合物，并且将该结果与来自具有已知分期的CNS疾病或CNS病症的个体的对照结果进行比较。
在另一个实施方案中，本发明提供LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物的组合物，所述组合物用作药物。在一个方面中，所述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物是前述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物中的一种。在一个方面中，所述LRP8-结合分子缀合到所述至少一种CNS-活性化合物上。在一个这样的方面中，所述缀合是所述LRP8-结合分子与所述至少一种CNS-活性化合物之间的共价连接。在另一个这样的方面中，所述缀合通过接头进行。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子选自LRP8的天然配体、LRP8的天然配体的片段、LRP8的天然配体的修饰形式和LRP8的天然配体的修饰形式的片段。在一个这样的方面中，所述LRP8的天然配体选自颤蛋白和含硒蛋白质P。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子是抗体。在一个这样的方面中，所述抗体是多特异性抗体。在另一个这样的方面中，所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和结合LRP8的抗体片段。
在另一个方面中，所述LRP8-结合分子不与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子结合LRP8的细胞外结构域。在另一个方面中，所述LRP8-结合分子优先结合在脑中表达的LRP8。
在另一个方面中，所述CNS-活性化合物选自治疗性化合物和诊断性化合物。在一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自神经营养因子和化合物以治疗或预防下列各项中的一种或多种：神经病，淀粉样变性，癌症，眼科疾病或病症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。在另一个这样的方面中，所述治疗性化合物选自治疗或预防帕金森病的化合物和治疗或预防阿尔茨海默病的化合物。在另一个这样的方面中，所述诊断性化合物是特异性结合CNS靶标的标记的肽或抗体。在另一个方面中，所述LRP-结合分子与LRP8的结合实现所述CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运。
在另一个实施方案中，本发明提供一种药物制剂，其包含组合物和药用载体，所述组合物含有LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物(用作药物的)。在一个方面中，所述药物制剂还包含另外的治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明提供LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物用于制备用于治疗CNS疾病或CNS病症的药物的应用。在一个方面中，所述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物是前述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物中的一种。在另一个实施方案中，本发明提供LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物用于制备用于诊断或分期CNS疾病或CNS病症的药物的应用。在一个方面中，所述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物是前述LRP8-结合分子或包含LRP8-结合分子的组合物中的一种。
附图简述
图1是在细胞膜情形中LRP8蛋白的结构示意图。LRP8的细胞外结构域是LRP8由蛋白N端延伸至跨膜结构域的部分，并且包括7个配体-结合重复和一个EGF-前体结构域。LRP8的细胞内部分包括细胞内信号传导结构域并且存在于细胞内部。
图2A-2D描述将LRP8鉴定为在与血脑屏障相关的脑血管内皮细胞上高度且特异性表达的蛋白的实验结果。图2A描述FACS分析的结果，从其他细胞类型中分选出CD31-阳性内皮细胞用于进一步的实验。图2B和2C图解描述实施例1中所述的微阵列实验的结果。在图2B-1-2B-3中，显示了来自成体样品的相对转录水平，图2C-1和2C-2来自相同的分析并且仅包括关于LRP8和LRP1的成体、幼体和胚胎样品。在LRP8图上最大的Y轴值是5.7，而在LRP1图上最大的Y轴值是0.123。图2D显示实施例1中所述的验证性定量RT-PCR实验的结果，证实在肺/肝血管内皮细胞中几乎没有观察到LRP8RNA，而那些细胞确实显示高的LRP1RNA水平。相对转录物丰度值以针对设定为1的平均脑水平标准化的所有数值绘图。
图3A-3E描述实施例2A所述的实验的结果，从而鉴定有效用于确定LRP8蛋白在血管内皮细胞样品中的可检测性的试剂并且确定LRP8蛋白在血管内皮细胞样品中的可检测性。图3A显示使用不同抗-ApoER2抗体进行的ApoER2蛋白质印迹分析。将重组人ApoER2稀释到具有1x还原剂的Invitrogen LDS样品缓冲液中，并且以10ng、3ng、1ng、0.3ng的量上样到10％Bis-Tris Nupage 15-孔凝胶中。左图：a.)将1∶500稀释的抗-ApoER2小鼠单克隆抗体(Abcam ab58216)(2.0μg/ml)用作一级抗体并且与印迹在4℃在振动器上温育48小时，b.)将1∶2000稀释的生物素XX-抗-小鼠抗体用作二级抗体并且与印迹在室温下温育2小时。中间图：a.)将兔抗-ApoER2兔多克隆抗体(Invitrogen 40-7800)用作一级抗体并且与印迹在4℃在振动器上温育48小时，b.)将1∶2000稀释的生物素XX-抗-兔抗体用作二级抗体并且与印迹在室温下温育2小时。右图：a.)将1∶500稀释的LRP8小鼠多克隆抗体(Abnova H00007804-A01)(2.0μg/ml)用作一级抗体并且与印迹在4℃在振动器上温育48小时，2.)将1∶2000稀释的生物素XX-抗-小鼠抗体用作二级抗体并且与印迹在室温下温育2小时。图3B和3C如图3A中的所示的蛋白质印迹，但是测定来自T175玻瓶培养物的第30代的D3细胞裂解物中LRP8的存在。图3D描述如在实施例2中所述的检测HUVEC或HBMEC细胞裂解物中LRP8蛋白的存在的Western印迹的结果。左图使用兔抗-人LRP8抗体(Zymed)，右图使用山羊抗-人LRP8抗体(Novus)，并且二图均检测到存在98KD分子量范围的条带，预测与存在LRP8相关。图3E图示竞争测定的结果，表明RAP不与抗-LRP8抗体竞争与ApoER2的结合。
图4A-4F描述在实施例2B中描述的实验的结果，其估测LRP8在各种培养的血管内皮细胞和在小鼠与人组织中的定位。图4A显示与固定的、渗透化处理的HUVEC的抗-LRP8结合的免疫细胞化学分析的图片(左图，Santa Cruz山羊抗-人LRP8抗体；右图，Zymed兔抗-人LRP8抗体)。图4B显示在固定/渗透化处理(二级抗体山羊-抗-兔Alexa-Fluor488)后通过用抗-人LRP8抗体(Sigma A3481)染色无限增殖的人脑内皮细胞(hCMEC/D3，左)或原代人脑微血管内皮细胞(右)得到的免疫荧光图像。二图均显示LRP8的膜和囊泡分布；在原代细胞中的表达水平高于在无限增殖细胞系中的表达水平。图4C显示来自用LRP8配体颤蛋白预先处理HUVEC对那些细胞的抗-LRP8抗体染色的影响的免疫细胞化学分析的图片，并且证明颤蛋白处理不改变LRP8在HUVEC上的定位。图4D提供来自用抗-LRP8和CD31标记的小鼠脑组织的免疫组织化学分析的图像，表明LRP8与血管内皮细胞共定位。图4E提供来自用Alexa488-标记的抗-LRP8抗体系统处理1小时的小鼠的图片，其表明抗-LRP8抗体在脑切片中的定位。在整个切片中可以清楚地看到点状模式的抗体，并且还容易在血管中显现。图4F显示使用针对LRP8的一级抗体与针对细胞核的DAPI染色的人皮质阿尔茨海默病脑切片的荧光显微图。可以检测到在血管部位的LRP8染色。
图5A示意性描述实施例3中所述的迁移测定。图5B-5C显示实施例3中所述的实验的结果，其在体外迁移测定中确定LRP8穿过hCMEC/D3细胞单层转运的能力。
发明实施方案详述
I.定义
“接受体人构架”用于本文的目的是包含来源于如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。“来源于”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接受体人构架可以包括其相同的氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下或2个以下。在一些实施方案中，VL接受体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，用在本文时，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)成员之间的1∶1相互作用。分子X针对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性的实施法案。
“亲和力成熟的”抗体是指与不具有所述改变的亲本抗体相比在一个或多个高变区(HVRs)具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
术语“抗-LRP8抗体”和“与LRP8结合的抗体”是指能够以充分的亲和力结合LRP8的抗体，所述亲和力足以使所述抗体有效用作靶向LRP8并且促进LRP8-介导的缔合分子或邻近分子的转运的试剂。在一个实施方案中，抗-LRP8抗体与不相关的、非-LRP8蛋白结合的程度比例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的所述抗体与LRP8的结合小约10％。在特定实施方案中，与LRP8结合的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM (例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在特定实施方案中，抗-LRP8抗体结合在LRP8与不同物种之间保守的LRP8的表位。在特定实施方案中，抗-LRP8抗体结合LRP8的细胞外表位。在特定实施方案中，抗-LRP8抗体不与一种或多种天然LRP8配体竞争与LRP8的结合。在特定实施方案中，抗-LRP8抗体确实与一种或多种天然LRP8配体竞争与LRP8的结合。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意思使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需要的抗原-结合活性。
“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括，但不限于，Fv，Fab，Fab′，Fab’-SH，F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断所述参照抗体与其抗原的结合50％以上的抗体，反之，在竞争测定中所述参照抗体阻断所述抗体与其抗原的结合50％以上。本文提供了示例性的竞争测定。
“血脑屏障”或“BBB”是指在外周循环与脑和脊髓之间由脑毛细管内皮质膜内的紧密连接形成的生理屏障，产生限制分子、甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿)转运到脑中的紧密屏障。脑内的血脑屏障、脊髓内的血液-脊髓屏障、和在视网膜内的血液-视网膜屏障是在CNS中的连续毛细管屏障，并且在本文中统称为血脑屏障或BBB。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，其中所述屏障包括室管膜细胞而不是毛细管内皮细胞。
“中枢神经系统”或“CNS”是指控制身体功能的神经组织的复合体，并且包括脑和脊髓。
术语“嵌合的”蛋白是指这样的分子，其中蛋白的一部分来源于特定的来源或物种，而蛋白的其余部分来源于不同的来源或物种。在抗体的情形中，“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“种类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5种主要的抗体种类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。与不同种类的免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。
“中枢神经系统活性化合物”或“CNS-活性化合物”用在本文中是指在受试者的CNS内具有作用的物质。CNS活性化合物包括，但不限于，治疗性化合物、诊断性化合物和具有在研究中有用的作用的化合物。治疗性CNS-活性化合物是有效治疗一种或多种CNS疾病或病症、预防一种或多种CNS疾病或病症的发作或发展、或减小或防止一种或多种CNS疾病或病症的严重性、持续时间或症状的化合物。诊断性CNS活性化合物是有效用于诊断或分期一种或多种CNS疾病或病症或有效用于一个或多个脑部区域成像的化合物。
“中枢神经系统疾病或病症”或“CNS疾病或病症”用在本文中是指影响CNS和/或具有在CNS中的病因学的疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括，但不限于，神经病，淀粉样变性，癌症，眼科疾病或病症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。为了本申请的目的，CNS理解为包括眼，其通常通过血液-视网膜屏障与身体其余部分隔开。
术语“细胞毒性剂”用在本文中是指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于，反射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲氨喋呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入试剂(intercalating agents))；生长抑制剂；酶及其片段，如核酸裂解酶；抗生素；毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌试剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
试剂的“有效量”，例如药物制剂的“有效量”，是指在必要剂量和时间期间有效获得所需治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的C-端区域，其包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区由Cys226，或由Pro230延伸至重链的羧基-末端。然而，Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是按照EU编号系统进行的，EU编号系统也称为EU索引(EU index)，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白的序列)，第5版，公众健康服务，全国卫生研究所(Public Health Service，NationalInstitutes ofHealth)，Bethesda，MD，1991中所述。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下述顺序出现在VH (或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“完全抗体”在本文中可互换使用，用来指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指外源核酸已经引入其中的细胞，包括所述细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和来源于其的后代，与传代次数无关。后代可以不与亲代细胞的核酸内容物完全相同，而是可以包含突变。本文包括具有与在初始转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或来源于非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的一种抗体，所述非人来源利用人抗体全体成员或其他人抗体-编码序列。人抗体的这一定义特异性排除包括非人抗原-结合残基的人源化的抗体。
“人共有构架”是表示在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是来自可变结构域序列的亚组。通常，序列的亚组是Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白的序列)，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如Kabat等，同上所述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如Kabat等，同上所述的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVRs的氨基酸残基和来自人FRs的氨基酸残基的嵌合抗体。在特定实施方案中，人源化抗体基本上包括至少一个、和典型地两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的HVRs(例如，CDRs)对应于非-人抗体的那些，全部或基本上全部的FRs对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包括来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如，非-人抗体的“人源化形式”，是指已经进行人源化的抗体。
术语“高变区”或“HVR”用在本文时是指在序列上高变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，天然4链抗体包含6个HVRs；三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。HVRs通常包括来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDRs)的氨基酸残基，后者是最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)中。(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987)。)示例性的CDRs(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102中。(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫目的的蛋白的序列)，第5版，公众健康服务，全国卫生研究所(Public HealthService，National Institutes of Health)，Bethesda，MD (1991)。)除了VH中的CDR1，CDRs通常包括形成和高变环的氨基酸残基。CDRs还包含“特异性决定残基”或“SDRs”，其是接触抗原的残基。SDRs包含在称为缩短-CDRs(abbreviated-CDRs)或a-CDRs的CDRs区域中。示例性的a-CDRs (a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102中。(参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另外指明，HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中按照Kabat等，同前所述编号。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家畜(例如，母牛，绵羊，猫，狗，和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在特定实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”多肽是已经与其天然环境成分分离的一种多肽。在一些实施方案中，多肽纯化至大于95％或99％的纯度，如例如通过电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定纯度。关于例如抗体纯度的评估方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境成分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所包含的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置上。
“分离的编码抗-LRP8抗体的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单一载体或分离的载体中的所述核酸分子，并且所述核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
“接头结构部分”或“接头”用在本文中时是指共价或非共价连接LRP8-结合化合物与CNS-活性分子的结构。接头的主要功能是作为间隔臂，并且其在本发明的穿梭试剂中的存在是任选的，这取决于要缀合的特定LRP8-结合分子和CNS-活性化合物的需要。在特定实施方案中，接头是肽。在其他实施方案中，接头是化学接头。
术语“LRP8”，与“载脂蛋白E受体2”和“ApoER2”互换使用，用在本文中时，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然的LRP8，除非另外指明，脊椎动物来源包括哺乳动物，如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语包括“全长的”未加工的LRP8以及由细胞内加工导致的任何形式的LRP8。该术语还包括天然存在的LRP8变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性人LRP8的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中：
MGLPEPGPLRLLALLLLLLLLLLLRLQHLAAAAADPLLGGQGPAKECEKDQFQCRNERCIPSVWRCDEDDDCLDHSDEDDCPKKTCADSDFTCDNGHCIHERWKCDGEEECPDG SDESEATCTKQVCPAEKLSCGPTSHKCVPASWRCDGEKDCEGGADEAGCATLCAPHEFQCGNRSCLAAVFVCDGDDDCGDGSDERGCADPACGPREFRCGGDGGGACIPERWVCDRQFDCEDRSDEAAELCGRPGPGATSAPAACATVSQFACRSGECVHLGWRCDGDRDCKDKSDEADCPLGTCRGDEFQCGDGTCVLAIKHCNQEQDCPDGSDEAGCLQGLNECLHNNGGCSHICTDLKIGFECTCPAGFQLLDQKTCGDIDECKDPDACSQICVNYKGYFKCECY PGYEMDLLTKNCKAAGGKSPSLIFTNRYEVRRIDLVKRNYSRLIPMLKNVVALDVEVATNRIYWCDLSYRKIYSAYMDKASDPKEQEVLIDEQLHSPEGLAVDWVHKHIYWTDSGNKTISVATVDGGRRRTLFSRNLSEPRAIAVDPLRGFMYWSDWGDQAKIEKSGLNGVDRQTLVSDNIEWPNGITLDLLSQRLYWVDSKLHQLSSIDFSGGNRKTLISSTDFLSHPFGIAVFEDKVFWTDLENEAIFSANRLNGLEISILAENLNNPHDIVIFHELKQPRAPDACELSVQPNGGCEYLCLPAPQISSHSPKYTCACPDTMWLGPDMKRCYRAPQSTSTTTLASTMTRTVPATTRAPGTTVHRSTYQNHSTETPSLTAAVPSSVSVPRAPSISPSTLSPATSNHSQHYANEDSKMGSTVTAAVIGIIVPIVVIALLCMSGYLIWRNWKRKNTKSMNFDNPVYRKTTEEEDEDELHIGRTAQIGHVYPAAISSFDRPLWAEPCLGETREPEDPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKNPLSELPVVKSKRVALSLEDDGLP(SEQ IDNO：1)(Genbank BAA21824.1)。在特定实施方案中，SEQ ID NO：1的前32个氨基酸是信号序列，并且示例性的加工过的人LRP8蛋白的序列在SEQID NO：2中给出：
AADPLLGGQGPAKECEKDQFQCRNERCIPSVWRCDEDDDCLDHSDEDDCPKKTCADSDFTCDNGHCIHERWKCDGEEECPDGSDESEATCTKQVCPAEKLSCGPTSHKCVPASWRCDGEKDCEGGADEAGCATLCAPHEFQCGNRSCLAAVFVCDGDDDCGDGSDERGCADPACGPREFRCGGDGGGACIPERWVCDRQFDCEDRSDEAAELCGRPGPGATSAPAACATVSQFACRSGECVHLGWRCDGDRDCKKKSDEADCPLGTCRGDEFQCGDGTCVLAIKHCNQEQDCPDGSDEAGCLQGLNECLHNNGGCSHICTDLKIGFECTCPAGFQLLDQKTCGDIDECKDPDACSQICVNYKGYFKCECYPGYEMDLLTKNCKAAGGKSPSLIFTNRYEVRRIDLVKRNYSRLIPMLKNVVALDVEVATNRIYWCDLSYRKIVSAYMDKASDPKEQEVLIDEQLHSPEGLAVDWVHKHIYWTDSGNKTISVATVDGGRRRTLFSRNLSEPRAIAVDPLRGFMYWSDWGDQAKIEKSGLNGVDRQTLVSDNIEWPNGITLDLLSQRLYWVDSKLHQLSSIDFSGGNRKTLISSTDFLSHPFGIAVFEDKVFWTDLENEAIFSANRLNGLEISILAENLNNPHDIVIFHELKQPRAPDACELSVQPNGGCEYLCLPAPQISSHSPKYTCACPDTMWLGPDMKRCYRAPQSTSTTTLASTMTRTVPATTRAPGTTVHRSTYQNHSTETPSLTAAVPSSVSVPRAPSISPSTLSPATSNHSQHYANEDSKMGSTVTAAVIGIIVPIVVIALLCMSGYLIWRNWKRKNTKSMNFDNPVYRKTTEEEDEDELHIGRTAQIGHVYPAAISSFDRPLWAEPCLGETREREDPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKNPLSELPVVKSKRVALSLEDDGLP(SEQ ID NO：2)。
“LRP8-结合分子”是指特异性结合LRP8的分子。LRP8-结合分子包括，但不限于，LRP8的天然配体(即，颤蛋白，ApoE，或含硒蛋白质P)，LRP8的天然配体的修饰形式，针对LRP8的抗体，特异性结合LRP8的肽，特异性结合LRP8的适体，和特异性结合LRP8的小分子以及前述任一项的LRP8-结合片段。在特定实施方案中，LRP8-结合分子不与LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在特定实施方案中，LRP8-结合分子与LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在特定实施方案中，LRP8-结合分子拮抗正常的LRP8功能。在特定实施方案中，LRP8-结合分子激动正常的LRP8功能。
术语“LRP8的天然配体的修饰形式”是指已经被修饰的LRP8的天然配体，以使其不再与天然存在的LRP8配体形式相同但仍然保留结合LRP8的能力。所述修饰包括，但不限于，翻译后修饰(即，糖基化)，氨基酸修饰(即，氨基酸置换、缺失或添加，条件是修饰的分子保持与LRP8结合)，融合(即，Fc-融合)，和化学修饰(即，连接放射性标记或其他可检测的标签，如但不限于，荧光团或六组氨酸标签)。
