IT201600101862A1

IT201600101862A1 - Ligandi del recettore dell’ormone FSH nella diagnosi e nella terapia dei tumori

Info

Publication number: IT201600101862A1
Application number: IT102016000101862A
Authority: IT
Inventors: Andrea Carpi; Fabio Maset; Monte Renzo Dal
Original assignee: Abresearch Srl
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2018-04-11

Description

Titolo: “Ligandi del recettore dell’ormone FSH nella diagnosi e nella terapia dei tumori”

Descrizione

Campo della tecnica dell’invenzione

La presente invenzione trova applicazione nel settore medico e, in particolare, nella diagnosi e nella terapia dei tumori.

Stato dell’arte

L’ormone follicolo-stimolante (Follicle Stimulanting Hormone, FSH) è una glicoproteina appartenente alla classe degli ormoni glicoproteici (Glicoprotein Hormones, GPHs), la quale include proteine caratterizzate da un’elevata similarità strutturale, come l’ormone tireo-stimolante (Tireo-Stimulating Hormone, TSH), l’ormone luteinizzante (Luteinizing Hormone, LH) e la gonadotropina corionica (Chorionic Gonadotropin, CG).

L’FSH viene sintetizzato nell’ipofisi anteriore e rilasciato nel circolo sanguigno a seguito della stimolazione dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH).

L’FSH riveste un ruolo chiave nella fisiologia della riproduzione, inducendo la maturazione del follicolo ovarico nella donna, mentre nell’uomo stimola le cellule del Sertoli promuovendo la spermatogenesi (Simoni et al.

1997).

Preparazioni a base di FSH ricombinante, come Puregon® e Gonal-F®, o di estrazione da urina, come Fostimon®, sono abitualmente impiegate nella pratica clinica per il trattamento dell’infertilità sia femminile che maschile e nei protocolli per la procreazione assistita (De Barross et al. 2013).

FSH è un eterodimero costituito da due subunità, α e β, associate in maniera non covalente.

La subunità α è comune a tutti i GPHs, mentre la subunità β varia nei diversi ormoni glicoproteici e ne definisce l’attività biologica specifica.

La subunità β (UniProt code: P01225) dell’ormone follicolo stimolante umano (FSHβ) ha un peso molecolare di circa 12,5 kDa ed è composta da 111 residui amminoacidici di cui 12 residui di cisteina, coinvolti nella formazione di 6 ponti disolfuro. Nella proteina sono presenti due siti di N-glicosilazione a livello dei residui di asparagina 7 e asparagina 24.

La bioattività dell’ormone FSH dipende dallo stato di glicosilazione del residuo di asparagina 52 della catena α che riveste un ruolo fondamentale nell’induzione della risposta biologica.

Inoltre, anche il pattern di glicosilazione a livello di FSHβ influenza la capacità di legame dell’ormone al recettore specifico.

Forme ipoglicosilate sono dotate di maggior affinità per il recettore in vitro ma di tempi di emivita più brevi in vivo, mentre si assiste al fenomeno opposto per le isoforme caratterizzate da una glicosilazione completa (Ulloa-Aguirre et al. 2011).

L’ormone FSH, liberato nel torrente sanguigno è in grado di raggiungere attraverso il microcircolo qualsiasi distretto dell’organismo. L’FSH esplica la sua azione fisiologica attraverso il legame e l’attivazione di un recettore specifico (FSH Receptor, FSHR).

In condizioni fisiologiche, il recettore viene espresso nell’uomo solo nelle cellule del Sertoli dei testicoli, mentre nella donna solo nelle cellule ovariche della granulosa.

Il recettore per FSH appartiene alla famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G (G-Protein Coupled Receptor) e la formazione del complesso ligandorecettore innesca una serie di segnali a cascata il cui significato metabolico non è del tutto noto.

L’effetto fisiologico più studiato è costituito dall’attivazione dell’enzima adenilato ciclasi che converte l’adenosina-monofosfato (AMP) nel secondo messaggero adenosina-monofosfato ciclico (cAMP) innalzandone la concentrazione citosolica.

cAMP è un forte attivatore della proteina chinasi A (PKA) che rappresenta un enzima chiave nella regolazione di diversi processi essenziali per la vita della cellula.

Nelle cellule del Sertoli, ad esempio, l’attivazione di FSHR si traduce nell’aumento di espressione dell’aromatasi, enzima che converte il testosterone in 17β-estradiolo stimolando i processi metabolici ad esso associati (Ulloa-Aguirre et al. 1998).

Già negli anni 1999-2000 la comunità scientifica inizia ad evidenziare l’espressione abnorme di FSHR nei tumori prostatici ma soprattutto in quelli delle ovaie (Ben-Josef et al. 1999; Zheng et al. 2000).

Negli anni successivi le evidenze in tal senso aumentano in modo significativo, ma solo nel 2010 Radu e colleghi (Radu et al. 2010) dimostrano che l’FSHR viene espresso in modo anomalo a livello dei tessuti endoteliali del microcircolo di numerosi tumori solidi.

Successivamente, viene consolidata l’evidenza che nei tumori ovarici la over-espressione dell’FSHR correla con la severità della patologia; inoltre vengono prodotte numerose evidenze che confermano il lavoro di Radu (Radu et al. 2010) e dimostrano che l’FSHR viene espresso ad alti livelli in diversi tipi di tumori solidi primari o metastatici (Pawlikowski et al. 2015; Planeix et al. 2015; Siraj et al. 2013; Sardella et al.

2012; Siraj et al. 2010).

Ligandi di FSHR in fase di sviluppo

Attualmente la ricerca di ligandi specifici per FSHR segue due metodologie principali: i) lo sviluppo di peptidi sintetici, ii) lo sviluppo di anticorpi monoclonali.

Entrambe le strategie hanno però importanti svantaggi quali, ad esempio, la limitata specificità, nel caso dei peptidi o l’instabilità intrinseca, nel caso degli anticorpi.

La molecola con la più alta specificità di legame per FSHR, ad oggi conosciuta, è rappresentata dall’ormone FSH, presente fisiologicamente in concentrazione nanomolare (nM) nel circolo sanguigno.

E’ quindi necessario identificare nuove e valide alternative a quelle esistenti, che permettano di raggiungere, diagnosticare e trattare in modo specifico le forme tumorali che coinvolgono il recettore FSH.

Riassunto dell’invenzione

La presente invenzione si basa sull’aver sorprendentemente trovato che la subunità β dell’ormone follicolo stimolante umano (FSHβ) è in grado di legarsi con alta affinità al recettore FSHR.

In particolare, è stato trovato che la subunità β dell’ormone follicolo stimolante umano (FSHβ) può inattivare il recettore FSHR.

Inoltre, gli inventori della presente domanda di brevetto hanno trovato che anche forme della subunità FSHβ ottenute impiegando la tecnologia del DNA ricombinante hanno dimostrato di potersi legare con alta affinità al recettore FSHR consentendo particolari e sorprendenti vantaggi.

Oggetto dell’invenzione

Un primo oggetto della presente invenzione è rappresentato dall’uso medico della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).

Secondo aspetti particolari, la subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) trova impiego per l’uso medico nella terapia e/o nella diagnosi dei tumori.

In un secondo oggetto, l’invenzione descrive una piattaforma biotecnologica per la preparazione della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante in forma ricombinante (ABRβ).

La subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante ottenuta con tale piattaforma (ABRβ) rappresenta un ulteriore oggetto della presente invenzione.

L’uso medico della subunità ABRβ, e in particolare l’uso medico per il trattamento e/o la diagnosi dei tumori, rappresentano ulteriori oggetti della presente invenzione.

Secondo un altro aspetto, vengono descritte preparazioni farmaceutiche per la somministrazione delle subunità FSHβ e ABRβ.

In tali preparazioni, dette subunità FSHβ e ABRβ possono essere coniugate a molecole aventi attività terapeutica o diagnostica.

Le sequenze nucleotidiche dei costrutti e dei vettori utilizzati per ottenere le forme ricombinanti descritte rappresentano ognuno ulteriori aspetti della presente invenzione, così come le nuove sequenze amminoacidiche descritte.

In un altro oggetto, la presente invenzione descrive un metodo per la diagnosi e/o la terapia dei tumori comprendente l’impiego della subunità FSHβ o ABRβ.

In un ulteriore oggetto della presente invenzione è descritto l’uso della subunità FSHβ o ABRβ per l’inattivazione del recettore FSH (FSHR).

Secondo un aspetto aggiuntivo dell’invenzione, è qui descritto un metodo per la preparazione di un ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante (ABRβ o ABRβ1) comprendente la modifica della regione C terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) mediante l’introduzione della sequenza KDEL.

In un aspetto particolare, tale metodo può comprendente inoltre l’introduzione di una coda istidinica (His-tag) all’estremità N-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).

Pertanto, l’uso della sequenza KDEL all’estremità C-terminale ed eventualmente anche l’uso di una coda istidinica (His-tag) all’estremità N-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) per la preparazione di ligandi del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) rappresentano ulteriori oggetto della presente invenzione.

Breve descrizione delle figure

La figura 1 mostra la struttura del vettore binario pABR: RB/LB, siti specifici di ricombinazione, bordo sinistro e bordo destro; Tml_p, Promotore del tumor morphology large DNA; NPT II, neomicina fosfotransferasi II; Tml_t, terminatore del tumor morphology large DNA; CaMV35x2_p, promotore del cauliflower mosaic virus; TEV 5’, sequenza TEV non tradotta; Nos_t, terminatore della nopalyne synthase;

la Figura 2 mostra i risultati dell’analisi elettroforetica di ABRβ1 purificato;

la Figura 3 mostra l’analisi SDS-PAGE dopo la deglicosilazione di ABRβ1 purificato;

la Figura 4 mostra i risultati delle analisi dello stato di aggregazione del ligando ABRβ1 mediante size exclusion chromatography in HPLC;

la Figura 5 mostra i risultati dell’analisi dell’effetto di ABRβ1 sull’attivazione di FSHR mediante misura della produzione di estradiolo (E2) nelle cellule del Sertoli. I dati sono rappresentati come media ± SD (n=3). Ctr: cellule non trattate; Gonal F: cellule trattate con il farmaco commerciale; ABRβ1: cellule trattate con il ligando ABRβ1 purificato; T: cellule addizionate di testosterone;

la Figura 6 mostra i risultati delle analisi del legame di ABRβ1 marcato con NBD a FSHR in cellule tumorali;

la Figura 7 mostra il risultato delle analisi dell’internalizzazione di Gonal F (Pannello A e B) e ABRβ1 (Pannello C e D) nelle cellule HeLa trasformate con FSHR umano. Cellule incubate con solo anticorpo secondario FITC (Pannello A e C);

la Figura 8 riporta i risultati della produzione di cAMP indotta da Gonal F e neutralizzata dal ligando ABRβ1;

la Figura 9 mostra l’effetto del ligando ABRβ1 sulla crescita delle cellule tumorali;

la Figura 10 mostra l’effetto del ligando ABRβ1 marcato con Alexa Fluor 647 sulla crescita delle cellule tumorali;

la Figura 11 mostra un esempio di boxplots ottenuti come output dall’analisi dei dati di espressione genica di FSHR condotta interrogando il database ArrayExpress (EMBL). Il set di dati analizzati comprende 504 campioni umani di neuroblastoma infantile;

la Figura 12 mostra i risultati dell’analisi del legame di ABRβ1 marcato con NBD a FSHR nelle cellule NB3;

la Figura 13 mostra i risultati dell’analisi dell’internalizzazione di ABRβ1 marcato con NBD nelle cellule NB3 (Una frazione superiore al 96% delle cellule trattate evidenzia comparsa di segnale localizzato in vescicole citoplasmatiche (pannello B) (n=3). Cellule non trattate (Pannello A));

la Figura 14 mostra la copertura della sequenza amminoacidica mediante analisi in spettrometria di massa della forma deglicosilata del ligando ABRβ1 sottoposto a digestione triptica (CAM:carbammido-metilcisteina; (1): missed cleavage; MSO: metionina solfossido).

