ES2965624T3 - Epítopo de IGG y aplicación del mismo como diana - Google Patents

Abstract

Un epítopo de IgG y una aplicación del mismo como objetivo. El epítopo de IgG es un dominio CH1 de IgG de origen no celular B, está modificado con ácido siálico N-glicosilado en un sitio Asn162 del dominio y depende de la sialilación en el sitio para cumplir una función antigénica del mismo. Además se proporciona una aplicación del epítopo de IgG como objetivo farmacológico en la preparación de un fármaco para el diagnóstico y/o tratamiento de un tumor epitelial. La función del antígeno como diana farmacológica depende de la sialilación del sitio Asn162 del mismo, y al ser dependiente la sialilación del sitio Asn162 de la sialiltransferasa ST3GAL4, indica que la enzima se puede utilizar como diana farmacológica para la preparación de un tumor. tratamiento de drogas. La integrina β4 se coexpresa y colocaliza con IgG que contiene el epítopo anterior; y por tanto, a la luz de dicha función, la IgG puede usarse como marcador para la preparación de un fármaco que ayude a la detección de un tumor epitelial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Epítopo de IGG y aplicación del mismo como diana

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo técnico general del diagnóstico y tratamiento de tumores en inmunología, y se refiere a una IgG no derivada de células B, en particular a un epítopo de IgG y sus aplicaciones como diana farmacológica.

Antecedentes

Fuente e investigación existente del anticuerpo monoclonal RP215: En la década de 1980, para obtener anticuerpos monoclonales que reconocieran específicamente el cáncer de ovario, el grupo de investigación de Lee de la Universidad de Columbia en Canadá inmunizó animales con proteínas extraídas de líneas celulares de cáncer de ovario y adquirió cerca de 3,000 células de hibridoma. Descubrieron que una célula de hibridoma podía reconocer células de cáncer de ovario, pero no células de ovario normales, llamadas RP215, pero no sabían qué antígenos reconocía en ese momento, por lo que el antígeno que reconoció se denominó temporalmente "CA215". Más tarde se descubrió que RP215 no sólo reconocía bien el cáncer de ovario, sino que también mostraba una buena especificidad en el reconocimiento de otros tipos de células tumorales, por lo que CA215 se definió como "marcador pancanceroso". En 2017, el grupo de investigación de Lee identificó CA215. Obtuvieron una gran cantidad de "CA215" del sobrenadante del cultivo de líneas celulares de cáncer de ovario mediante cromatografía de afinidad. Los 32 fragmentos peptídicos proporcionados por espectrometría de masas eran todos cadenas pesadas de IgG. Para confirmar aún más este resultado, utilizaron el "CA215" purificado como antígeno para preparar cinco cepas de anticuerpos monoclonales específicos. Los experimentos confirmaron que los cinco anticuerpos monoclonales reconocían moléculas de IgG. Demostró que CA215 era IgG expresada por células cancerosas. Los resultados posteriores confirmaron que la glicosilación de la IgG expresada por las células cancerosas era significativamente diferente de la de la IgG circulante. El epítopo reconocido por RP215 es el epítopo relacionado con glicosilo exclusivo de este tipo de región variable de cadena pesada de IgG (consulte la Publicación de patente china No. 102901817A).

En otras palabras, RP215 no podía reconocer la IgG (IgG circulante) secretada por los linfocitos B después de la diferenciación en células plasmáticas, pero podía reconocer la IgG expresada por células no B. Los estudios han demostrado que la IgG reconocida por RP215 (en adelante denominada RP215-IgG) puede ser expresada por células de diferentes linajes, pero el nivel de expresión es menor que el de las células tumorales no originadas en células B, por lo que se denomina colectivamente como IgG no derivada de células B (no-B-IgG). No B-IgG es muy diferente de la IgG tradicional derivada de células B en estructura y funciones.

La RP215-IgG, que está sobreexpresada por células similares a células madre tumorales, tiende a ubicarse en la unión entre la superficie celular y la célula, especialmente en la estructura de adhesión focal. Además, las células RP215-IgG de alto nivel tienen una alta capacidad de adhesión a la matriz extracelular (ECM), alta migración e invasividadin vitroein vivo,para mejorar la capacidad de autorrenovación y formación de tumores de las células madre tumorales. Sin embargo, la estructura específica y la naturaleza del epítopo único reconocido por RP215 y el mecanismo de aparición y desarrollo del tumor impulsado por RP215-IgG aún se desconocen, por lo que es imposible preparar medicamentos para el diagnóstico o tratamiento dirigidos específicamente a IgG distintos de RP215. El documento WO2013186630 también describe el anticuerpo RP215. Valliere-Douglass y colaboradores (J Biol. Chem.