术语“单克隆抗体”用在本文中是指由一群基本上同源的抗体获得的抗体，即，包含所述群体的单一抗体是相同的和/或结合相同的表位，排除可能的变体抗体，例如，包含天然存在的突变或在生产单克隆抗体制剂过程中产生的变体抗体，所述变体通常以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示抗体从基本上同源的抗体群体获得的特征，并且不被解释为需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，要按照本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括但不限于，杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体-展示方法，和使用包括所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的所述方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指没有缀合到异源结构部分(例如，CNS-活性化合物)或放射性标记上的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指天然存在的具有变化结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两个相同的轻链和两个相同的重链构成。从N-端到C-端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是三个恒定结构域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N-端到C-端，每个轻链具有可变区(VL)，还称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。
“LRP8的天然配体”或“LRP8天然配体”是指作为天然存在的LRP8配体的多肽。所述天然存在的配体包括，但不限于，颤蛋白，ApoE，含硒蛋白质P和RAP。在特定实施方案中，LRP8的天然配体结合在LRP8上的任何位置。在特定实施方案中，LRP8的天然配体结合LRP8的细胞外结构域。在特定实施方案中，使用LRP8的天然配体的LRP8-结合片段。天然存在的人颤蛋白的氨基酸序列为：
MERSGWARQTFLLALLLGATLRARAAAGYYPRFSPFFFLCTHHGELEGDGEQGEVLISLHIAGNPTYYVPGQEYHVTISTSTFFDGLLVTGLYTSTSVQASQSIGGSSAFGFGIMSDHQFGNQFMCSVVASHVSHLPTTNLSFIWIAPPAGTGCVNFMATATHRGQVIFKDALAQQLCEQGAPTDVTVHPHLAEIHSDSIILRDDFDSYHQLQLNPNIWVECNNCETGEQCGAIMHGNAVTFCEPYGPRELITTGLNTTTASVLQFSIGSGSCRFSYSDPSIIVLYAKNNSADWIQLEKIRAPSNVSTIIHILYLPEDAKGENVQFQWKQENLRVGEVYEACWALDNILIINSAHRQVVLEDSLDPVDTGNWLFFPGATVKHSCQSDGNSIYFHGNEGSEFNFATTRDVDLSTEDIQEQWSEEFESQPTGWDVLGAVIGTECGTIESGLSMVFLKDGERKLCTPSMDTTGYGNLRFYFVMGGICDPGNSHENDIILYAKIEGRKEHITLDTLSYSSYKVPSLVSVVINPELQTPATKFCLRQKNHQGHNRNVWAVDFFHVLPVLPSTMSHMIQFSINLGCGTHQPGNSVSLEFSTNHGRSWSLLHTECLPEICAGPHLPHSTVYSSENYSGWNRITIPLPNAALTRNTRIRWRQTGPILGNMWAIDNVYIGPSCLKFCSGRGQCTRHGCKCDPGFSGPACEMASQTFPMFISFSFGSSRLSSYHNFYSIRGAEVSFGCGVLASGKALVFNKEGRRQLITSFLDSSQSRFLQFTLRLGSKSVLSTCRAPDQPGEGVLLHYSYDNGITWKLLEHYSYLSYHEPRIISVELPGDAKQFGIQFRWWQPYHSSQREDVWAIDEIIMTSVLFNSISLDFTNLVEVTQSLGFYLGNVQPYCGHDWTLCFTGDSKLASSMRYVETQSMQIGASYMIQFSLVMGCGQKYTPHMDNQVKLEYSTNHGLTWHLVQEECLPSMPSCQEFTSASIYHASEFTQWRRVIVLLPQKTWSSATRFRWSQSYYTAQDEWALDSIYIGQQCPNMCSGHGSCDHGICRCDQGYQGTECHPEAALPSTIMSDFENQNGWESDWQEVIGGEIVKPEQGCGVISSGSSLYFSKAGKRQLVSWDLDTSWVDFVQFYIQIGGESASCNKPDSR EEGVLLQYSNNGGIQWHLLAEMYFSDFSKPRFVYLELPAAAKTPCTRFRWWQPVFSGEDYDQWAVDDIIILSEKQKQIIPVINPTLPQNFYEKPAFDYPMNQMSVWLMLANEGMVKNETFCAATPSAMIFGKSDGDRFAVTRDLTLKPGYVLQFKLNIGCANQFSSTAPVLLQYSHDAGMSWFLVKEGCYPASAGKGCEGNSRELSEPTMYHTGDFEEWTRITIVIPRSLASSKTRFRWIQESSSQKNVPPFGLDGVYISEPCPSYCSGHGDCISGVCFCDLGYTAAQGTCVSNVPNHNEMFDRFEGKLSPLWYKITGAQVGTGCGTLNDGKSLYFNGPGKREARTVPLDTRNIRLVQFVIQIGSKTSGITGIKPRTRNEGLIVQYSNDNGILWHLLRELDFMSFLEPQIISIDLPQDAKTPATAFRWWQPQHGKHSAQWALDDVLIGMNDSSQTGFQDKFDGSIDLQANWYRIQGGQVDIDCLSMDTALIFTENIGKPRYAETWDFHVSASTFLQFEMSMGCSKPFSNSHSVQLQYSLNNGKDWHLVTEECVPPTIGCLHYTESSIYTSER FQNWKRITVYLPLSTISPRTRFRWIQANYTVGADSWAIDNVVLASGCPWMCSGRGICCDAGRCVCDRGFGGPYCVPVVPLPSILKDDFNGNLHPDLWPEVYGAERGNLNGETIKSGTSLIFKGEGLRMLISRDLDCTNTMYVQFSLRFIAKSTPERSHSILLQFSISGGITWHLMDEFYFPQTTNILFINVPLPYTAQTNATRFRLWQPYNNGKKEEIWIVDDFIIDGNNVNNPVMLLDTFDFGPREDNWFFYPGGNIGLYCPYSSKGAPEEDSAMVFVSNEVGEHSITTRDLNVNENTIIQFEINVGCSTDSSSADPVRLEFSRDFGATWHLLLPLCYHSSSHVSSLCSTEHHPSSTYYAGTMQGWRREVVHFGKLHLCGSVRFRWYQGFYPAGSQPVTWAIDNVYIGPQCEEMCNGQGSCINGTKCICDPGYSGPTCKISTKNPDFLKDDFEGQLESDRFLLMSGGKPSRKCGILSSGNNLFFNEDGLRMLMTRDLDLSHARFVQFFMRLGCGKGVPDPRSQPVLLQYSLNGGLSWSLLQEFLFSNSSNVGRYIALEIPLKARSGSTRLRWWQPSENGHFYSPWVIDQILIGGNISGNTVLEDDFTTLDSRKWLLHPGGTKMPVCGSTGDALVFIEKASTRYVVSTDVAVNEDSFLQIDFAASCSVTDSCYAIELEYSVDLGLSWHPLVRDCLPTNVECSRYHLQRILVSDTFNKWTRITLPLPPYTRSQATRFRWHQPAPFDKQQTWAIDNVYIGDGCIDMCSGHGRCIQGNCVCDEQWGGLYCDDPETSLPTQLKDNFNRAPSSQNWLTVNGGKLSTVCGAVASGMALHFSGGCSRLLVTVDLNLTNAEFIQFYFMYGCLITPNNRNQGVLLEYSVNGGITWNLLMEIFYDQYSKPGFVNILLPPDAKEIATRFRWWQPRHDGLDQNDWAIDNVLISGSADQRTVMLDTFSSAPVPQHERSPADAGPVGRIAFDMFMEDKTSVNEHWLFHDDCTVERFCDSPDGVMLCGSHDGREVYAVTHDLTPTEGWIMQFKISVGCKVSEKIAQNQIHVQYSTDFGVSWNYLVPQCLPADPKCSGSVSQPSVFFPTKGWKRITYPLPESLVGNPVRFRFYQKYSDMQWAIDNFYLGPGCLDNCRGHGDCLREQCICDPGYSGPNCYLTHTLKTFLKERFDSEEIKPDLWMSLEGGSTCTECGILAEDTALYFGGSTVRQAVTQDLDLRGAKFLQYWGRIGSENNMTSCHRPICRKEGVLLDYSTDGGITWTLLHEMDYQKYISVRHDYILLPEDALTNTTRLRWWQPFVISNGIVVSGVERAQWALDNILIGGAEINPSQLVDTFDDEGTSHEENWSFYPNAVRTAGFCGNPSFHLYWPNKKKDKTHNALSSRELIIQPGYMMQFKIVVGCEATSCGDLHSVMLEYTKDARSDSWQLVQTQCLPSSSNSIGCSPFQFHEATIYNSVNSSSWKRITIQLPDHVSSSATQFRWIQKGEETEKQSWAIDHVYIGEACPKLCSGHGYCTTGAICICDESFQGDDCSVFSHDLPSYIKDNFESARVTEANWETIQGGVIGSGCGQLAPYAHGDSLYFNGCQIRQAATKPLDLTRASKIMFVLQIGSMSQTDSCNSDLSGPHAVDKAVLLQYSVNNGITWHVIAQHQPKDFTQAQRVSYNVPLEARMKGVLLRWWQPRHNGTGHDQWALDHVEVVLVSTRKQNYMMNFSRQHGLRHFYNRRRRSLRRYP(Genbank kAAC51105.1)(SEQ ID NO：3)。天然存在的人含硒
蛋白质P的氨基酸序列为：
MWRSLGLALALCLLPSGGTESQDQSSLCKQPPAWSIRDQDPMLNSNGSVTVVALLQASXYLCIIEASKLEDLRVKLKKEGYSNISYIVVNHQGISSRLKYTHLKNKVSEHIPVYQQEENQTDVWTLLNGSKDDFLIYDRCGRLVYHLGLPFSFLTFPYVEEAIKIAYCEKKCGNCSLTTLKDEDFCKRVSLATVDKTVETPSPHYHHEHHHNHGHQHLGSSELSENQQPGAPNAPTHPAPPGLHHHHKHKGQHRQGHPENRDMPASEDLQDLQKKLCRKRCINQLLCKLPTDSELAPRSXCCHCRHLIFEKTGSAITXQCKENLPSLCSXQGLRAEENITESCQXRLPPAAXQISQQLIPTEASASXRXKNQAKKXEXPSN(GenBank：CAA77836.1)，(SEQ IDNO：4)。
术语“包装插页”用来指通常包括在商业治疗产品包装中的使用说明，其含有关于适应证、用途、剂量、施用、组合治疗、禁忌症和/或关于使用所述治疗产品的警告的信息。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在比对序列和必要时引入缺口以获得最大序列同一性百分数，并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所述参照多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为确定氨基酸序列同一性百分数目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式获得，例如，使用公众可获得的计算机软件如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当的参数，包括在被比较的序列全长上获得最大比对所需要的任意算法。然而，为了本文的目的，氨基酸序列同一性％值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.所有，并且源编码已经提交美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)的用户文件，在那里其注册为美国版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech，Inc.公众获得，或者可以由源编码进行编码。ALIGN-2程序应该为在UNIX操作系统、包括数字UNIX V4.0D上应用进行编码。所有序列比较参数通过ALIGN-2程序设定并且不变化。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形中，给定的氨基酸序列A对于、与或针对给定的氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以备选地表述为具有或包括对于、与或针对给定的氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性％的给定的氨基酸序列A)计算如下：
100×分数X/Y
其中X是在A和B的ALIGN-2程序比对中被序列比对程序ALIGN-2得分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中氨基酸残基的总数。应该理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情形中，A对于B的氨基酸序列同一性％不等于B对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别阐明，本文所用的所有氨基酸序列同一性％值如在紧接本段的前段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
在一些实施方案中，试剂是“外周施用的”或“施用在外周的”。当用于本文时，这些术语是指药剂、例如治疗剂对个体的任何形式的施用，其不是直接施用至CNS，例如，其使得该试剂与血脑屏障的非脑一侧相接触。外周施用包括，但不限于，静脉内、皮下、肌内、腹膜内、经皮、吸入、经颊(transbuccal)、鼻内、直肠和口服施用。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其采用允许其中所包含的活性成分的生物学活性有效的形式，并且其不包含对要施用该制剂的受试者有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药用制剂中除活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药用载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“穿梭试剂”当用于本文时是指包含至少一种LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物的化合物，其中所述至少一种LRP8-结合分子共价地(即，直接融合或接头-介导的缀合)或非共价地(即，通过离子或疏水相互作用)缀合到所述至少一种CNS-活性化合物上。作为非限制性实例，穿梭试剂包括特异性结合LRP8和所需要的治疗性或诊断性CNS靶标中任一种的多特异性融合蛋白。
“治疗有效的”是指产生比在不患有病症的个体中的平均或正常状况更好的状况(即，与不受折磨或无症状的受试者中的正常或平均状态相比，在受试者中可至少部分归因于CNS的功能行使的超常作用，如改善的认知、记忆、情绪或其他特征)的产生。
当用于本文时，“治疗(treatment)”(及其语法变化，如“进行治疗(treat)”或“正在治疗(treating)”)是指尝试改变被治疗的个体的天然过程的临床干预，并且可以为预防目的而进行或者在临床病理学过程中进行。治疗的理想作用包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，减轻症状，消除任何直接的或间接的疾病病理学后果，防止转移，减小疾病进展的速度，改善或减轻疾病状况，并且减退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于延缓疾病或病症的发展或者减缓疾病或病症(即，CNS疾病或CNS病症)的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包括4个保守构架区(FRs)和3个高变区(HVRs)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单一VH或VL结构域可以足以赋予抗原-结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分离，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.(免疫学杂志)150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature(自然)352：624-628(1991)。
术语“载体”当用于本文时是指能够增殖其所连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到其被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
血脑屏障(“BBB”)是将多种外周-施用的化合物递送至中枢神经系统(CNS)的限制因素。具体地，BBB对能够自由渗透到CNS中的分子设置大小限制。通常，大分子治疗剂，如重组蛋白、反义药物、基因药物、单克隆抗体、或基于RNA干扰(RNAi)的药物不能以药学显著量有效地穿过BBB。尽管通常认为小分子药物能够穿过BBB，但是，由于它们缺少穿过BBB的转运，事实上有＜2％的所有小分子药物在脑中有活性。一般说来，为了以药学显著量穿过BBB，分子必须是脂溶性的并且具有小于400道尔顿的分子量，并且绝大部分小的有机分子不具有这两种分子特征。因此，BBB是用于脑和CNS的新的治疗剂、诊断剂和研究工具开发中的限制步骤。
为了避开或回避这一BBB问题，已经使用了侵入式经颅药物递送策略，诸如脑室内(ICV)输注、脑内(IC)施用和对流增强的扩散(CED)。还已经使用了可植入性装置。这些到脑的经颅药物递送方法的每一种都是昂贵的、侵入性的和大部分无效的。ICV途径典型地仅将蛋白递送至脑的室管膜表面，不递送到脑实质中。此外，由于脑内的低效率药物扩散，IC施用通常导致将药物仅递送至注射部位的局部区域。本发明提供一种关于这些高侵入性的和通常不令人满意的方法的备选方案，以避开BBB，允许试剂，例如肽、蛋白和抗体由外周血穿过BBB。本发明是基于在BBB中存在的内源性转运系统的应用来提供一种将需要的物质由外周血转运到CNS中的机制。
本发明还阐述了尚未解决的将试剂穿过BBB递送至CNS中的一种重要的关键因素：到脑的脑特异性递送。还没有记述高度脑特异性的受体介导的递送。先前用于递送的大部分受体也在外周组织中高度表达，使得不可能用这些分子进行仅脑特异性的递送。提高的脑特异性的优点是所施用的化合物更高的功效，以及在给定化合物剂量更少的潜在副作用。本发明提供令人惊讶的发现，即，LRP8是一种高度BBB-特异性的蛋白，其可以用于促进通常不能穿过BBB渗透到脑中的其他分子的转运，所述其他分子包括生物学分子，如抗体。
LRP8是低密度脂蛋白受体(LDLR)家族的一员(Brown和Goldstein，Science(科学)232(1986)：34-47)；然而，LRP8包含另外的外显子，其编码在细胞质尾中的新颖的59个氨基酸片段，其包括关于Src同源性3(SH3)-结合基序的最小共有序列的三个潜在的拷贝(Riddell等，J.Lipid Res.(脂质研究杂志)40(1999)：1925-1930)。LRP8的结构示意图显示在图1中。LRP8具有几个细胞外结构域，包括在N端附近由7个重复组成的配体-结合重复区(连续编号，在最N端部分从1开始，在重复区的最C端部分为7)，EGF重复区，YWTDβ-螺旋桨区和糖结构域。在短跨膜区之后，蛋白的C-端信号传导结构域位于细胞内。
与其他所述的转运蛋白相比，LRP8更加特异性地在脑/血脑屏障中表达。先前已经显示在人中，LRP8主要在脑和胎盘中表达，并且在其他组织中是不可检测的(Novak等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：11732-11736(1996)；Kim等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：8373-8380(1996))。对于使用其的治疗剂，与如果也在外周以及脑中发生结合时另外需要的治疗剂剂量相比，LRP8的高特异性不仅允许使用更小剂量的治疗剂，还可以通过降低治疗剂对除脑/CNS外的其他器官的暴露而减少或防止治疗剂的潜在的副作用。
本发明的一个目的是提供能够穿过BBB并且进入脑发挥其治疗和/或诊断功能的治疗性和诊断性组合物。因此，本发明提供包含LRP8-结合分子和CNS-活性化合物二者的化合物，其中所述LRP8-结合分子结合LRP8并且实施将所述化合物穿过BBB的转移，并且所述CNS-活性化合物在脑中具有需要的治疗性和/或诊断性功能。
在一个实施方案中，所述穿梭试剂的LRP8-结合分子部分特异性结合LRP8。在一个方面中，所述LRP8-结合分子以导致其穿过BBB转运的方式特异性结合LRP8。在一个方面中，所述LRP8-结合分子以导致所述LRP8-结合分子及其缔合的穿梭试剂的其余部分穿过BBB转运的方式特异性结合LRP8。
在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是LRP8的天然配体。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是颤蛋白。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是含硒蛋白质P。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是LRP8的天然配体的修饰形式。在一个方面中，所述天然配体通过添加标记而被修饰。在一个方面中，所述标记选自放射性标记、荧光团、生色团和亲和标签。在一个方面中，所述天然配体通过添加、缺失或置换一个或多个氨基酸而被修饰。在一个方面中，所述添加、缺失或置换相对于未修饰的天然配体与LRP8的结合调节修饰的天然配体与LRP8的结合。在一个这样的方面中，所述调节是增加的结合。在一个这样的方面中，所述调节是减少的结合。在一个方面中，所述添加、缺失或置换调节所述修饰的天然配体通过LRP8穿过BBB的转运。在一个这样的方面中，穿过BBB的转运被提高。在一个这样的方面中，穿过BBB的转运被减少。在一个方面中，天然配体的所述修饰形式是修饰的颤蛋白。在一个方面中，天然配体的所述修饰形式是修饰的SEQ ID NO：3的蛋白。在一个方面中，天然配体的所述修饰形式是修饰的含硒蛋白质P。在一个方面中，天然配体的所述修饰形式是修饰的SEQ ID NO：4的蛋白。在一个方面中，天然配体的所述修饰形式是一种免疫缀合物。
在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是LRP8的天然配体的LRP8-结合片段。在一个方面中，所述LRP8-结合片段是颤蛋白的片段。在一个方面中，所述LRP8-结合片段是具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的蛋白的片段。在一个方面中，所述LRP8-结合片段是含硒蛋白质P的片段。在一个方面中，所述LRP8-结合片段是具有SEQID NO：4的氨基酸序列的蛋白的片段。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是LRP8的天然配体修饰形式的LRP8-结合片段。在一个方面中，所述天然配体通过添加标记而被修饰。在一个方面中，所述标记选自放射性标记、荧光团、生色团和亲和标签。在一个方面中，所述天然配体通过添加、缺失或置换一个或多个氨基酸而被修饰。在一个方面中，所述添加、缺失或置换相对于天然配体的未修饰的LRP8-结合片段与LRP8的结合调节修饰的天然配体的LRP8-结合片段与LRP8的结合。在一个这样的方面中，所述调节是增加的结合。在一个这样的方面中，所述调节是减少的结合。在一个方面中，所述添加、缺失或置换调节修饰的天然配体的LRP8-结合片段通过LRP8穿过BBB的转运。在一个这样的方面中，穿过BBB的转运被提高。在一个这样的方面中，穿过BBB的转运被减少。在一个方面中，天然配体的LRP8-结合片段的修饰形式是修饰的颤蛋白的LRP8-结合片段。在一个方面中，天然配体的LRP8-结合片段的修饰形式是修饰的SEQ ID NO：3的蛋白的LRP8-结合片段。在一个方面中，天然配体的LRP8-结合片段的修饰形式是修饰的含硒蛋白质P的LRP8-结合片段。在一个方面中，天然配体的LRP8-结合片段的修饰形式是修饰的SEQ ID NO：4的蛋白的LRP8-结合片段。在一个方面中，天然配体的LRP8-结合片段的修饰形式是一种免疫缀合物。
在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复区。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复1。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复2。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复3。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复4。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复5。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复6。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的配体结合重复7。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的EGF重复区。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的YWTDβ-螺旋桨区。在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8的糖结构域区。
在一个实施方案中，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是抗体。在一个方面中，所述抗体是单克隆抗体。在一个方面中，所述抗体是嵌合抗体。在一个方面中，所述抗体是人源化的抗体。在一个方面中，所述抗体是人抗体。在一个方面中，所述抗体是多特异性抗体。在一个方面中，所述抗体被标记。在一个这样的方面中，所述标记选自放射性标记、荧光团、生色团和亲和标签。在一个方面中，所述抗体具有足以允许其穿过BBB的转运的针对LRP8的亲和力。在一个方面中，所述抗体具有足以允许穿梭试剂的其余部分(其是跨过BBB的部分)穿过BBB转运的针对LRP8的亲和力。在一个方面中，所述抗体不具有效应子功能。在一个方面中，所述抗体确实具有效应子功能。在一个方面中，所述抗体同种型选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA，IgD和IgE。在一个方面中，所述抗体结合LRP8的细胞外结构域。在一个方面中，所述抗体与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8细胞外结构域的结合。在一个方面中，所述抗体不与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8细胞外结构域的结合。在另一个方面中，前述任一方面的抗体是结合LRP8的抗体片段。
在一个实施方案中，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分选自肽、适体和小分子。在一个方面中，所述LRP8-结合分子的结合亲和力足以允许其穿过BBB的转运。在一个方面中，所述LRP8-结合分子具有足以允许穿梭试剂的其余部分(其是跨过BBB的部分)穿过BBB转运的针对LRP8的亲和力。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是LRP8-结合肽。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是适体。在一个方面中，所述LRP8-结合分子是小分子。
在一个实施方案中，穿梭试剂的CNS-活性化合物部分是对一种或多种CNS靶标有作用的化合物。在一个方面中，所述作用在研究中是有用的。在一个方面中，所述作用是治疗性作用。在一个方面中，所述作用是在诊断中有用的作用。在一个这样的方面中，所述CNS-活性化合物结合CNS中的一种或多种靶标并且允许那些靶标成像。在一个这样的方面中，所述CNS-活性化合物与一种或多种CNS靶标的结合指示CNS疾病或病症的存在或进展。