Descrizione dettagliata dell’invenzione

Definizioni

Nella presente descrizione dell’invenzione i termini indicati devono intendersi, dove non indicato diversamente, come qui a seguito riportato.

“FSHR” è il recettore dell’ormone umano follicolo stimolante (FSH).

“FSHβ” è la subunità beta dell’ormone umano follicolo stimolante (FSH); tale subunità è caratterizzata dalla sequenza corrispondente alla SEQ.ID.n. 1.

“ABRβ” indica le subunità beta dell’ormone umano follicolo stimolante (FSH) ottenute mediante l’impiego di una piattaforma biotecnologica secondo la presente invenzione.

“ABRβ1” indica una specifica subunità beta dell’ormone umano follicolo stimolante (FSH) ottenuta mediante l’impiego della piattaforma biotecnologica per la produzione in cellule vegetali di Nicotiana benthamiana in accordo con la presente invenzione; tale subunità è caratterizzata dalla sequenza corrispondente alla SEQ.ID.n. 2.

Più in generale, alle subunità FSHβ, ABRβ e ABRβ1 si può fare riferimento con il termine “ligando” del recettore FSHR, in quanto capaci di legarsi al recettore stesso.

In accordo con un primo oggetto dell’invenzione è descritto l’uso medico della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).

In particolare, la presente invenzione descrive l’uso della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) nella terapia e/o nella diagnosi dei tumori.

Con il termine tumori si intendono il tumore ed il cancro, cioè quei tessuti caratterizzati da una crescita anomala causata da un’incontrollata moltiplicazione cellulare.

In un aspetto preferito, tale tumore o cancro è un tumore solido, primario o metastatico.

In dettaglio, sono inclusi il tumore ed il cancro della prostata (in particolare l’adenocarcinoma prostatico), della ghiandola mammaria, del colon, del pancreas, del rene, del polmone, del fegato, del testicolo, dell’ovaio, del cervello e della tiroide.

Secondo un aspetto dell’invenzione, tale uso medico può trovare applicazione nel trattamento del neuroblastoma infantile.

In particolare, tale uso medico è descritto in pazienti pediatrici e, preferibilmente, in pazienti in età infantile fino ai 6 anni di vita.

Per gli scopi della presente invenzione, la subunità FSHβ trova impiego nella terapia tumorale in forma tal quale oppure coniugata a farmaci antitumorali.

Nella forma non coniugata ad alcun farmaco, la subunità FSHβ può essere impiegata come competitore dell’FSH nel legame con FSHR e quindi in grado di bloccare l’attività del recettore.

Per quanto concerne, invece, i farmaci antitumorali che possono essere utilizzati e coniugati alla subunità β, questi possono appartenere:

- alla classe degli agenti citotossici. Preferibilmente, tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: gli antagonisti pirimidinici come ad esempio il capecitabina, gli inibitori enzimatici come la famiglia delle camptotecine, ad esempio l’irinotecan;

- alla classe degli agenti alchilanti. Preferibilmente, tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia dei sali metallici come ad esempio il cisplatino, gli intercalanti del DNA come ad esempio la doxorubicina, la famiglia delle antracicline;

- alla classe dei modulatori della sintesi proteica. Preferibilmente, tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia degli inibitori del proteasoma come ad esempio il bortezomib, la famiglia degli inibitori di mTOR come ad esempio il temsirolimus; - alla classe degli inibitori mitotici. Preferibilmente, tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia delle ansamitocine come ad esempio la maytansina, la famiglia degli inibitori della polimerizzazione dei microtubuli come ad esempio la auristatina E.

Secondo un aspetto dell’invenzione, la subunità FSHβ trova impiego nella diagnosi dei tumori.

In particolare, si tratta dei tumori e delle forme di cancro sopra menzionate.

Una volta opportunamente coniugata, la subunità FSHβ consente quindi la rilevazione nella diagnostica per immagini in ambito oncologico.

Le tecniche utilizzate a tale scopo includono, ad esempio: la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica nucleare (NMR), la tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT) e l’ecografia; pertanto, la subunità FSHβ può essere opportunamente coniugata con molecole adatte alla diagnosi mediante tecniche come: la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica nucleare (NMR), la tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT) e l’ecografia.

Per gli scopi presenti, con il termine diagnosi si intende anche la possibilità di verificare la progressione di un tumore nel tempo e/o la sua progressione o regressione nel corso di un trattamento terapeutico.

Per gli scopi della presente invenzione, con diagnosi si intende anche l’utilizzo della subunità FSHβ per condurre analisi in vitro a scopo di laboratorio.

Secondo un primo aspetto, la subunità FSHβ può essere opportunamente coniugata a molecole fluorescenti come ad esempio: fluoresceina isotiocianato (FITC), la ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5).

Nell’ambito della medicina nucleare, invece, subunità FSHβ può essere coniugata a molecole radioattive come ad esempio:<123>I,<111>In,<188>Re,<18>F,<35>S,

<99>Tc.

In un aspetto particolare, la subunità FSHβ può essere coniugata anche a derivati del boro o a nanoparticelle di diversa natura.

La coniugazione con nanoparticelle può essere tramite un opportuno linker.

Nanoparticelle

Le nanoparticelle utilizzate in ambito medico come carrier (ad esempo per farmaci, radioisotopi, molecole fluorescenti o enzimi) usualmente hanno dimensioni comprese tra 1 nm e 1 μm.

Le nanoparticelle possono presentare superficie liscia o irregolare, possono essere piene, cave, attraversate da canalicoli o costituite da strutture lenticolari.

Le nanoparticelle sono particelle formate da materiali inorganici o organici; quelle a base inorganica possono essere costituite da Au, Ag, Si, Se, Cd o composti del carbonio, come il grafene, mentre quelle di origine organica possono essere costituite, ad esempio, da polimeri di zuccheri o lipidi (micelle, liposomi) o da molecole come l’acido poli(lattico-coglicolico) (PLGA).

Scopo delle nanoparticelle è veicolare un quantitativo elevato di molecole contenute al loro interno sul sito di riferimento.

Per gli scopi della presente invenzione, con il termine “coniugata” si intende che la subunità FSHβ o una subunità ABRβ o, più in particolare, una subunità ABRβ1 è opportunamente legata ad una molecola terapeutica o diagnostica.

Tale legame, in particolare, può essere rappresentato da un legame chimico di tipo covalente, diretto o ottenuto tramite un opportuno linker, o da un legame di coordinazione.

Circa l’origine della subunità FSHβ, questa può essere ottenuta dalla purificazione di urina umana oppure mediante tecniche di DNA ricombinante; può essere inoltre ottenuta da prodotti commerciali come, ad esempio, Fertinex®, Metrodin HP®, Gonal-F® (Serono), Follistim®, Puregon ® (Merk Sharp & Dohme).

In un secondo oggetto, l’invenzione descrive una piattaforma biotecnologica per la preparazione della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante da cellule vegetali e, più in dettaglio, da Nicotiana benthamiana (ABRβ1).

Più in dettaglio, la piattaforma biotecnologica sfrutta un processo con cui la sequenza amminoacidica della subunità FSHβ è opportunamente modificata così da inserire un peptide segnale caratteristico delle cellule vegetali per l’indirizzamento verso il reticolo endoplamatico.

La presente invenzione fa quindi uso della sequenza KDEL per modificare la regione C-terminale della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ), in particolare allo scopo di mantenere la proteina nel reticolo endoplasmatico.

Il peptide così ottenuto subisce pertanto solo una parte del processo di maturazione della glicosilazione che sorprendentemente lascia inalterati i processi che guidano il folding proteico.

In particolare, i residui di asparagina 7 e 24 vengono glicosilati o iperglicosilati formando strutture ramificate di residui di mannosio.

In un aspetto particolare, si fa inoltre uso di una coda istidinica (His-tag) all’estremità N-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).

La piattaforma pertanto fa uso della sequenza KDEL all’estremità C-terminale ed eventualmente anche l’uso di una coda istidinica (His-tag) all’estremità N-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) per la preparazione di ligandi del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).

Come sopra decritto, la subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante ottenuta secondo la metodologia qui descritta (ABRβ1) ed il suo uso medico nel trattamento e/o nella diagnosi dei tumori rappresentano ulteriori oggetti della presente invenzione.

In particolare, la presente invenzione descrive l’uso della subunità ABRβ per la terapia e/o nella diagnosi dei tumori.

Con il termine tumori si intendono il tumore ed il cancro, cioè quei tessuti caratterizzati da una crescita anomala causata dalla incontrollata moltiplicazione cellulare.

In dettaglio, sono inclusi il tumore ed il cancro della prostata, della ghiandola mammaria, del colon, del pancreas, del rene, del polmone, del fegato, del testicolo, dell’ovario, del cervello e della tiroide.

Come sopra descritto, la subunità ABRβ1 è ottenuta per via biotecnologica da coltura di cellule vegetali di Nicotiana benthamiana in sospensione.

Secondo aspetti alternativi della presente invenzione, la subunità ABRβ può essere ottenuta per via biotecnologica in altre cellule, ad esempio, in cellule di mammifero, di lievito, di batteri o di altre cellule vegetali.

In particolare, fra le cellule vegetali possono essere impiegate cellule di Daucus carota, Oryza sativa, Glycine max, Maize, ecc.

Secondo un altro aspetto, sono descritte preparazioni farmaceutiche per la somministrazione delle subunità FSHβ e ABRβ e, più in particolare, della subunità ABRβ1.

Più in dettaglio, tali preparazioni possono comprendere la subunità FSHβ o una subunità ABRβ o, più in particolare, una subunità ABRβ1, ed uno o più veicolanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili.

Tali subunità possono in aspetti preferiti dell’invenzione, essere eventualmente coniugate ad opportune molecole per la terapia o per la diagnosi, secondo quanto sopra descritto con riferimento alla subunità FSHβ.

Pertanto, la presente invenzione mette a disposizione formulazioni terapeutiche e diagnostiche comprendenti le subunità FSHβ, ABRβ1 sopra descritte o altre subunità ABRβ (ottenute mediante la tecnologia del DNA ricombinante applicata ad altre cellule).

Più in dettaglio, tali preparazioni sono formulate per la somministrazione endovena.

Secondo un ulteriore oggetto, con la presente invenzione viene descritto un metodo per la terapia e/o per la diagnosi dei tumori comprendente l’impiego della subunità FSHβ, ABRβ1 o di altre subunità ABRβ.

In particolare, tale metodo comprende la fase di somministrazione ad un paziente che ne ha bisogno di una quantità farmaceuticamente efficace della subunità FSHβ o ABRβ o ABRβ1, eventualmente formulata in un’opportuna preparazione farmaceutica.

Per gli scopi presenti, un paziente è inteso essere un soggetto affetto da un tumore solido, primario o metastatico.

