CN108610414A - IgG抗原表位及其作为靶点的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了IgG抗原表位及其作为靶点的应用。该IgG抗原表位，为非B细胞来源的IgG的CH1结构域，且在该结构域的Asn162位点有N‑糖基化唾液酸修饰，其抗原功能的实现必须依赖于该位点的唾液酸化。本发明还提供了该IgG抗原表位作为药物作用靶点在制备诊断和/或治疗上皮性肿瘤的药物中的应用。另外我们研究得出，该抗原作为药物靶点的功能依赖于其Asn162位点的唾液酸化，而该位点的唾液酸化又必须依赖于唾液酸转移酶ST3GAL4，表明该酶可以作为药物作用靶点用于制备肿瘤治疗药物。另外，整合素β4与含有上述抗原表位的IgG共表达和共定位，鉴于IgG的功能，因此可以作为标志物用于制备辅助检测上皮性肿瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属于免疫学中肿瘤的诊断和治疗技术领域，涉及非B细胞来源的IgG，具体是一种IgG抗原表位及其作为靶点的应用。
背景技术
RP215单克隆抗体的来源及研究现状：加拿大哥伦比亚大学的Lee课题组早在上世纪80年代，为了获得特异性识别卵巢癌的单克隆抗体，曾用卵巢癌细胞系提取的蛋白免疫动物，获得了近3000株杂交瘤细胞，在筛选的过程中发现，其中有一株杂交瘤细胞，称之为RP2015，能够很好地识别卵巢癌细胞而不识别正常卵巢细胞，但当时不清楚其所识别的抗原是什么，因此暂时对其识别的抗原命名为“CA215”。后来发现，RP215不但能够很好地识别卵巢癌，同时在对其他类型的肿瘤细胞识别中也显示了良好的特异性，由此将CA215定义为“pan-cancer-marker”。20017年，Lee课题组对CA215进行了鉴定。他们用亲和层析的方法，从卵巢癌细胞系培养上清中获得了大量的“CA215”，质谱鉴定所提供的32条肽段均为IgG的重链，为了进一步确认这一结果，他们又用纯化的“CA215”作为抗原制备了5株特异性单抗，实验结果证实，所有5个单抗都识别IgG分子。证明了CA215是癌细胞表达的IgG。随后的结果证实，癌细胞表达的IgG在糖基化修饰与循环中IgG有明显差异。RP215识别的表位正是这类IgG重链可变区特有的糖基类相关表位(参见中国专利公开号102901817A)。
也就是说，RP215不能识别B淋巴细胞分化为浆细胞后分泌的IgG(循环IgG)，但能识别非B细胞表达的IgG。研究表明RP215识别的IgG(以下简称RP215-IgG)可被多种不同谱系起源的细胞表达，但表达水平低于非B细胞起源的肿瘤细胞，因此被统称为非B细胞来源的IgG(non B-IgG)。non B-IgG在结构和功能上都与传统认识上的B细胞来源的IgG有很大不同。
被肿瘤干细胞样细胞过度表达的RP215-IgG，倾向定位于细胞表面和细胞之间的连接，特别是黏着斑结构。此外，高水平的RP215-IgG细胞对细胞外基质(ECM)具有较高的黏附能力，在体外和体内都具有较高的迁移和侵袭力，增强肿瘤干细胞自我更新和肿瘤形成能力。然而，RP215识别的独特抗原表位的具体结构、性质以及由RP215-IgG驱动的肿瘤发生发展的详细机制仍然未知，因此也就无法制备出除了RP215以外的、其他的以该IgG为特异性靶点的诊断或者治疗药物。
经过我们之前的努力，已经清楚认识到能够被RP215特异性识别的IgG为非B细胞来源的IgG，且该IgG上被识别的位点高度唾液酸化，唾液酸化的糖基与O-糖基化没有关系。这种特殊的唾液酸化的IgG能够作为标志物来识别干细胞或者祖细胞，进而根据该糖蛋白来制备相关制剂。
鉴于非B细胞来源的IgG与上皮癌细胞的密切相关性，进一步研究该IgG的分子结构将更有利于加强对多种恶性肿瘤的干预。
发明内容
本发明的目的是对非B细胞来源的IgG分子结构及功能进行更进一步的研究，分析出具体的可以作为靶标的抗原表位，提供该抗原表位的新用途。
通过相关蛋白酶消化分析非B细胞来源的IgG，并且通过糖基化分析和蛋白功能位点的分析，最终发现非B细胞来源的IgG，其与肿瘤相关的功能主要依赖于特殊位点的唾液酸化。
基于我们的研究结果，本发明的第一方面，提供了一种IgG抗原表位，其为非B细胞来源的IgG的CH1结构域，且在该结构域的Asn162位点有N-糖基化唾液酸修饰。
可选或优选的，上述IgG抗原表位，的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二方面，提供了上述IgG抗原表位作为药物作用靶点在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。含有上述Asn162特异性位点唾液酸化抗原表位的IgG，被证实能够促进肿瘤的增值、迁移和侵袭能力。
可选或优选的，上述应用中，所述肿瘤为非小细胞肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、唾液腺囊腺癌、胃癌、胰腺癌或食道癌。
本发明的第三方面，提供了上述IgG抗原表位作为整合素α6β4的配体在制备α6β4-FAK-c-Met途径介导的疾病的诊断和/或治疗药物中的应用。研究显示，含有上述抗原表位的IgG与整合素α6β4结合形成复合物，才能推动整合素-FAK信号传导通路的激活。
本发明的第四方面，还提供了唾液酸转移酶ST3GAL4作为药物作用靶点在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。含有上述抗原表位的特异性位点唾液酸化，依赖于唾液酸转移酶ST3GAL4。
本发明还提供了唾液酸转移酶ST3GAL4联合唾液酸转移酶ST3GAL6作为药物作用靶点在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。研究发现唾液酸转移酶ST3GAL6在上述抗原表位特异性位点唾液酸化过程中也起到了一定的辅助作用，因此二者联合可以作为药物作用靶点干预抗原表位的唾液酸化，进而影响其后续的功能发挥。
本发明的第五方面，还提供了整合素β4作为标志物在制备辅助检测上皮性肿瘤的药物中的应用。含有上述抗原表位的IgG和整合素β4在组织水平和细胞水平存在共表达和共定位，所以检测到整合素β4，也就相当于检测到了IgG，也就相当于检测到了上皮性肿瘤的存在。
本发明提供的上述技术方案，具有如下有益效果：
本发明明确了非B细胞来源的IgG功能性分子结构，其是IgG的CH1结构域上Asn162位点N-聚糖的高度唾液酸化的结构，它在上皮性肿瘤干细胞被过度表达并且对多种上皮性恶性肿瘤的致癌性质很重要，并且是抗体治疗、Car-T细胞治疗及小分子化合物的有吸引力的靶标，为后期相关癌症的治疗提供了有效的药物靶标，也为抗体药物研究提供了抗原表位。