在一个实施方案中，穿梭试剂的CNS-活性化合物部分针对其治疗CNS疾病或病症的能力进行选择。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是淀粉样变性。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是癌症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是眼科疾病或病症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是病毒或微生物感染。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是炎症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是缺血。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经变性疾病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是发作。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是行为障碍。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是溶酶体贮积病。在一个方面中，所述CNS-活性化合物消除所述疾病或病症。在一个方面中，所述CNS-活性化合物减轻所述疾病或病症的严重性或持续时间。在一个方面中，所述CNS-活性化合物防止所述疾病或病症的发作或进展。
在一个实施方案中，穿梭试剂的CNS-活性化合物部分针对其检测CNS疾病或病症的能力进行选择。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是淀粉样变性。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是癌症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是眼科疾病或病症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是病毒或微生物感染。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是炎症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是缺血。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经变性疾病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是发作。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是行为障碍。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是溶酶体贮积病。在一个方面中，所述CNS-活性化合物在症状发作之前检测所述疾病或病症。在一个方面中，所述CNS-活性化合物允许评估所述疾病或病症的严重性或持续时间。在一个方面中，所述CNS-活性化合物允许对所述疾病或病症的非侵入性检测和/或成像。在一个方面中，所述成像是通过放射线照相术进行的。在一个方面中，所述成像是通过体层摄影术进行的。在一个方面中，所述成像是通过核磁共振成像进行的。
在一个实施方案中，CNS-活性化合物选自抗体、蛋白、肽、适体、抑制性核酸和小分子，或前述任一项的片段。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是抗体。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是蛋白。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是肽。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是适体。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是抑制性核酸。在一个这样的方面中，所述抑制性核酸是siRNA。在一个这样的方面中，所述抑制性核酸是核酶。在一个方面中，所述CNS-活性化合物是小分子。在一个方面中，CNS-活性化合物是前述任一项保留其在CNS中的活性的片段。在一个方面中，CNS-活性化合物被标记。在一个这样的方面中，所述标记选自放射性标记、荧光团、生色团和亲和标签。
在一个实施方案中，所述LRP8-结合分子与所述CNS-活性化合物缀合。在一个方面中，缀合通过无接头的直接缀合进行。在一个方面中，缀合通过接头结构部分的方式进行。在一个方面中，缀合是共价的。在一个方面中，缀合是非共价的。在一个方面中，所述接头在CNS内可分解。在一个方面中，所述缀合导致所述LRP8-结合分子与所述CNS-活性化合物中的每一个保留它们的正常结合和/或活性的一部分。在一个这样的方面中，每一种原始活性的100％被保留。
在一个实施方案中，所述LRP8-结合分子是多特异性抗体。在一个方面中，所述多特异性抗体是双特异性的。在一个这样的方面中，所述抗体特异性结合LRP8并且还通过组成第二特异性的CNS-结合化合物的方式而结合另一种CNS靶标。
在一个实施方案中，穿梭试剂包含多于一种LRP8-结合分子。在一个方面中，所述LRP8-结合分子的每个实例是相同的。在一个方面中，所述LRP8-结合分子不同。在一个实施方案中，穿梭试剂包含多于一种CNS-活性化合物。在一个方面中，穿梭试剂中CNS-活性化合物的每个实例是相同的。在一个方面中，所述CNS-活性化合物不同。
在一个实施方案中，本发明的穿梭试剂被修饰以调节分子的血清半衰期。在一个方面中，所述穿梭试剂的LRP8-结合分子部分被修饰。在一个方面中，所述穿梭试剂的CNS-活性化合物部分被修饰。在一个方面中，所述穿梭试剂的LRP8-结合分子部分和CNS-活性化合物部分均被修饰。在一个方面中，所述修饰是糖基化。在一个方面中，所述修饰是聚乙二醇化。在一个方面中，所述修饰是添加Fc结构域。在特定方面中，血清半衰期的平均值是未修饰的穿梭试剂的血清半衰期的至少约5倍大。
在一个实施方案中，配制本发明任一前述化合物。在一个方面中，制剂是无菌的。在一个方面中，所述制剂具有药用载体。在一个方面中，所述制剂适于施用途径。在一个方面中，所述制剂还包含另外的化合物。在一个这样的方面中，选择所述另外的化合物来治疗需要治疗的疾病。
在一个实施方案中，提供编码穿梭试剂的蛋白质样部分的核酸分子。在一个方面中，提供编码穿梭试剂的LRP8-结合分子部分的核酸分子。在一个方面中，提供编码穿梭试剂的CNS-活性化合物部分的核酸分子。在一个方面中，提供编码穿梭试剂的LRP8-结合分子和CNS-活性化合物两个部分的单一核酸分子。在一个实施方案中，提供包含前述核酸分子中的任一种的载体。在一个方面中，所述载体是表达载体。在一个实施方案中，提供转化了本发明的载体的宿主细胞。在一个方面中，所述宿主细胞是原核宿主细胞。在一个方面中，所述宿主细胞是真核宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供制备本发明的穿梭试剂的方法。在一个方面中，所述穿梭试剂是完全蛋白质样的，并且由本发明的宿主细胞表达和纯化。在一个方面中，穿梭试剂仅有一部分是蛋白质样的，并且该部分由本发明的宿主细胞表达和纯化。
在一个实施方案中，本发明的前述组合物中的任一种用于制备药物。在一个实施方案中，本发明的前述组合物中的任一种用于制备用于治疗CNS疾病或病症的药物。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是淀粉样变性。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是癌症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是眼科疾病或病症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是病毒或微生物感染。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是炎症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是缺血。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经变性疾病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是发作。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是行为障碍。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是溶酶体贮积病。
在一个实施方案中，本发明的前述组合物中的任一种用于制备用于检测CNS疾病或病症的药物。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是淀粉样变性。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是癌症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是眼科疾病或病症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是病毒或微生物感染。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是炎症。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是缺血。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是神经变性疾病。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是发作。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是行为障碍。在一个方面中，所述CNS疾病或病症是溶酶体贮积病。
在一个实施方案中，提供使用本发明的前述组合物来治疗受试者中的CNS疾病或病症的方法。在一个实施方案中，提供使用本发明的前述组合物来检测、分期或监测受试者中CNS疾病或病症的进展的方法。在一个方面中，外周施用前述组合物中的任一种。在一个方面中，所述施用是口服的。在一个方面中，所述施用是静脉内的。在一个方面中，所述施用是肌内的。在一个方面中，所述施用是皮下的。在一个方面中，所述施用是腹膜内的。在一个方面中，所述施用是直肠的。在一个方面中，所述施用是经口的。在一个方面中，所述施用是鼻内的。在一个方面中，所述施用是经皮的。在一个方面中，所述施用是吸入的。在一个方面中，施用约1mg至约100mg的组合物。
在一个实施方案中，CNS疾病或病症可以通过施用本发明的穿梭试剂联合非侵入性疗法进行治疗。在一个方面中，所述疗法是放射性疗法。在另一个方面中，所述疗法是行为疗法或精神疗法。
A.示例性的穿梭试剂
在一个方面中，本发明提供与LRP8结合并且穿过BBB转运到CNS中的分离的穿梭试剂。如本文所述，穿梭试剂包含至少一种LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物。至少一种LRP8-结合分子与所述至少一种CNS-活性化合物之间缀合。
所述穿梭试剂的LRP8-结合分子部分特异性结合LRP8并且促进所述穿梭试剂穿过BBB的转运。特异性结合给定抗原的结合分子的鉴定和制备在本领域中是公知的。可以是本发明的LRP8-结合分子的特定分子包括，但不限于，抗体、肽、LRP8的天然配体(即，颤蛋白，ApoE，或含硒蛋白质P)、LRP8的天然配体的修饰版本、适体和小分子，以及前述任一项的保留LRP8-结合活性的片段。在特定实施方案中，LRP8-结合分子不与LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在特定实施方案中，LRP8-结合分子与LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。在特定实施方案中，LRP8-结合分子不干扰LRP8的正常功能行使。在特定实施方案中，LRP8-结合分子拮抗正常的LRP8功能。在特定实施方案中，LRP8-结合分子激动正常的LRP8功能。
所述穿梭试剂的CNS-活性化合物部分在受试者的CNS中具有作用。CNS活性化合物包括，但不限于，治疗性化合物、诊断性化合物和具有在研究中有用的作用的化合物。治疗性CNS-活性化合物是有效治疗一种或多种CNS疾病或病症、预防一种或多种CNS疾病或病症的发作或发展、或减小或防止一种或多种CNS疾病或病症的严重性、持续或症状的化合物。诊断性CNS活性化合物是有效用于诊断或分期一种或多种CNS疾病或病症或有效用于一个或多个脑部区域成像的化合物。
可以是本发明的CNS-活性化合物的特定分子包括，但不限于，CNS靶标结合分子、CNS靶标抑制剂、CNS靶标激活剂、药物、酶、细胞毒素和检测分子(通常针对CNS或对特定的CNS靶标特异的)。可以是本发明的CNS-活性化合物的特定分子包括，但不限于，抗体、肽、蛋白、一种或多种CNS靶标的天然配体、一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰版本、适体、抑制性核酸(即，小的抑制性RNAs(siRNA)和短的发夹RNAs(shRNA))、核酶和小分子、或前述任一项的活性片段。示例性的本发明的CNS-活性化合物记述在本文中，并且包括，但不限于，抗体、适体、蛋白、肽、抑制性核酸和小分子以及前述任一项的本身或特异性识别CNS靶标分子和/或对CNS靶标分子作用(即，抑制、激活或检测)的活性片段，所述CNS靶标分子诸如，但不限于，淀粉样前体蛋白或其部分、β淀粉样蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、DR6、早老蛋白、ApoE、神经胶质瘤或其他CNS癌症标记以及神经营养蛋白。
当将抗体与药物缀合时，得到的复合物称为抗体-药物缀合物(ADC)。在一个实施方案中，穿梭试剂是一种ADC。除了先前已知的用于治疗本文所述的CNS疾病或病症的治疗性化合物之外，例如，在下面G部分中所的化合物，其可以在特定实施方案中用作CNS-活性化合物，一般的细胞毒性药物可以用作本发明的穿梭试剂中的一种或多种CNS-活性化合物。所述药物包括，但不限于，美坦生类化合物(maytansinoid)(参见美国专利号5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235B1)；auristatin如monomethylauristatin药物结构部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，以及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利号5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.(癌症研究)53：3336-3342(1993)；和Lode等，Cancer Res.(癌症研究)58：2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等，Current Med.Chem.(当前药物化学)13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic & Med.Chem.Letters(生物有机和药物化学通信)16：358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.(生物缀合物化学)16：717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.& Med.Chem.Letters (生物有机和药物化学通信)12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.(药物化学杂志)45：4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他赛(docetaxel)，紫杉醇(paclitaxel)，拉罗他赛(larotaxel)，替司他赛(tesetaxel)，和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯族化合物(trichothecene)；以及CC1065。
在另一个实施方案中，穿梭试剂包含至少一种CNS-活性化合物，所述CNS-活性化合物是酶活性毒素或其片段。所述毒素或其片段包括，但不限于，白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，蒴莲根毒素A链，α-八叠球菌，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，依诺霉素，和单端孢霉烯族化合物。
在任一前述实施方案中，穿梭试剂可以包含一个或多个结合放射性原子的部分以形成放射性缀合物。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素。当使用放射性缀合物进行检测时，其可以包括用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也已知为磁共振成像，mri)的自旋标记，同样如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
在任一前述实施方案中，穿梭试剂中包含的抗体可以被人源化。在一个这样的实施方案中，穿梭试剂中包含的抗体包含来自非人物种的蛋白的高变区(HVRs)，并且还包含接受体人构架，例如，人免疫球蛋白构架或人共有构架。
在本发明的另一个方面中，按照任一前述实施方案穿梭试剂中包含的抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化的抗体或人抗体。在一个实施方案中，穿梭试剂中包含的抗体是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体，或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，例如，本文定义的任一抗体种类或同种型的完整抗体。在另一个方面中，按照任一前述实施方案的穿梭试剂可以单独地或组合地结合如在下述部分1-7中所述的任一特征：
1.亲和力
在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂具有充分的针对LRP8的亲和力，足以允许所缀合的CNS-活性化合物的LRP8-介导的转运。在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂具有至少两种亲和力：LRP8-结合分子部分具有针对LRP8的亲和力，CNS-活性化合物具有针对至少一种CNS靶标的亲和力。在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，Kd通过用目的蛋白及其靶标结合配偶体按照本领域公知的标准技术进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量。例如，对于包含Fab的穿梭试剂，测定可以如下进行。Fabs对抗原的溶液结合亲和力这样测量：通过在存在滴定系列的未标记的抗原下用最低浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的平板捕获所结合的抗原(参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999))。为了确定用于该测定的条件，将
Figure BDA00001907018200341
多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml的捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温下(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)上，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释液混合(例如，与抗-VEGF抗体，Fab-12的测量一致，在Presta等，Cancer Res.(癌症研究)57：4593-4599(1997))。然后将目的Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的时间期间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获平板中用于在室温下温育(例如，1小时)。然后，去除溶液，将平板用在PBS中的0.1％聚山梨酸酯20(吐温
Figure BDA00001907018200342
)洗涤八次。当平板已经干燥时，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将该平板在TOPCOUNTTM γ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争结合测定。
按照另一个实施方案，Kd用表面等离子体共振测定法测量，所述表面等离子体共振测定法在25℃用以～10反应单位(RU)的固定的靶标(即，LRP8，或CNS靶标)CM5芯片使用
Figure BDA00001907018200343
-2000或
Figure BDA00001907018200344
-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)进行。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照供应商的使用说明活化。将靶标用10mM pH 4.8的乙酸钠稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10个反应单位(RU)的偶联的蛋白。在注射抗原后，注射1M的乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力性测量，将以确定Kd(0.78nM至500nM)的目的蛋白(例如，Fab，抗体，免疫缀合物，或其他结合蛋白)的两倍连续稀释液在25℃以大约25μl/min的流速注射在具有0.05％聚山梨酸酯20(吐温-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA00001907018200345
评估软件版本3.2)通过同时拟合缔合和解离传感图而计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)作为koff/kon比率计算。参见，例如，Chen等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离子共振测定的on-速率超过106M-1s-1，则该on-速率可以通过使用荧光猝灭技术确定，该荧光猝灭技术技术在25℃在存在增加浓度的抗原的条件下测量20nM在pH 7.2的PBS中的抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm通带)，所述抗原浓度如在分光光度计中测量，诸如在配备停流的分光光度计(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或具有搅拌小杯的8000-系统SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中测量。如本领域普通技术人员应该理解的，可以容易地采用前述测定法来测量非-抗体结合分子。
2.片段
在特定实施方案中，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是较大LRP8-结合蛋白的LRP8-结合片段。在特定实施方案中，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是LRP8的天然配体的LRP8-结合片段，或其修饰版本。在特定实施方案中，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是抗-LRP8抗体的LRP8-结合片段。抗体片段包括，但不限于，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，以及下文所述的其他片段。对于特定抗体片段的综述，参见Hudson等Nat.Med.(自然医药)9：129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)中；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894与5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
在特定实施方案中，穿梭试剂包含多特异性抗体的片段。双抗体是具有两个抗原-结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.(自然医药)9：129-134(2003)；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90：6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体也记述在Hudson等，Nat.Med.(自然医药)9：129-134(2003)中。
在特定实施方案中，穿梭试剂包含一种或多种单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在特定实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
片段可以通过多种技术制备，包括但不限于，蛋白的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合分子和人源化分子
本发明的穿梭试剂包含LRP8-结合分子和CNS-活性化合物二者，并且因此是嵌合分子。在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂的LRP8-结合分子部分是嵌合分子。在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂的CNS-活性化合物部分是嵌合分子。在特定实施方案中，本发明提供的作为穿梭试剂的抗体或其部分是嵌合抗体。特定的嵌合抗体记述在，例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，81：6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“种类转换的”抗体，其中种类或亚类已经由亲本抗体的种类或亚类变化。嵌合抗体包括其抗原-结合片段。
本领域普通技术人员应该理解，修饰来源于非人物种的穿梭试剂中的一种或多种氨基酸是合乎需要的，以使其在面对人免疫系统时更加“人化”和/或当施用给人时增加其活性或半衰期。在非人抗体或嵌合抗体的情形中(其中，分别没有抗体或一些抗体是来源于人分子的)，最常进行“人源化”。在特定实施方案中，包含非人或嵌合抗体的穿梭试剂被人源化。在特定实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。典型地，非人抗体被人源化，以减少对人的免疫原性同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVRs，例如，CDRs(或其部分)来源于非人抗体，FRs(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所衍生的抗体)的相对应的残基置换，例如，以恢复或提高抗体的特异性或亲和力。
人源化抗体以及制备其的方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，并且进一步记述在例如Riechmann等，Nature(自然)332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337，7,527,791，6,982,321，和7,087,409；Kashmiri等，Methods(方法)36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移接)；Padlan，Mol.Immunol.(分子免疫学)28：489-498(1991)(描述“表面再建”)；Dall’Acqua等，Methods(方法)36：43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等，Methods(方法)36：61-68(2005)与Klimka等，Br.J.Cancer(英格兰癌症杂志)，83：252-260(2000)(描述针对FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳适配”法(参见，例如，Sims等J.Immunol.(免疫学杂志)151：2296(1993))选择的构架区；来源于特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(参见，例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，89：4285(1992)；和Presta等J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2623(1993))；人成熟的(体细胞成熟的)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的构架区(参见，例如，Baca等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272：10678-10684(1997)和Rosok等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)271：22611-22618(1996))。