2009. 284: 32493-32506) describe el dominio de anticuerpos humanos Ch1 de IgG modificada por oligosacárido.

Gracias a nuestros esfuerzos, hemos sido claramente conscientes de que la IgG que puede ser reconocida específicamente por RP215 es una IgG no derivada de células B, y que el sitio reconocido en la IgG está altamente sialilado y el grupo glicosilo sialilado no está relacionado con O-glicosilación. Esta IgG sialilada especial se puede utilizar como marcador para identificar células madre o células progenitoras y luego preparar preparaciones relacionadas basadas en la glicoproteína.

En vista de la estrecha correlación entre la IgG no derivada de células B y las células cancerosas epiteliales, más estudios sobre la estructura molecular de la IgG facilitarán la intervención de diversos tumores malignos.

Resumen

El objetivo de la presente invención es identificar un epítopo que pueda usarse como diana a través de estudios adicionales sobre las estructuras moleculares y funciones de la IgG no derivada de células B y proporcionar nuevos usos del epítopo.

Finalmente se encontró IgG no derivada de células B mediante el análisis de digestión relacionado con proteasas, el análisis de glicosilación y el análisis del sitio funcional de la proteína, y sus funciones relacionadas con el tumor dependieron principalmente de la sialilación de sitios específicos.

De acuerdo con los resultados de nuestro estudio, el primer aspecto de la presente invención proporciona un epítopo de IgG, que es el dominio C<h>1 de IgG no derivada de células B, y tiene una modificación de ácido siálico N-glicosilado en el sitio Asn162 del dominio CH1 y en el que la secuencia de aminoácidos del epítopo de IgG consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1, para uso en diagnósticoin vivoy/o para uso en un método para el tratamiento de un paciente que tiene tumores como diana de fármaco, en el que los tumores son tumores epiteliales.

Se ha demostrado que la IgG que contiene el epítopo sialilado en el sitio específico de Asn162 promueve la capacidad de proliferación, migración e invasión de tumores.

Preferiblemente, en la solicitud anterior, los tumores son cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer intestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cistadenocarcinoma de glándulas salivales, cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de esófago.

De acuerdo con las soluciones técnicas anteriores proporcionadas en el presente documento, la presente invención tiene los siguientes efectos beneficiosos:

La presente invención ha identificado la estructura molecular funcional de la IgG no derivada de células B, que es una estructura altamente sialilada de N-glicano en el sitio de Asn162 en el dominio Ch1 de IgG. Se sobreexpresa en células madre de tumores epiteliales y es muy importante para las propiedades cancerígenas de una variedad de neoplasias malignas epiteliales; además, es una diana atractiva para la terapia con anticuerpos, la terapia con células T-Car y compuestos de moléculas pequeñas, lo que proporciona un objetivo farmacológico eficaz para el tratamiento de cánceres relacionados y un epítopo para la investigación de fármacos con anticuerpos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1-1 muestra los resultados del análisis del enriquecimiento de RP215-IgG y la glicosilación de proteínas derivadas de tumores mediante la columna de cromatografía de afinidad de RP215 en el Ejemplo 1. A: Diagrama esquemático de IgG reconocida por RP215 enriquecida a partir de carcinoma de células escamosas de pulmón utilizando Proteína G combinada con una columna de cromatografía de afinidad de RP215-CNBr; B: Diagrama estructural de cada cadena de carbohidratos y el contenido de diferentes glicanos; C: Se utilizaron SNA y MAL I que reconocían el ácido siálico para identificar el estado del ácido siálico de IgG en cada componente de la columna de cromatografía de afinidad; D: Resultados de transferencia Western de IgG sialilada después de digerirla con N-glicosidasa, O-glicosidasa y sialidasa, respectivamente. Elución: eluyente; tampón 1: tampón de digestión de N-glicosidasa y O-glicosidasa; tampón 2: tampón de digestión de sialidasa.