附图说明
图1-1为实施例1--肿瘤来源的蛋白经RP215亲和层析柱富集RP215-IgG及糖基化分析结果。A：使用ProteinG联合RP215-CNBr亲和层析柱从肺鳞癌肿瘤中富集的RP215识别的IgG的示意图；B：各糖链结构图以及不同聚糖的含量，C:分别用识别唾液酸的SNA及MAL I鉴定亲和层析柱各组分中IgG唾液酸状况；D：唾液酸化IgG分别用N-糖苷酶、O-糖苷酶和唾液酸酶消化后Western blot检测结果，elution：洗脱液；buffer1：N-糖苷酶和O-糖苷酶的酶切缓冲液；buffer2：唾液酸酶的酶切缓冲液。
图1-2为实施例1--突变位点序列指示及抗原表位鉴定结果。A：是未突变RP215-IgG(WT)及两个突变体(CH1mu和CH2mu)氨基酸序列，框出来的部分是相应的突变位点；B：在293T细胞中过表达RP215-IgG(可变区序列为VH5-51/D3-9/JH4)和相应突变体后，用Westernblot检测RP215识别情况；C:在NCI-H520细胞中过表达RP215-IgG(可变区序列为VH5-51/D3-9/JH4)和相应突变体，用Western blot检测RP215识别情况；其中mock为阴性对照，vector为空载体。
图2-1为实施例2--RP215-IgG在非小细胞肺癌细胞系中的表达。A：Western blots检测非小细胞肺癌细胞系中RP215-IgG表达情况，GAPDH为内参；B：Western blots检测NCI-H520细胞和SK-MES-1细胞培养上清中RP215-IgG分泌结果；C：通过免疫荧光的方法检测RP215-IgG(绿色)在NCI-H520细胞和SK-MES-1细胞中的定位，Hochest标记细胞核(蓝色)，二抗：山羊抗小鼠Alexa Flour 488，标尺25μm；D：流式细胞术检测RP215-IgG在非小细胞肺癌细胞系细胞膜的表达情况(活细胞染色)，二抗：山羊抗小鼠Alexa Flour 488。
图2-2为实施例2--敲减IgG抑制肺鳞癌细胞的克隆形成能力实验结果。A：NCI-H520细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，Western blot检测敲减结果，GAPDH为内参；B：NCI-H520细胞转染siRNA36h后，进行Transwell实验，检测细胞迁移能力；C：NCI-H520细胞转染siRNA36h后，进行Matrigel-Transwell实验，检测细胞侵袭能力；D：用IgG的siRNA敲减SK-MES-1中IgG,Western blot检测敲减结果，GAPDH为内参；E:SK-MES-1细胞转染siRNA36h后，进行Transwell实验,检测细胞迁移能力；F:SK-MES-1细胞转染siRNA36h后，进行Matrigel-Transwell,检测侵袭能力的结果。*，P＜0.05；**，P＜0.01；标尺200μm。
图2-3为实施例2--敲减IgG抑制肺鳞癌细胞的克隆形成能力实验结果。A：为NCI-H520细胞敲减IgG后，用克隆形成实验检测细胞增殖及自我更新能力；B：SK-MES-1细胞敲减IgG后，进行克隆形成实验检测细胞增殖及自我更新能力。**，P＜0.01。
图2-4为实施例2--体外实验检测RP215-IgG的促肿瘤作用与CH1结构域的唾液酸化N-糖基化表位的关系。A：Western blot检测RP215识别情况，商品化抗人IgG为阴性对照，GAPDH为内参；B：克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力的结果；C：Transwell实验检测细胞的迁移能力的结果；D：Matrigel-Transwell实验检测细胞的侵袭能力的结果。WT：野生型IgG，CH1mu：CH1突变型IgG；Vector：对照空载体；mock：阴性对照。ns,not significant(不显著)；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
图2-5为实施例2--NCI-H520细胞分别表达WT、CH1mu和Vector的稳定株在裸鼠体内成瘤情况。A：实验结束时WT、CH1mu、Vector三组肿瘤大小的图片；B：WT、CH1mu、Vector三组肿瘤体积的生长曲线；C：实验结束时WT、CH1mu、Vector三组肿瘤体积统计图；D：实验结束时WT、CH1mu、Vector三组肿瘤重量统计图。ns,notsignificant(不显著)；**,P<0.01；***,P<0.001。
图3-1为实施例3--四种唾液酸转移酶对RP215-IgG唾液酸化影响及Western blot检测结果。A：四种唾液酸转移酶沉默后RP215识别的结果；B：四种唾液酸转移酶过表达后RP215识别的结果，其中GAPDH为内参。
图3-2为实施例3--肺腺癌和肺鳞癌组织中分别进行RP215、抗ST3GAL4及抗ST3GAL6抗体进行免疫组化检测结果。
图4-1为实施例4--RP215-IgG特异性相互作用蛋白鉴定。A：RP215-IgG特异性相互作用蛋白的Gene Ontology软件分析结果；B：指示用GO term分析方法分析质谱肽段评分较高的蛋白。
图4-2为实施例4--RP215-IgG与整合素α6β4相互作用验证实验结果。A：RP215与NCI-H520细胞裂解液孵育进行免疫沉淀，用整合素β1、整合素β4、整合素α6抗体和RP215进行Western blot检测的结果；B：整合素β4抗体与NCI-H520细胞裂解液孵育进行免疫沉淀，用整合素β4抗体和RP215进行Western blot检测的结果；C：整合素α6抗体与NCI-H520细胞裂解液孵育进行免疫沉淀，用整合素α6抗体和RP215进行Western blot检测的结果。mIgG为对照抗体，rIgG为兔抗体，作为co-IP对照。
图4-3为实施例4--免疫组化检测RP215-IgG和整合素β4肺鳞癌组织中的染色定位结果，肺鳞癌组织相邻切片中显示RP215和整合素β4抗体染色模式相近。标尺50μm。
图4-4为实施例4--RP215-IgG和整合素β4在肺鳞癌细胞中共分布和共定位实验结果。A：流式细胞术分析肺鳞癌PDX模型细胞表面RP215-IgG和整合素β4的表达水平，分析策略为：首先以细胞大小和颗粒度圈门排除细胞碎片，并以7-AAD阴性细胞圈门获得活细胞，然后以RP215-FITC圈门，获得RP215-IgG阳性和RP215-IgG阴性两个细胞群；再用抗整合素β4-PE分析上述两群细胞中整合素β4表达水平；B：用流式分选RP215强阳性及弱阳性的NCI-H520细胞，Western blots检测RP215-IgG高表达(RP215-IgG high)和RP215-IgG(RP215-IgGlow)低表达细胞中整合素β4表达水平。