4.人分子
在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂是人源的。在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂中所包含的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的多种技术制备。人抗体通常记述在van Dijk和van deWinkel，Curr.Opin.Pharmacol.(当前药理学观点)5：368-74(2001)和Lonberg，Curr.Opin.Immunol.(当前免疫学观点)20：450-459(2008)中。
人抗体可以通过给转基因动物施用免疫原而制备，所述转基因动物已经被修饰来响应抗原刺激产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物典型地包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这样的转基因动物中，通常内源性免疫球蛋白基因座已被失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.(自然生物技术)23：1117-1125(2005)。还参见，例如，美国专利号6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利号5,770,429，其描述
Figure BDA00001907018200381
技术；美国专利号7,041,870，其描述K-M技术，和美国专利申请公布号US 2007/0061900，其描述
Figure BDA00001907018200383
技术)。来自由这样的动物产生的完整抗体的人可变区可以进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合进行修饰。
人抗体还可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经记述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系。(参见，例如，KozborJ.Immunol.(免疫学杂志)，133：3001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术和应用)，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)；和Boerner等，J.Immunol.(免疫学杂志)，147：86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也记述在Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (美国国家科学院学报)，103：3557-3562(2006)中。另外的方法包括记述在例如美国专利号7,189,826(描述由杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)和Ni，XiandaiMianyixue(现代免疫学)，26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还记述在Vollmers和Brandlein，Histologyand Histopathology(组织学和组织病理学学)，20(3)：927-937(2005)与Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology(实验和临床药理学方法和发现)，27(3)：185-91(2005)。
人抗体还可以通过分离选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列而产生。然后，可以将所述可变结构域序列与需要的人恒定结构域组合。从抗体文库选择人抗体的技术记述在下文中。
5.文库来源的蛋白
本发明的穿梭试剂、LRP8-结合分子和CNS-活性化合物可以通过筛选关于具有一种或多种所需要的活性的穿梭试剂、LRP8-结合分子和CNS-活性化合物的组合文库而分离。例如，本领域已知有多种方法用于产生噬菌体文库并且筛选所述文库获得具有所需要的结合特征的蛋白。这样的方法综述在例如Sidhu等，编，Phage Display In Biotechnology andDrug Discovery(生物技术和药物发现中的噬菌体展示)，CRC Press(2005)；Hoogenboom等Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O’Brien等，编，Human Press，Totowa，NJ，2001)，并且进一步记述在例如McCafferty等，Nature(自然)348：552-554；Clackson等，Nature(自然)352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in MolecularBiology(分子生物学方法)248：161-175(Lo，编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)338(2)：299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)284(1-2)：119-132(2004)。
在针对抗体鉴别的特定噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的全体成员库，并且在噬菌体文库中随机重组，然后，其可以筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等，Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)，12：433-455(1994)中所述。噬菌体典型地展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自被免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆未接触抗原的全体成员库(例如，来自人)，从而提供单一来源的抗体至宽泛范围的非自体以及自体抗原，而无需任何的免疫，如Griffiths等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未接触抗原的文库还可以这样合成制备：通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段，并且使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并且在体外完成重排，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布包括，例如：美国专利号5,750,373，和美国专利公布号2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936，和2009/0002360。
由人文库分离的蛋白(即，抗体或抗体片段)在本文中认为是人蛋白。
6.多特异性抗体
在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在特定实施方案中，一种结合特异性是针对LRP8的并且另一种结合特异性是针对任意其他CNS靶标的。在特定实施方案中，多特异性抗体可以结合LRP8和任意其他CNS靶标的两个不同表位。多特异性抗体还可以用来将CNS-活性化合物定位到表达LRP8的细胞。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature(自然)305：537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))，和“凸起-在-孔中”改造(参见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体还可以这样制备：通过改造静电操作作用(engineeringelectrostatic steering effects)用于制备抗体Fc-异型二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等，Science (科学)，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.(免疫学杂志)，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等，J.Immunol.(免疫学杂志)，152：5368(1994))；和制备三特异性抗体，如例如在Tutt等，J.Immunol.(免疫学杂志)147：60(1991)中所述。
具有三个以上功能抗原结合位点的改造的抗体，包括“章鱼(Octopus)抗体”也包括在本文中(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
本发明的抗体或片段还包括“双重作用Fab(Dual Acting FAb)”或“DAF”，其包含结合LRP8以及另一个不同抗原(例如参见，US 2008/0069820)，即CNS靶标的抗原结合位点。
7.穿梭试剂变体
在特定实施方案中，考虑本发明提供的穿梭试剂的氨基酸序列变体。例如，当所述部分是蛋白时，可以理想地提高穿梭试剂的LRP8-结合分子部分或CNS-活性化合物部分、或上述两个部分的结合亲和力和/或其他生物学特性。所有或部分穿梭试剂的氨基酸序列变体可以通过向编码所述穿梭试剂或其部分的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成制备。所述修饰包括，例如，从所述穿梭试剂的氨基酸序列中缺失、和/或插入和/或置换残基。可以进行缺失、插入和置换的任意组合，以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需要的特征，例如，靶标结合，诸如结合LRP8和结合一种或多种所需要的CNS靶标。
a)置换、插入和缺失变体
在特定实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的穿梭试剂变体。本发明提供的穿梭试剂中的变异可以这样进行，例如，使用例如在美国专利号5,364,934中提及的保守和非保守突变的任意技术和指导进行。当考虑进行修饰的穿梭试剂的一个或多个部分是抗体时，用于置换诱变的目的位点包括高变区和构架区。保守氨基酸置换显示在表1中，其标题为“保守置换”。更实质性的变化提供在表1中，其标题为“示例性置换”，并且参照氨基酸侧链种类在下文中进一步描述。关于确定哪种或哪些氨基酸残基可以插入、置换或缺失而不会不利地影响所需要的活性的指导可以通过将所述穿梭试剂的LRP8-结合分子和/或CNS-活性化合物的序列与已知同源的蛋白分子比较并且将在高度同源性区域中进行氨基酸序列变化的数目减至最少而进行。扫描氨基酸分析也可以用来沿着连续序列鉴定一种或多种氨基酸。氨基酸置换可以引入到目的穿梭试剂中，并且筛选产物的理想活性，例如，与LRP8和/或CNS靶标的保留的/提高的结合或减少的免疫原性＝。
表1
Figure BDA00001907018200421
按照常规侧链特性可以将氨基酸分成下述组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香的：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换将限定为这些种类中的一种的成员与另一种类交换。
在抗体的情形中，一种类型的置换变体包括置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性的改进(例如，提高)(例如，增加的亲和力，减少的免疫原性)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。这种类型的示例性的置换变体是亲和力成熟抗体，其可以便利地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所述的那些。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变异抗体展示在噬菌体上并且筛选特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。
例如，可以在HVRs中进行变化(例如，置换)，以提高抗体亲和力。所述变化可以在HVR“热点”和/或SDRs(a-CDRs)上进行，所述“热点”即由在体细胞成熟过程中高频率发生突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.(分子生物学方法)207：179-196(2008))，对所得到的变异VH或VL检测结合亲和力。通过构建和由二级文库重新选择的亲和力成熟已经记述在例如Hoogenboom等Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)178：1-37(O’Brien等，编，HumanPress，Totowa，NJ，(2001).)中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸-定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后，筛选该文库以鉴定具有所需要的亲和力的任意抗体变体。另一种引入多样性的方法包括HVR-定向方法，其中一些HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模来鉴定。通常特别靶向CDR-H3和CDR-L3。
在特定实施方案中，置换、插入或缺失可以发生在一个或多个HVRs中，只要所述变化基本上不减少抗体与抗原结合的能力。例如，可以在HVRs中进行基本上不减少结合亲和力的保守变化(例如，如本文提供的保守置换)。所述变化可以在HVR“热点”或SDRs之外。在上文提供的变异VH和VL序列的特定实施方案中，每个HVR是未变化的、或包含不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体的残基或区域的有效方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science(科学)，244：1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，如arg，asp，his，lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。其他置换可以在表明针对初始置换的功能敏感性的氨基酸位置引入。备选地，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构鉴定抗体与抗原之间的接触点。所述接触残基和邻近的残基可以被靶向或消除作为置换的候选。可以筛选变体来确定它们是否包含所需要的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围在一个残基到包含一百以上残基的多肽的氨基-端和/或羧基-端融合，以及单个氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括在抗体的N-端或C-端融合酶(例如，用于ADEPT)或融合增加抗体的血清半衰期的多肽。
b)糖基化变体
在特定实施方案中，改变本发明提供的穿梭试剂以增加或减少所述穿梭试剂被糖基化的程度。向穿梭试剂添加或删除糖基化位点可以便利地通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而实现。
在穿梭试剂包含Fc区的情形中，可以改变连接在其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体典型地包含分支的、双触角(biantennary)寡糖，其通常通过N-连接连接到Fc区的CH2结构域的Asn297上。参见，例如，Wright等TIBTECH 15：26-32(1997)。所述寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及与双触角寡糖结构的“茎干”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行对本发明的穿梭试剂中的寡糖的修饰，从而产生具有某些改善的特性的穿梭试剂变体。
在一个实施方案中，提供具有缺少连接(直接或间接地)到Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的穿梭试剂变体。例如，在所述穿梭试剂中，岩藻糖的量可以为1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过相对于如通过MALDI-TOF质谱测量的连接到Asn 297上的所有糖结构(例如，复合型、杂合型和高甘露糖结构)的总和计算在Asn297的糖链内的岩藻糖的平均量而确定，例如，如在WO 2008/077546中所述。Asn297是指在Fc区中位于大约位置297(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体内较小的序列变化，Asn297还可以位于位置297的上游或下游大约±3个氨基酸处，即，在位置294和300之间。所述岩藻糖化的变体可以具有提高的ADCC功能。参见，例如，美国专利公布号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd)。关于“去岩藻糖化”或“岩藻糖-不足”的抗体变体的公布的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)。能够产生去岩藻糖化的蛋白的细胞系的实例包括缺失蛋白岩藻糖化的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是在实施例11中)，和敲除的细胞系，如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)，94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有平分型寡糖的穿梭试剂变体，例如，其中连接到所述穿梭试剂的Fc区上的双触角寡糖被GlcNAc平分。所述穿梭试剂变体可以具有减少的岩藻糖化合/或提高的ADCC功能。所述穿梭试剂变体的实例记述在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在连接到Fc区的寡糖中具有至少一种半乳糖残基的穿梭试剂变体。所述变体可以具有提高的CDC功能。在抗体情形中的所述变体记述在例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
c)Fc区变体
在特定实施方案中，可以向一种或多种氨基酸修饰引入到本发明提供的穿梭试剂所包含的Fc区中，由此产生Fc区变体。所述Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置含有氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。
在特定实施方案中，本发明考虑包含具有一些而不是全部效应子功能的Fc变体的穿梭试剂，这使得其成为用于这样的应用的理想候选物，在所述应用中，穿梭试剂的体内半衰期是重要的而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定来验证CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定来确保所述抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，而保留FcRn结合能力。调控ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.(免疫学年度综述)9：457-492(1991)第464页的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例记述在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom，I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA(美国国家科学院学报)83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)82：1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)166：1351-1361(1987))中。备选地，可以使用非放射性测定法(参见，例如，关于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和
Figure BDA00001907018200461
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。对所述测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如，在动物模型如Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95：652-656(1998)中公开的那些中。还可以进行C1q结合测定来验证抗体不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods(免疫学方法)202：163(1996)；Cragg，M.S.等，Blood(血液)101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood(血液)103：2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法(参见，例如，Petkova，S.B.等，Int’l.Immunol.(国际免疫学)18(12)：1759-1769(2006))进行FcRn结合和体内清除/半衰期确定。
具有减少是效应子功能的包含Fc的穿梭试剂包括具有Fc区残基238，265，269，270，297，327和329中的一个或多个的置换的那些(美国专利号6,737,056)。所述Fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327的两个或多个置换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297置换为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
记述了具有提高的或减小的与FcRs的结合的某些Fc变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2)：6591-6604(2001).)
在特定实施方案中，包含Fc的穿梭试剂变体包含具有一个或多个提高ADCC的氨基酸置换的Fc区，例如，具有在Fc区的位置298，333，和/或334(残基的EU编号)的置换。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致改变的(即，提高的或减小的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如在美国专利号6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie等，J.Immunol.(免疫学杂志)164：4178-4184(2000)中所述。
US2005/0014934A1(Hinton等)描述了具有增加的半衰期和提高的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其负责将母体IgGs转运到胎儿(Guyer等，J.Immunol.(免疫学杂志)117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.(免疫学杂志)24：249(1994))。那些抗体包含在其中具有一个或多个提高Fc区与FcRn的结合的置换的Fc区。所述Fc变体包括具有在下述Fc区残基中的一个或多个的置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。
关于其他Fc区变体的实例，还参见Duncan&Winter，Nature(自然)322：738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO94/29351。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在特定实施方案中，当穿梭试剂包含抗体或抗体片段时，可以理想地产生半胱氨酸改造的抗体，例如，“thioMAbs”，其中所述抗体或抗体片段的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，所置换的残基发生在抗体的可接近的位点。通过用半胱氨酸置换这些残基，由此反应性硫醇基团位于抗体的可接近位点，并且可以用于将所述抗体缀合到其它结构部分上，如药物结构部分或接头-药物结构部分，从而产生免疫缀合物，如本文进一步所述。在特定实施方案中，下述残基中的任一种或多种可以用半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)衍生物
在特定实施方案中，本发明提供的穿梭试剂可以进一步修饰以包含本领域已知的且容易获得的另外的非蛋白质样结构部分。适于穿梭试剂的衍生的结构部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚合物或随机的共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/环氧乙烷共聚物(prolypropylene oxide/ethylene oxide co-polymers)，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇，以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可以具有制备中的优点。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是分支的或不分支的。连接到穿梭试剂上的聚合物的数目可以不同，并且如果连接多于一个聚合物，则它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数目和/或类型可以基于下述考虑确定，所述考虑包括但不限于，穿梭试剂要提高的特定特性或功能，穿梭试剂衍生物是否将用于限定条件下的治疗等等。
在另一个实施方案中，提供穿梭试剂和非蛋白质样结构部分的缀合物，其可以通过暴露于射线而被选择性加热。在一个实施方案中，所述非蛋白质样结构部分是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)102：11600-11605(2005))。射线可以是任意波长的，并且包括但不限于，不损伤普通细胞的波长，但是其将所述非蛋白质样结构部分加热至将邻近所述抗体-非蛋白质样结构部分的细胞杀死的温度。
B.重组方法和组合物
穿梭试剂可以使用本领域公知的重组方法和组合物产生。对于一种抗体生产和纯化的实例，参见美国专利号4,816,567。在一个实施方案中，提供编码本文所述的整个或部分穿梭试剂的分离的核酸。当所述穿梭试剂是多特异性抗体时，或当穿梭试剂的一部分是抗体时，所述核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。
在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，其中所述穿梭试剂或其部分是抗体或抗体片段，宿主细胞包含(例如，已经转化下述)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。
在一个实施方案中，提供制备穿梭试剂或其部分的方法，其中所述方法包括在适于表达所述穿梭试剂或其部分的条件下，培养如上文提供的包含编码所述穿梭试剂或其部分的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于穿梭试剂的重组生产，分离例如如上文所述的编码穿梭试剂的核酸并且将其插入到一种或多种载体中，用于进一步的克隆和/或在宿主细胞中的表达。所述核酸可以容易地用常规方法分离并测序(例如，通过使用能够特异性结合编码所述穿梭试剂的基因的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达穿梭试剂编码载体、LRP8-结合分子编码载体或CNS-活性化合物编码载体的适当的宿主细胞包括本文所述的原核细胞或真核细胞。例如，穿梭试剂可以在细菌中产生，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199，和5,840,523。(还参见Charlton，Methodsin Molecular Biology(分子生物学方法)，卷248(B.K.C.Lo，编，HumanaPress，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊状物中分离在可溶级分中的穿梭试剂，并可以进一步纯化。