In dettaglio, sono inclusi il tumore ed il cancro della prostata (in particolare l’adenocarcinoma prostatico), della ghiandola mammaria, del colon, del pancreas, del rene, del polmone, del fegato, del testicolo, dell’ovario, del cervello e della tiroide.

Secondo un aspetto particolare, tale metodo può trovare applicazione nel trattamento del neuroblastoma infantile.

Con metodo per la diagnosi si intende anche la possibilità di verificare la progressione di un tumore nel tempo e/o la sua progressione o regressione nel corso di un trattamento terapeutico.

In altre parole, si fa riferimento ad un metodo per verificare la progressione di un tumore nel tempo e/o la sua progressione o regressione nel corso di un trattamento terapeutico comprendente le fasi di determinare l’estensione del tumore in un soggetto a tempi diversi e successivi (ad esempio un tempo t0ed un tempo t1), laddove fra detti tempi (ad esempio t0e t1) può essere condotta una fase di trattamento terapeutico del tumore.

La presente invenzione mette a disposizione inoltre un metodo per l’inattivazione in vivo del recettore FSHR comprendente la fase di somministrare una quantità farmaceuticamente attiva della subunità FSHβ o ABRβ o ABRβ1.

Tale metodo può essere alternativamente eseguito in vitro in laboratorio per scopi differenti.

In accordo con un ulteriore aspetto della presente invenzione è descritto l’uso della subunità FSHβ o ABRβ o ABRβ1 per l’inattivazione del recettore FSHR.

Tale inattivazione, in particolare, può essere condotta in vivo o in vitro.

Nella presente domanda di brevetto sono descritte quindi le seguenti sequenze:

SEQ ID n. 1 Sequenza della subunità FSHβ umana

SEQ ID n. 2 Sequenza ABRβ1

SEQ ID n. 3 Sequenza codificante ABRβ1

Con riferimento alla sequenza della subunità ABRβ1, si intendono comprese negli scopi della presente invenzione anche tutte le sequenze che presentano una similarità con la SEQ. ID. n. 2 tale da non modificare l’interazione con il recettore FSHR.

In particolare, per “similarità” si intende la percentuale di amminoacidi occupanti la medesima posizione che possono essere sostituiti con un amminoacido differente o strutturalmente equivalente, laddove una similarità pari al 100% significa che le due sequenze sono identiche.

La similarità può essere determinata mediante allineamento, condotto in particolare secondo uno o più algoritmi o programmi noti come, ad esempio, CLUSTALW o BLAST.

In un aspetto preferito dell’invenzione, la percentuale di similarità è in riferimento alla sola sequenza della subunità ABRβ1 in comune con la sequenza della subunità FSHβ.

In un altro aspetto preferito dell’invenzione, la percentuale di similarità è in riferimento ai soli amminoacidi delle porzioni della sequenza di ABRβ1 che non includono gli amminoacidi che partecipano all’interazione con il recettore.

Gli amminoacidi della porzione di ABRβ1 che partecipano all’interazione con il recettore corrispondono agli amminoacidi 33-53 della sequenza di FSHβ.

Per gli scopi della presente invenzione la similarità è maggiore di circa il 90%, preferibilmente è compresa fra circa 90-99,9% e più preferibilmente compresa fra circa 95-97%.

PARTE SPERIMENTALE

1. Produzione e purificazione del ligando ABR

La sequenza proteica di FSHβ umana (UniProt: P01225) è stata modificata in silico come descritto nella successiva parte relativa ai materiali e metodi. La sequenza genica codificante per la nuova proteina, compresa la regione del peptide segnale, (ligando ABRβ1) è stata ottimizzata per l’espressione in pianta (SEQ. ID. n. 3).

La sequenza nucleotidica è stata quindi inserita nella cassetta di espressione del vettore binario pABR (Figura 1) e utilizzando come sistema di trasformazione delle cellule vegetali l’Agrobacterium tumefaciens sono stati ottenuti e selezionati i cloni stabili di Nicotiana benthamiana che esprimono il più alto livello del ligando ABRβ1.

Il ligando ABRβ1 è stato purificato dalle cellule vegetali coltivate in sospensione utilizzando cromatografie sequenziali.

2. Caratterizzazione chimica del ligando ABRβ1

Il ligando ABRβ1 ottenuto dopo ottimizzazione del processo di purificazione è stato analizzato utilizzando la tecnica elettroforetica SDS-PAGE.

L’analisi in immunoblotting con anticorpo specifico per FSHβ umano e i gel di policrilammide sottoposti a colorazione con Coomassie Brilliant Blue o con la più sensibile colorazione all’argento mostrano che il ligando ABRβ1 raggiunge un grado di purezza del 95-98%. L’analisi rivela l’esistenza di due specie reattive all’anticorpo per FSHβ.

In figura 2 sono riportati i risultati dell’analisi elettroforetica di ABRβ1 purificato. 0,1 µg di ABRβ1 purificato sono analizzati in SDS-PAGE. MW, marcatore di peso molecolare; SS, colorazione argentica; WB, immunoblottig utilizzando l’anticorpo specifico per FSHβ umano. Le forme a 25 e 37 kDa rilevate dalla colorazione argentica sono reattive all’anticorpo specifico per FSHβ umano. Le due specie di peso molecolare apparente di 25 kDa e 37 kDa sono il risultato del diverso pattern di glicosilazione della proteina. Il trattamento del campione con una glicosilasi (PNGase F) produce la scomparsa delle due specie ad alto peso molecolare trasformandole in un’unica forma di peso molecolare apparente di 14 kDa.

La figura 3 mostra i risultati dell’analisi SDS-PAGE dopo la deglicosilazione di ABRβ1 purificato. 0,1 µg di ABRβ1 purificato sono stati sottoposti a protocollo di deglicosilazione e analizzati in SDS-PAGE e successiva colorazione argentica. A sinistra, marcatore di peso molecolare; 1, ligando ABRβ1 purificato e non deglicosilato; 2, ligando ABRβ1 purificato e sottoposto a deglicosilazione. Le forme glicosilate a 25 e 37 kDa scompaiono dopo deglicosilazione e si osserva la per generazione di una forma non deglicosilata del peso apparente di 14 kDa.

Tutte le specie molecolari sono state analizzate con diverse tecniche di spettrometria di massa per determinarne il peso molecolare accurato e la sequenza amminoacidica. Alle specie glicosilate è stato assegnato un peso molecolare rispettivamente di 24493,2 Da e 37654,57 Da, la proteina deglicosilata ha un peso molecolare di 13783,6. Da.

L’analisi di fingerprint proteico ha dimostrato che la sequenza amminoacidica del ligando ABRβ1 è identica a quella di FSHβ maturo umano con le modifiche apportate descritte nella presente domanda di brevetto (Figura 14).

Poiché la struttura terziaria risulta essenziale per l’efficiente legame con FSHR è stato verificato il pattern di assemblaggio dei ponti disolfuro del ligando ABRβ1. L’analisi in spettrometria di massa dei campioni ottenuti da proteolisi parziale del ligando ABRβ1 ha permesso di identificare le coppie di cisteine coinvolte nella formazione dei ponti disolfuro. L’identificazione delle coppie di cisteina coinvolte nella formazione dei ponti disolfuro evidenzia un pattern identico a quanto osservato in FSHβ umano maturo confermando che il ligando ABRβ1 possiede il corretto folding proteico.

3. Glicosilazione

Il ligando ABRβ1 possiede al C terminale la sequenza aminoacidica KDEL che ne garantisce la ritenzione all’interno del reticolo endoplasmatico. Questo fatto presuppone che la glicosilazione a livello del’amminoacido asparagina comprenda due residui di N-actilglucosammina e un certo numero di residui di mannosio. Considerando il peso molecolare delle due forme proteiche glicosilate e di quella deglicosilata si può ricavare la massa della porzione glucidica nelle proteine. Supponendo che nei due residui di asparagina presenti nella stessa forma proteica il pattern di glicosilazione sia simile, possiamo dedurre che nella proteina di 24493 Da sia presente una prima porzione glucidica formata da 2 N-acetilglucosammina e 30 residui di mannosio e da una seconda porzione glucidica formata da 2 N-acetilglucosammina e 31 residui di mannosio. Lo stesso tipo di considerazioni suggeriscono che nella forma proteica di 37654 sia presente una porzione glucidica formata da 2 N-acetilglucosammina e 70 residui di mannosio e da una seconda porzione glucidica formata da 2 N-acetilglucosammina e 71 residui di mannosio.4. Stabilità e aggregazione

Per verificare la stabilità e la tendenza ad aggregare del ligando ABRβ1, la proteina purificata è stata sottoposta a tre cicli di congelamento/scongelamento, crio-liofilizzazione sotto vuoto o incubazione a 20°C e a 37°C per 72 ore.

La valutazione del grado di aggregazione è stata condotta utilizzando la tecnica della size exclusion chromatography (SEC) in HPLC.

L’analisi ha rivelato che nel ligando ABRβ1 alla fine del processo di purificazione la percentuale di proteina aggregata rispetto alla proteina totale è inferiore al 4%.

La figura 4 mostra i risultati delle analisi dello stato di aggregazione del ligando ABRβ1 mediante size exclusion chromatography in HPLC. Il ligando ABRβ1 mostra un profilo cromatografico con la presenza di un unico picco principale corrispondente alle forme solubili. L’analisi delle aree sottese dai picchi rivela aggregazione inferiore al 4% in tutti i campioni analizzati (n=3, p≤0,05).

I campioni di proteina purificata, sottoposti ai trattamenti sopra descritti, non mostrano significative variazioni della percentuale di aggregazione ad indicare che la proteina in tali condizioni è caratterizzata da ottima solubilità e stabilità nel tempo.

5. Effetto del ligando ABRβ1 sull’attivazione del recettore FSHR nelle cellule del Sertoli.

Le cellule del Sertoli rappresentano il modello di elezione per lo studio dell’ormone FSH e dell’attivazione di FSHR “in vitro”. In queste cellule l’attivazione di FSHR induce un aumento di espressione dell’enzima aromatasi che converte il testosterone in estradiolo. L’aumento di estradiolo prodotto rappresenta quindi un parametro importante per verificare se una molecola è in grado di attivare FSHR. In questo modello Gonal-F® induce l’aumento di produzione di estradiolo di circa il 300% rispetto alle cellule non trattate. Sorprendentemente, nelle stesse condizioni sperimentali, il ligando ABRβ1 non provoca nessun cambiamento nella produzione di estradiolo dimostrando quindi la competa incapacità di attivare FSHR.

La figura 5 mostra i risultati dell’analisi dell’effetto di ABRβ1 sull’attivazione di FSHR mediante misura della produzione di estradiolo (E2) nelle cellule del Sertoli. I dati sono rappresentati come media ± SD (n=3). Ctr: cellule non trattate; Gonal F: cellule trattate con il farmaco commerciale; ABRβ1: cellule trattate con il ligando ABRβ1 purificato; T: cellule addizionate di testosterone. I vari reagenti sono utilizzati alle concentrazioni indicate in figura. Gonal F lega FSHR e si traduce nell’aumento di E2 di circa il 300% rispetto al Ctr, il ligando ABRβ1 non è in grado di attivare FSHR e la produzione di E2 è nulla (p≤0,0001). Il trattamento con testosterone rivela la massima attività aromatasica potenziale nelle diverse condizioni (controllo sperimentale).