图4-5为实施例4--免疫荧光分析NCI-H520细胞中RP215-CIgG(左第一列)和整合素β4(左第二列)的定位。标尺，10μm。
图4-6为实施例4--两种肺鳞癌细胞系中敲减IgG对抑制Integrin-FAK信号通路的影响。A：NCI-H520细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，Western blots检测敲减效果和Integrin-FAK信号通路相关分子，GAPDH为内参。B：SK-MES-1细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，Western blots检测敲减效果和Integrin-FAK信号通路相关分子，GAPDH为内参。
图4-7为实施例4--RP215-IgG特异性相互作用蛋白的部分质谱评分结果。
图4-8为实施例4--利用RTK磷酸化芯片检测IgG对RTK受体的磷酸化影响。A：NCI-H520细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，细胞裂解液与RTK磷酸化芯片孵育后显色的统计结果；B：SK-MES-1细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，细胞裂解液与RTK磷酸化芯片孵育后显色的统计结果。
图4-9为实施例4--两种肺鳞癌细胞系中敲减IgG对c-Met信号通路影响的Westernblot实验结果。A：NCI-H520细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，Westernblots检测敲减效果和c-Met磷酸化水平及其下游信号通路相关分子，GAPDH为内参。B：SK-MES-1细胞分别转染对照或针对IgG的siRNA，Westernblots检测敲减效果和c-Met磷酸化水平及其下游信号通路相关分子，GAPDH为内参。
图4-10为实施例4--RP215-IgG与c-Met通过整合素β4相互作用。A：RP215和c-Met抗体分别与NCI-H520细胞裂解液孵育进行免疫沉淀，用c-Met抗体和RP215进行Westernblots检测的结果；B：NCI-H520细胞分别转染对照siRNA和针对c-Met的siRNA，Westernblots检测敲减效果。RP215分别与转染对照siRNA和针对c-Met的siRNA的NCI-H520细胞裂解液孵育，用整合素β4抗体和RP215进行Western blots检测的结果。C为NCI-H520细胞分别转染对照siRNA和针对整合素β4的siRNA，Western blots检测敲减效果。抗体RP215分别与转染对照siRNA和针对整合素β4的siRNA的NCI-H520细胞裂解液孵育，用c-Met抗体和RP215进行Western blots检测。
图4-11为实施例4--外源加入抗体RP215对抑制NCI-H520细胞Integrin-FAK信号通路和克隆形成能力的实验结果。NCI-H520细胞培养上清加入对照抗体mIgG(50μg/ml)或者不同浓度的抗体RP215(2μg/ml,10μg/ml,50μg/ml)。A：12h,24h,36h收取细胞，Westernblots检测Integrin-FAK信号通路；B：克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。ns,notsignificant；***,P<0.001。
图4-12为实施例4--外源加入RP215-IgG可逆转抗体RP215对SK-MES-1细胞Integrin-FAK信号通路和克隆形成能力的抑制作用实验结果。SK-MES-1细胞培养上清加入抗体RP215(10μg/ml)和不同浓度的RP215-CIgG(2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)或者穿过液组分(10μg/ml、50μg/ml)。A：48h收取细胞，Western blots检测Integrin-FAK信号通路。B：克隆形成实验检测细胞克隆形成能力培养结果及数据统计结果。ns,notsignificant；***,P<0.001。
图5为实施例5--RP215‐IgG在肺癌组织、肺组织、引流淋巴结表达及其与肺癌预后的相关性。A:在242例肺癌组织的免疫组化染色评分结果；B:不同类型肺癌患者组织中RP215‐IgG的免疫组化染色切片；C：正常肺泡组织(Alveolus)、引流淋巴结组织(Lymphnode)以及支气管组织(Bronchus)的RP215免疫组化染色结果；D：Kaplan‐Meier生存曲线分析RP215染色评分等级与肺鳞癌患者5‐7年生存率的相关性曲线图。
图6为实施例7--使用RP215的抗肿瘤体内实验结果。A：实验流程示意图；B：分别注射RP215(单克隆抗体)和对照mIgG的肿瘤变化；C：PDX肿瘤模型体内肿瘤随时间增加体积的变化；D、E分别是两组实验不同天数肿瘤重量变化的散点图和线形图。
图7为实施例7--124I-PR215在肿瘤体内模型的显像结果。A：124I-PR215的放射性标记示意图；B：124I-PR215标记纯化前后的Radio-TLC分析结果；C：124I-PR215在不同时间的Micro-PET/CT显像。
具体实施方式
以下实施例中，RP215-IgG是指能够被单克隆抗体RP215特异性识别的IgG，为非B细胞来源的IgG。
生物材料来源：
单克隆抗体RP215：
杂交瘤细胞株，通过在弗氏佐剂致敏的BALB/c小鼠的腹腔中培养杂交瘤克隆来产生含有RP215的腹水。根据生产商的描述，使用蛋白G亲和层析(GE healthcare，USA)从腹水中纯化抗体，然后浓缩并用PBS作为溶剂获得。
癌细胞系：
LSCC细胞系NCI-H520和SK-MES-1以及293T从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)获得并由北京大学人类基因组学中心保存。
实施例1 RP215-IgG功能性结构确定
1、从癌组织中纯化IgG
(1)使用protein G-Sepharose 4Fast Flow(GE healthcare，USA)预先从非小细胞肺癌组织、乳腺癌或卵巢癌组织，或肺鳞癌(LSCC)建立的PDX肿瘤模型中纯化肿瘤IgG。使用PDX肿瘤模型的目的是排除外周血来源的IgG影响。