La Fig. 1-2 muestra la indicación de secuencia del sitio de mutación y el resultado de la identificación del epítopo en el Ejemplo 1. A: Secuencias de aminoácidos de RP215-IgG (WT) no mutada y dos mutantes (C<h>1it i<u>y C<h>2it i<u>), la parte enmarcada es el sitio de mutación correspondiente; B: Detección del reconocimiento de RP215 mediante transferencia Western después de sobreexpresar RP215-IgG (la secuencia de la región variable es VH5-51/D3-9/JH4) y el mutante correspondiente en células 293T; C: Detección del reconocimiento de RP215 mediante transferencia Western tras sobreexpresar RP215-IgG (la secuencia de la región variable es Vh5-51/D3-9/Jh4) y el mutante correspondiente en células NCI-H520; donde simulado es un control negativo y vector es un vector vacío.

La Fig. 2-1 muestra la expresión de RP215-IgG en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas en el Ejemplo 2. A: transferencias Western para detectar la expresión de RP215-IgG en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas, GAPDH es la referencia interna; B: transferencias Western para detectar la secreción de RP215-IgG en el sobrenadante del cultivo de células NCI-H520 y células SK-MES-1; C: método de inmunofluorescencia para detectar la localización de RP215-IgG (verde) en células NCI-H520 y células SK-MES-1, núcleos marcados con Hoechst (azul), anticuerpo secundario: Alexa Fluor 488 de cabra antirratón, escala 25 pm; D: citometría de flujo para detectar la expresión de RP215-IgG en la membrana celular de una línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas (tinción de células vivas), anticuerpo secundario: Alexa Fluor 488 de cabra antirratón. La Fig. 2-2 muestra el resultado del ensayo de clonalidad en placa de células de carcinoma escamoso de pulmón inhibidas por inactivación de IgG en el Ejemplo 2. A: Detección por transferencia Western de la inactivación después de que las células NCI-H520 se transfecten con control o ARNip contra IgG, respectivamente. GAPDH es referencia interna; B: las células NCI-H520 se transfectan con ARNip durante 36 h, luego se realiza el ensayo Transwell para detectar la capacidad de migración celular; C: las células NCI-H520 se transfectan con ARNip durante 36 h, luego se realiza el ensayo Matrigel-Transwell para detectar la capacidad de invasión celular; D: la transferencia Western detecta el resultado de la inactivación tras la inactivación de IgG en SK-MES-1 con ARNip de IgG, GAPDH es la referencia interna; E: las células SK-MES-1 se transfectan con ARNip durante 36 h, luego se realizó el ensayo Transwell para detectar la capacidad de migración celular; F: las células<s>K-MES-1 se transfectan con ARNip durante 36 h y luego se realiza el ensayo Matrigel-Transwell para detectar la capacidad invasiva. *, P<0.05; **, P<0.01; escala 200 pm. La Fig. 2-3 muestra los resultados del ensayo de formación de colonias de células de carcinoma escamoso de pulmón inhibidas por inactivación de IgG en el Ejemplo 2. A: se realizó un ensayo de formación de colonias para detectar la proliferación celular y la autorrenovación después de la inactivación de IgG para células NCI-H520; B: se realizó un ensayo de formación de colonias para detectar la proliferación celular y la autorrenovación después de la inactivación de IgG para células SK-MES-1. ** , P<0.01.

La Fig. 2-4 muestra los experimentosin vitropara detectar la relación entre el efecto de promoción tumoral de RP215-IgG y el epítopo de N-glicosilación sialilado del dominio C<h>1 en el Ejemplo 2. A: transferencia Western para detectar el reconocimiento de RP215, la IgG antihumana comercial es un control negativo, GAPDH es una referencia interna; B: resultados del ensayo de clonalidad en placa; C: ensayo Transwell para detectar la capacidad de migración celular; D: ensayo Matrigel-Transwell para detectar la capacidad de invasión celular. WT: IgG tipo silvestre, Cn1mu: IgG mutante Cii1; Vector: vector vacío de control; simulado: control negativo. ns, no significativo; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.

La Fig. 2-5 muestra la formación de tumoresin vivode cepas estables de células NCI-H520 que expresan WT, Ch1itiu y Vector en ratones desnudos respectivamente en el Ejemplo 2. A: Imágenes de volúmenes tumorales en WT, grupos ChI itiu y Vector al final del experimento; B: Curva de crecimiento de volúmenes tumorales en WT, grupos ChI itiu y Vector; C: Gráfico de volúmenes tumorales en WT, grupos C<h>I<itiu>y Vector al final del experimento; D: gráfico de pesos tumorales en WT, grupo C<h>I<itiu>y Vector al final del experimento. ns, no significativo; **, P <0.01; ***, P<0.001.