6. Marcatura del ligando ABRβ1 e binding a FSHR

Per verificare l’ipotesi che il ligando ABRβ1 sia in grado di legare in modo specifico ed efficiente FSHR è stato necessario derivatizzare la proteina purificata con sonde fluorescenti che consentissero di effettuare analisi di binding ligando-recettore su modelli cellulari in vitro.

A tale scopo sono state utilizzate tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza e sulla citofluorimetria. Il ligando ABRβ1 è stato derivatizzato con due differenti molecole fluorescenti: 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD) e Alexa Fluor 647.

Le linee cellulari umane immortalizzate (modello di tumore ovarico) OVCAR-3, OVCAR-5, CAOV-3 sono state scelte come modello in vitro in quanto esprimono FSHR. Le cellule incubate per un breve periodo con il ligando ABRβ1 fluorescente mostrano omogenea e marcata decorazione della membrana cellulare che correla con la concentrazione di proteina fluorescente utilizzata nell’incubazione e scompare nel caso di co-incubazione con Gonal-F® a dimostrare la specificità di binding del ligando ABRβ1 con FSHR.

L’analisi citofluorimetrica rivela che la percentuale di cellule marcate rispetto alle cellule totali è in tutti casi superiore al 96%.

Gli stessi risultati si sono ottenuti anche su altre linee cellulari come ad esempio le LS-180 (modello di tumore del colon umano).

La figura 6 mostra i risultati delle analisi del legame di ABRβ1 marcato con NBD a FSHR in cellule umorali.

Le cellule tumorali indicate nella figura sono state trattate con il ligando ABRβ1 marcato e quindi lavate in soluzione salina prima dell’analisi del segnale di fluorescenza (FL; canale del FITC). L’esperimento è stato condotto utilizzando un citofluorimetro. L’analisi rivela che le cellule che legano ABRβ1 (picco grigio chiaro) rappresentano più del 96% delle cellule totali trattate (picco grigio scuro), (n=3).

7. Analisi dell’internalizzazione di ABRβ1

Le analisi dell'effetto del ligando ABRβ1 sulle dinamiche di internalizzazione del recettore FSHR sono state condotte mediante immunofluorescenza e microscopia confocale. Le cellule HeLa (coltivate in mezzo DMEM completo) seminate su vetrino sono state trasfettate con il plasmide che permette la sovra-espressione di FSHR umano, 24 ore dopo la semina le cellule sono state trattate con 0,1 µg/ml di Gonal-F®, ABRβ1 o con ABRβ1 marcato con NBD.

Le cellule trattate con ABRβ1 marcato con NBD sono state fissate (come descritto nella sezione materiali e metodi) e analizzate in microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio confocale. Le cellule trattate con Gonal-F® o con il ligando ABRβ1 non marcato sono state fissate e sottoposte al protocollo di immunocitochimica. In questo caso l’internalizzazione del recettore FSHR è stata evidenziata grazie all’utilizzo di un anticorpo specifico contro FSHR umano e un anticorpo secondario che ne permette la rivelazione in microscopia a fluorescenza confocale. Come mostrato in figura 7, in tutti i casi si evidenzia la comparsa di vescicole fluorescenti citoplasmatiche. Le cellule HeLa adese su vetrino sono state trasformate con il plasmide per l’espressione di FSHR umano. 24 ore dopo la trasfezione le cellule sono state incubate con Gonal F o con il ligando ABRβ1 (100 ng/ml per 15 min) e quindi lavate in soluzione salina, incubate per ulteriori 30 min a 37°C prima di essere fissate e sottoposte all’analisi immunocitochimica usando un anticorpo primario specifico per FSHR umano e un secondario coniugato con FITC che viene rilevata usando un microscopio confocale a fluorescenza. L’analisi rivela che il Gonal F (Pannello A e B) e il ligando ABRβ1 (Pannello C e D) presentano un forte tasso di internalizzazione come evidenziato dalla comparsa di segnale localizzato in vescicole citoplasmatiche. Cellule incubate con solo anticorpo secondario FITC (Pannello A e C).

Le diverse tecniche utilizzate evidenziano e confermano che il fenomeno osservato è dovuto all’internalizzazione del recettore FSHR indotta da ligando specifico.

8. Analisi della produzione di cAMP indotta da Gonal-F® e neutralizzazione indotta da ABRβ1

Per verificare la specificità e l’efficienza di legame del ligando ABRβ1 a FSHR è stato valutato il suo effetto sulla produzione di cAMP (frutto di binding e attivazione del recettore) in studi di competizione con Gonal-F®. Le cellule HEK293 sono state co-trasfettate con un plasmide contenete il gene codificante per FSHR umano e con un plasmide codificante per la sonda proteica Epac1-camps che permette di misurare le variazioni di cAMP utilizzando tecniche di microscopia a fluorescenza. Analisi preliminari dose-risposta con Gonal-F® hanno permesso di definire la sensibilità, il range dinamico di risposta del sistema e la concentrazione alla quale Gonal-F® produce il massimo effetto. Le misure della variazione di cAMP negli esperimenti di competizione in cui la concentrazione del ligando ABRβ1 viene mantenuta fissa a 500 ng/ml e la concentrazione di Gonal-F® viene variata nel range 1-100 ng/ml hanno permesso di generare la curva di competizione Gonal-F®/ligando ABRβ1.

La figura 8 riporta i risultati della produzione di cAMP indotta da Gonal F e neutralizzata dal ligando ABRβ1. Le cellule HEK293 sono state trasfettate con FSHR umano e con la sonda che permette di misurare la concentrazione citoplasmatica di cAMP in fluorescenza tramite FRET (Epac2-camps). Gonal F induce la produzione di cAMP in modo dose dipendente (linea nera). In presenza del ligando ABRβ1 alla concentrazione di 500 ng/ml (linea grigia) è necessaria l’addizione di 50 ng/mL Gonal F per ottenere il 50% della sua attività massima in assenza di competizione. DR/R/min, variazione di fluorescenza normalizzata sulla fluorescenza basale. I dati sono rappresentati come media ± SD, (*=p≤0,01; *=p≤0,05).). Dai dati ottenuti si evidenzia che in presenza di 500 ng/ml del ligando ABRβ1 sono necessari 50 ng/ml di Gonal-F® per raggiungere il 50% dell’attività massima del farmaco in assenza di competizione. Da questo si evince che per neutralizzare 50 ng/ml di Gonal-F®, il più potente ligando conosciuto di FSHR sono sufficienti 500 ng/ml del ligando ABRβ1. Tale rapporto di concentrazione, ovvero 1:10 si rivela essere molto basso ed evidenzia l’estrema efficacia di ABRβ1 nel competere con Gonal-F® per il recettore umano FSHR confermandone inoltre l’estrema affinità e specificità.

9. Effetto del ligando ABRβ1 sul tasso di crescita di cellule tumorali: competizione con Gonal F

Poiché l’attivazione di FSHR è coinvolto nei meccanismi che regolano la crescita cellulare, gli inventori hanno verificato l’effetto del ligando ABRβ1 sul tasso di crescita cellulare in due linee modello ti tumore ovarico umano: CAOV-3 e OVCAR-3. In entrambe le linee cellulari il trattamento con Gonal F (0,1 µg/ml) induce a 48 ore dalla somministrazione un aumento significativo del tasso di crescita delle cellule (CAOV-3 40% e OVCAR-3 20%). Il trattamento con il ligando ABRβ1 (0,1 µg/ml) riduce il tasso di crescita cellulare del 15% nelle cellule CAOV-3 e del 40% nelle cellule OVCAR-3 rispetto a quanto misurato nelle condizioni di controllo. Sorprendentemente il ligando ABRβ1 risulta in grado di annullare l’effetto sulla crescita cellulare di Gonal F azzerandone gli effetti.

In figura 9 è mostrato l’effetto del ligando ABRβ1 sulla crescita delle cellule tumorali. Le cellule tumorali indicate nella figura sono state trattate con il ligando ABRβ1 (0,1 µg/ml), Gonal F (0,1 µg/ml) o con la miscela di entrambi Gonal F ABRβ1 (entrambi alla concentrazione di 0,1 µg/ml) in unica somministrazione a t=0 ore. Gonal F induce aumento del tasso di crescita, a 48 ore, di circa il 40%(p≤0,05) nelle cellule CAOV-3 e di circa il 20% (p≤0,05) nelle OVCAR-3 rispetto al controllo (Ctr). Il ligando ABRβ1 induce la riduzione del tasso di crescita a 48 ore di circa il 15% (p≤0,1) nelle cellule CAOV-3 e di circa il 40% (p≤0,05) nelle OVCAR-3. In entrambe le linee cellulari il ligando ABRβ1 compete con Gonal F annullandone l’effetto sulla crescita cellulare (p≤0,005). Per motivi di chiarezza non sono riportate in figura le S.D. (n=3). (Figura 9). Questo significa che “in vitro” il ligando ABRβ1 interagisce con FSHR competendo con Gonal F in concentrazioni confrontabili.

10. Effetto del ligando ABRβ1 marcato con Alexa Fluor 647 sul tasso di crescita di cellule tumorali: competizione con Gonal F

Il ligando ABRβ1 è stato marcato con Alexa Fluor 647 in modo tale da ottenere una molecola che possa essere tracciata nell’animale in esperimenti “in vivo”. Questo è importante per verificare ad esempio l’accumulo specifico del ligando ABRβ1 all’interno della massa tumorale indotta nell’animale. Per verificare che il processo di marcatura non alteri la capacità di binding a FSHR del ligando ABRβ1 sono stati ripeturi gli esperimenti descritti al punto 8. ABRβ1 Alexa Fluor 647 risulta in grado di competere con Gonal F anche se in modo un po’ meno efficiente rispetto al ligando ABRβ1 non marcato (Figura 10).

In particolare, in figura 10 sono mostrati gli effetti del ligando ABRβ1 marcato con Alexa Fluor 647 sulla crescita delle cellule tumorali. Le cellule tumorali sono state trattate con il ligando ABRβ1 marcato con Alexa Fluor 647 (ABRβ1_FL) (0,1 µg/ml), Gonal F (0,1 µg/ml) o con la miscela di entrambi Gonal F ABRβ1_FL (entrambi alla concentrazione di 0,1 µg/ml) in unica somministrazione a t=0 ore. Il ligando ABRβ1_FL inibisce l’effetto di Gonal F in modo simile a quanto prodotto dal ligando ABRβ1 evidenziando che la marcatura con Alexa Fluor 647 ne altera solo parzialmente l’efficacia. Per motivi di chiarezza non sono riportate in figura le S.D. (n=3). La perdita di efficienza è dovuta al legame con la molecola fluorescente che altera la capacità di interazione del ligando ABRβ1 con FSHR. L’effetto osservato risulta comunque contenuto e conferma che ABRβ1 Alexa Fluor 647 può essere utilizzato negli esperimenti “in vivo”.

11. ABRβ1 e FSHR nel neuroblastoma infantile

Per definire il pattern di espressione genica di FSHR nel neuroblastoma (NB) infantile, è stato analizzato un set di dati definito “E-MTAB-16” depositato presso The European Molecular Biology Laboratory (EMBL).

Nel database sono stati raccolte analisi di espressione genica ottenute con la tecnologia dei microarray.

La collezione è formata da 504 campioni di NB raggruppati nelle 7 classi elencate di seguito: classi di rischio, stadi di evoluzione del tumore, stato del gene MYCN, sopravvissuti/deceduti, recidive, età alla diagnosi e sopravvivenza dalla diagnosi.