(2)用RP215亲和柱纯化RP215-IgG。
RP215亲和柱制备方法：单克隆抗体RP215与经过CNBr活化的Sepharose 4FastFlow(GE Healthcare，USA)偶联，参考图1-1A，根据说明书按以下步骤进行：①330mg CNBr-sepharese 4B经1mM盐酸活化后，用偶联缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3)平衡。②将5mg RP215抗体溶解在偶联缓冲液中，加入到活化的CNBr琼脂糖凝胶填料上并在4℃下孵育过夜。③4℃下，用pH 8.0、0.1M的Tris-HCl洗涤偶联的凝胶并重悬过夜，以阻断未偶联的活化位点。④用酸性洗涤液(0.1M NaAc，0.5M NaCl，pH4.0)和碱性洗涤液(0.1M Tris，0.5MNaCl，pH8.0)交替洗涤亲和柱至少3次以除去多余的RP215。
RP215亲和柱纯化RP215-IgG：将在PBS中调整至1μg/μl的大约5mg肿瘤IgG与亲和柱在4℃温育过夜，使亲和柱上的RP215与肿瘤IgG结合。⑥用至少5倍柱体积的PBS洗涤后，使用0.1M Tris-甘氨酸(pH2.4)进行洗脱程序。收集洗脱液并用PBS超滤浓缩以用于进一步分析，浓缩的洗脱液中含有分离出来的IgG，标记为RP215-IgG。
2、IgG糖基化分析
N-聚糖释放
取50μg RP215-IgG，2.5μL 200mM DTT和150μL 20mM碳酸氢铵缓冲液，加入到超滤反应器(PALL，USA)中，50℃条件下孵育1小时，再向溶液中加入10μl 200mM IAA。在没有光照的情况下室温孵育45分钟使蛋白质变性。用200μl 20mM碳酸氢铵缓冲液洗涤变性的蛋白质两次。向反应器中加入1μl PNGase F和200μl 20mM碳酸氢铵缓冲液。进一步在37℃下温育过夜以实现复杂的N-聚糖释放。
离心收集释放的含N-聚糖的溶液。衍生化之前，将溶液冻干。
N-聚糖UPLC-HRMS分析：
在UPLC-HRMS分析之前，收集的N-聚糖加入到衍生化溶液中，衍生化溶液包括10μl含有1μl 10％乙酸水溶液、7μl含30mg/ml 2,4-双(二乙氨基)-6-肼基-1,3,5-三嗪的异丙醇和2μl水。衍生化反应在37℃条件下2小时完成。
通过UPLC-Orbitrap(Thermo Fisher Scientific，Bremen，德国)直接进一步分析衍生化产物而无需任何进一步纯化。流动相A是10mM甲酸铵水溶液。流动相B是乙腈。流动相A在15分钟内从20％增加至50％并保持5分钟。然后流动相A在5分钟内降至20％，再保持5分钟。流速为0.4ml/min，柱温为10℃，进样量为3μl。ESI电压设置为3.2kV用于质量数据收集，并且应用35个arb鞘气和10个arb辅助气以稳定ESI。衍生化的低聚糖在阳性模式下检测。全扫描质量范围从800至3000m/z。
结果显示，检测到28种N-聚糖，包括在循环IgG中不常见的岩藻糖和唾液酸。四种聚糖：N5M3FG2和N5M3FG1(均不含唾液酸)，以及N4M3FG1S1和N5M3FG1S1(均含一个末端唾液酸残基)在RP215不结合组分较高，而N5M3FG2S2(具有唾液酸化双触角结构)的比例在该RP215不结合组分中明显减少(图1-1B)。相比之下，N5M3FG2S2在RP215结合组分中具有更高的丰度(图1-1B)。
3、IgG表位位点分析
识别位点的糖基化分析：
将纯化出的RP215-IgG去糖基化。
以上述1中的洗脱液(内含RP215-IgG，标记为elution)为样品，为了消化N-连接的和O-连接的聚糖，将样品加入到变性缓冲液中100℃变性10分钟。然后，在含有NP-40和适量糖苷酶的G7反应缓冲液中37℃孵育2小时消化蛋白质。
糖苷酶为：N-糖苷酶(PNGase F)(NEB，USA)，PNGase F可以水解几乎所有的N-糖链；O-糖苷酶(O-glycosidase)(NEB，USA)水解O-糖链；
为了消化唾液酸，样品在含有神经氨酸酶(Nueraminidase，即唾液酸酶)(NEB，USA)的G1反应缓冲液中37℃消化2小时。
实验结果参见图1-1D。用PNGaseF和神经氨酸酶处理后，RP215识别的条带消失，用O-糖苷酶消化后RP215识别不受干扰。此外，我们发现在RP215-IgG的最内侧的GlcNAc和Asn残基之间的所有N-连接碳水化合物之间的分子量从55kD下降到50kD，而O-糖苷酶处理后的IgG没有变化。上述结果表明，RP215识别的表位与IgG上的N-聚糖的唾液酸残基相关。
图1-1A电泳图显示，纯化洗脱产物elution(含目标IgG)可以被RP215识别，未过柱的样品液input条带轻微显示，而流过液flow through不能被RP215识别。
图1-1C为用可以特异性识别唾液酸的凝集素——主要识别α2,6连接的唾液酸的西洋接骨木凝集素(Sambucusnigra agglutinin,SNA)，主要识别α2,3连接的唾液酸朝鲜槐凝集素I(MaackiaamurensisleukoagglutininI，MAL I)，去鉴定RP215亲和柱是否可以富集唾液酸化IgG的实验结果，显示洗脱液中含有α2,6、α2,3两种连接方式连接的唾液酸。
4、RP215-IgG的唾液酸化识别位点分析
IgG的Fab片段由CH1和可变区组成，其中可变区表现出很大的多样性，我们假设RP215识别的可能的N-聚糖位点可能位于CH1中，基于我们先前的研究，RP215可以识别来自不同组织的上皮癌症来源的IgG其带有不同的VDJ重组模式，因此推测RP215所识别的表位不在可变区上，而应该在CH1上。所以在CH1结构域中发现的非典型糖基化基序TVSWN162SGAL(S160A和N162C)中引入了定点突变用于初步探索，同时，还引入了CH2结构域中经典糖基化位点天冬酰胺(N)297替换为谷氨酰胺(Q)作为对照。
突变位点参见图1-2A，其中WT为野生型；CH1mu为162位点突变：S160A和N162C；CH2mu为297位点突变：N 297Q。
两个带有突变位点的恒定区分别与可变区VH5-51/D3-9/JH4(肺鳞癌细胞中检测到的优势表达序列)融合，分别命名为CH1mu和CH2mu，同时构建具有野生型CH1和CH2结构域的IgG(WT)作为对照。首先将这些重组IgG质粒(WT，CH1mu和CH2mu)在293T细胞中过表达，利用Western blot检测RP215对野生型和突变型IgG的识别情况，结果显示RP215能识别WT和CH2mu，却不能识别CH1mu(参见图1-2B)。