除了原核生物，真核微生物，如丝状真菌或酵母也是穿梭试剂编码载体的适当的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致以部分或完全人糖基化模式生产穿梭试剂。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.(自然生物技术)24：210-215(2006)。用于蛋白表达的适当的原核和真核宿主细胞记述在例如PCT公布号WO2008080045中。
用于表达糖基化的穿梭试剂的适当的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种可以与昆虫细胞联合应用、特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，Thomas等，“Productionof Therapeutic Products in Plants(在植物中生产治疗性产物)，”U.Calif.Agricultural Biotechnology in California Series，Pub.No.8078(2002)，和美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978，和6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。其他有用的哺乳动物宿主细胞的实例是转化了SV40(COS-7)的猴肾CV1株系；人胚肾株系(293或293细胞，如在例如Graham等，J.Gen Virol.(遗传病毒学杂志)36：59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如在例如Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77：4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如Y0，NS0和Sp2/0。对于适于例如抗体生产的特定哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology (分子生物学方法)，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
除了在宿主细胞中克隆和表达之外，然后从所述宿主细胞培养物纯化穿梭试剂或其部分，其他技术已知的生产本发明的穿梭试剂或其部分的方法在本领域中是已知的。例如，蛋白可以通过使用固相技术的直接的肽合成(参见，例如，Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)；或通过按照供应商的使用说明应用自动化肽合成仪来合成。
如本文所述，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分和CNS-活性化合物部分可以共价或非共价缀合，并且用或不用接头。本领域普通技术人员应该理解，前述制备穿梭试剂的方法等价适用于分开生产来自同一穿梭试剂的其他部分的穿梭试剂的成分。当包含LRP8-结合分子部分和CNS-活性化合物部分之间的非共价缀合的单一穿梭试剂的不同部分分开生产时，之后可以使用已知的化学和分子生物学技术按照特定穿梭试剂中所用的特定缀合法将它们组合成单一穿梭载体。
C.测定
可以通过本领域已知的多种测定法鉴定、筛选或表征本发明提供的穿梭试剂的物理/化学特性和/或生物学活性。
1.结合测定和其他测定
穿梭试剂的LRP8-结合分子部分结合LRP8，并且可以测量所述结合活性。在特定实施方案中，穿梭试剂的CNS-活性部分是特异性结合一种或多种CNS靶标的结合分子。因此，在一个实施方案中，例如，通过已知的方法，如ELISA，Western印迹等，检测本发明的穿梭试剂的靶标结合活性(即，与LRP8和/或CNS靶标结合)。
在另一个方面中，竞争测定法可以用来鉴定与其他已知的LRP8或CNS靶标结合剂竞争与LRP8或CNS靶标的结合的穿梭试剂。在特定实施方案中，所述竞争性穿梭试剂结合已知的LRP8或CNS靶标结合剂所结合的相同表位(例如，线性的或构象表位)。关于定位抗体或其他结合蛋白所结合的表位的详细示例性方法提供在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols(表位绘图流程)，”在Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)卷66(Humana Press，Totowa，NJ)中。
在一种示例性的竞争测定法中，将固定的LRP8或CNS靶标在包含第一标记的结合剂(即，抗体)和第二未标记的穿梭试剂的溶液中温育，所述第一标记的结合剂结合LRP8或CNS靶标，所述第二未标记的穿梭试剂被检测其与所述第一结合剂竞争与LRP8或CNS靶标结合的能力。作为对照，将固定的LRP8或CNS靶标在包含第一标记的结合剂但不包含第二未标记的穿梭试剂的溶液中温育。在允许第一结合剂与LRP8或CNS靶标结合的条件下温育后，去除过量的未结合的结合剂，并且测量与固定的LRP8或CNS靶标缔合的标记的量。如果与固定的LRP8或CNS靶标缔合的标记的量在测试样品中相对于对照样品大量减少，那么这表示所述穿梭试剂与所述第一结合剂竞争与LRP8或CNS靶标的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)第14章(Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港实验室)，Cold SpringHarbor(冷泉港)，NY)。
2.活性测定
在一个方面中，提供用于鉴定具有生物学活性的穿梭试剂的测定法，所述生物学活性即，其中所述穿梭试剂的CNS-活性化合物部分表现出对一种或多种CNS靶标的作用。生物学活性可以包括，例如，酶活性，抑制性(拮抗)活性，刺激性(激动)活性，转运活性和结构活性。还提供在体内和/或体外具有所述生物学活性的穿梭试剂。
在特定实施方案中，在体外检测本发明的穿梭试剂的所述生物学活性。取决于所述穿梭试剂的CNS-活性化合物部分的性质，多种本领域已知的测定法可用，并且怎样选择适当的本领域已知的测定法来检测穿梭试剂中所包含的特定CNS-活性化合物的活性是公知的。例如，如果穿梭试剂包括作为酶的CNS-活性化合物部分，则所述穿梭试剂的酶活性可以容易地用公知的酶测定法(即，用于激酶、磷酸酶、蛋白酶、脂酶等的测定法)来评估，它们中的多种可以试剂盒形式商购。作为另一个非限制性实例，对于包含作为特定CNS靶标的抑制剂或激活剂的CNS-活性化合物部分的穿梭试剂，可以进行测量所述穿梭试剂抑制或刺激所述CNS靶标的活性的体外测定法(即，对于肽、适体或CNS靶标的小分子抑制剂或激活剂，可以在体外测量存在和不存在所述肽、适体或小分子抑制剂或激活剂条件下的CNS靶标的活性)。
在特定实施方案中，在体内检测本发明的穿梭试剂的所述生物学活性。多种动物模型也可以用来检测候选治疗剂的功效。所述模型的体内性质使得它们特别预测在人患者中的反应。例如，多种神经变性病症的动物模型和检验与这些神经变性模型相关的病理过程的相关技术(例如，在存在或不存在穿梭试剂时)在本领域中是容易获得的。多种神经病症的动物模型包括非重组的和重组的(转基因)动物。非重组的动物模型包括，例如，啮齿动物，例如，鼠模型。所述模型可以通过用标准技术将细胞引入到同系小鼠中产生，所述标准技术例如皮下注射、尾静脉注射、脾移植、腹膜内移植、和在肾囊下移植。体内模型包括中风/脑缺血模型，神经变性疾病体内模型，诸如小鼠帕金森病模型；小鼠阿尔茨海默病模型，小鼠肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)模型；小鼠脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy)模型；小鼠/大鼠局部和全体脑缺血模型，例如，普通颈动脉闭塞或大脑中动脉闭塞模型；或在离体完整胚胎培养物中。作为一个非限制的实例，存在多种本领域已知的小鼠阿尔茨海默病模型((参见，例如，Rakover等，Neurodegener.Dis.(神经变性病)(2007)；4(5)：392-402；Mouri等，FASEB J.(2007)Jul；21(9)：2135-48；Minkeviciene等，J.Pharmacol.Exp.Ther.(药理学实验治疗杂志)(2004)Nov；311(2)：677-82和Yuede等，Behav Pharmacol.(行为药理学)(2007)Sep；18(5-6)：347-63)。所述多种测定法可以已知的体外或体内测定形式进行，如本领域已知的和参考文献中所述那样。多种所述动物模型也可以从商业卖家获得，如从Jackson实验室获得。
当将穿梭试剂施用给人来治疗以认知损害为特征的CNS疾病或病症(即，阿尔茨海默病或轻度认知损害)时，一种或多种认知结果测量与整体评估联合可以用来评估所述穿梭试剂的功效(参见，例如，Leber P：Guidelines for the Clinical Evaluation ofAntidementia Drugs(临床评价抗痴呆症药物的指导)，1st draft，Rockville，MD，US Food and DrugAdministration，1990)。例如，可以使用单组或多组标准来检验对神经病症如AD的作用。例如，欧洲医药评价机构(European Medicine EvaluationAgency，EMEA)介绍了一种反应定义，其对应于预先指定的认知提高程度以及功能和整体活性二者的稳定性程度(参见，例如，欧洲医药评价机构(European Medicine Evaluation Agency，EMEA)：Note for Guidelines onMedicinal Products in the Treatment of Alzheimer′s Disease(关于治疗阿尔茨海默病的医药产品的指导的备忘录).London，EMEA，1997)。多种可以单独或组合用来评价患者对药剂的反应性的具体的已确定的检测在本领域中是已知的(参见，例如，Van Dyke等，Am.J.Geriatr.Psychiatry 14：5(2006)。例如，可以使用Severe Impairment Battery(SIB)来评价对药剂的反应性，Severe Impairment Battery(SIB)是一种用来测量具有较严重的AD的患者中的认知变化的检测(参见，例如，Schmitt等，Alzheimer Dis.Assoc.Disord.1997；11(suppl 2)：51-56)。对药剂的反应性也可以使用19项阿尔茨海默病合作研究-日常生活项目活动(19-item Alzheimer′s DiseaseCooperative Study-Activities of Daily Living inventory，ADCSADL 19)测量，19项阿尔茨海默病合作研究-日常生活项目活动是测量进行为晚期痴呆症设计的和验证的日常生活活动的独立性水平的19项项目(参见，例如，Galasko等，J.Int.Neuropsychol.Soc.(2005)；11：446-453)。对药剂的反应性还可以使用基于临床医师的变化印象加看护者输入(Clinician′sInterview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input，CIBIC-Plus)测量，所述临床医师的变化印象加看护者输入是基于患者和看护者二者的结构化访视的7-点整体变化分级(参见，例如，Schneider等，Alzheimer DisAssoc Disord(阿尔茨海默病相关的病症)1997；11(suppl 2)：22-32)。对药剂的反应性还可以使用神经精神医学项目(Neuropsychiatric Inventory，NPI)测量，其基于看护者访视评估12种行为症状的频率和严重性(参见，例如，Cummings等，Neurology(神经病学)1994；44：2308-2314)。
D.缀合
如本文所述，本发明的穿梭试剂包含LRP8-结合分子部分和CNS-活性化合物部分。这两个部分缀合成单一穿梭试剂。所述缀合可以是共价或非共价的，并且适当地取决于考虑用于缀合的具体的LRP8-结合分子和CNS-活性化合物。
共价缀合可以直接进行或通过接头进行。在特定实施方案中，直接缀合通过构建蛋白融合体进行(即，通过编码LRP8-结合分子和CNS-活性化合物的两种基因的基因融合并且表达为单一蛋白)。在特定实施方案中，直接的缀合通过在穿梭试剂两部分之一的反应基团与所述穿梭试剂另一部分上的相对应的基团或接受体之间形成共价键进行。在特定实施方案中，直接缀合通过将要缀合的两种分子中的一种进行修饰(即基因修饰)而进行，从而包括在适当条件下形成与要缀合的另一种分子的共价连接的反应基团(作为非限制性实例，巯基或羧基)。作为一个非限制性的实例，可以引入具有需要的反应基团(即，半胱氨酸残基)的分子(即，氨基酸)，即，引入到LRP8-结合分子部分中，并且与CNS-活性化合物部分形成二硫键。核酸与蛋白共价缀合的方法也是本领域已知的(即，光交联，参见，例如，Zatsepin等(2005)Russ.Chem.Rev.(俄罗斯化学综述)74：77-95)。非共价缀合可以通过任意非共价连接方式进行，非共价连接方式包括氢键、离子键、静电相互作用等，这是本领域普通技术人员容易理解的。缀合还可以使用多种接头进行。例如，穿梭试剂的LRP8-结合分子部分与CNS-活性化合物部分可以使用多种双官能性蛋白偶联剂缀合，所述双官能性蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，iminothiolane(亚氨基硫烷，IT)，亚胺基酯的双官能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐(dimethyl adipimidate HCl))，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，二叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，二-重氮物衍生物(如二-(对-二-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2，6-二异氰酸酯)，和二-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。也可以使用包含通过肽键连接的1至20个氨基酸的肽接头。在特定的这样的实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在特定的其他这样的实施方案中，一种或多种氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头可以是“可切割的接头”，其在递送至脑时促进CNS-活性化合物的释放。例如，可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或包含二硫化合物的接头(Chari等，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本发明的穿梭试剂明确考虑，但不限于，用交联剂制备的所述缀合物，所述交联剂包括，但不限于，BMPS，EMCS，GMBS，HBVS，LC-SMCC，MBS，MPBH，SBAP，SIA，SIAB，SMCC，SMPB，SMPH，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-KMUS，磺基-MBS，磺基-SIAB，磺基-SMCC，和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可以商购获得(例如，购自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在特定实施方案中，提供标记的穿梭试剂。标记包括，但不限于，直接检测的标记或结构部分(如荧光，发色，电子密度，化学发光，和放射性标记)，以及间接检测的结构部分，如酶或配体，例如，通过酶反应或分子相互作用检测。示例性的标记包括，但不限于，同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)，萤光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其偶联这样的酶，所述酶利用过氧化氢来氧化染料前体，如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
在特定实施方案中，本发明提供的任一种穿梭试剂有效用于检测生物样品或受试者中LRP8和/或一种或多种CNS靶标的存在。术语“检测”用在本文中包括定量或定性检测。在特定实施方案中，生物样品包括细胞或组织，如脑脊液、神经细胞或脑组织。
在一个实施方案中，提供用于体外诊断或检测方法的穿梭试剂。在另一个方面中，提供检测LRP8在生物样品中的存在的方法。在另一个方面中，提供检测一种或多种CNS靶标在样品中的存在的方法。在特定实施方案中，所述方法包括在允许穿梭试剂与LRP8和/或一种或多种CNS靶标结合的条件下，使生物样品与本文所述的穿梭试剂接触，并且检测在所述穿梭试剂与LRP8和/或一种或多种CNS靶标之间是否形成复合物。所述方法可以是体外方法或体内方法。在一个实施方案中，穿梭试剂用于选择适合使用穿梭试剂的疗法的受试者，例如，其中CNS靶标是用于选择患者的生物标记。
在一个实施方案中，提供用于体内诊断或检测方法的穿梭试剂。在一个方面中，提供检测受试者中一种或多种CNS靶标的存在、量和/或活性的方法。在特定的方面中，将穿梭试剂施用给受试者，并且检测所述穿梭试剂在CNS内的定位。在特定的这样的方面中，穿梭试剂被标记。在特定的这样的方面中，检测通过非侵入性成像方式(即，放射性照相术、体层摄影术、磁共振成像、或其他成像技术)进行。在特定的方面中，检测通过评估来自已经施用穿梭试剂的受试者的一种或多种生物样品的穿梭试剂的存在和/或活性而进行。在特定的方面中，除了测量穿梭试剂在CNS内的定位之外或不测量穿梭试剂在CNS内的定位，测量CNS内穿梭试剂的量。在特定的方面中，测量CNS内穿梭试剂的活性(即，如本领域普通技术人员应该理解的，穿梭试剂上的标记可以这样选择，即仅在穿梭试剂的CNS-活性部分有活性时，该标记才是可检测的)。在特定的方面中，所述受试者是人。在特定的方面中，检测用于受试者中CNS状况的常规评价。在特定的方面中，检测是用于CNS内变性或损伤的检测。在特定的方面中，检测是用于存在CNS疾病或病症的一种或多种指征的早期检测。在特定的方面中，检测是为了评估CNS疾病或病症的严重性和/或进展。在特定的方面中，检测是为了评估一种或多种具体疗法的功效或影响。本领域普通技术人员应该理解，前述类型的检测中的任一种可以受益于在给定时间期限内收集的一系列检测、或具体检测的结果与来自健康受试者或具有已知水平的CNS疾病或病症的对照受试者的结果的比较，或包括在给定时间期限内收集的一系列检测、或具体检测的结果与来自健康受试者或具有已知水平的CNS疾病或病症的对照受试者的结果的比较。
可以使用本发明的抗体诊断的示例性的疾病和病症包括神经病、淀粉样变性、癌症、病毒或微生物感染、炎症、缺血、神经变性疾病、发作、行为障碍和溶酶体贮积病。
F.药物制剂
本发明所述的穿梭试剂(即，与CNS-活性化合物缀合的抗-LRP8抗体)的药物制剂通过将所述具有所需要的纯度的穿梭试剂与一种或多种任选的药用载体混合而制备(Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)第20版，Osol，A.编：Williams和Wilkins PA，USA(2000))，采用冻干制剂或水溶液的形式。药用载体以所用的剂量和浓度对接受者通常是无毒的，并且包括，但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸及其盐；无机酸盐，如盐酸盐；氢溴酸盐；和硫酸盐；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)；苄索氯铵(benzethonium chloride)；苯酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；硫柳汞；和间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本发明示例性的药用载体还包括肠药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA00001907018200591
Baxter International，Inc.)。某些示例性的sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20，记述在美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanases)如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂记述在美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中记述的那些，后述制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
当被治疗的具体适应证需要时，本发明的制剂还可以包含多于一种活性成分，优选包含具有没有彼此不利的影响的互补活性的那些活性成分。例如，可以理想地进一步提供适于治疗与穿梭试剂要治疗的CNS疾病或病症相同或不同的CNS疾病或病症的一种或多种化合物。类似地，可以理想地进一步提供适于诊断与穿梭试剂要诊断的CNS疾病或病症相同或不同的CNS疾病或病症的一种或多种化合物。适当的另外的化合物是本领域普通技术人员所公知的。例如，当穿梭试剂是靶向LRP8和CNS靶标(其意欲治疗阿尔茨海默病，如淀粉样前体蛋白、淀粉样β肽(单体、寡聚体或纤丝形式)、β分泌酶、γ分泌酶等)的双特异性抗体时，所述穿梭试剂的制剂还可以包含一种或多种另外的阿尔茨海默治疗剂(即，胆碱酯酶抑制剂，美金刚(memantine)，抗-激动药物(anti-agitationmedication)，抗抑郁药，抗焦虑药等)。所述活性成分适当地以对要用的目的有效的量以组合形式存在。
活性成分可以被包封在微胶囊中，在胶质药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)中，或在粗乳液中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这样的技术公开在Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)第16版，Osol，A.Ed.(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质采用成形物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地获得无菌性，例如，通过经由无菌过滤膜过滤获得。
G.治疗方法和组合物
本发明的穿梭试剂可以用作治疗性组合物。在特定实施方案中，本发明的穿梭试剂用于治疗或预防一种或多种CNS疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括，但不限于，神经病，淀粉样变性，癌症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。
神经病症是以不适当的或失控的神经信号传导或缺少神经信号传导为特征的神经系统的疾病或异常，并且包括，但不限于，慢性疼痛(包括伤害性疼痛(nociceptive pain)(即，由对身体组织的损伤引起的疼痛，包括癌症相关的疼痛)，神经性疼痛(neuropathic pain)(即，由神经、脊髓或脑中的异常引起的疼痛)，和精神性疼痛(psychogenic pain)(完全或主要与精神病症相关)，头痛，偏头痛(migraine)，神经病(neuropathy)，和经常伴随所述神经病症的症状和综合征，如眩晕(vertigo)或恶心(nausea)。
淀粉样变性是一组与CNS中的细胞外蛋白质样沉积物相关的疾病或病症，包括，但不限于，继发性淀粉样变性(secondary amyloidosis)、年龄相关的淀粉样变性(age-related amyloidosis)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知损伤(MCI)，雷维小体痴呆症(Lewy body dementia)，唐氏综合征(Down’s syndrome)，具有淀粉样变性的遗传性脑出血(hereditary cerebralhemorrhage with amyloidosis)(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆症综合征(GuamParkinson-Dementia complex)，脑淀粉样血管病(cerebral amyloidangiopathy)，亨廷顿病(Huntington’s disease)，进展性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)，多发性硬化(multiple sclerosis)；克-雅病(Creutzfeld Jacob disease)，帕金森病，传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy)，HIV-相关的痴呆症，肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotropic lateral sclerosis，ALS)，包涵体肌炎(inclusion-body myositis，IBM)，和与β-淀粉样蛋白沉积相关的眼科疾病(ocular diseases relating to beta-amyloid deposition)(即，黄斑变性，玻璃疣-相关的视神经病(drusen-related optic neuropathy)，和白内障(cataract))。
CNS的癌症特征在于一种或多种CNS细胞(即，神经细胞)的异常增殖，并且包括，但不限于，神经胶质瘤(glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)，脑膜瘤(meningioma)，星形细胞瘤(astrocytoma)，听神经瘤(acoustic neuroma)，软骨瘤(chondroma)，少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)，髓母细胞瘤(medulloblastomas)，神经节神经胶质瘤(ganglioglioma)，神经鞘瘤(Schwannoma)，神经纤维瘤(neurofibroma)，成神经细胞瘤(neuroblastoma)，和硬膜外、髓内或硬膜内肿瘤(extradural，intramedullary or intradural tumors)。
眼科疾病或病症是眼睛的疾病或病症，为了本文的目的，认为眼睛是关于BBB的CNS器官对象。眼科疾病或病症包括，但不限于，巩膜、角膜、虹膜和睫状体的病症(即，角膜炎(scleritis)，角膜炎(keratitis)，角膜溃疡(corneal ulcer)，角膜擦伤(corneal abrasion)，雪盲(snowblindness)，弓形眼(arc eye)，泰格森浅层点状角膜病变(Thygeson’ssuperficial punctate keratopathy)，角膜新血管形成(cornealneovascularisation)，富克斯营养不良(Fuchs’dystrophy)，圆锥形角膜(keratoconus)，干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)，虹膜炎(iritis)和葡萄膜炎(uveitis))，晶状体病症(即，白内障(cataract))，脉络膜和视网膜的病症(即，视网膜剥离(retinal detachment)，视网膜劈裂症(retinoschisis)，高血压性视网膜病(hypertensive retinopathy)，糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)，视网膜病(retinopathy)，早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)，年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration)，黄斑变性(macular degeneration)(湿性或干性)，视网膜外膜，色素性视网膜炎(epiretinal membrane，retinitis pigmentosa)和黄斑水肿(macular edema))，青光眼(glaucoma)，悬浮物(floaters)，视神经和视通路的病症(disorders of optic nerve and visual pathways)(即，莱伯遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy)和视盘玻璃疣(optic disc drusen))，眼肌/双眼运动调节/屈光病症(disorders of ocularmuscles/binocular movement accommodation/refraction)(即，斜视(strabismus)，眼外肌麻痹(ophthalmoparesis)，进行性眼外肌麻痹(progressive external opthalmoplegia)，内斜视(esotropia)，外斜视(exotropia)，远视眼(hypermetropia)，近视眼(myopia)，散光(astigmatism)，屈光参差症(anisometropia)，老花眼(presbyopia)和老花眼(ophthalmoplegia))，视觉障碍(visual disturbances)和失明(blindness)(即，弱视(amblyopia)，莱伯先天性黑矇(Lever’s congenital amaurosis)，盲点(scotoma)，色盲(color blindness)，全色盲(achromatopsia)，夜盲症(nyctalopia)，失明，盘尾丝虫病(river blindness)和显微眼科/眼缺损(micro-opthalmia/coloboma))，红眼(red eye)，阿·罗瞳孔(Argyll Robertsonpupil)，角膜真菌病(keratomycosis)，干眼症(xerophthalmia)和无虹膜(andaniridia)。