I dati primari sono stati recuperati dal database come dati normalizzati https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/files/E-MTAB-161/E-MTAB-161.processed.1.zip).

Le sequenze individuate come sonde per i geni di interesse sono state riassegnate sul genoma di riferimento hg19 utilizzando il software bowtie2.

Solo le sonde che identificano i geni di interesse con alta specificità e confidenza sono state utilizzate per le successive analisi.

I livelli di espressione genica ottenuti nel caso di diverse sonde che appaiano sullo stesso gene sono stati normalizzati sfruttando il valore mediano dei dati disponibili. L’analisi è stata condotta al fine di delineare l'espressione genica di FSHR in relazione a numerosi parametri differenti utilizzati per la classificazione del NB come l'età del paziente al momento della diagnosi, stadio del tumore, lo stato di espressione di MYCN.

I boxplot (Figura 11) di espressione genica di FSHR sono stati prodotti e analizzati utilizzando il test statistico di Wilcoxon e assegnando un valore di significatività statistica ai dati relativi ai diversi gruppi.

Gli inventori della presente domanda di brevetto hanno trovato che il recettore FSHR risulta sovraespresso nel neuroblastoma infantile, in tutti i campioni che compongono il gruppo di pazienti, indipendentemente dallo stato di evoluzione della condizione patologica. È rilevante il fatto che FSHR è sovraespresso sia nei campioni provenienti da pazienti con diagnosi precoce e alta probabilità di sopravvivenza sia in quelli provenienti da pazienti con diagnosi tardiva e deceduti. Per verificare l’espressione la presenza della proteina FSHR nel neuroblastoma sono state utilizzate le cellule NB3 (modello cellulare di neuroblastoma). Le cellule sono state incubate con il ligando ABRβ1 fluorescente e analizzate in microscopia a fluorescenza e in citofluorimetria.

I dati ottenuti dimostrano che la percentuale di cellule marcate con il ligando ABRβ1 (fluorescente) e che quindi esprimono FSHR sulla superficie cellulare, è superiore al 96% in tutte le cellule analizzate.

La figura 12 mostra i risultati dell’analisi del legame di ABRβ1 marcato con NBD a FSHR nelle cellule NB3. Le cellule NB3 (modello in vitro di neuroblastoma) sono state trattate con il ligando ABRβ1 marcato e quindi lavate in soluzione salina prima dell’analisi del segnale di fluorescenza (FL) condotta con citofluorimetro nel canale del FITC. L’analisi rivela che le cellule che legano ABRβ1 (pannello B) rappresentano più del 96% delle cellule totali trattate (Pannello A), (n=3).

Inoltre gli esperimenti di microscopia evidenziano che il ligando ABRβ1, nelle cellule NB3, presenta un elevato tasso di internalizzazione che interessa la maggioranza delle cellule come dimostrato dalla comparsa di vescicole citoplasmatiche fluorescenti in più del 96% delle cellule analizzate.

La Figura 13 mostra i risultati dell’internalizzazione di ABRβ1 marcato con NBD nelle cellule NB3. Le cellule NB3 adese su vetrino sono state incubate con il ligando ABRβ1 marcato (150 ng/ml per 15 min) e quindi lavate in soluzione salina, incubate per ulteriori 30 min a 37°C prima dell’analisi in microscopia a fluorescenza (canale del FITC). L’analisi rivela che il ligando ABRβ1 presenta un forte tasso di internalizzazione. Una frazione superiore al 96% delle cellule trattate evidenzia comparsa di segnale localizzato in vescicole citoplasmatiche (pannello B) (n=3). Cellule non trattate (Pannello A).

Materiali e metodi

Costruzione del vettore

Per la trasformazione di batteri e cellule vegetali, abbiamo usato il vettore pABR derivato dal vettore binario pGreenII nel quale è stata rimossa la sequenza del sito di policlonaggio e del gene lacZ e sostituita con una nuova sequenza contenente il gene che conferisce la resistenza alla kanamicina negli eucarioti e da una nuova cassetta di espressione.

La cassetta di espressione è formata dal promotore della trascrizione genica del virus del mosaico del cavolfiore duplicato CaMV 35Sx2 (Franck et al. 1980) a valle del quale è stata inserita la sequenza TEV che potenzia sia la trascrizione che la traduzione del gene che codifica per la proteina umana (Nopo et al. 2012).

Tra la sequenza TEV e il terminatore del gene della nopalina sinasi nos (Luo Z. et al. 2007), che serve per migliorare la stabilità dell’mRNA prodotto e l’efficienza nella terminazione della sua traduzione, si trova il sito di policlonaggio per l’inserimento della sequenza di cDNA codificante per la proteina esogena (figura 1, in cui RB/LB: siti specifici di ricombinazione, bordo sinistro e destro; Tml p: promotore del tumor morphology large DNA; NPT II: neomicina fosforasferasi II; Tml t: terminatore del tumor morphology large DNA; CaMV35 x2_p: promotore del cauliflower mosaic virus; TEV 5’: sequenza TEV, 5’ non tradotta; Nos t: terminatore della nopaline synthase). Costruzione della sequenza codificante per il ligando ABRβ1 (FSHβ umano)

La sequenza amminoacidica di FSHβ umana è stata ricavata interrogando il database UniProtKB disponibile all’indirizzo www.expasy.org. Il numero identificativo della proteina è P01225.

La sequenza della proteina matura è stata opportunamente modificata per gli scopi della presente invenzione ottenendo la nuova sequenza amminoacidica riportata qui di seguito:

SEQ. ID. n. 2 HHHHHHNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTR

DLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTY PVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKEKDEL

Attraverso l’uso di strumenti di bioinformatica è stata

creata la sequenza nucleotidica codificante per tale

proteina, successivamente tale sequenza è stata

ottimizzata per l’espressione in cellule vegetali.

Al 5’ e al 3’ di tale sequenza sono previsti i siti di

riconoscimento per gli enzimi di restrizione Eco RI e

Xba I per il corretto clonaggio all’interno della

cassetta di espressione nel vettore pABR.

Il frammento di DNA corrispondente a tale sequenza è

stato ottenuto attraverso un processo di sintesi genica

in laboratorio.

La nuova sequenza codificante per il ligando ABRβ1,

compreso il peptide segnale di indirizzamento al

reticolo endoplasmatico, è riportata di seguito.

SEQ. ID. n. 3 GAATTCAACAATGGCTACTCAGAGAAGGGCTAACCCATCTT CTCTTCACCTGATTACCGTGTTCTCTCTGCTTGTGGCTGTG GTGTCTGCTGAGGTGTTCCATCATCACCATCATCACAATTC TTGCGAGCTGACCAACATCACCATTGCTATCGAGAAAGAAG AGTGCAGGTTCTGCATCAGCATCAACACTACTTGGTGCGCT GGTTACTGCTACACCAGGGATCTTGTGTACAAGGATCCTGC TAGGCCTAAGATCCAAAAGACCTGCACCTTCAAAGAGCTGG TTTACGAGACTGTTAGGGTGCCAGGTTGTGCTCATCATGCT GATTCTCTGTACACCTACCCTGTTGCTACTCAGTGCCATTG CGGTAAGTGCGATAGCGATTCTACTGATTGCACCGTGAGAG GTCTGGGACCTTCTTACTGTTCTTTCGGTGAGATGAAAGAA

AAGGATGAGCTGTAGTCTAGA

Coltura cellulare in sospensione di Nicotiana

benthamiana

La coltura cellulare di Nicotiana benthamiana è mantenuta in un volume di 250 ml di terreno di coltura liquido MS (Murashige 1962) 30 g/L di saccarosio, e 2 mg/L di acido naftalen-acetico (NAA) e 0,2 mg/L di kinetina.

Sub colture vengono allestite ogni 7 giorni trasferendo una aliquota di 125 ml di sospensione cellulare nel mezzo fresco.

Le cellule vengono incubate in agitazione (120 rpm) al buio alla temperatura costante di 25°C.

Trasformazione stabile della coltura cellulare Nicotiana benthamiana

L’Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) trasformato con il plasmide pABR è stato coltivato nel mezzo YEP (0,5% p/v estratto di lievito, 0,5% p/v peptone vegetale, 25 g/L di LB-Broth Miller) addizionato di 100 mg/L di streptomicina e 50 mg/L di kanamicina (Duchefa).

È stata allestita una coltura batterica di 25 ml in beuta da 100 ml incubata a 28°C, 120 rpm fino al raggiungimento di 1 OD.

I batteri sono stati quindi raccolti mediante centrifugazione (10 min a 4000 g a RT) e risospesi in 25 ml di MS. 200 µl della sospensione batterica sono inoculati in 25 ml di coltura di Nicotiana benthamiana (peso fresco delle cellule vegetali pari a 9 g).

Trascorse 48 ore di co-coltura al buio, 25°C e 120 rpm le cellule sono state filtrate utilizzando una rete di nylon, lavate con un eccesso del mezzo di coltura e quindi risospese in 25 ml dello stesso mezzo. Le cellule sono state quindi seminate su capsule petri contenenti il terreno di selezione costituito da MS addizionato di 0,9% p/v di agar, 250 mg/L carbenicillina e 100 mg/L kanamicina (Duchefa).

Le capsule sono state incubate a 25°C al buio per circa 3 settimane, fino alla comparsa dei calli. Successivamente i calli vengono trasferiti in terreno di selezione fresco ogni 15 giorni per 2 mesi. Dopo tale periodo i cloni stabili vengono mantenuti in MS senza antibiotici.

Protocollo di purificazione del ligando ABRβ1 da coltura cellulare in sospensione di Nicotiana benthamiana

1. Preparazione del buffer di estrazione

Buffer di estrazione: 50 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, 20 mM acido citrico, 40 mM acido ascorbico, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,05% (v/v) Tween-20, pH 6,5 addizionato di 1% (w/v) XAD-4 e 1% (w/v) polivinilpolipirrolidone (PVPP). La resina polistirenica XAD-4 necessita di un trattamento prima di essere aggiunta al buffer di estrazione, che consiste in un lavaggio in metanolo, per almeno 1 o 2 h seguito da un abbondante risciacquo con acqua deionizzata.

Il PVPP deve essere addizionato al buffer di estrazione almeno 2-4 h ore prima del suo utilizzo, in modo da permetterne l’idratazione.

2. Estrazione

Un’aliquota di cellule in sospensione, filtrata su calza (cut-off circa 50 µm) e conservata a -80°C, viene posta a 4°C e scongelata overnight. Si procede all’aggiunta di un tampone 20 mM Na2HPO4, 10 mM EDTA, pH 7,2 in rapporto 2:1, ovvero 2 ml di buffer per grammo di cellule. La sospensione viene mantenuta a 4°C sotto costante agitazione per 1 ora ed in seguito centrifugata a 18000 g per 20 min alla temperatura controllata di 4°C scartando il surnatante.

Al pellet viene aggiunto il buffer di estrazione in rapporto 3:1 (3 ml/grammo cellula) e mantenuto a 4°C per 1 h. L’estratto viene quindi centrifugato a 18000 g per 20 min alla temperatura di 4°C recuperando il surnatante.

3. Precipitazione con ammonio solfato

All’estratto viene aggiunto ammonio solfato fino ad ottenere una concentrazione di saturazione del 70% (concentrazione alla quale è stata dimostrata la completa precipitazione del ligando ABRβ1).