接下来，我们在肺鳞癌细胞系NCI-H520中验证RP215识别的表位，从而排除内源性RP215-IgG的干扰，我们构建了带有flag标签的重组IgG质粒，然后用anti-flag beads进行IP获得外源表达的野生型或突变型IgG。与293T结果相似，在NCI-H520细胞中，RP215可以很好的识别WT或CH2mu，但是对CH1mu的识别很弱(参见图1-2C)。
RP215-IgG上经RP215识别的表位位于CH1结构域的非经典N-糖基化位点Asn162，而不是经典N-糖基化位点Asn297。
因此，该Asn162位点有N-糖基化唾液酸修饰的CH1结构域可以作为非B细胞来源的IgG的独特抗原表位。
实施例2 IgG抗原表位作为靶点标识非B细胞来源IgG，该IgG具有促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力
实施例1证实了非B细胞来源的IgG独特抗原表位，该抗原表位能够被RP215特异性识别，因此以该抗原表位作为特异性识别位点，用RP215来检测非B细胞来源IgG(RP215-IgG)的功能。
LSCC细胞系：A549(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)，Calu-3(人肺腺癌细胞)，NCI-H1299(人肺癌细胞),NCI-H520(人肺癌细胞),SK-MES-1(人肺鳞癌细胞)。
我们首先在以上几种LSCC细胞系中检测到RP215-IgG表达，发现LSCC细胞系可以表达和分泌的RP215-IgG定位于细胞表面和ECM(参见图2-1)。
当靶向NCI-H520细胞和SK-MES-1细胞中的重链恒定区的siRNA下调IgG时，这些细胞形成克隆的大小减小，克隆形成数量也明显减少，此外细胞的迁移和侵袭能力在Transwell和基质胶包被的Transwell测定中显着降低(图2-2，图2-3)。另外，同样的实验结果表明，唾液酸化的IgG与肺ADC，乳腺癌和肾癌中的细胞迁移，侵袭和转移相关。
在体外实验中，过表达野生型IgG(WT)可以明显促进细胞的迁移能力、侵袭能力、以及克隆形成能力，而将CH1结构域的上糖基化位点突变后，与WT相比，CH1突变型IgG(CH1mu)的促进细胞迁移、侵袭、以及克隆形成能力均显著下降，并且其活性与空载体组相比具有一定的促迁移作用，但在侵袭能力上没有明显差别(图2-4)。
进一步，我们将稳定表达野生型IgG、CH1突变型IgG及空载体的NCI-H520细胞分别在裸鼠中建立皮下成瘤模型，观察野生型IgG、CH1突变型IgG的促肿瘤生长能力。结果发现，野生型IgG过表达能明显促进肿瘤的生长，而CH1mu组细胞生长相对缓慢，其成瘤个数、所成肿瘤体积及肿瘤重量都显著低于WT组，并与空载体(Vector)组无显著差异(图2-5)。
综上所述，通过体内、体外实验，我们发现RP215-IgG可促进肺鳞癌的生存、迁移和侵袭，其生物学活性依赖于CH1结构域的非经典糖基化位点。
实施例3唾液酸转移酶ST3GAL4参与RP215-IgG的唾液酸化
唾液酸化的寡糖序列的生物合成由称为唾液酸转移酶的酶家族催化，并且每种唾液酸转移酶都具有其特异性底物。
先前的研究表明，在经典N-糖基化位点(Asn297)上与N-聚糖连接的唾液酸是由唾液酸转移酶ST6GAL-1介导的，唾液酸与N-聚糖β-D-吡喃半乳糖基(Gal)残基以α2,6-方式连接。
我们已经确定在非经典N-糖基化位点(Asn162)上与N-聚糖连接的唾液酸通过MALI连接到β-D-吡喃半乳糖基(Gal)残基上，所以三个唾液酸转移酶ST3GAL3，ST3GAL4，ST3GAL6(参与ST3β-半乳糖苷α-2,3-连接)，和ST6GAL1(作为对照)作为进一步筛选的候选者。
为了解决哪种唾液酸转移酶参与RP215-IgG聚糖合成，将RP215分别用于四种唾液酸转移酶沉默的Western印迹中。结果显示，ST3GAL4和ST3GAL6敲低都降低了RP215-IgG的表达，过表达ST3GAL4和ST3GAL6导致RP215识别的IgG增加。值得注意的是，商业抗-IgG抗体的Western印迹没有发生变化，表明RP215识别的IgG大大受唾液酸影响(实施例3-1)。
为了找出唾液酸化IgG(即RP215-IgG)和ST3GAL4/ST3GAL6之间的关系，我们分析了NSCLC中的表达谱和分布。免疫组化结果显示肺腺癌组织中支气管上皮细胞基底细胞和肺鳞状细胞癌组织中均有的RP215-IgG和ST3GAL4染色，而ST3GAL6阳性染色则不受限制。IHC结果明ST3GAL4与RP215-IgG的唾液酸化更相关(实施例3-2)。
因此，阻断ST3GAL4酶的活性即可阻止IgG的唾液酸化进而抑制其在肿瘤细胞迁移和侵袭中的功能，阻止肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。
实施例4 RP215-IgG与整联蛋白α6β4相互作用而且与c-Met交联
为了探讨RP215-IgG促进肺鳞癌增殖、迁移及侵袭的机制，我们首先寻找RP215-IgG相互作用蛋白。提取肺鳞癌细胞系NCI-H520蛋白，利用RP215进行免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)，然后分别将抗体RP215和对照抗体mIgG IP获得的所有蛋白通过LC-MS/MS做质谱分析。
在利用质谱解析潜在相互作用蛋白的同时，我们还用无标记定量蛋白组学(label-free quantification,LFQ)的方法来量化这些蛋白的相对丰度。将用RP215IP获得的蛋白与用阴性对照抗体mIgG IP获得的蛋白进行比较，我们认为只有在mIgG组中LFQ值等于零的蛋白才是能够与RP215-CIgG特异性相互作用的蛋白。接下来，利用数据库https://david.ncifcrf.gov/将筛选出的所有蛋白进行细胞组分的Gene Ontology(GO)分析，即Gene Ontology Cellular Component analysis。结果显示，与RP215-IgG存在特异性相互作用的蛋白组分主要是细胞膜相关蛋白，参与了细胞-细胞间粘附连接、粘着斑以及半桥粒的形成等等(图4-1A)。进一步分析涉及这几个GO term中的蛋白组分，并比较其质谱评分(结果见图4-1B)，最终我们选择关注整合素家族，基于近年来多篇文献报道它们在促进肿瘤的发生和转移中发挥着重要作用。
为了证实我们MS的发现，我们用RP215进行了IP(免疫沉淀)，发现唾液酸化IgG(即RP215-IgG)与整合素β4或整合素α6相互作用，与整合素β1无相互作用。同时，用整合素β4或整合素α6进行免疫沉淀，在二者的亲和洗脱组分中均检测到RP215-IgG，表明唾液酸化IgG与整合素α6β4复合物的特异性相互作用(见图4-2)。