CNS的病毒或微生物感染包括，但不限于，病毒(即，流感(influenza)，HIV，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)，风疹(rubella))感染，细菌(即，奈瑟球菌属物种(Neisseria sp.)，链球菌属物种(Streptococcus sp.)，假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)，变形杆菌属物种(Proteus sp.)，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，肺炎球菌属物种(Pneumococcus sp.)，脑膜炎双球菌属物种(Meningococcus sp.)，嗜血菌属物种(Haemophilussp.)，和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))及其他微生物如真菌(即，酵母菌，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans))，寄生虫(即，鼠弓形虫(toxoplasma gondii))或阿米巴(amoebas)导致的CNS病理生理学，包括，但不限于，脑膜炎(eningitis)，脑炎(encephalitis)，脊髓炎(myelitis)，脉管炎(vasculitis)和脓肿(abscess)，其可以是急性的或是慢性的。
CNS炎症是由CNS损伤引起的炎症，其可以是物理损伤(即，由于事故、手术、脑外伤、脊髓损伤、脑震荡(concussion))或是由于一种或多种其他CNS疾病或病症(即，脓肿、癌症、病毒或微生物感染)导致的或与一种或多种其他CNS疾病或病症(即，脓肿、癌症、病毒或微生物感染)相关的损伤。
当用在本文中时，CNS缺血是指一组与脑中异常的血流或血管行为相关的病症或其病因，并且包括但不限于，局部脑缺血，全脑缺血，中风(即，蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage)和脑内出血(intracerebralhemorrhage))，以及动脉瘤(aneurysm)。
神经变性疾病是一组与CNS中神经细胞丧失功能或死亡相关的疾病和病症，包括，但不限于，肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)，亚历山大病(Alexander’s disease)，阿耳珀病(Alper’s disease)，肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)，运动失调性毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia)，巴腾病(Batten disease)，科凯恩综合征(cockaynesyndrome)，皮质基底变性(corticobasal degeneration)，由淀粉样变性引起的变性或与淀粉样变性相关的变性，弗里德赖希共济失调症(Friedreich’s ataxia)，额颞叶退化(frontotemporal lobar degeneration)，肯尼迪病(Kennedy’s disease)，多系统萎缩(multiple system atrophy)，多发性硬化，原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)，进行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy)，脊髓性肌萎缩(spinal muscularatrophy)，横贯性脊髓炎(transverse myelitis)，植烷酸贮积症(Refsum’sdisease)，和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia)。
CNS的发作疾病和病症包括CNS中的不适当的和/或异常的电传导，包括，但不限于，癫痫(epilepsy)(即，失神型发作(absence seizures)，无张力性癫痫发作(atonic seizures)，良性运动性癫痫(benign Rolandicepilepsy)，儿童失神(childhood absence)，阵挛性发作(clonic seizures)，复杂性部分性发作(complex partial seizures)，额叶癫痫(frontal lobeepilepsy)，发热性癫痫发作(febrile seizures)，婴儿痉挛(infantile spasms)，青少年期肌阵挛性癫痫(juvenile myoclonic epilepsy)，青少年期失神癫痫(juvenile absence epilepsy)，伦-格综合征(Lennox-Gastaut syndrome)，兰-克综合征(Landau-Kleffner Syndrome)，Dravet’s综合征，Otahara综合征，韦斯特综合征(West syndrome)，肌阵挛性癫痫发作(myoclonicseizures)，线粒体病症(mitochondrial disorders)，进行性肌阵挛性癫痫(progressive myoclonic epilepsies)，精神性发作(psychogenic seizures)，反射性癫痫(reflex epilepsy)，腊斯默森综合征(Rasmussen′s Syndrome)，单纯性部分癫痫发作(simple partial seizures)，继发性全身性癫痫发作(secondarily generalized seizures)，颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy)，强直阵挛性发作(toniclonic seizures)，强直性发作(tonic seizures)，心理运动发作(psychomotor seizures)，边缘系统癫痫(limbic epilepsy)，部分癫痫发作(partial-onset seizures)，全身发作性癫痫发作(generalized-onsetseizures)，癫痫持续状态(status epilepticus)，腹型癫痫(abdominal epilepsy)，运动不能发作(akinetic seizures)，植物神经性发作(autonomic seizures)，大规模双边肌阵挛(massive bilateral myoclonus)，月经性癫痫(catamenialepilepsy)，下降发作(drop seizures)，情绪发作(emotional seizures)，病灶性发作(focal seizures)，gelastic seizures，Jacksonian March，拉福拉病(Lafora Disease)，运动性发作(motor seizures)，多病灶性发作(multifocalseizures)，夜间发作(nocturnal seizures)，光敏性发作(photosensitiveseizure)，假性发作(pseudo seizures)，感觉性发作(sensory seizures)，subtle seizures，sylvan seizures，withdrawal seizures，和视反射发作(visualreflex seizures))。
行为障碍是特征为受折磨的受试者的异常行为的CNS病症，包括，但不限于，睡眠障碍(sleep disorders)(即，失眠症(insomnia)，深眠状态(parasomnias)，夜惊(night terrors)，昼夜节律性睡眠障碍(circadianrhythm sleep disorders)，和发作性睡病(narcolepsy))，情绪障碍(mooddisorders)(即，抑郁症(depression)，自杀性抑郁症(suicidal depression)，焦虑症(anxiety)，慢性情感性精神障碍(chronic affective disorders)，恐惧症(phobias)，惊恐发作(panic attacks)，强迫症(obsessive-compulsivedisorder)，注意力缺陷多动症(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)，注意缺陷障碍(attention deficit disorder，ADD)，慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)，场所恐惧症(agoraphobia)，创伤后精神紧张性精神障碍(post-traumatic stress disorder)，双相性精神障碍(bipolardisorder))，饮食障碍(eating disorders)(即，厌食症(anorexia)或贪食症(bulimia))，重性精神病(psychoses)，发育性行为障碍(developmentalbehavioral disorders)(即，孤独症(autism)，雷特综合征(Rett’s syndrome)，Aspberger’s综合征(Aspberger’s syndrome))，人格障碍(personalitydisorders)和精神病(psychotic disorders)(即，精神分裂症(schizophrenia)，妄想症(delusional disorder)，等等)。
溶酶体贮积病是这样的代谢病症，其在某些情形中与CNS相关或者具有CNS特异性症状；所述病症包括，但不限于，泰-萨克斯病(Tay-Sachsdisease)，高歇病(Gaucher’s disease)，法布里病(Fabry disease)，粘多糖贮积病(mucopolysaccharidosis)(I，II，III，IV，V，VI和VII型)，糖原贮积病(glycogen storage disease)，GM1-神经节苷脂贮积病(GM1-gangliosidosis)，异染性脑白质营养不良(metachromaticleukodystrophy)，法伯病(Farber’s disease)，Canavan’s脑白质营养不良症(Canavan’s leukodystrophy)，和1型和2型神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinoses)，尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，庞皮病(Pompe disease)，和球形细胞脑白质营养不良(Krabbe’s disease)。
本发明提供的任一种穿梭试剂可以用于治疗方法。在一个方面中，提供用作药物的穿梭试剂。在其他方面中，提供用于治疗CNS疾病或病症的穿梭试剂。在特定实施方案中，提供用于治疗方法中的穿梭试剂。在特定实施方案中，本发明提供用在治疗患有CNS疾病或病症的个体的方法中的穿梭试剂，所述方法包括给所述个体施用有效量的所述穿梭试剂。在一个这样的实施方案中，所述CNS疾病或病症选自神经病，淀粉样变性，癌症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病，如上文进一步说明的。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。按照上述任一个实施方案所述的“个体”优选是人。
在另一个方面中，本发明提供穿梭试剂在制造或制备药物中的应用。在一个实施方案中，所述药物用于治疗CNS疾病或病症。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗CNS疾病或病症的方法中，所述方法包括给患有CNS疾病或病症的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在任何一个所述实施方案中，所述CNS疾病或病症选自神经病，淀粉样变性，癌症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。按照上述任一个实施方案所述的“个体”优选是人。
在另一个方面中，本发明提供用于治疗CNS疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给患有所述CNS疾病或病症的个体施用有效量的穿梭试剂。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括给个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在任何一个所述实施方案中，所述CNS疾病或病症选自神经病，淀粉样变性，癌症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。按照上述任一个实施方案所述的“个体”优选是人。
在另一个方面中，本发明提供包含本文提供的任一种穿梭试剂的药物制剂，例如，用于任一种上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种穿梭试剂和药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一种穿梭试剂和至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。
特定穿梭试剂的CNS-活性化合物部分可以选自本领域普通技术人员已知的有效用于检测、预防和/或治疗特定CNS疾病或病症的化合物。给定的CNS-活性化合物可以具有检测、预防和/或多于一种CNS疾病或病症的功效或用途。
对于神经病症，可以选择作为镇痛剂的CNS-活性化合物，所述镇痛剂包括，但不限于，麻醉性/阿片样物质镇痛剂(即，吗啡(morphine)，芬太尼(fentanyl)，氢可酮(hydrocodone)，哌替啶(meperidine)，美沙酮(methadone)，羟吗啡酮(oxymorphone)，喷他佐辛(pentazocine)，右丙氧芬(propoxyphene)，曲马朵(tramadol)，可待因(codeine)和羟可酮(oxycodone))，非类固醇类抗炎药(NSAID)(即，布洛芬(ibuprofen)，萘普生(naproxen)，双氯芬酸(diclofenac)，二氟尼柳(diflunisal)，依托度酸(etodolac)，非诺洛法芬(fenoprofen)，氟比洛芬(flurbiprofen)，吲哚美辛(indomethacin)，酮咯酸(ketorolac)，甲芬那酸(mefenamic acid)，美洛昔康(meloxicam)，萘丁美酮(nabumetone)，奥沙普秦(oxaprozin)，吡罗昔康(piroxicam)，舒林酸(sulindac)，和托美汀(tolmetin))，皮质类固醇(corticosteroid)(即，可的松(cortisone)，泼尼松(prednisone)，泼尼松龙(prednisolone)，地塞米松(dexamethasone)，甲泼尼龙(methylprednisolone)和曲安西龙(triamcinolone))，抗偏头痛药剂(即，sumatriptin，阿莫曲坦(almotriptan)，夫罗曲坦(frovatriptan)，舒马曲坦(sumatriptan)，利扎曲坦(rizatriptan)，依来曲坦(eletriptan)，佐米曲坦(zolmitriptan)，双氢麦角胺(dihydroergotamine)，依来曲坦(eletriptan)和麦角胺(ergotamine))，对乙酰氨基酚(acetaminophen)，水杨酸盐(即，阿司匹林(aspirin)，水杨酸胆碱(choline salicylate)，水杨酸镁(magnesiumsalicylate)，二氟尼柳(diflunisal)，和双水杨酯(salsalate))，抗惊厥剂(anti-convulsant)(即，卡马西平(carbamazepine)，氯硝西泮(clonazepam)，加巴喷丁(gabapentin)，拉莫三嗪(lamotrigine)，普瑞巴林(pregabalin)，噻加宾(tiagabine)，和托吡酯(topiramate))，麻醉剂(anaesthetic)(即，异氟醚(isoflurane)，三氯乙烯(trichloroethylene)，氟烷(halothane)，七氟烷(sevoflurane)，苯佐卡因(benzocaine)，氯普鲁卡因(chloroprocaine)，可卡因(cocaine)，环美卡因(cyclomethycaine)，二甲卡因(dimethocaine)，丙氧卡因(propoxycaine)，普鲁卡因(procaine)，奴佛卡因(novocaine)，丙美卡因(proparacaine)，丁卡因(tetracaine)，阿替卡因(articaine)，布比卡因(bupivacaine)，卡替卡因(carticaine)，辛可卡因(cinchocaine)，依替卡因(etidocaine)，左布比卡因(levobupivacaine)，利多卡因(lidocaine)，甲哌卡因(mepivacaine)，哌罗卡因(piperocaine)，丙胺卡因(prilocaine)，罗哌卡因(ropivacaine)，三甲卡因(trimecaine)，蛤蚌毒素(saxitoxin)和河豚毒素(tetrodotoxin))，和cox-2-抑制剂(即，塞来考昔(celecoxib)，罗非昔布(rofecoxib)，和伐地考昔(valdecoxib))。对于涉及眩晕(vertigo)的神经病症，可以选择作为抗眩晕药剂的CNS-活性化合物，包括，但不限于，美克洛嗪(meclizine)，苯海拉明(diphenhydramine)，异丙嗪(promethazine)和地西泮(diazepam)。对于涉及恶心的神经病症，可以选择作为抗恶心药剂的CNS-活性化合物，包括，但不限于，异丙嗪，氯丙嗪(chlorpromazine)，丙氯拉嗪(prochlorperazine)，曲美苄胺(trimethobenzamide)，和甲氧氯普胺(metoclopramide)。对于神经变性病，可以选择作为生长激素或神经营养因子的CNS-活性化合物；实例包括，但不限于，脑来源的神经营养因子(BDNF)，神经生长因子(NGF)，神经营养蛋白-4/5，成纤维细胞生长因子(FGF)-2和其他FGFs，神经营养蛋白(NT)-3，红细胞生成素(erythropoietin，EPO)，肝细胞生长因子(HGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)-α，TGF-β，血管内皮生长因子(VEGF)，白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)，神经秩蛋白(neurturin)，血小板来源的生长因子(PDGF)，神经生长因子(heregulin)，神经调节蛋白(neuregulin)，artemin，persephin，白介素类，神经胶质细胞来源的神经营养因子(GFR)，粒细胞集落刺激因子(CSF)，粒细胞-巨噬细胞-CSF，导素(netrins)，心脏营养素-1(cardiotrophin-1)，刺猬(hedgehogs)，白血病抑制因子(LIF)，肝素结合细胞因子(midkine)，多效蛋白(pleiotrophin)，骨形态发生蛋白质(bonemorphogenetic proteins，BMPs)，导素，鞘脂酶激活蛋白(saposins)，信号素(semaphorins)，和干细胞因子(SCF)。
对于癌症，可以选择作为化学治疗剂的CNS-活性化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化试剂，如如塞替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和methylamelamines，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、塞替哌(triethiylenethiophosphor-amide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(特别是bullatacin和bullatacinone)；Δ-9-四氢大麻酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)、
Figure BDA00001907018200682
)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan)
Figure BDA00001907018200691
CPT-11(伊立替康(irinotecan))、乙酰喜树碱(acetylcamptothecin)、scopolectin和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycins)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)、特别是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1(参见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；烯二炔蒽环类抗生素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、去甲柔红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、
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多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补偿物如frolinic acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside)；5-氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美坦生类化合物(maytansinoids)如美坦生(maytansine)和美登木素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；异丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA00001907018200701
多糖复合物(JHS Natural Products(JHS天然产品)，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺(2，2’，2”-trichlorotriethylamine)；单端孢霉烯(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A(roridin A)和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
Figure BDA00001907018200712
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如，
Figure BDA00001907018200713
紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，新泽西)ABRAXANETM无克列莫佛(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，伊利诺伊州)；和多西他赛(doxetaxel)(
Figure BDA00001907018200715
-Poulenc Rorer、Antony、法国)；chloranbucil；吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA00001907018200716
；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)
Figure BDA00001907018200717
；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
Figure BDA00001907018200718
；奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；维甲类(retinoids)如视黄酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；任何上述物质的药用盐、酸或衍生物；以及上述物质中两种或多种的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合治疗法的缩写，和FOLFOX，使用奥沙利铂(oxaliplatin)(ELOXATINTM)与5-FU和leucovovin联合的治疗方案的缩写。
下列药剂也包含在化学治疗剂的这一定义中，它们是：起调控、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用的抗激素药剂，所述抗激素药剂通常处在系统治疗或全身治疗形式中。它们可以是激素本身。实例包括抗雌激素药和选择性雌激素受体调节物(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括
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他莫昔芬)、
Figure BDA00001907018200722
雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和
Figure BDA00001907018200723
托瑞米芬(toremifene)；抗黄体酮药(anti-progesterones)；雌激素受体下调剂(ERDs)；起作用抑制或关闭卵巢的药剂，例如，促黄体生成激素释放素(leutinizing hormone-releasing hormone)(LHRH)激动剂如
Figure BDA00001907018200724
和
Figure BDA00001907018200725
醋酸亮丙立德(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和tripterelin；其它抗雄激素药诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；和芳香酶抑制剂(aromatase inhibitors)，其抑制芳香酶，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例如，4(5)-咪唑类(4(5)-imidazoles)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure BDA00001907018200726
醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、
Figure BDA00001907018200727
依西美坦(exemestane)、赴美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、
Figure BDA00001907018200728
伏氯唑(vorozole)、
Figure BDA00001907018200729
来曲唑(letrozole)和
Figure BDA000019070182007210
阿那曲唑(anastrozole)。另外，所述化疗剂的定义包括二膦酸盐(bisphosphonates)如氯膦酸盐(clodronate)(例如，