La soluzione viene mantenuta alla temperatura di 4°C per 1 h sotto costante agitazione. Dopo centrifugazione a 18000 g per 20 min a 4°C, il surnatante viene scartato e il precipitato risospeso in 1/10 del volume iniziale in un buffer idoneo a favorire l’interazione tra le proteine e la resina IMAC.

4. Cromatografia IMAC

Il precipitato ottenuto dopo trattamento con ammonio solfato viene risospeso in 1/10 del volume iniziale in un buffer 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0, centrifugato a 18000 g e filtrato a 0,22 µm. La soluzione ottenuta viene caricata su una colonna impaccata con resina Ni Sepharose 6 FF (GE Healthcare, 17-5318-01) equilibrata con un buffer 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0 ed eluita con un buffer 20 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazolo, pH 8.0 utilizzando un gradiente a più steps. L’assorbanza viene monitorata a 280 e 254 nm.

Le frazioni collezionate mediante tecniche di elettroforesi SDS-PAGE ed immunoblotting utilizzando come tecnica di rilevazione la Enhanced ChemiLuminescence (ECL).

Per tali analisi vengono utilizzati un anticorpo primario policlonale anti hFSH-β espresso in coniglio (Abcam, AB171431), un anticorpo secondario anti-rabbit IgG derivatizzato con perossidasi di rafano (KPL, 474-1506) e hFSH-β ricombinante umano espresso in E. coli come standard di riferimento (Abnova, H00002488-Q01).

5. Cromatografia ad esclusione molecolare

Le frazioni derivanti da cromatografia IMAC in cui è stata riscontrata la presenza del ligando ABRβ1 vengono riunite e caricate su una colonna impaccata con resina Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare, 17-0033-01). La colonna viene equilibrata ed eluita con un buffer 50 mM sodio acetato, 150 mM NaCl, 60 µM Tween-20, pH 5,5. L’assorbanza viene monitorata a 280 e 254 nm.

L’eluato raccolto in corrispondenza dei picchi cromatografici viene analizzato mediante tecniche di elettroforesi SDS-PAGE ed immunoblotting con rilevazione ECL, al fine di monitorare in quali vi sia la presenza della proteina ricombinante. Per tali analisi vengono utilizzati un anticorpo primario policlonale anti hFSH-β espresso in coniglio (Abcam, AB171431), un anticorpo secondario anti-rabbit IgG derivatizzato con perossidasi di rafano (KPL, 474-1506) e hFSH-β ricombinante umano espresso in E. coli come standard di riferimento (Abnova, H00002488-Q01).

6. Cromatografia di scambio ionico

Le frazioni derivanti da cromatografia ad esclusione molecolare risultate positive alla presenza del ligando ABβR vengono riunite e caricate su una colonna impaccata con resina SP Sepharose HP (GE Healthcare, 17-1087-01) equilibrata con un buffer 50 mM sodio acetato, 150 mM NaCl, 60 µM Tween-20, pH 5,5 ed eluita con un buffer 50 mM sodio acetato, 1 M NaCl, 60 µM Tween-20, pH 5,5 mediante un gradiente a più steps. L’assorbanza viene monitorata a 280 e 254 nm.

Come per le precedenti cromatografie è necessario analizzare le frazioni collezionate al fine di verificare in quali vi sia la presenza della proteina umana ricombinante.

Deglicosilazione mediante PNGasi F

Un’aliquota di ligando ABRβ1 proveniente da cromatografia di scambio ionico è stata concentrata a 0,5 mg/ml utilizzando un Vivaspin con cut-off di 10 kDa (VS0403, Sartorious) e sostituendo il buffer con un tampone 50 mM NH4HCO3, 0,1% (v/v) Rapigest SF (Waters, Manchester, U.K.) pH 7,9.

La concentrazione proteica è stata determinata mediante saggio dell’acido bicinconinico (QuantiPro™ BCA Assay Kit, QPBCA, Sigma Aldrich) utilizzando il protocollo descritto dal produttore.

Il campione, addizionato di PNGasi F (Roche Custom Biotech,Mannheim, Germany) in rapporto molare 1:50 (enzima:substrato), è stato incubato overnight alla temperatura costante di 37°C.

Al termine della reazione, la soluzione è stata addizionata di acido trifluoracetico al 4% (w/v) e centrifugato a 13.000 g per 10 min.

Il campione è stato quindi analizzato mediante SDS-PAGE (Laemmli 1970) su gel di poliacrilammide al 12% e spettrometria di massa ad elevate prestazioni.

Digestione triptica in situ

Il gel di poliacrilammide colorato con Coomassie Brilliant Blue G250 viene risciacquato con acqua ultrapura e si incide la banda elettroforetica corrispondente alla proteina che si vuole sequenziale. La banda viene sminuzzata in piccoli frammenti che vendono lavati con 100-150 µl di acqua ultrapura per 5 minuti. Si centrifuga e si elimina il liquido. Si aggiunge un volume di acetonitrile (CH3CN) pari a 3-4 volte il volume dei frammenti e si attendono 10–15 minuti, fino ad avere un restringimento dei cubetti dall’aspetto “grinzoso”.

Si elimina il surnatante e si porta a secco mediante liofilizzatore. Si riprende con buffer 0,1 M NH4HCO3, 10 mM DTT fino a ricoprire i frammenti e si pone ad incubare per 30 minuti a 56°C per ridurre i ponti disolfuro delle proteine.

Si centrifuga, si elimina il liquido e si tratta nuovamente con acetonitrile come indicato in precedenza. Si sostituisce l’acetonitrile con buffer 0,1 M NH4HCO3, 55 mM iodoacetamide e si lascia ad incubare protetto dalla luce per 20 minuti a temperatura ambiente, così da derivatizzare i residui di cisteina.

Si rimuove la soluzione di iodoacetamide e si lava con circa 150 µl di buffer 0,1 M NH4HCO3per 15 minuti.

Si centrifuga, si elimina il liquido e si tratta nuovamente con acetonitrile.

Se i frammenti di gel presentano ancora una colorazione blu, si reidratano con 150 µl di buffer 0,1 M NH4HCO3per 10-15 minuti.

Successivamente, si aggiunge un ugual volume di acetonitrile e si mantiene su agitatore orbitale per 20 minuti.

Si centrifuga, si elimina la soluzione e si tratta con acetonitrile, portando poi a secco in liofilizzatore. Si ripetono queste operazioni finché persiste la colorazione blu. Successivamente, vengono aggiunti 13 µl di una soluzione 12,5 ng/µl di una soluzione di tripsina modificata (Sequencing Grade Modified Trypsin V5111, Promega) e si ricoprono i frammenti con µg 50 mM NH4HCO3.

Si mantengono i campioni a 4°C per circa 30-45 minuti, per permettere ai frammenti di reidratarsi e di assorbire la soluzione contenente l’enzima.

Durante questo passaggio si controlla se il volume della soluzione è sufficiente a ricoprire i frammenti ed eventualmente si aggiunge buffer 50 mM NH4HCO3. Si lasciano i campioni ad incubare overnight alla temperatura controllata di 37°C.

Al termine dell’incubazione si procede all’estrazione dei peptidi derivanti dalla proteolisi triptica.

1) Si aggiungono alla soluzione 10-15 µl di buffer 25 mM NH4HCO3e si agitano i campioni a 37°C per 15 minuti utilizzando un termomixer. Si centrifuga e si aggiunge un volume di CH3CN pari a 1-2 volte quello dei frammenti di gel. Si agita per ulteriori 15 minuti a 37°C in termomixer. Si centrifuga e si raccoglie il surnatante.

2) Ai frammenti di gel residui si aggiungono 40-50 µl di acido formico (HCOOH) al 5% (v/v). Si mantengono i campioni in costante agitazione a 37°C per 15 minuti. Si centrifuga e si aggiunge un volume di CH3CN pari a 1-2 volte quello dei frammenti di gel. Si agita per ulteriori 15 minuti a 37°C in termomixer. Si centrifuga e si raccoglie il surnatante.

Si riuniscono gli estratti e si porta a secco in liofilizzatore.

Analisi cromatografica del digerito triptico

In seguito a proteolisi in situ, il materiale proteico è stato liofilizzato e risospeso in acido formico:acetonitrile:acqua 2:3:95.

20 µl sono stati caricati su una colonna Vydac C18 (1x150mm, granulometria 5 µm, porosità 300 Å), equilibrata con una soluzione acquosa 2% (v/v) acetonitrile, 2% (v/v) acido formico. La colonna viene eluita a 50 µl/min con un gradiente lineare di acetonitrile 3-65% in 25 minuti.

L’eluato è stato esaminato monitorando la Total Ion Current (TIC) utilizzando uno spettrometro di massa Xevo G2-XS Q-TOF.

Determinazione della percentuale di aggregazione mediante cromatografia ad esclusione molecolare

Lo stato di aggregazione del ligando ABRβ1 è stato valutato mediante cromatografia ad esclusione molecolare utilizzando una colonna YARRA, 3 mm SEC 3000, 150 mm x 7,8 mm (Phenomenex) con intervallo di frazionamento 10-600 kDa.

Sono stati caricati 20 µl di un’aliquota di ligando ABRβ1 (160 µg/ml) e la colonna è stata eluita con un tampone 20 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Assegnazione dei ponti di solfuro

Un’aliquota di ligando ABRβ1 è stata sottoposta a deglicosilazione enzimatica mediante PNGasi F come qui sopra descritto e la miscela di reazione è stata analizzata in elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non riducenti. Il gel è stato colorato con Coumassie Brilliant Blue G250. La banda corrispondente al ligando ABRβ1 completamente deglicosilato è stata sottoposta a digestione triplica in situ come precedentemente descritto, ma mantenendo intatti i ponti di solfuro e quindi evitando di ridurre e alchilare i residui di cisteina.

Il liofilizzato della miscela peptidica derivante da proteolisi triptica è stato ripreso in un tampone 50 mM NH4HCO3, 1 mM CaCl2, pH 8,2 aggiunto di subtilisina (Subtilisin Carlsberg P-5380, Sigma) in rapporto molare enzima:substrato pari ad 1:50.

La soluzione è stata lasciata incubata alla temperatura controllata di 37°C overnight e successivamente liofilizzata.

Il campione è stato risolubilizzato in acido formico:acetonitrile:acqua 2:3:95.

Un volume pari a 20 µl è stato caricato su una colonna Vydac C18 (1x150mm, granulometria 5µm, porosità 300 Å). La colonna è stata eluita ad un flusso costante di 50 µl/min con un gradiente lineare di acetonitrile dal 3 al 65% in 12 minuti.

L’analisi è stata monitorata registrando il segnale TIC (Total Ion Current) utilizzando uno spettrometro di massa Xevo G2-XS Q-TOF e per ciascun picco cromatografico è stato determinato il peso molecolare delle specie presenti.

Isolamento e colture delle cellule del Sertoli

Per la preparazione delle cellule del Sertoli (CS) sono stati utilizzati testicoli di suinetti ottenuti da animali maschi prepubere, di razza Large-White, dell'età di 7-15 giorni. Il materiale è stato prelevato e conservato in modo idoneo da personale qualificato durante le usuali operazioni di castrazione inerenti all'allevamento, pertanto l'utilizzo in esperimenti in vitro per scopi di ricerca non ha richiesto l'approvazione da parte del Comitato Etico locale.