为了明确唾液酸化IgG表达是否与整合素β4表达相关，我们首先利用临床肺鳞癌组织，用免疫组化的方法在相邻的石蜡切片上，分别检测唾液酸化IgG和整合素β4的组织分布模式。我们发现，在肺鳞癌中RP215和抗整合素β4抗体均在细胞膜上有强阳性染色，且二者的分布模式非常相似(图4-3)。
此外，我们在细胞水平探讨RP215-IgG和整合素β4表达水平的相关性。我们用胶原酶IV和DNA酶I消化肺鳞癌PDX模型肿瘤组织，获得单细胞悬液，然后用流式细胞术分析二者在细胞膜上的表达情况。以7-AAD阴性圈门获得活细胞后，RP215-IgG在肺鳞癌PDX肿瘤中均高水平表达。进一步流式结果显示，RP215-IgG阳性细胞群中整合素β4的阳性率(79.3％-92.6％)明显高于RP215-IgG阴性细胞群中整合素β4的阳性率(14.1％-57.2％)(图4-4A)。
此外，我们还在肺鳞癌细胞系中评估了RP215-IgG阳性细胞中整合素β4的表达。利用流式细胞分选技术，从NCI-H520细胞系中富集得到唾液酸化IgG高表达(RP215-IgGhigh)和低表达(RP215-IgGlow)的两群细胞，之后通过Western blots检测两群细胞中整合素β4表达情况。结果表明，在LSCC细胞系中，RP215-IgG与整合素β4的蛋白表达水平呈正相关(图4-4B)。
最后，我们应用免疫荧光的方法，检测RP215-IgG和整合素β4在细胞中的定位。结果显示，RP215-IgG在细胞膜和细胞质中均有表达，整合素β4主要表达在细胞膜上，并且二者在细胞膜上存在明显共定位(图4-5)。
综上所述，我们发现RP215-IgG和整合素β4在组织水平和细胞水平存在共表达和共定位，这为天然情况下二者的相互作用提供了物质基础。
RP215-IgG和整合素β4的共表达和共定位，也证明了整合素β4可以作为表征RP215-IgG分布和表达的标志物，用于RP215-IgG的检测，由于RP215-IgG能够促进上皮性肿瘤的增殖、迁移和侵袭能力，因此整合素β4可以作为标志物用于制备辅助检测上皮性肿瘤的药物。
在恶性肿瘤细胞中，整合素α6β4已被证实与多种受体酪氨酸激酶(RTK)相关，然后放大信号以促进肿瘤细胞的侵袭和转移。我们用抗体RP215在NCI-H520细胞中进行免疫沉淀、利用质谱寻找RP215-IgG相互作用蛋白时发现，与RP215结合的组分中还检测到RTK家族的c-Met和EGFR，且其评分相对较高，提示RP215-IgG和RTK家族也存在相互作用(图4-7)。
为了研究由唾液酸化IgG激活的特异性RTK，我们在NCI-H520和SK-MES-1中敲减IgG后，利用磷酸化芯片检测RTK家族中EGFR、HER2、c-Met以及这些RTK下游信号转导关键分子的磷酸化水平。结果显示，在两个细胞系敲减IgG后，c-Met的Tyr1234/1235位点的磷酸化水平均显著下调，而EGFR和HER2的磷酸化水平并没有明显变化(图4-8)。同时，RTK下游Ras-MAPK以及PI3K-Akt通路关键分子MEK、Erk1/2、Akt的磷酸化水平都明显下降。我们还利用Western blots进一步确认了磷酸化芯片的结果(图4-9)。
由于IgG敲低强烈降低了Met的酪氨酸磷酸化，我们进一步探索了LSCC中唾液酸化IgG是如何与整合素β4或Met形成复合物的。
首先，我们在NCI-H520细胞中通过内源性免疫共沉淀证实了RP215-IgG和c-Met之间存在相互作用。接下来，我们同样用免疫共沉淀方法探讨了RP215-IgG、整合素ɑ6β4、c-Met三者的相互作用关系。我们在NCI-H520细胞中分别敲减c-Met及整合素β4，然后用RP215进行免疫沉淀。结果发现，与未敲减组NC相比，敲减了c-Met并不影响RP215-IgG与整合素β4之间的相互作用，但敲减整合素β4后，RP215-IgG与c-Met之间的相互作用消失(参见图4-10B、C)。总之，这可能表明唾液酸化IgG必须与整合素β4形成复合物才能与Met相互作用。
整合素-FAK和Met信号通路参与唾液酸化IgG调节的细胞增殖和迁移。
接下来，我们研究了唾液酸化IgG促进LSCC细胞系增值和迁移的分子机制。整合素家族作为细胞外基质蛋白受体，其本身并不具有内在的酪氨酸激酶活性，而是主要通过招募和激活非受体酪氨酸激酶来进行信号转导。当整合素β4与相应配体结合后，可通过其胞质区的结构域招募粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)，使得FAK的Tyr397位点磷酸化，继而与Src的SH2结构域结合并促进Src的Tyr416位点磷酸化；而Src发生磷酸化后可以通过反馈调节的方式使得FAK的Tyr925位点磷酸化，最终引起下游Ras-MAPK或者PI3K-Akt级联反应。
为了了解唾液酸化的IgG是否涉及FAK或Met信号传导，通过siRNA在LSCC细胞系中使IgG沉默。显然，两条不同的siRNA敲低IgG后均可导致FAK和Src相关位点磷酸化水平显著下调，说明RP215-IgG表达水平下调可导致FAK-Src信号传导失活。此外，paxilin作为粘着斑复合物的成员，是FAK的直接激活靶点，其Tyr118位点磷酸化水平上调能够使得paxilin活化而发挥细胞骨架接头蛋白的功能，从而激活细胞运动或者细胞极化相关信号通路。我们同样发现，当IgG被敲低后，桩蛋白paxilin的Tyr118位点磷酸化水平也明显受到抑制(参见图4-6)。
由于唾液酸化的IgG可分泌到上清液中，并与LSCC细胞膜上的整合素β4共定位，为了研究观察到的IgG沉默的LSCC细胞中FAK信号的变化是否由分泌的IgG诱导，使用单克隆抗体RP215阻断和破坏由IgG和整合素β4形成的复合物。与同种型对照相比，RP215处理后FAK，Src，paxilin和Akt的磷酸化以浓度和时间依赖性方式显着降低，另外大大降低由Met信号传导介导的Erk1/2的活化(实验结果参见图4-10)。
为了进一步验证分泌性IgG的功能作用，用RP215亲和层析法从LSCC PDX肿瘤纯化的外源性唾液酸化IgG(RP215-IgG)加入到NCI-H520细胞的培养基中以拯救外源加入RP215或敲低IgG导致的FAK信号传导。发现通过与增加剂量的RP215-IgG一起孵育，对FAK信号传导的抑制逐渐被逆转。此外，外源加入RP215-IgG也能显著拯救IgG敲低导致克隆形成能力和迁移能力的下降，但RP215亲和层析中的穿过液IgG组分不能实现这种功能(参见图4-11和图4-12)。
为了进一步研究唾液酸化IgG中和的FAK信号激活是否依赖于其唾液酸化的N-聚糖修饰，将RP215-IgG用神经氨酸酶消化。当与10μg/ml RP215孵育36小时后，没有观察到用神经氨酸酶消化后RP215-IgG对FAK活性有作用，表明唾液酸化IgG的功能活性依赖于其上的唾液酸结构。