Figure BDA000019070182007211
或
Figure BDA000019070182007212
)、依替膦酸盐(etidronate)、NE-58095、
Figure BDA000019070182007214
唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)、
Figure BDA000019070182007215
阿仑膦酸盐(alendronate)、
Figure BDA000019070182007216
帕米膦酸盐(pamidronate)、
Figure BDA000019070182007217
替鲁膦酸盐(tiludronate)、或
Figure BDA000019070182007218
利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、特别是抑制异常细胞增生所涉及的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如
Figure BDA000019070182007219
疫苗和基因治疗疫苗、例如，
Figure BDA000019070182007220
疫苗、
Figure BDA000019070182007221
疫苗和
Figure BDA000019070182007222
疫苗；
Figure BDA000019070182007223
拓扑异构酶1抑制剂；
Figure BDA000019070182007224
rmRH；托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也已知为GW572016)；和上述任意物质的药用盐、酸或衍生物。
可以选作用于癌症治疗或预防的CNS-活性化合物的另一组化合物是抗癌免疫球蛋白(包括，但不限于，曲妥珠单抗(trastuzumab)，贝伐珠单抗(bevacizumab)，阿仑珠单抗(alemtuxumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)，帕尼单抗(panitumumab)和利妥昔单抗(rituximab)。在一些情形中，与毒素标记联合的抗体可以用于靶向并杀死所需要的细胞(即，癌症细胞)，包括，但不限于，具有131I放射性标记的托西莫单抗(tositumomab)。
对于眼科疾病和病症，可以选择作为抗血管生成的眼用药剂的CNS-活性化合物(即，贝伐珠单抗(bevacizumab)，雷珠单抗(ranibizumab)和培加尼布(pegaptanib))，眼用青光眼药剂(即，卡巴胆碱(carbachol)，肾上腺素，地美溴铵(demecarium bromide)，阿可乐定(apraclonidine)，溴莫尼定(brimonidine)，布林唑胺(brinzolamide)，左布诺洛尔(levobunolol)，噻吗洛尔(timolol)，倍他洛尔(betaxolol)，多佐胺(dorzolamide)，比马前列素(bimatoprost)，卡替洛尔(carteolol)，美替洛尔(metipranolol)，地匹福林(dipivefrin)，曲伏前列素(travoprost)和拉坦前列素(latanoprost))，碳酸酐酶抑制剂(即，醋甲唑胺(methazolamide)和乙酰唑胺(acetazolamide))，眼用抗组织胺药(antihistamine)(即，萘甲唑啉(naphazoline)，去氧肾上腺素(phenylephrine)和四氢唑啉(tetrahydrozoline))，和眼用润滑剂，眼用类固醇(即，氟米龙(fluorometholone)，泼尼松龙(prednisolone)，氯替泼诺(loteprednol)，地塞米松(dexamethasone)，二氟泼尼酯(difluprednate)，利美索龙(rimexolone)，肤轻松(fluocinolone)，甲羟松(medrysone)和曲安西龙(triamcinolone))，眼用麻醉剂(即，利多卡因，丙美卡因和丁卡因(tetracaine))，眼用抗感染剂(即，左氧氟沙星(levofloxacin)，加替沙星(gatifloxacin)，环丙沙星(ciprofloxacin)，莫西沙星(moxifloxacin)，氯霉素(chloramphenicol)，杆菌肽(bacitracin)/多粘菌素b(polymyxinb)，磺胺醋酰(sulfacetamide)，妥布霉素(tobramycin)，阿奇霉素(azithromycin)，besifloxacin，诺氟沙星(norfloxacin)，磺胺异噁唑(sulfisoxazole)，庆大霉素(gentamicin)，碘苷(idoxuridine)，红霉素(erythromycin)，纳他霉素(natamycin)，短杆菌肽(gramicidin)，新霉素(neomycin)，氧氟沙星(ofloxacin)，曲氟尿苷(trifluridine)，更昔洛韦(ganciclovir)，阿糖腺苷(vidarabine))，眼用抗炎剂(即，奈帕芬胺(nepafenac)，酮咯酸(ketorolac)，氟比洛芬(flurbiprofen)，舒洛芬(suprofen)，环孢菌素(cyclosporine)，曲安西龙(triamcinolone)，双氯芬酸(diclofenac)和溴芬酸(bromfenac))，和药用抗组织胺药或解充血药(decongestant)(即，酮替芬(ketotifen)，奥洛他定(olopatadine)，依匹斯汀(epinastine)，萘甲唑啉(naphazoline)，色甘酸钠(cromolyn)，四氢唑啉，吡嘧司特(pemirolast)，贝他斯汀(bepotastine)，萘甲唑啉，去氧肾上腺素，奈多罗米(nedocromil)，洛度沙胺(lodoxamide)，去氧肾上腺素，依美斯汀(emedastine)和氮卓斯汀(azelastine))。
对于发作病症，可以选择作为抗惊厥药(anticonvulsant)或抗癫痫药(antiepileptic)的CNS-活性化合物，包括，但不限于，巴比妥酸盐抗惊厥药(barbiturate anticonvulsants)(即，扑米酮(primidone)，美沙比妥(metharbital)，甲苯比妥(mephobarbital)，阿洛巴比妥(allobarbital)，异戊巴比妥(amobarbital)，阿普比妥(aprobarbital)，烯丙苯巴比妥(alphenal)，巴比妥(barbital)，溴烯比妥(brallobarbital)和苯巴比妥(phenobarbital))，地西泮(benzodiazepine)抗癫痫药(即，安定(diazepam)，氯硝西泮(clonazepam)，和劳拉西泮(lorazepam))，氨基甲酸酯抗癫痫药(即非尔氨酯(felbamate))，碳酸酐酶抑制剂抗癫痫药(即，乙酰唑胺(acetazolamide)，托吡酯(topiramate)和唑尼沙胺(zonisamide))，二苯并氮(dibenzazepine)抗癫痫药(即，卢非酰胺(rufinamide)，卡马西平(carbamazepine)，和奥卡西平(oxcarbazepine))，脂肪酸衍生物抗癫痫药(即，双丙戊酸钠(divalproex)和丙戊酸(valproic acid))，γ-氨基丁酸类似物(即，普瑞巴林(pregabalin)，加巴喷丁(gabapentin)和氨己烯酸(vigabatrin))，γ-氨基丁酸重吸收抑制剂(即，噻加宾(tiagabine))，γ-氨基丁酸转氨酶抑制剂(即，氨己烯酸(vigabatrin))，乙内酰脲(hydantoin)抗癫痫药(即苯妥英(phenytoin)，乙苯妥英(ethotoin)，磷苯妥英(fosphenytoin)和美芬妥英(mephenytoin))，其他各类抗癫痫药(即，lacosamide和硫酸镁)，孕激素类(progestins)(即，孕酮(progesterone))，噁唑烷二酮(oxazolidinedione)抗癫痫药(即，甲乙双酮(paramethadione)和三甲双酮(trimethadione))，吡咯烷(pyrrolidine)抗癫痫药(即，左乙拉西坦(levetiracetam))，琥珀酰亚胺(succinimide)抗癫痫药(即，乙琥胺(ethosuximide)和甲琥胺(methsuximide))，三嗪抗癫痫药(即，拉莫三嗪(lamotrigine))，和脲抗癫痫药(即，苯乙酰脲(phenacemide)和苯丁酰脲(pheneturide))。
对于溶酶体贮积病，可以选择作为其本身或另外模拟疾病中受损的酶的活性的CNS-活性化合物。用于治疗溶酶体贮积病的示例性的重组酶包括，但不限于例如在美国专利申请公布号20050142141中提出的那些(即，α-L-艾杜糖醛酸酶(alpha-L-iduronidase)，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulphatase)，N-硫酸酯酶(N-sulfatase)，α-N-乙酰氨基葡糖苷酶，N-乙酰基-半乳糖胺-6-硫酸酯酶，β-半乳糖苷酶，芳香基硫酸酯酶B(arylsulphatase B)，β-葡糖醛酸糖苷酶，酸性α-葡萄糖苷酶，葡糖脑苷脂酶，α-半乳糖苷酶A，己糖胺酶A，酸性鞘磷脂酶，β-半乳糖脑苷脂酶，β-半乳糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，酸性神经酰胺酶，天冬氨酸酰酶，棕榈酰基-蛋白硫酯酶1和三肽基氨基肽酶1)。
对于淀粉样变性，可以选择这样的CNS-活性化合物，其包括，但不限于，特异性结合选自下述的靶标的抗体或其他结合分子(包括，但不限于，小分子，肽，适体，或其他蛋白结合剂)：β分泌酶，tau，早老素，淀粉样前体蛋白或其部分，淀粉样蛋白β肽或其寡聚体或纤丝，死亡受体6(DR6)，关于高级糖化作用终产物的受体(RAGE)，parkin，和huntingtin；胆碱酯酶抑制剂(即，加兰他敏(galantamine)，多奈哌齐(donepezil)，利斯的明(rivastigmine)和他克林(tacrine))；NMDA受体拮抗剂(即，美金刚)，单胺耗竭剂(即，丁苯那嗪(tetrabenazine))；甲磺酰双氢麦角毒(ergoloid mesylate)；抗胆碱能抗帕金森综合征药剂(anticholinergic antiparkinsonism agent)(即，丙环定(procyclidine)，苯海拉明，trihexylphenidyl，苯扎托品(benztropine)，比哌立登(biperiden)和苯海索(trihexyphenidyl))；多巴胺能抗帕金森综合征药剂(dopaminergicantiparkinsonism agent)(即，恩他卡朋(entacapone)，司立吉兰(selegiline)，普拉克索(pramipexole)，溴隐亭(bromocriptine)，罗替高汀(rotigotine)，司立吉林，罗匹尼罗(ropinirole)，雷沙吉兰(rasagiline)，阿扑吗啡(apomorphine)，卡比多巴(carbidopa)，左旋多巴(levodopa)，培高利特(pergolide)，托卡朋(tolcapone)和金刚烷胺(amantadine))；丁苯那嗪(tetrabenazine)；抗炎药(包括，但不限于，非类固醇抗炎药(即，吲哚美辛(indomethicin)和上文列出的其他化合物)；激素(即，雌激素，孕酮和亮丙立德leuprolide))；维生素(即，叶酸和烟酰胺)；dimebolin；homotaurine(即，3-氨基丙磺酸；3APS)；5-羟色胺受体活性调控剂(即，扎利罗登(xaliproden))；干扰素，和糖皮质激素。
对于病毒或微生物疾病，可以选择下述CNS-活性化合物，其包括，但不限于，抗病毒化合物(包括，但不限于，金刚烷(adamantane)抗病毒药(即，金刚乙胺(rimantadine)和金刚烷胺(amantadine))，抗病毒干扰素(即，聚乙烯乙二醇α-2b(peginterferon alfa-2b))，趋化因子受体拮抗剂(即，maraviroc)，整合酶链转移抑制剂(即，raltegravir)，神经氨酸酶抑制剂(即，奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir))，非核苷逆转录酶抑制剂(即，依法韦仑(efavirenz)，etravirine，地拉韦定(delavirdine)和奈韦拉平(nevirapine))，核苷逆转录酶抑制剂(去羟肌苷加(tenofovir)，阿巴卡韦(abacavir)，拉米夫定(lamivudine)，齐多夫定(zidovudine)，司他夫定(stavudine)，恩替卡韦(entecavir)，恩曲他滨(emtricitabine)，阿德福韦(adefovir)，扎昔他宾(zalcitabine)，telbivudine和去羟肌苷(didanosine))，蛋白酶抑制剂(即，darunavir，阿扎那韦(atazanavir)，呋山那韦(fosamprenavir)，替拉那韦(tipranavir)，利托纳韦(ritonavir)，奈芬纳韦(nelfinavir)，氨普那韦(amprenavir)，英地纲韦(indinavir)和沙奎那韦(saquinavir))，嘌呤核苷(即，伐昔洛韦(valacyclovir)，泛昔洛韦(famciclovir)，阿昔洛韦(acyclovir)，利巴韦林(ribavirin)，更昔洛韦(ganciclovir)，缬更昔洛韦(valganciclovir)和西多福韦(cidofovir))，和其他各类抗病毒药(即，恩夫韦肽(enfuvirtide)，膦甲酸(foscarnet)，帕利珠单抗(palivizumab)和福米韦生(fomivirsen)))，抗生素(包括，但不限于，氨基青霉素(aminopenicillin)(即，阿莫西林(amoxicillin)，氨苄西林(ampicillin)，苯唑西林(oxacillin)，萘夫西林(nafcillin)，氯唑西林(cloxacillin)，双氯西林(dicloxacillin)，flucoxacillin，替莫西林(temocillin)，阿洛西林(azlocillin)，羧苄西林(carbenicillin)，替卡西林(ticarcillin)，美洛西林(mezlocillin)，哌拉西林(piperacillin)和巴氨西林(bacampicillin))，头孢菌素(cephalosporin)(即，头孢唑林(cefazolin)，头孢氨苄(cephalexin)，头孢菌素(cephalothin)，头孢孟多(cefamandole)，头孢曲松(ceftriaxone)，头孢噻肟(cefotaxime)，头孢泊肟(cefpodoxime)，头孢他啶(ceftazidime)，头孢羟氨苄(cefadroxil)，头孢拉定(cephradine)，氯碳头孢(loracarbef)，头孢替坦(cefotetan)，头孢呋辛(cefuroxime)，头孢丙烯(cefprozil)，头孢克洛(cefaclor)，和头孢西丁(cefoxitin))，碳青霉烯/表霉烯(carbapenem/penem)(即，亚胺培南(imipenem)，美罗培南(meropenem)，厄他培南(ertapenem)，法罗培南(faropenem)和多利培南(doripenem))，单酰胺菌素(monobactam)(即，氨曲南(aztreonam)，替吉莫南(tigemonam)，norcardicin A和α，ε-二氨基-β-羟庚二酸-β-内酰胺(tabtoxinine-beta-lactam)，β-内酰胺酶抑制剂(beta-lactamase inhibitor)(即，棒酸(clavulanic acid)，三唑巴坦(tazobactam)和舒巴克坦(sulbactam))与另一种β-内酰胺抗生素联合，氨基葡糖苷(aminoglycoside)(即，阿米卡星(amikacin)，庆大霉素，卡那霉素(kanamycin)，新霉素(neomycin)，奈替米星(netilmicin)，链霉素(streptomycin)，妥布霉素(tobramycin)，和巴龙霉素(paromomycin))，利福布汀(ansamycin)(即，格尔德霉素(geldanamycin)和除莠霉素(herbimycin))，碳头孢烯(carbacephem)(即，氯碳头孢(loracarbef))，糖肽类(即，替考拉宁(teicoplanin)和万古霉素(vancomycin))，大环内酯(即，阿奇霉素(azithromycin)，克拉霉素(clarithromycin)，地红霉素(dirithromycin)，红霉素，罗红霉素(roxithromycin)，醋竹桃霉素(troleandomycin)，泰利霉素(telithromycin)和大观霉素(spectinomycin))，单酰胺菌素(monobactam)(即，氨曲南(aztreonam))，喹诺酮(quinolone)(即，环丙沙星(ciprofloxacin)，依诺沙星(enoxacin)，加替沙星(gatifloxacin)，左氧氟沙星(levofloxacin)，洛美沙星(lomefloxacin)，莫西沙星(moxifloxacin)，诺氟沙星(norfloxacin)，氧氟沙星(ofloxacin)，曲伐沙星(trovafloxacin)，格帕沙星(grepafloxacin)，司帕沙星(sparfloxacin)和替马沙星(temafloxacin))，磺胺类药(sulfonamide)(即，磺胺米隆(mafenide)，sulfonamidochrysoidine，磺胺醋酰(sulfacetamide)，磺胺嘧啶(sulfadiazine)，磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)，磺胺(sulfanilamide)，柳氮磺吡啶(sulfasalazine)，磺胺异噁唑(sulfisoxazole)，甲氧苄啶(trimethoprim)，甲氧苄啶和磺胺甲基异恶唑(sulfamethoxazole))，四环素(tetracycline)(即，四环素，地美环素(demeclocycline)，多西环素(doxycycline)，米诺环素(minocycline)和土霉素(oxytetracycline))，抗肿瘤药或细胞毒性抗生素(即，多柔比星(doxorubicin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，博来霉素(bleomycin)，柔红霉素(daunorubicin)，更生霉素(dactinomycin)，表柔比星(epirubicin)，伊达比星(idarubicin)，普卡霉素(plicamycin)，丝裂霉素(mitomycin)，喷司他丁(pentostatin)和戊柔比星(valrubicin))和其他各类抗菌化合物(即，杆菌肽(bacitracin)，粘菌素(colistin)和多粘菌素B(polymyxin B)))，抗真菌药(即，甲硝唑(metronidazole)，硝唑尼特(nitazoxanide)，替硝唑(tinidazole)，氯喹(chloroquine)，双碘喹啉(iodoquinol)和巴龙霉素(paromomycin))，和抗寄生虫药(antiparasitic)(包括，但不限于，奎宁(quinine)，氯喹(chloroquine)，阿莫地喹(amodiaquine)，乙胺嘧啶(pyrimethamine)，磺胺多辛(sulphadoxine)，氯胍(proguanil)，甲氟喹(mefloquine)，阿托伐醌(atovaquone)，伯氨喹(primaquine)，artemesinin，卤泛群(halofantrine)，多西环素(doxycycline)，克林霉素(clindamycin)，甲苯达唑(mebendazole)，双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)，噻苯哒唑(thiabendazole)，乙胺嗪(diethylcarbamazine)，伊维菌素(ivermectin)，利福平(rifampin)，两性霉素B(amphotericin B)，美拉胂醇(melarsoprol)，efornithine和阿苯达唑(albendazole))。
对于缺血，可以选择这样的CNS-活性化合物，其包括，但不限于，溶血栓药(thrombolytic)(即，尿激酶(urokinase)，阿替普酶(alteplase)，瑞替普酶(reteplase)和替奈普酶(tenecteplase))，血小板聚集抑制剂(即，阿司匹林(aspirin)，西洛他唑(cilostazol)，氯吡格雷(clopidogrel)，prasugrel和双嘧达莫(dipyridamole))，他汀类(statin)(即，洛伐他汀(lovastatin)，普伐他汀(pravastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，瑞舒伐他汀(rosuvastatin)，阿托伐他汀(atorvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，西立伐他汀(cerivastatin)和匹伐他汀(pitavastatin))，和改善血流或血管弹性的化合物，包括，例如，血压药物。
对于行为障碍，CNS-活性化合物可以选自改善行为的化合物，包括，但不限于，非典型抗精神病药物(atypical antipsychotic)(即，利培酮(risperidone)，奥氮平(olanzapine)，apripiprazole，喹硫平(quetiapine)，帕潘立酮(paliperidone)，asenapine，氯氮平(clozapine)，伊潘立酮(iloperidone)和齐拉西酮(ziprasidone))，吩噻嗪抗精神病药物(phenothiazineantipsychotic)(即，丙氯拉嗪(prochlorperazine)，氯丙嗪(chlorpromazine)，氟奋乃静(fluphenazine)，奋乃静(perphenazine)，三氟拉嗪(trifluoperazine)，硫利达嗪(thioridazine)和美索达嗪(mesoridazine))，硫蒽(thioxanthene)(即，替沃噻吨(thiothixene))，其他各类抗精神病药物(即，匹莫齐特(pimozide)，锂，吗茚酮(molindone)，氟哌啶醇(haloperidol)和洛沙平(loxapine))，选择性血清素再吸收抑制剂(serotonin reuptake inhibitor)(即，西酞普兰(citalopram)，依他普仑(escitalopram)，帕罗西汀(paroxetine)，氟西汀(fluoxetine)和舍曲林(sertraline))，血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor)(即，度洛西汀(duloxetine)，文拉法辛(venlafaxine)，desvenlafaxine，三环抗抑郁药(tricyclic antidepressant)(即，多塞平(doxepin)，氯米帕明(clomipramine)，阿莫沙平(amoxapine)，去甲替林(nortriptyline)，阿米替林(amitriptyline)，曲米帕明(trimipramine)，丙咪嗪(imipramine)，普罗替林(protriptyline)和地昔帕明(desipramine))，四环抗抑郁药(tetracyclic antidepressant)(即，米氮平(mirtazapine)和马普替林(maprotiline))，苯基哌嗪抗抑郁药(phenylpiperazine antidepressant)(即，曲唑酮(trazodone)和奈法唑酮(nefazodone))，单胺氧化酶抑制剂(monoamine oxidase inhibitor)(即，异卡波肼(isocarboxazid)，苯乙肼(phenelzine)，司来吉兰(selegiline)和反苯环丙铵(tranylcypromine))，苯二氮杂
Figure BDA00001907018200791
(即，阿普唑仑(alprazolam)，艾司唑仑(estazolam)，flurazeptam，氯硝西泮(clonazepam)，劳拉西泮(lorazepam)和地西泮(diazepam))，去甲肾上腺素-多巴胺再吸收抑制剂(norepinephrine-dopamine reuptake inhibitor)(即，安非他酮(bupropion))，CNS兴奋剂(即，芬特明(phentermine)，安非拉酮(diethylpropion)，去氧麻黄碱(methamphetamine)，右旋安非他命(dextroamphetamine)，安非他命(amphetamine)，哌甲酯(methylphenidate)，dexmethylphenidate，lisdexamfetamine，莫达非尼(modafinil)，匹莫林(pemoline)，苯甲曲嗪(phendimetrazine)，苄非他明(benzphetamine)，苯甲曲嗪，armodafinil，安非拉酮，咖啡因(caffeine)，托莫西汀(atomoxetine)，多沙普仑(doxapram)，和马吲哚(mazindol))，抗焦虑药/镇静剂/催眠药(anxiolytic/sedative/hypnotic)(包括，但不限于，巴比妥酸盐(barbiturate)(即，司可巴比妥(secobarbital)，苯巴比妥(phenobarbital)和甲苯比妥(mephobarbital))，苯二氮杂(如上述)，和其他各类抗焦虑药/镇静剂/催眠药(即苯海拉明，羟丁酸钠(sodium oxybate)，扎来普隆(zaleplon)，羟嗪(hydroxyzine)，水合氯醛(chloral hydrate)，aolpidem，丁螺环酮(buspirone)，多塞平，左旋佐匹克隆(eszopiclone)，雷美尔通(ramelteon)，甲丙氨酯(meprobamate)和乙氯戊烯炔醇(ethclorvynol)))，分泌素(secretin)(参见，例如，Ratliff-Schaub等.(2005)Autism 9：256-265)，阿片样肽(参见，例如，Cowen等，(2004)J.Neurochem.(神经科学杂志)89：273-285)，和神经肽(neuropeptide)(参见，例如，Hethwa等(2005)Am.J.Physiol.(美国生理学杂志)289：E301-305)。
对于CNS炎症，可以选择这样的CNS-活性化合物，即，其本身可以解决炎症(即，非类固醇类的抗炎药剂，如布洛芬(ibuprofen)或萘普生(naproxen))，或其治疗潜在的炎症病因(即，抗病毒药剂或抗癌药剂)。
本发明的穿梭试剂可以单独或与其他药剂组合用在治疗中。例如，本发明的穿梭试剂可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。在特定实施方案中，另外的治疗剂是有效治疗与所述穿梭试剂用来治疗的CNS疾病或病症相同或不同的CNS疾病或病症的治疗剂。示例性的另外的治疗剂包括，但不限于，上述多种CNS-活性化合物，胆碱酯酶抑制剂(如多奈哌齐(donepezil)，加兰他敏(galantamine)，rovastigmine，和加兰他敏(tacrine))，NMDA受体拮抗剂(如美金刚)，淀粉样蛋白β肽聚集抑制剂，抗氧化剂，γ-分泌酶调控剂，神经生长因子(NGF)模拟物或NGF基因治疗，PPARγ激动剂，HMS-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物(statins))，安帕金(ampakines)，钙通道阻断剂(calcium channel blockers)，GABA受体拮抗剂，糖原合酶激酶抑制剂，静脉内免疫球蛋白，毒蕈碱性受体激动剂(muscarinic receptor agonists)，nicrotinic受体调控剂，主动或被动的淀粉样蛋白β肽免疫，磷酸二酯酶抑制剂，5-羟色胺受体拮抗剂(serotonin receptor antagonists)和抗-淀粉样蛋白β肽抗体。在特定实施方案中，针对其减轻所述CNS-活性化合物的一种或多种副作用的能力，选择所述至少一种另外的治疗剂。
上述组合疗法包括组合的施用(其两种或多种治疗剂包含在同一种或分开的制剂中)，和分开的施用，在该情形中，本发明的抗体的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅剂(adjuvant)之前、同时、和/或之后发生。本发明的抗体还可以与其他干预性疗法组合，所述其他干预性疗法如，但不限于，射线疗法，行为疗法，或本领域已知的且适用于要治疗或预防的CNS疾病或病症的其他疗法。