La procedura di isolamento delle CS prevede l’asportazione dei testicoli dai maialini anestetizzati. Dopo la rimozione del cappuccio fibroso, i testicoli sono stati finemente triturati per ottenere un’omogenea frammentazione del tessuto che è stato successivamente sottoposto digestioni enzimatiche sequenziali utilizzando 2 mg/ml di collagenasi P (Roche Diagnostics) in soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS, Sigma-Aldrich).

La digestione si protrae fino al raggiungimento della disgregazione fisica dei tubuli seminiferi.

Dopo lavaggio, la sospensione di tessuto disgregato è stata incubata con la soluzione HBSS addizionata di tripsina e DNasi I per 15 min (Sigma-Aldrich).

Al termine di questa seconda digestione, il pellet di tessuto ottenuto dopo decantazione è stato lavato due volte in HBSS e quindi centrifugato a 120 g per 3 min. Il pellet così ottenuto è stato filtrato attraverso una maglia di acciaio inox da 500 micrometri e risospeso in un tampone costituito da 2 M glicina, 2 mM EDTA, pH 7,2. Lo scopo è quello di eliminare tutte le cellule residue di Leydig.

I tubuli residui, senza le cellule peritubulari, sono stati quindi raccolti e mantenuti in coltura in presenza di 0,166 nM acido retinoico (Sigma-Aldrich) e 5ml/500ml di insulina/selenio (Becton Dickinson). La coltura cellulare viene allestita in incubatore a 37°C. Dopo 3 giorni di coltura le cellule sono state trattate in modo tale da eliminare tutte le cellule germinali residue (Galdieri et al. 1981; Korbutt et al. 1997; Luca et al.

2005; Luca et al.2007).

Misura dell’attività dell’enzima aromatasi

Prima di procedere con i diversi trattamenti ormonali, la vitalità delle cellule in coltura è stata valutata mediante colorazione con bromuro di etidio e fluoresceina diacetato (Sigma-Aldrich) in microscopia a fluorescenza (Nikon, Optiphot-2, Nikon Corporation). Per valutare l’attività dell’α-aromatasi, 20×10<6>sono state trattate per 3 giorni con diverse concentrazioni dell’ormone follicolo stimolante (Gonal-F) o con le stesse concentrazioni di ligando ABRβ1; alla fine del periodo di trattamento 0,2 mg/ml di testosterone sono sati aggiunti alle colture che sono incubate per ulteriori 8 ore.

Al termine della stimolazione, il 17β-estradiolo (E2) prodotto è rilasciato nel mezzo di coltura delle cellule è stato valutato utilizzando un kit specifico ad alta sensibilità (ADVIA Centaur, Estradiol-6 III, Bayer Diagnostics).

Marcatura del ligando ABRβ1 con molecole fluorescenti Per gli esperimenti di binding in vitro e di localizzazione in vivo il ligando ABRβ1 è stato coniugato con due diverse molecole fluorescenti: 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD) (Sigma) e Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific).

Per la marcatura con NBD è stata preparata una soluzione concentrata di 50 mM in acetonitrile della sonda fluorescente.

La reazione di marcatura del ligando ABRβ1 50 µM/ml avviene in soluzione, 50 mM acetato di sodio, 500 mM NaCl, 60 µM Tween 20, 1 mM acido etilendiamminotetracetico (EDTA), 30 mM tris(idrossimetil)amminometano cloridrato (Tris/HCl) pH 7,0 e 5 mM NBD (Bernal-Perez et al. 2012).

La soluzione viene incubata a 24°C per 16 ore, la marcatura della proteina e l’eventuale presenza di aggregazione vengono valutati attraverso mediante analisi al fluorimetro e al microscopio a fluorescenza (ecc. 465 nm; em. 515 nm). Per quanto riguarda la coniugazione del ligando ABRβ1 con Alexa Fluor 647 (ecc.

650 nm; em. 665 nm) è stato utilizzato il Kit commerciale Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific) seguendo le indicazioni fornite dal produttore.

Analisi del legame al recettore del ligando ABRβ1 mediante citofluorimetria

Le linee cellulari umane stabilizzate (OVCAR-3, OVCAR-5 di carcinoma ovarico ed LS180 di carcinoma del colon) e la linea primaria di carcinoma ovarico A116 sono state coltivate in RPMI1640 addizionato con 10% siero fetale bovino scomplementato al calore, 1% glutammina e 1% penicillina streptomicina.

Alcuni esperimenti di controllo sono stati eseguiti in assenza di antibiotici o dopo 24 ore di coltura in mezzo senza siero per escludere l’eventuale interferenze da parte di componenti sieriche o degli antibiotici.

Le cellule al momento del saggio di immunofluorescenza sono state staccate dal supporto di coltura attraverso incubazione con tripsina-EDTA e dopo essere state contate sono state diluite alla concentrazione di 100.000 cellule/100 µl ed incubate con il ligando ABRβ1 fluorescente. L’immunofluorescenza diretta utilizzando l’analisi al citofluorimetro è stata eseguita sulle cellule preincubate per 15 min a 37°C con 10 µl/ml (350 ng) di ligando ABRβ1 marcato con NBD, l’analisi è stata condotta utilizzando il canale del FITC al citofluorimetro. La marcatura delle cellule può essere evidenziata anche a concentrazione più basse del ligando ABRβ1, il segnale in fluorescenza non è più apprezzabile quando le cellule sono preincubate con concentrazioni di ligando ABRβ1 inferiori al 70 ng/ml. Prima delle analisi in citofluorimetria, per valutare la vitalità cellulare e il binding del ligando ABRβ1 senza l’intervento di enzimi proteolitici che potrebbero alterare i risultati causando il distacco del ligando dal recettore specifico, sono stati eseguiti alcuni esperimenti senza distaccare le cellule dal substrato, tali analisi sono state condotte utilizzando un microscopio confocale FV500 Olympus.

Internalizzazione ABRβ1

Le cellule vengono quindi fissate in 4% paraformaldeide (p:v PBS 1X, Phosphate-buffered saline,) per 30 minuti a 4°C e lavate in PBS 1X (3 lavaggi di 5 minuti ciascuno). Nel caso dell’immunofluorescenza le cellule fissate vengono permeabilizzate mediante incubazione con PBS 1X, addizionato con BSA all’1% (bovine serum albumine) e Triton-X100 allo 0.1% (Sigma) per 5 min. a temperatura ambiente. La soluzione di permeabilizzazione viene eliminata mediante lavaggi con PBS 1X (3 lavaggi di 5 min. ciascuno). Le cellule vengono quindi incubate con l’anticorpo primario (anti-FSHR SAB4501041) diluito in soluzione salina, addizionato con BSA all’1% per 2 ore a 37°C. A conclusione dell’incubazione, l’anticorpo primario viene rimosso mediante lavaggi con PBS 1X (3 di 5 minuti ciascuno) e le cellule incubate con l’opportuno anticorpo secondario diluito in PBS 1X, addizionato con BSA all’1%, per 30 min. a 37°C. In questo studio è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato a cianina-3 (che eccitata a 550 nm emette luce rossa, a 570 nm). Le cellule vengono quindi lavate con PBS 1X (3 lavaggi di 5 min. ciascuno), i nuclei marcati con DAPI (4’,6-diamidin-2-fenilindolo) (1:5000, v:v in PBS 1X) (Sigma) per 5 min. a temperatura ambiente. I vetrini vengono montati con Elvanol, conservati a 4°C e analizzati al microscopio confocale Leica SP5 o al microscopio a fluorescenza LEICA DFC300FX. Nel caso del trattamento con ABRβ1 marcato con NBD le cellule vengono fissate dopo lavaggio e immediatamente allestite per l’osservazione in microscopia (come descritto sopra) utilizzando la coppia di filtri per osservazione nel canale del FITC.

Analisi delle curve di crescita cellulare

Le cellule CAOV-3 sono state coltivate in DMEM addizionato del 10% di siero bovino fetale e 2 mM di glutammina (Sigma). Le cellule OVCAR-3 sono state coltivate in RPMI addizionato del 20% di siero bovino fetale e 2 mM di glutammina e 0,01 mg/ml di insulina (Sigma).

Le colture cellulari sono mantenute in incubatore a 37°C. Per le analisi del tasso di crescita le cellule sono state seminate su piastre da 6 pozzetti a una concentrazione di 5x10<4>cellule/pozzetto in presenza del mezzo appropriato in funzione della linea cellulare. Le cellule sono state trattate con Gonal-F®, con il ligando ABRβ1 o con entrambi alla concentrazione di 0,1 µg/ml.

La crescita cellulare è stata valutata a 24, 48 e 72 ore dall’aggiunta nel mezzo di coltura di Gonal-F® e ABRβ1. Il tasso di proliferazione cellulare è stato valutato attraverso la conta delle cellule, ai tempi indicati, utilizzando il test di vitalità Trypan blue exclusion test.

Analisi di binding di ABRβ1 a FSHR nelle cellule NB3 (modello di neuroblastoma infantile)

I dati ottenuti mediante analisi citofluorimetrica utilizzando il ligando ABRβ1 marcato con NBD, dimostrano che la percentuale di cellule marcate che quindi esprimono FSHR sulla superficie cellulare, è superiore al 96% in tutte le cellule analizzate.

Internalizzazione di ABRβ1 nelle cellule NB3

Le cellule NB3 sono coltivate in DMEM e seminate su vetrino 24 ore prima dell’esperimento. Le cellule sono state incubate con 150 ng/ml del ligando ABRβ1 marcato con NBD per 15 minuti in incubatore a 37°C. Al termine del trattamento le cellule vengono lavate in soluzione salina, incubate in mezzo di coltura completo per diversi periodi di tempo, lavate in soluzione salina e osservate al microscopio a fluorescenza utilizzando la coppia di filtri per FITC. Questo permette valutare l’internalizzazione del ABRβ1 fluorescente nelle cellule grazie alla comparsa di vescicole fluorescenti localizzate a livello citoplasmatico.

Analisi della produzione di cAMP indotta da Gonal-F® e neutralizzazione con ABRβ1

Le analisi hanno utilizzato cellule HEK293, nelle quali l'espressione esogena del FSHR umano (HG15960-UT DBA) e del biosensore per AMP-ciclico (cAMP), Epac1-camps è stata ottenuta mediante co-trasfezione transiente dei geni codificante i due costrutti. Le analisi hanno utilizzato microscopia a fluorescenza in singola cellula vitale, con protocolli precedentemente ottimizzati e validati nel laboratorio.

La misura dinamica delle variazioni intracellulari di cAMP indotte dall'attivazione di FSHR umano con l'agonista Gonal-F® sono state confrontate in assenza o presenza del ligando ABRβ1 a varie concentrazioni di utilizzo. Le analisi dell'effetto del ligando ABRβ1 sulle dinamiche di internalizzazione del recettore FSHR sono state condotte mediante immunofluorescenza e microscopia confocale.

La trasfezione di cellule HEK293 è stata ottenuta mediante Lipofectamina (Invitrogen) secondo raccomandazione del produttore, ottimizzato in laboratorio. La miscela di co-trasfezione, è ottenuta miscelando il DNA di Epac2-camps e FSHR in rapporto 1:1. Alla fine della procedura di co-trasfezione le cellule vengono lavate e incubate in terreno di coltura DMEM a 37°C per 48 ore (per consentire la sintesi delle proteine esogene trasfettate).