综上所述，整合素-FAK信号传导是唾液酸化IgG促进癌细胞增殖和迁移的关键分子机制。
前面的研究也表明，唾液酸化IgG与整合素α6β4结合形成复合物，才能推动整合素-FAK信号传导通路的激活，因此，唾液酸化IgG可以作为整合素α6β4的配体用于制备α6β4-FAK途径介导的疾病的诊断或治疗药物，当然，该IgG的CH1结构域Asn162位点是被N-糖基化唾液酸修饰。
实施例5 RP215-IgG特异性标记非小细胞肺癌
患者样本：
哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨市黑龙江省)242例患者手术中获得福尔马林固定、石蜡包埋的肺癌组织切片。临床病理特征从医疗记录的审查中获得。肿瘤标本的诊断和组织学分类基于世界卫生组织(WHO)分类。根据美国癌症联合委员会(AJCC)的指南确定肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期。
所有患者年龄25～82(56.6±10.6)岁，其中SCC(鳞状细胞癌)121例，ADC(肺腺癌)76例，SCLC(小细胞肺癌)21例，大细胞肺癌5例，5例为支气管肺泡癌，14例为未分化癌。62名(25.6％)患者来自女性。在组织病理学分级中，26.8％的样品(n＝65)分化良好(I级)，49.2％(119例)中度分化(II级)，和24.0％(58例)低分化(三级)。按照TNM分期标准，134例(55.4％)处于I期，50人(20.7％)处于Ⅱ期，56人(23.1％)处于Ⅲ期，2人(0.8％)处于Ⅳ期。
使用单克隆抗体RP215在不同类型的肺癌患者的242个癌症组织中测定了唾液酸化的IgG。
我们首先在NSCLC的中发现唾液酸化的IgG的高表达(140/221，63％)，但是在SCLC(0/21)中没有。此外，在NSCLC病例中，唾液酸化IgG在SCC中高频率表达(102/121，84.3％)；而在ADC(28/76，36.8％)、小细胞肺癌(2、5，40.0％)和在未分化癌(8/14，57.1％)中低频率表达；在支气管肺泡癌(0/5)未见染色。
我们还比较了唾液酸化IgG的表达模式和病理评分，发现在SCC的唾液酸化IgG阳性组织中，所有癌细胞，特别是细胞表面显示非常强的染色(评分：110.9)，然而，在非SCC组织中，仅少数癌细胞呈弱或中等染色(评分：21.1)，表明唾液酸化的IgG也可以促进NSCLC的进展，并且SCC的细胞表面上的唾液酸化的IgG可以作为靶用于肺SCC疗法。
接下来，我们探索唾液酸化的IgG是否可以在正常肺组织中表达。在从尸检(6例)或邻近癌组织(23例)引流淋巴结，我们发现假复层柱状睫状上皮细胞，正常肺泡上皮细胞和引流淋巴结淋巴细胞无染色。但是，在支气管上皮细胞的基底细胞中观察到周染色。到目前为止，LSCC被认为是来源于这个细胞群，特别是在与癌组织相邻的支气管增生基底细胞(参见图5A-C)。
实施例6 RP215-IgG同样特异性标记其它上皮性肿瘤
患者样本：
癌组织切片包括100例结肠癌患者，200例乳腺癌，87例前列腺癌，70例肾癌，45例膀胱癌，80例唾液腺囊腺癌，70例胃癌，20例胰腺癌，50例食道癌，分别购自陕西超英生物技术及上海芯超生物技术公司。临床病理特征从医疗记录的审查中获得。肿瘤标本的诊断和组织学分类基于世界卫生组织(WHO)分类。根据美国癌症联合委员会(AJCC)的指南确定肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期。
使用单克隆抗体RP215在不同类型的上皮性肿瘤组织中测定了RP215-IgG。
我们发现在结肠癌组织中的表达频率为74％(74/100)；在乳腺癌中的表达频率94.5％(189/200)；在前列腺癌组织中的表达频率为85％(74/87)；在肾癌组织中的表达频率为77％(54/70)；在膀胱癌组织中的表达频率为100％(54/54)；在唾液腺囊腺癌组织中的表达频率为94％(75/80)；在胃癌组织中的表达频率为86％(60/70)；在胰腺癌组织中的表达频率为100％(20/20)；在食道癌组织中的表达频率为100％(50/50)。显然，RP215-IgG在多种上皮来源的肿瘤高频表达。
在从尸检(6例)或邻近癌组织(23例)引流淋巴结，发现假复层柱状睫状上皮细胞，正常肺泡上皮细胞(图5C左上角图)和引流淋巴结淋巴细胞(图5C右上角图)无染色。但是，在支气管上皮细胞的基底细胞中观察到周染色(图5C下方两个图)。到目前为止，LSCC被认为是来源于这个细胞群，特别是在与癌组织相邻的支气管增生基底细胞。
我们还比较了表达频率与肿瘤转移及不良预后的关系，发现RP215-IgG的表达水平及频率都与肿瘤的转移及不良预后呈现正相关关系。提示RP215-IgG参与上述上皮性肿瘤的发生及转移，具有多种上皮性肿瘤的治疗靶点，并可应用于预测肿瘤的转移及不良预后(图5D)。
实施例7阻断RP215-IgG可治疗癌症
功能性阻断抗体RP215在体内对LSCC PDX模型显示治疗效果
前面的实验结果已经证实，RP215-IgG的CH1结构域Asn162位点N-糖基经唾液酸修饰后才能被RP215识别，且具备该功能性结构的IgG其糖基化修饰是由唾液酸转移酶ST3GAL4介导的。下面通过识别这一独特结构的单抗RP215来结合RP215-IgG以阻断其功能。
参与肿瘤细胞的迁移和侵袭，
建立PDX肿瘤模型和抗体治疗：
重症联合免疫缺陷(SCID)-Beige小鼠在6周时从Vital River Laboratories科技有限公司(中国北京)获得。所有动物的护理和使用均按照北京大学医学部动物用药与护理指导原则进行。
在北京大学肿瘤医院接受手术切除的肺鳞状细胞癌患者中，获得3例肿瘤组织。第4代的PDX用于抗体治疗。将转移的肿瘤置于含有RPMI 1640的无菌培养皿中，然后切成2×2×2mm3的组织块。典型地，将每个片段植入右侧和左侧的皮下区域。肿瘤达到～100mm3后开始抗体治疗。将小鼠随机分配至各自的治疗组。通过尾静脉将mIgG或RP215(溶于PBS中)以5mg/kg每周两次注射6周。每隔一天监测肿瘤的生长情况。
了解了LSCC中RP215-IgG的致癌特性，我们接下来检测RP215是否可以通过静脉注射来建立PDX模型的治疗效果。
PDX肿瘤保留了原发肿瘤中表达的大部分关键基因，并且比原来建立的细胞系更接近原始临床癌症。我们的研究中使用了3例来自LSCC患者的肿瘤，并且移植瘤的组织学分析证实异种移植物维持了LSCC的表型。