La Fig. 3-1 muestra el efecto de cuatro sialiltransferasas sobre la sialilación de RP215-IgG y los resultados de la detección por transferencia Western en el Ejemplo 3. A: el resultado del reconocimiento de RP215 tras el silencio de cuatro sialiltransferasas; B: el resultado del reconocimiento de RP215 después de la sobreexpresión de cuatro sialiltransferasas, de las cuales GAPDH es una referencia interna.

La Fig. 3-2 muestra los resultados de detección inmunohistoquímica de RP215, anticuerpos anti-ST3GAL4 y anti-ST3GAL6 en tejidos de adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón en el Ejemplo 3. La Fig. 4-1 muestra la identificación de la proteína interactiva específica RP215-IgG en el Ejemplo 4. A: resultados del análisis de ontología genética de la proteína interactiva específica RP215-IgG; B: método de análisis de términos GO para analizar proteínas con alta puntuación de segmentos peptídicos de MS.

La Fig. 4-2 muestra los resultados del experimento de verificación de interacción de RP215-IgG y la integrina a6p4 en el Ejemplo 4. A: los resultados de la transferencia Western del anticuerpo de la integrina p1, la integrina p4, integrina a6 y Rp215 después de que se incuban los lisados de células RP215 y NCI-H520 para inmunoprecipitación; B: los resultados de la transferencia Western del anticuerpo de la integrina p4 y RP215 después de que el anticuerpo de la integrina p4 y el lisado de células NCI-H520 se incuban para la inmunoprecipitación; C: los resultados de la transferencia Western del anticuerpo de la integrina a6 y RP215 después de que el anticuerpo de la integrina a6 y el lisado de células NCI-H520 se incuban para la inmunoprecipitación. mIgG es un anticuerpo de control, rIgG es un anticuerpo de conejo, como control de co-IP

La Fig. 4-3 muestra la detección inmunohistoquímica de la tinción y localización de RP215-IgG e integrina p4 en tejidos de carcinoma de células escamosas de pulmón, y las secciones de tejido de carcinoma de células escamosas adyacentes mostraron patrones de tinción similares de RP215 y anticuerpo de integrina p4 en el Ejemplo 4. Escala, 50 |jm.

La Fig. 4-4 muestra la co-distribución y co-localización de RP215-IgG y la integrina p4 en células de carcinoma escamoso de pulmón en el Ejemplo 4. A: citometría de flujo para analizar los niveles de expresión de RP215-IgG e integrina p4 en la superficie celular de modelos PDX de carcinoma de células escamosas de pulmón. La estrategia de análisis: en primer lugar, los desechos celulares se excluyen mediante la puerta de tamaño celular y el tamaño de partícula, las células vivas se obtienen mediante la puerta celular negativa 7-AAD, luego las poblaciones de células positivas para RP215-IgG y negativas para RP215-IgG se obtienen mediante la puerta de RP215-FITC; y luego se analizan los niveles de expresión de la integrina p4 de las dos poblaciones celulares anteriores mediante anti-integrina p4-PE; B: citometría de flujo para clasificar las células NCI-H520 con RP215 positivo fuerte y positivo débil, y transferencias Western para detectar el nivel de expresión de la integrina p4 en las células con alta expresión de RP215-IgG (RP215-IgG alto) y baja expresión de RP215-IgG (RP215-IgG bajo).

La Fig. 4-5 muestra el análisis de inmunofluorescencia de la ubicación de RP215-CIgG (primera columna desde la izquierda) y la integrina p4 (segunda columna desde la izquierda) en células NCI-H520 en el Ejemplo 4. Escala, 10 jm.

La Fig. 4-6 muestra el efecto de la inactivación de IgG sobre la inhibición de la vía de señalización de integrina-FAK en dos líneas celulares de carcinoma escamoso de pulmón en el Ejemplo 4. A: las células NCI-H520 se transfectan con control o ARNip contra IgG, respectivamente. Las transferencias Western se utilizan para detectar efectos de inactivación y moléculas relacionadas con la vía de señalización de Integrina-FAK. GAPDH es una referencia interna. B: las células SK-MES-1 se transfectan con control o ARNip contra IgG, respectivamente. Las transferencias Western se utilizan para detectar efectos de inactivación y moléculas relacionadas con la vía de señalización de Integrina-FAK. GAPDH es referencia interna.