L'analisi della farmacologia della molecola ABRβ1 è stata svolta mediante la misura in cellule vitali della variazione dei livelli intracellulari di cAMP, la cui sintesi è molto rapida e attivata dall'attivazione del recettore per FSH. La metodica si basa sull'espressione in cellula di un biosensore basato su tecnologia FRET per cAMP (Nikolaev et al. 2006). Il biosensore codifica due varianti di colore della proteina fluorescente GFP interconnesse da un dominio proteico ad alta affinità per cAMP. L’intensità relativa di emissione delle due varianti di GFP varia in modo dipendente dalla concentrazione intracellulare di cAMP. La misura della variazione della fluorescenza viene effettuata mediante microscopia a fluorescenza in singola cellula, calcolando il rapporto fra l'intensità di emissione nel canale a 480 /- 25nm e nel canale a 535 /- 35nm, secondo il metodo validato di 'sensitized emission ratio'. Le cellule HEK293 sono state seminate su vetrini da 24 mm di diametro e trasfettate per co-esprimere EPAC1-cAMPs e FSHR. I vetrini vengono montati in una cameretta adatta all'uso con microscopio invertito, per gli esperimenti di imaging. Il terreno di coltura viene rimosso e sostituito dalla soluzione salina (Ringer modificata: 125 NaCl, 5 KCl; 1 Na3PO4; 1 MgSO4; 5.5 Glucosio; 20 Hepes; 1.8 CaCl2, in H2O, pH 7.4) tamponata con Hepes.

Per determinare la sintesi di cAMP, le cellule sono state trattate con Gonal-F® a concentrazioni comprese tra 1 e 100 ng/ml. Il farmaco agonista è stato aggiunto direttamente alla soluzione di imaging dopo un’acquisizione di due minuti mirata a stimare i livelli di FRET in condizioni basali. In un set indipendente di esperimenti, la misura di cAMP è stata effettuata con le medesime concentrazioni di Gonal-F® in cellule incubate con il ligando ABRβ1 a concentrazioni comprese tra 10-500 ng/ml, per 5 minuti. L'acquisizione ed analisi delle immagini è stata condotta mediante il software Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Il confronto tra i gruppi sperimentali è stato effettuato per mezzo del test Anova, considerando P<0.05 statisticamente significativo. Tutti i dati sono espressi come media±SEM.

Da quanto sopra descritto, la persona esperta nel settore potrà comprendere i vantaggi offerti dalla presente invenzione.

Per quanto concerne la subunità β dell’FSH, è stato sorprendentemente trovato che non attiva la cosiddetta cascata dell’cAMP.

Per quanto concerne, invece, la subunità β ottenuta per via ricombinante, e in particolare la subunità ABRβ1 ottenuta mediante tecnologia ricombinante ed espressione in Nicotiana benthamiana, questa ha dimostrato di poter offrire numerosi vantaggi fra i quali: un’elevata qualità e sicurezza biologica, grazie al rischio pressoché nullo di contaminazione da virus, oncogeni, prioni, tossine o residui di reagenti pericolosi normalmente impiegati nella produzione di proteine terapeutiche.

La possibilità di ottenere tale subunità ABRβ1, in un ospite di natura vegetale, con pattern di glicosilazione complesso ma simile a quello di un intermedio nella sintesi della subunità umana in cellule di mammifero risulta altrettanto utile e sorprendente.

Inoltre, la subunità ABRβ1 ha dimostrato una sorprendente ed utile stabilità, superiore anche a quella dell’FSH e degli anticorpi.

Tali vantaggi non si sono dimostrati a detrimento dell’attività e affinità verso il recettore di FSH.

Un ulteriore vantaggio è rappresentato dal fatto che anche la subunità ABRβ1 non attiva il recettore FSH, come dimostrato dalla non attivazione della cascata dell’cAMP.

Per entrambe le subunità FSHβ e ABRβ (e ABRβ1) è stato visto che il legame specifico con FSHR non aumenta il tasso di crescita delle cellule tumorali.

Pur non attivando il recettore, le subunità ABRβ (e ABRβ1) hanno mostrato un importante tasso di internalizzazione nelle cellule utilizzate come sistema modello.

Un vantaggio assolutamente non trascurabile della presente invenzione è rappresentato dalla potenziale applicazione al trattamento e alla diagnosi del neuroblastoma.

Il neuroblastoma è infatti il tumore solido extracranico più comune nell’età infantile che si origina dalle cellule indifferenziate delle creste neurali.

Rappresenta il tumore più comune nei bambini con età inferiore ad 1 anno ed è comunque molto diffuso nella fascia di età fino ai 5 anni.

Il tumore primario si trova spesso nella regione midollare del surrene o nei gangli paraspinali ed al momento della diagnosi purtroppo in più del 50% dei casi sono già presenti metastasi.

Nei pazienti affetti da neuroblastoma l’analisi di espressione dell’oncogene MYCN (V-Myc Avian Myelocytomatosis Viral Oncogene Neuroblastoma) dà positività nel 20% dei casi e questa correla strettamente con l’alto rischio di prognosi infausta.

Attualmente, l'amplificazione di MYCN rappresenta il miglior marcatore genetico per l’assegnazione di rischio nel neuroblastoma.

L’assegnazione del rischio di mortalità si basa sull’integrazione di diversi fattori clinici e biologici, tra cui lo stadio di avanzamento del neuroblastoma (Brodeur et al. 1993), l'età alla diagnosi (Brodeur et al. 1988), l’amplificazione di MYCN (Seeger et al. 1985) e l’esame istologico (Shimada et al. 1984).

Tra tutti questi criteri, l'età e la precocità della diagnosi rappresentano le variabili più importanti per l’assegnazione del rischio nei pazienti metastatici.

Il gruppo di rischio intermedio comprende i pazienti che ricevono la diagnosi prima del loro primo anno di vita.

I pazienti con ritardo nella diagnosi vengono invece inseriti nella classe ad alto rischio, mentre i pazienti a basso e medio rischio generalmente hanno prognosi favorevole con un tasso di sopravvivenza di circa l’80%.

La situazione diventa estremamente sfavorevole nei pazienti ad alto rischio nei quali il tasso di sopravvivenza scende sotto il 40%.

Inoltre, è stata recentemente identificata una classe di pazienti ad “altissimo rischio” nei quali non c’è risposta alla terapia antitumorale o si presentano con alta probabilità recidive (Maris et al. 2007; Matthay et al. 2012).

Le terapie attualmente allo studio per la cura del neuroblastoma sono basate su molecole radiomarcate che vengono captate dal tumore in modo preferenziale rispetto ai tessuti sani, sull’immunoterapia che sfrutta anticorpi monoclonali contro antigeni tumorali di superficie e su inibitori sintetici delle chinasi che controllano il ciclo cellulare.

Tuttavia, a causa dell’instabilità degli anticorpi e della limitata specificità delle altre molecole per il tessuto tumorale, si verificano pesanti effetti collaterali nei pazienti che limitano l’efficacia dei protocolli terapeutici (Matthay et al. 2012b).

La presente invenzione può rappresentare una alternativa promettente ai trattamenti oggi disponibili.

Claims

RIVENDICAZIONI: 1. Un ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante caratterizzato dalla sequenza corrispondente alla SEQ. ID. n. 2 o da una sequenza avente una similarità di almeno circa il 90% con essa, preferibilmente compresa fra circa 90-99,9% e più preferibilmente compresa fra circa il 95-97%.
2. Un ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante caratterizzato dall’essere codificato dalla sequenza corrispondente alla SEQ. ID. n. 3.
3. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2 per l’uso medico.
4. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione precedente per l’uso medico nella terapia e/o nella diagnosi dei tumori.
5. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione precedente 3 o 4 per l’uso nella terapia e/o nella diagnosi dei tumori, in cui detti tumori sono tumori solidi, primari o metastatici.
6. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 3 a 5 per l’uso nella terapia dei tumori, in cui detti tumori comprendono: il tumore alla prostata e in particolare l’adenocarcinoma prostatico, della ghiandola mammaria, del colon, del pancreas, del rene, del polmone, del fegato, del testicolo, dell’ovaio, del cervello e della tiroide.
7. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 3 a 6 per l’uso nella terapia dei tumori, in cui detta subunità è coniugata ad una molecola avente attività antitumorale selezionata nel gruppo che comprende: - la classe degli agenti citotossici, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: gli antagonisti pirimidinici come ad esempio il capecitabina, gli inibitori enzimatici come la famiglia delle camptotecine, ad esempio l’irinotecan; - la classe degli agenti alchilanti, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia dei sali metallici come ad esempio il cisplatino, gli intercalanti del DNA come ad esempio la doxorubicina, la famiglia delle antracicline; - la classe dei modulatori della sintesi proteica, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia degli inibitori del proteasoma come ad esempio il bortezomib, la famiglia degli inibitori di mTOR come ad esempio il temsirolimus; - la classe degli inibitori mitotici, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia delle ansamitocine come ad esempio la maytansina, la famiglia degli inibitori della polimerizzazione dei microtubuli come ad esempio la auristatina E.
8. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti da 3 a 5 per l’uso nella diagnosi dei tumori e/o per analisi in vitro, in cui detta subunità è coniugata: - a molecole fluorescenti scelte nel gruppo che comprende: fluoresceina isotiocianato (FITC), la ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5); oppure - a molecole radioattive scelte nel gruppo che comprende:<123>I,<111>In,<188>Re,<18>F,<35>S,<99>Tc; - a derivati del boro o a nanoparticelle.
9. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2, coniugato ad una molecola avente attività antitumorale selezionata nel gruppo che comprende: - la classe degli agenti citotossici, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: gli antagonisti pirimidinici come ad esempio il capecitabina, gli inibitori enzimatici come la famiglia delle camptotecine, ad esempio l’irinotecan; - la classe degli agenti alchilanti, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia dei sali metallici come ad esempio il cisplatino, gli intercalanti del DNA come ad esempio la doxorubicina, la famiglia delle antracicline; - la classe dei modulatori della sintesi proteica, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia degli inibitori del proteasoma come ad esempio il bortezomib, la famiglia degli inibitori di mTOR come ad esempio il temsirolimus; - la classe degli inibitori mitotici, laddove preferibilmente tali composti sono scelti nel gruppo che comprende: la famiglia delle ansamitocine come ad esempio la maytansina, la famiglia degli inibitori della polimerizzazione dei microtubuli come ad esempio la auristatina E.
10. Il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2 coniugato ad una molecola avente attività diagnostica scelta nel gruppo che comprende: - molecole fluorescenti scelte nel gruppo che comprende: fluoresceina isotiocianato (FITC), la ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5); - molecole radioattive scelte nel gruppo che comprende:<123>I,<111>In,<188>Re,<18>F,<35>S,<99>Tc; - derivati del boro o nanoparticelle.
11. Una preparazione farmaceutica comprendente il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2 ed uno o più veicolanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
12. Una preparazione farmaceutica comprendente il ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 9 o 10 ed uno o più veicolanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
13. La preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 o 12 per somministrazione endovenosa.
14. Uso del ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2 per l’inattivazione in vitro del recettore FSHR.
15. Un metodo per la preparazione del ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione 1 o 2 comprendente la fase di modificare la regione C-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ) mediante l’introduzione della sequenza KDEL.
16. Il metodo per la preparazione del ligando del recettore dell’ormone umano follicolo stimolante secondo la rivendicazione precedente, comprendente la fase ulteriore di introdurre una coda istidinica (His-tag) all’estremità N-terminale della sequenza della subunità β dell’ormone umano follicolo stimolante (FSHβ).