本发明的穿梭试剂(和任意另外的治疗剂)可以通过任何适当的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且，如果需要局部治疗，可以在损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。给药可以通过任何适当的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于所述施用是短期的还是长期的。本发明考虑多种给药时间方案，包括但不限于，在多个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的穿梭试剂将以与良好的医学实践一致的方式配制、给药和施用。在这种情形中考虑的因素包括被治疗的具体病症，被治疗的具体的哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的病因，递送药剂的部位，施用方法，施用时间表，和医学执业者已知的其他因素。穿梭试剂不需要但是任选地与一种或多种目前用来预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。所述其他药剂的有效量取决于所述制剂中存在的穿梭试剂的量，病症或治疗的类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量和用如本文所述的施用途径使用，或本文所述的剂量的约1至99％，或以执业者凭经验/临床确定的任意剂量和任意途径使用。
对于疾病的预防和治疗，本发明的穿梭试剂的适当的剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于要治疗的疾病的类型，穿梭试剂的类型，疾病的严重性和病程，是否为预防或治疗目的施用所述穿梭试剂，先前的疗法，患者的临床病史和对所述穿梭试剂的反应，以及主治医师的判断力。所述穿梭试剂适当地一次或在一系列治疗中施用给患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的穿梭试剂可以作为施用给患者的初始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用还是通过连续输注施用。一种典型地每日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg以上范围内，这取决于上文提及的因素。对于在数天或更久时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常将持续到出现理想的疾病症状抑制。一种示例性的穿梭试剂的剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以给患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或它们的任意组合)。所述剂量可以间断性施用，例如，每周或每三周(例如，以使患者接受约两次至约二十次或例如约6次剂量的穿梭试剂)。可以使用较高的初始负载剂量，然后施用一种或多种较低的剂量。然而，其他剂量方案可以是有效的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法进行监测。
H.制品
在本发明的另一个方面中，提供制品，其包含有效用于治疗、预防和/或诊断上述CNS疾病和病症的物质。所述制品包括容器和在所述容器上或相连的标签或包装插页。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器容纳单独的或与有效用于治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物组合的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，所述容器可以是具有由皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本发明的穿梭试剂。标签或包装插页指示所述组合物用于治疗选择的病症。此外，所述制品可以包括：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的穿梭试剂；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他治疗剂。在本发明这一实施方案中的制品可以进一步包括指示所述组合物可以用于治疗具体病症的包装插页。备选地，或另外地，所述制品可以进步一包括包含药用缓冲剂的第二(或第三)容器，如抑菌的注射用水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，林格溶液和葡萄糖溶液。其可以进一步包括在商业和使用者立场上是合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应该理解，给定上文提供的总述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1：LRP8鉴定为候选的BBB-特异性转运-促进靶标
进行微阵列基因表达研究来鉴定下述蛋白：(a)对血脑屏障是特异性的，(b)表现出高表达水平和(c)在动物的生命周期过程中的不同时间点一致性存在。因此，在纯化的脑内皮细胞相对于胚胎、幼小鼠和成体小鼠的肝和肺细胞分析蛋白表达。具体地，将C57bl6成体小鼠、幼体小鼠(出生后第7天)和胚胎(第14.5天)小鼠通过标准技术处死。对于成体小鼠和幼体小鼠，将大脑皮层、肝和肺收集在冰冷的PBS中。按下述制备每种组织的单细胞混悬液。对于脑，去除脑膜(在成体小鼠和幼体小鼠中通过Whatman纸去除，在胚胎中通过镊子去除)，并且将大脑皮层与前脑剖离。按照供应商的指导使用基于木瓜蛋白酶的神经解离试剂盒(Miltenyi)，不同的是使用PBS而不是HBSS，并且细胞通过70微米滤器以1,200rpm离心三分钟进行过滤。在胚胎样品的情形中，没有应用该试剂盒的正常髓磷脂-去除步骤。对于肺(在成体小鼠、幼体小鼠和胚胎小鼠的每一种中都是完整肺叶)和肝(选择每片肝叶的边缘区，以避开肝门静脉)，应用改进的神经解离试剂盒(Miltenyi)，其中初始木瓜蛋白酶温育进行1小时(成体小鼠)、30分钟(幼体小鼠)或1-5分钟(胚胎小鼠)，而不是供应商指示的15分钟。仅对于成体小鼠样品，在研磨之前将肝/肺样品用转子匀浆。
按下述对所有细胞混悬物进行内皮细胞的FACS分选。将细胞混悬物用FACS缓冲液(在PBS中的2％BSA)洗涤一次。加入1∶100Fc预封闭物(preblock)(CD16或CD32)在4℃历时10分钟，然后1∶100分别加入对细胞标记特异性的两种荧光标记的一级抗体(与作为内皮细胞的标记的FITC缀合的抗-小鼠CD31和与作为有核造血细胞的标记的藻红蛋白缀合的抗-小鼠CD45)。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并且通过70微米滤器以1,200rpm离心三分钟进行过滤。加入碘化丙啶至终浓度1μg/ml以允许在FACS分选过程中除去死细胞。大约有0.8％的脑细胞样品是CD31-阳性的和CD45-阴性的内皮细胞，它们的RNA通过RNeasy Micro Plus试剂盒(Qiagen)纯化，并且在微阵列分析中进行进一步的应用(参见图2A)。
还使用用于某些细胞特异性标记的标准技术进行定量RT-PCR来验证上述结果。通常使用QuantiTect SYBR绿色RT-PCR试剂盒一步试剂盒(QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit One-step kit，Qiagen)用下述不同的细胞特异性引物进行RT-PCR反应。为了评估内皮细胞含量，使用Mm Tek 1SG QuantiTect引物测定法(QuantiTect Primer Assay，Qiagen)测量标记Tie2。为了评估星形胶质细胞含量，使用Mm_Aqp4_1_SG QuantiTect引物测定法(Qiagen)测量标记水通道蛋白4。为了评估少突胶质细胞含量，使用Mm_Sox10_2_SG QuantiTect引物测定法(Qiagen)测量标记Sox10。为了评估神经元含量，使用Mm_Snap25_2_SG QuantiTect引物测定法(Qiagen)测量标记Snap25。为了评估小胶质细胞含量，使用Mm_CD68_1_SG QuantiTect引物测定法(Qiagen)测量标记CD68。所有反应均使用大约10ng模板RNA(或在有限的可用起始原料的情形中为2ng)并且按照供应商的指导进行。在96-孔板中在Stratagene MX3000P PCR系统中进行RT-PCR反应。
对于RNA微阵列分析，使用分光光度计(NanoDrop ND-1000)确定RNA浓度。总RNA用于合成dsDNA并且在存在荧光染料的条件下利用标准程序进行体外转录以产生标记的cRNA。使用自动化装置(Tecan)将Cy5-标记的测试样品RNAs和Cy3-标记的通用小鼠参照RNAs同时杂交到商购的安捷伦(Agilent)全小鼠基因表达阵列(WMG 4x44K)上。杂交后，将该阵列洗涤、扫描并且用特征提取软件(feature extraction software，安捷伦(Agilent))处理图片。将得到的数据用生物分析软件(PartekGenomic Suite)和其他自动化微阵列分析进行分析。利用定量RT-PCR来验证最上部两个结果。RT-PCR按上述进行，但是使用的是下述引物(全部来自Qiagen)：LRP8：QT00156100和用于比较目的的LRP1：QT00155981。
结果显示在图2B-2D中。尽管在纯化的成体小鼠血脑屏障内皮细胞中有多种低密度脂蛋白受体家族成员高度表达，但是仅有LRP8在脑内皮细胞中表现出高表达并且在肺/肝细胞中表现出最低表达(图2B-1至2B-3)。此外，发现这种高表达在胚胎、幼体和成体样品中是一致的(图2C-1和2C-2)，而在肺/肝中的表达在所有时间点也一直是最低的。这些微阵列结果用对这些微阵列击中最好的两种特异的引物，即LRP8和用于比较目的的LRP1通过qRT-PCR进行验证(图2D)。尽管LRP1在脑内皮细胞中比在肺/肝细胞中更高度表达，但是LRP1在肺/肝细胞中显著表达，而在肺/肝细胞中几乎没有LRP8表达，这表明LRP8在鉴定用于寻找BBB-特异性靶标并且穿过BBB转运到CNS中的分子中是优选的选择。
实施例2：LRP8表达在内皮细胞中的定位
之前的实施例表明LRP8在BBB的内皮细胞上高度且特异性表达，并且表达LRP8的噬菌体在体外可以转运穿过D3细胞单层。为了更好地理解LRP8的作用并且其是否可以用于治疗剂递送，进行实验来验证LRP8在细胞和组织样品中的定位。
A.可用抗-LRP8抗体的鉴定和表征
通过使用标准技术通过Western分析进行不同商购的单克隆和多克隆抗-LRP8抗体的结合的研究，以鉴定能够识别纯化状态的或蛋白复合物混合物状态(即，细胞裂解物)的LRP8的一种或多种抗体。将重组人ApoER2(R&D系统(R&D Systems)#3520-AR)稀释到具有1x还原剂的Invitrogen LDS样品缓冲液中，并且以10ng，3ng，1ng，和0.3ng上样到10％Bis-Tris Nupage 15-孔凝胶(Invitrogen NP0303BOX)上。将凝胶在室温下在MOPS缓冲液中运行50分钟，然后转移到iBlotTM系统(Millipore)中并且用封闭缓冲液(Invitrogen)封闭2小时。将一个印迹(图3A，左图)用1∶500稀释的(2.0μg/ml)作为一级抗体的小鼠抗-ApoER2单克隆抗体(Abcam ab58216)在4℃在振动器上温育48小时。洗涤后，将该印迹用1∶2000稀释的生物素XX-抗-小鼠二级抗体在室温下温育2小时。另一个印迹(图3A，中间图)用兔抗-ApoER2多克隆一级抗体(Invitrogen 40-7800)在4℃在振动器上温育48小时。洗涤后，将该印迹用1∶2000稀释的生物素XX-抗-兔二级抗体在室温下温育2小时。第三个印迹(图3A，右图)用1∶500稀释的(2.0μg/ml)小鼠抗-LRP8多克隆一级抗体(AbnovaH00007804-A01)在4℃在振动器上温育48小时。洗涤后，将该印迹用1∶2000稀释的生物素XX-抗-小鼠二级抗体在室温下温育2小时。所有的印迹用Invitrogen QDot 625链霉抗生物素蛋白缀合物显色。图3A显示在最左侧印迹中观察到三种抗体所测试的最灵敏的LRP8检测。
为了评估Abcam抗-LRP8抗体是否能够检测细胞裂解物中的LRP8，进行了进一步的Western印迹实验。将D3细胞在T175烧瓶中生长直至第30代，此时将细胞刮下，用PBS洗涤，并且通过加入200μl裂解缓冲液(20mM磷酸钠，500mM NaCl，2mM MgCl2，4mM OG，1xcomplete)经过吸液管头浸泡进行裂解。将样品以70,000rpm离心10分钟，并且将澄清的裂解液加入到100μl 7M尿素0.1M NaH2PO4100mM Tris-HCl，2mMMgCl2中。向该混合物中加入0.5μl 1M MgCl2和0.5μl benzonase核酸酶，然后涡旋，并且在20℃70,000rpm离心10分钟。将得到的沉淀物溶解在尿素中，并且将提取物和裂解物稀释到具有1x还原剂的Invitrogen LDS样品缓冲液中。将样品以不同的量上样到4-12％NuPage Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，所述量包括：10ng，3ng，1ng，和0.3ng重组人ApoER2，10μg裂解物(mBR/293；Figure 3B)或36μg裂解物(人胎盘/mBR/293；图3C)。将凝胶在MOPS缓冲液中以200V在室温下运行50分钟，在iBlot系统(Millipore)中转移到硝基纤维素上，并且用封闭缓冲液(Invitrogen)封闭1小时。将印迹用1∶500稀释的一级抗体Abcam抗-ApoER2(#58216)1μg/ml在4℃温育过夜，然后用1∶2000稀释的二级抗体生物素XX-抗-小鼠在室温下温育4小时。将印迹用Invitrogen QDot 625链霉抗生物素蛋白缀合物显色。数据清楚地显示在D3细胞系中存在LRP8(参见图3B和3C)。
使用相似的测定法确定某些抗体检测细胞裂解物中的LRP8的能力，其中将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的样品在存在蛋白酶抑制剂(完全微小无EDTA蛋白酶抑制剂片，罗氏(Roche))条件下在Triton裂解缓冲液中在4℃裂解30分钟。允许用一级抗-ApoER2抗体(2μg/ml Zymed 40-7800；0.3μg/ml Novus NB100-41391)在4℃温育过夜，并且用二级抗体(缀合到辣根过氧化物酶上的抗-山羊或抗-兔抗体)在室温温育1小时。鉴定了一些商购抗体，其能够以不同的灵敏度检测在两种细胞提取物中的LRP8(参见图3B-3D)，其中一些特异性识别人和小鼠LRP8(参见，例如，图3B和3C)。
将用这些性质鉴定的一种抗体(小鼠单克隆抗-人ApoER2，Abcam#58216)使用Cy5标记试剂盒(Amersham)按照供应商的使用说明用荧光团Cy5标记。使用具有用1μg/ml重组人ApoER2包被的孔的平板和不同浓度的抗-ApoER2进行标准的ELISA测定，允许在4℃结合过夜。将平板洗涤，并且用1∶10,000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的二级抗-小鼠IgG抗体处理，并且对该平板读数。结果表明对于这种特定抗-ApoER2抗体的IC50为68ng/ml。为了确定抗体是否与RAP竞争与ApoER2的结合，按上述进行另一种ELISA，但是不使用不同浓度的抗-ApoER2，而是在存在或不存在不同量的重组人RAP的条件下使用恒定的1μg/ml抗-ApoER2。具体地，将Nunc-ImmunoTM聚苯乙烯Maxisorp 96-孔板(NUNC)用100μl/孔在PBS中的1μg/ml的重组人Apo ER2(R&D Systems#3520-AR)在4℃包被过夜。将在T-PBS(0.1％吐温-20Sigma 93773-250G)中的200微升5％奶粉(Bio Rad 170-0604)添加到每个孔中在室温历时2小时。用洗涤缓冲液洗涤后，加入人RAP(Innovative Research#IRAP)(50μl/孔，在1％MP T-PBS中0.003-2.0μg/ml)并且在室温预先温育30分钟。加入抗-ApoER2(abcam#58216)(50μl/孔，至在1％MP T-PBS中终浓度为1μg/ml)并且将平板在4℃温育过夜。将孔如之前洗涤，并且按照供应商建议的稀释向每个孔中加入在1％MP T-PBS中的HRP-缀合的抗-小鼠IgG(Sigma#A-9044)(100μl/孔)，并且孔用TMB底物试剂盒(Pierce#34021)显色。使用Versamax读数仪测量450nm的光密度。如在图3E中所示，在该测定中，在该抗体与rhRAP之间没有观察到竞争。
B.LRP8在内皮细胞内部和在不同组织中的分布的分析
进行免疫细胞化学和免疫组织化学分析来评估LRP8在人血管内皮细胞和来自不同来源的组织中的分布。
1.HUVECs
进行免疫细胞化学分析来评估LRP8在人血管内皮细胞上的分布。简言之，将HUVEC细胞生长至大约5,000细胞/cm2的密度。将细胞在4％PFA中固定，用PBS洗涤两次，然后在5％BSA+在PBS中的0.3％Triton-X100在室温封闭30分钟。一级抗-LRP8抗体(Zymed 40-7800；Santa Cruz 10112)以1∶100加入到在1％BSA+0.3％Triton-X100中的细胞中，并且在室温温育两小时。将细胞用PBS洗涤两次，并且加入在1％BSA+0.3％Triton-X100中1∶1000的适当的二级抗-山羊IgG或抗-兔IgG抗体(Alexa)。用Axioplan 2成像(Zeiss)观察免疫荧光。如在图4A中所示，在渗透化的HUVEC中的LRP8染色表现出有点的，但是在所有细胞中均观察到一致的染色。重复这些实验，但是在PBS中洗涤之前，使用的是已经用5nM，25nM或125nM的LRP8配体颤蛋白(US Biologicals)在37℃进行30分钟处理的HUVECs，并且随后如上述固定和免疫标记。未处理的HUVEC表现出与用任意浓度的颤蛋白预先处理的HUVEC相同的染色模式，表明颤蛋白对LRP8在HUVEC中的定位没有影响(图4C)。
2.hCMEC/D3和原代人脑内皮细胞
将原代人脑内皮细胞(CellSystems)的单层和在胶原蛋白-包被的盖玻片上生长至汇合的hCMEC/D3细胞在甲醇中在-20℃固定10分钟。将细胞在含有1.5％BSA的1xPBS中在室温温育1小时，渗透化10分钟(具有0.1％Triton X-100的1xPBS)和用来自Sigma(A3481)或Abcam(ab52905)的兔抗-人ApoER2抗体在室温温育1小时。将细胞进行1xPBS洗涤15分钟，然后用山羊抗-兔IgG-Alexa Flour 488(1∶200，Invitrogen)在室温温育1小时。将细胞在1xPBS中洗涤30分钟，并且将盖玻片包固在UltraCruzTM荧光包固介质(Santa Cruz)中，并且通过荧光显微镜分析。结果显示在图4B中。两张图像表现出LRP8的膜和囊泡分布；在原代细胞中的表达水平(右图)高于在无限增殖细胞系中的表达水平(左图)。
3.小鼠和人脑组织
在小鼠的脑组织上进行相似的研究。首先，在体外评估LRP8在组织中的显现。按下述进行实验。收集来自C57bl6小鼠的脑，用PBS充满，并且在4％PFA中在4℃固定48小时。然后，将组织在30％蔗糖溶液中在4℃温育24小时。一级兔抗-人LRP8抗体(Zymed 40-7800)和抗-CD31抗体(BD Biosciences)分别以1∶500稀释加入，并且在4℃温育过夜。将组织用多次变化的PBS洗涤，加入1∶200稀释的二级抗-兔或抗-山羊IgG抗体(Alexa)，并且将样品在室温温育2小时。显现免疫荧光图片，并且用Axioplan 2成像显微镜和软件(Zeiss)进行评估。如在图4D中所示，LRP8染色与CD31染色共定位。由于CD31是一种已知的血管内皮细胞标记，这表明LRP8在体内表达在这样的细胞上，并且表明LRP8染色对于CD31-阳性血管内皮细胞是特异性的，如将在血脑屏障中所发现的一样。
为了确定是否能够在脑中检测到系统施用的抗-LRP8抗体，将小鼠静脉内注射标记的抗体，并且评估该抗体在脑中的存在。简言之，将小鼠通过尾静脉用Alexa488-缀合的抗-LRP8抗体(Abcam)或Alexa488-缀合的对照免疫球蛋白以2.5mg/kg的剂量进行静脉内注射。1小时后，将小鼠充满PBS，并且摘下脑并立即冷冻不进行固定。将脑在低温恒温器上切片(40微米的切片)，并且将切片包固在具有荧光金的载玻片上。显现免疫荧光图像并且用Axioplan 2成像显微镜和软件(Zeiss)进行评估。如在图4E中所示，在对照抗体图像(左图)中观察到很少至没有染色，而在抗-LRP8抗体图像(右图)中观察到显著染色。血管被深染色(如由于在血脑屏障存在LRP8所预测的一样)，但是在整个脑组织中也观察到以点模式的显著染色。这表明通过尾静脉注射施用的抗-LRP8抗体循环并且穿过BBB转运到小鼠脑中。
显示在图4F中的免疫组织化学数据使用来自获自尸检的皮质脑区的未固定的人脑组织的低温恒温器切片进行，其通过间接的免疫荧光标记。使用连续两步温育来检测兔多克隆抗-LRP8抗体(Sigma)，包括亲和纯化的与Alexa555(分子探针(Molecular Probes))缀合的山羊抗-兔IgG(H+L)。切片、染色和荧光显微镜和鉴定细胞核的DAPI染色一起按照标准步骤进行。容易检测与血管一致的LRP8染色。
实施例3：体外迁移测定
之前的实施例表明LRP8在体外和在体内都在血脑屏障的血管内皮细胞上高度且特异性表达。为了评估LRP8转运缔合的蛋白穿过血管内皮细胞层的能力，进行了迁移测定。在图5A中示意性描述了实验设定。简言之，将hCMEC/D3细胞使用Corning 0.4μm transwell(#3460)铺板在transwell平板上，其在预先用在0.02N乙酸的10μg/ml胶原蛋白(大鼠尾1型胶原蛋白#35436)包被的12-孔培养板上具有1.1cm2的生长面积。将细胞以2.5x104细胞/ml的密度以0.5ml/孔的总体积(1.5ml底外侧)涂布在休眠培养基(EGM2基本培养基；Lonza CC-4176)中，所述培养基包含12.5％人血清和2.2μM氢化可的松(Sigma#H0888)。3天和6天后更换培养基。细胞在第8天汇合。使用Cy5mAb标记试剂盒(Amersham#PA35001)制备Cy5-标记的抗-LRP8抗体，并且在transwell平板的顶面上以0.23mg/ml的浓度加入到500μl培养基中。使用相同试剂盒相同地制备Cy5-标记的对照抗体(抗-IL1β)，并且也加入到顶面中。
对于迁移实验，将与10倍过量的重组人ApoER2(终浓度0.11μM，10μg/ml)预混合的抗-LRP8-Cy5抗体(终浓度0.01μM，1.5μg/ml)或抗-LRP8-Cy5抗体加入到在transwell顶面的D3细胞中。评估两种类型的transwell设定：具有高密度孔的滤器和具有低密度孔的滤器。使用相同的浓度进行抗-IL1β-Cy5抗体对照。缺少D3细胞的仅有滤器的对照(胶原蛋白包被的)用于测量背景转运。在不同时间间隔从transwell平板的底外侧取出等量培养基(100μl)，并且在将样品更换到底外侧室之前，在96-孔黑色平板中，使用EnVisionTM荧光读数仪(DakoCytomation)用620nm激发波长和685nm发射波长测定抗-LRP8和抗-IL1β的含量。
图5B的结果显示抗-LRP8抗体穿过D3细胞层迁移，并且这种迁移在存在过量可溶性LRP8竞争剂时减少。观察到非常少的抗-IL1β抗体穿过D3细胞的转运。这些结果清楚地表明在该系统中为促进转运对于与LRP8的特异性结合的需要。
图5C显示进行与实施例2中ELISAs相似的ELISA实验。将平板用稀释到PBS中的1μg/ml重组的人ApoER2(R&D Systems#3520-AR)100μl/孔的体积包被，并且在4℃温育过夜。将孔通过加入稀释到T-PBS(0.1％吐温-20，Sigma#93773-250G)中的200μl 5％奶粉(BioRad 170-6404)进行封闭，并且将平板在室温温育2小时。将孔用100μl/孔加入或不加入LRP8的来自上述实验的包含抗-LRP8-Cy5的底外侧培养基洗涤，然后在4℃温育过夜。将该孔洗涤，并且加入稀释到1％MPT-PBS中的100μl/孔HRP-缀合的抗-小鼠IgG(Sigma#A-9044)。平板使用TMB底物试剂盒(Pierce#34021)按照供应商使用说明进行显色，并且在VersaMaxTM读数仪(分子装置(Molecular Devices))中在450nm处测量。结果(图5C)与图5B的数据一致，其表明抗-LRP8抗体穿过D3细胞层转运，并且进一步表明如果不存在与可溶性LRP8的竞争，则有更多量的抗-LRP8抗体转运穿过D3细胞层。对于具有10倍过量的LRP8的顶面样品所观察到的低值是由于在ELISA测定中的干扰。
实施例4：体内迁移测定
之前的实施例表明抗-LRP8抗体在体外结合LRP8并且穿过BBB转运。在小鼠模型中进行实验来评估在体内单次IV给药后标记的抗-LRP8抗体的组织分布。简言之，在存在或不存在不与LRP8结合的131I-标记的对照抗体的条件下，对C57Bl/6小鼠注射125I-标记的抗-LRP8。在注射后30分钟、1小时、4小时、12小时和24小时的时间点，将每组的两只小鼠处死，并且收集血液和组织用于分析每种标记的存在和量。
尽管为清楚理解的目的通过举例说明和实施例的方式详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应该解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科技文献的公开内容通过引用明确地完全结合于此。
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Claims (32)

1.组合物，其包含LRP8-结合分子和至少一种CNS-活性化合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子与所述至少一种CNS-活性化合物缀合。
3.权利要求2的组合物，其中所述缀合是所述LRP8-结合分子与所述至少一种CNS-活性化合物之间的共价连接。
4.权利要求2的组合物，其中所述缀合是通过接头进行的。
5.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子选自LRP8的天然配体、LRP8的天然配体的片段、LRP8的天然配体的修饰形式和LRP8的天然配体的修饰形式的片段。
6.权利要求5的组合物，其中所述LRP8的天然配体选自颤蛋白和含硒蛋白质P。
7.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子是抗体。
8.权利要求7的组合物，其中所述抗体是多特异性抗体。
9.权利要求7的组合物，其中所述抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和结合LRP8的抗体片段。
10.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子不与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。
11.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子与一种或多种LRP8的天然配体竞争与LRP8的结合。
12.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子结合LRP8的细胞外结构域。
13.权利要求1的组合物，其中所述LRP8-结合分子优先结合在脑中表达的LRP8。
14.权利要求1的组合物，其中所述CNS-活性化合物选自治疗性化合物和诊断性化合物。
15.权利要求14的组合物，其中所述治疗性化合物选自神经营养因子和化合物以治疗或预防下列各项中的一种或多种：神经病，淀粉样变性，癌症，眼科疾病或病症，病毒或微生物感染，炎症，缺血，神经变性疾病，发作，行为障碍和溶酶体贮积病。
16.权利要求15的组合物，其中所述治疗性化合物选自治疗帕金森病的化合物和治疗阿尔茨海默病的化合物。
17.权利要求15的组合物，其中所述诊断性化合物是特异性结合CNS靶标的标记的肽或抗体。
18.权利要求1的组合物，其中所述LRP-结合分子与LRP8的结合实现所述CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运。
19.药物制剂，其包含权利要求1的组合物和药用载体。
20.权利要求19的药物制剂，其还包含另外的治疗剂。
21.权利要求1-18中任一项的组合物，其用作药物。
22.权利要求1-18中任一项的组合物，其用于通过调节LRP8的表达、稳定性或活性来调节哺乳动物中CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运。
23.权利要求1-18中任一项的组合物，其通过靶向LRP8来调节CNS-活性化合物穿过包括紧密连接的血管内皮细胞层的转运。
24.权利要求1-18中任一项的组合物，其用于减少或预防CNS疾病或CNS病症的严重性、持续时间或症状。
25.权利要求1-18中任一项的组合物，其用于诊断CNS疾病或CNS病症。
26.权利要求1-18中任一项的组合物，其用于对CNS疾病或CNS病症分期。
27.权利要求1-18中任一项的组合物在制备药物中的应用。
28.权利要求27的应用，其中所述药物用于通过调节LRP8的表达、稳定性或活性来调节哺乳动物中CNS-活性化合物穿过血脑屏障的转运。
29.权利要求27的应用，其中所述药物用于通过靶向LRP8来调节CNS-活性化合物穿过包括紧密连接的血管内皮细胞层的转运。
30.权利要求27的应用，其中所述药物用于减少或预防CNS疾病或CNS病症的严重性、持续时间或症状。
31.权利要求27的应用，其中所述药物用于诊断CNS疾病或CNS病症。
32.权利要求27的应用，其中所述药物用于对CNS疾病或CNS病症分期。
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