La Fig. 4-7 muestra el resultado de la puntuación de espectrometría de masas parcial de las proteínas que interactúan específicas de RP215-IgG en el Ejemplo 4.

La Fig. 4-8 muestra la detección del efecto de IgG sobre la fosforilación del receptor RTK usando chips de fosforilación RTK en el Ejemplo 4. A: resultados estadísticos del filtrado después de transfectar células NCI-H520 con control o ARNip contra IgG, respectivamente, y se incuban en lisado celular y chips de fosforilación RTK; B: resultados estadísticos del filtrado después de transfectar células SK-MES-1 con control o ARNip contra IgG, respectivamente, y se incuban en lisado celular y chips de fosforilación RTK.

La Fig. 4-9 muestra los resultados de la transferencia Western del efecto de la inactivación de IgG en la vía de señalización de c-Met en dos líneas celulares de carcinoma escamoso de pulmón en el Ejemplo 4. A: las células NCI-H520 se transfectan con control o ARNip contra IgG, respectivamente. Las transferencias Western se utilizan para detectar el efecto de inactivación y el nivel de fosforilación de c-Met y moléculas relacionadas de la vía de señalización posterior. GAPDH es una referencia interna. B: las células SK-MES-1 se transfectan con control o ARNip contra IgG, respectivamente. Las transferencias Western se utilizan para detectar el efecto de inactivación y el nivel de fosforilación de c-Met y las moléculas relacionadas de las vías de señalización posteriores. GAPDH es una referencia interna. La Fig. 4-10 muestra la interacción entre RP215-IgG y c-Met a través de la integrina p4 en el Ejemplo 4. A: RP215 y el anticuerpo c-Met se incuban con lisado celular NCI-H520 para inmunoprecipitación, y la detección por transferencias Western se realiza con el anticuerpo c-Met y RP215; B: las células NCI-H520 se transfectan con ARNip de control y ARNip de c-Met, respectivamente, y se utilizan transferencias Western para detectar el efecto de inactivación. RP215 se incuba con lisado de células NCI-H520 transfectadas con ARNip de control y ARNip de c-Met, respectivamente, y la detección por transferencia Western se realiza con anticuerpo de integrina p4 y RP215. C: el efecto de inactivación detectado por transferencias Western después de que las células NCI-H520 se transfectan con ARNip de control y ARNip de integrina p4. El anticuerpo RP215 se incuba con lisado de células NCI-H520 transfectadas con ARNip de control y ARNip de integrina p4, respectivamente, y la detección por transferencias Western se realiza con anticuerpo c-Met y RP215.

La Fig. 4-11 muestra los resultados experimentales sobre la inhibición de la vía de señalización de integrina-FAK y la capacidad de formación de clones de células NCI-H520 después de la adición exógena del anticuerpo RP215 en el Ejemplo 4. Agregar el anticuerpo de control mIgG (50 pg/mL) o diferentes concentraciones de anticuerpo RP215 (2 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL) en el sobrenadante del cultivo celular de NCI-H520. A: las células se recogen a las 12 h, 24 h y 36 h, y la vía de señalización de integrina-FAK se detecta mediante transferencias Western; B: la capacidad de formación de colonias se detecta mediante un ensayo de formación de colonias. ns, no significativo; ***, P<0.001. La Fig. 4-12 muestra los resultados experimentales sobre la inhibición de la vía de señalización de integrina-FAK y la capacidad de formación de colonias de células SK-MES-1 después de la adición exógena del anticuerpo RP215 reversible RP215-IgG en el Ejemplo 4. Al sobrenadante del cultivo celular SK-MES-1 se le añade el anticuerpo RP215 (10 pg/mL) y diferentes concentraciones de RP215-CIgG (2 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL) o componentes líquidos de flujo continuo (10 pg/mL, 50 pg /mL). A: las células se recogen a las 48 h y se realiza una transferencia Western para detectar la vía de señalización de Integrina-FAK. B: los resultados del cultivo y los resultados estadísticos de la capacidad de formación de colonias detectados mediante el ensayo de formación de colonias. ns, no significativo; ***, P<0.001.