如图6所示，与mIgG对照相比，每只小鼠处理5mg/kg RP215减少了60％抑制的预先建立的肿瘤的生长。实验结束时RP215处理组肿瘤的平均重量为0.31±0.14g，显着低于对照组(0.81±0.29g)。另外两种情况也有类似的效果。
实施例8 124I-PR215的生产、质控及初步Micro-PET/CT研究
124TeO2(99.0％)购自俄罗斯Center of Molecular Research公司、Sumitomo HM-20回旋加速器和124I纯化系统(Industrial Equipment Division)购自日本住友公司、放射性测量活度计购自美国Capintec公司、Micro-PET/CT购自匈牙利Mediso公司。放射性标记示意图参见图7A。
标记与质控：
1.标记抗体：PR215，用量：0.2mg，抗体浓度为2.0mg/ml。
2.放射性124I：由本单位回旋加速器自行生产，批号：2018-I-124-003，放射性浓度为5×37MBq/mL。
3.纯化柱：美国Sigma公司PD-10柱。
4.氧化剂：溴代琥珀酰亚胺(简称NBS)，美国Sigma公司。
5.磷酸缓冲溶液(简称PB)：pH7.2和pH7.4的0.1和0.01M的磷酸缓冲溶液，自己配制。
6.人血清白蛋白(简称HSA)：含量为10％(20％的HAS稀释)，华北制药厂。
实验仪器：活度计：(中国计量科学研究院)，表面沾污仪(瑞典)，放射性碘标记手套箱(上海同普公司)。
抗体溶液的标记：
7.取0.2mg PR215(体积200μL)，加入0.3ml 0.1M的PH7.4的PB。
8.抽取所需的放射性Na124I溶液0.5ml，放射性活度为2.5×37MBq，将该放射性加入到要标记的抗体溶液中，立即加入10μg的NBS(相当于每mg抗体加入50μg的NBS,以0.01MPBS配置)，反应60s后加入0.3ml10％的HSA终止反应，然后取样测定标记率，过PD-10柱纯化分离，上柱量:1.5mCi，产量为：2.0mCi，放射性比活度为10mCi/mg；放射性浓度为1mCi/mL。
9.标记率的测定：采用丙酮展开剂。ITLC-SG做固定相行上行展开，标记物在原点，游离124I在前沿。用Radio-TLC测定放射性计数，并计算标记率。
放射性标记纯化前后的Radio-TLC分析见图7B。
24I-PR215的Micro-PET显像
通过尾部静脉注射18.5MBq的124I-PR215生理盐水溶液到人肺鳞癌PDX模型动物体内。药物注射后20h，60h，80h，120h，采用Matrx VIP 3000动物麻醉机以300mL/min的氧气吹动3.0％异氟烷进行小鼠麻醉，将小鼠以俯卧位固定于扫描床，以150mL/mi的氧气吹动1.0-1.5％异氟烷维持麻醉状态，并进行Micro-PET/CT扫描。扫描能量窗为350-700KeV，横断面视野为80mm，3D模式采集15min，采集完成后使用随机和散射衰减校正以Osem算法进行3D图像重建，重建完后使用MMWKS SUPERARGUS软件进行图像处理。
制备的124I-PR215溶液经尾静脉注射入正常小鼠体内后，采用Micro-PET/CT进行成像实验。结果如图7C所示，经尾静脉注射124I-PR215溶液后20h，60h，80h，120h，放射性富集从心血池到肿瘤有明显富集，而其他正常组织器官中的放射性浓浓聚较低。并且124I主要通过膀胱代谢。Micro-PET显像证明，本研究中所制备的124I-PR215符合碘系列单抗在生物体内的代谢行为，并且在模型动物肿瘤中有非常好的放射性摄取。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> IgG抗原表位及其作为靶点的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 170
<212> PRT
<213> IgG的CH1结构域
<400> 1
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
20 25 30
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
35 40 45
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
50 55 60
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
65 70 75 80
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
85 90 95
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
100 105 110
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
115 120 125
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
130 135 140
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
145 150 155 160
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
165 170
Claims (8)
1.IgG抗原表位，其特征在于，为非B细胞来源的IgG的CH1结构域，且在该结构域的Asn162位点有N-糖基化唾液酸修饰。
2.根据权利要求1所述的IgG抗原表位，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的IgG抗原表位作为药物作用靶点在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、唾液腺囊腺癌、胃癌、胰腺癌或食道癌。
5.权利要求1或2所述的IgG抗原表位作为整合素α6β4的配体在制备α6β4-FAK-c-Met途径介导的疾病的诊断和/或治疗药物中的应用。
6.唾液酸转移酶ST3GAL4作为药物作用靶点在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。
7.唾液酸转移酶ST3GAL4联合唾液酸转移酶ST3GAL6作为药物作用靶点在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤为上皮性肿瘤。
8.整合素β4作为标志物在制备辅助检测上皮性肿瘤的药物中的应用。
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