La Fig. 5 muestra las expresiones de RP215-IgG en tejidos de cáncer de pulmón, tejidos pulmonares, ganglios linfáticos de drenaje y sus correlaciones con el pronóstico del cáncer de pulmón en el Ejemplo 5. A: la puntuación de tinción inmunohistoquímica da como resultado 242 tejidos de cáncer de pulmón; B: secciones de tinción inmunohistoquímica de RP215-IgG en tejidos de pacientes con diferentes tipos de cáncer de pulmón; C: resultados de la tinción inmunohistoquímica de RP215 de tejidos alveolares normales (alvéolos), tejidos de ganglios linfáticos de drenaje (ganglios linfáticos) y tejidos bronquiales (bronquios); D: análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier de la correlación entre el grado de puntuación de tinción de RP215 y la tasa de supervivencia a 5-7 años de pacientes con carcinoma de células escamosas de pulmón.

La Fig. 6 muestra el resultado del experimento antitumoralin vivousando RP215 en el Ejemplo 7. A: diagrama esquemático del procedimiento experimental; B: cambios tumorales después de inyectar RP215 (anticuerpo monoclonal) y mIgG de control, respectivamente; C: cambios del volumen del tumor con el tiempo en los modelos de tumores PDX; D y E muestran un diagrama de dispersión y un gráfico de líneas de los cambios de peso del tumor en diferentes días en los dos grupos.

La Fig. 7 es el resultado de las imágenes de 124I-PR215 en modelos tumoralesin vivoen el Ejemplo 7. A: diagrama esquemático del radiomarcaje de 124I-PR215; B: resultados del análisis Radio-TLC de 124I-PR215 antes y después del marcaje y purificación; C: imágenes Micro-PET/CT de 124I-PR215 en diferentes momentos.

Descripción detallada de las realizaciones

En las siguientes realizaciones, RP215-IgG se refiere a IgG que puede ser reconocida específicamente por el anticuerpo monoclonal RP215, y es IgG no derivada de células B.

Fuentes de materiales biológicos:

Anticuerpo monoclonal RP215:

Para la línea celular de hibridoma, se produjo ascitis que contenía RP215 cultivando clones de hibridoma en la cavidad abdominal de ratones BALB/c sensibilizados con adyuvante de Freund. De acuerdo con la descripción del fabricante, los anticuerpos se purificaron a partir de ascitis mediante cromatografía de afinidad con proteína G (GE Healthcare, EE. UU.), luego se concentraron y se obtuvieron utilizando PBS como disolvente.

Líneas celulares cancerosas:

Las líneas celulares de LSCC NCI-H520, SK-MES-1 y 293T se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) y se conservaron en el Centro de Genómica Humana de la Universidad de Pekín.

Ejemplo 1. Determinación de la estructura funcional de RP215-IgG

1. Purificación de IgG de tejidos cancerosos.

(1) La IgG tumoral se purificó a partir de los modelos de tumores PDX establecidos por tejidos de cáncer de pulmón de células no pequeñas, tejidos de cáncer de mama o de cáncer de ovario, o tejidos de carcinoma de células escamosas de pulmón (LSCC) de antemano usando proteína G-Sepharose 4 Fast Flow (GE HealthCare, EE.UU.). El uso de modelos de tumores PDX tenía como objetivo excluir el efecto de la IgG derivada de la sangre periférica. (2) Purificación de RP215-IgG con columna de afinidad de RP215.

Preparación de la columna de afinidad de RP215: el anticuerpo monoclonal RP215 se acopló con Sepharose 4 Fast Flow (GE HealthCare, EE.UU.) activada por CNBr, como se muestra en la Fig. 1-1A. Las operaciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones. © Después de activar 330 mg de CNBr-sefarosa 4B con ácido clorhídrico 1 mM, se equilibró con tampón de acoplamiento (NaHCO<3>0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 8.3). @ Se disolvieron 5 mg de anticuerpo RP215 en tampón de acoplamiento, luego se agregaron al relleno de gel de agarosa CNBr activado y se incubaron durante la noche a 4°C. @ A 4°C, el gel acoplado se lavó con Tris-HCl (pH 8.0, 0.1 M) y se resuspendió durante la noche para bloquear el sitio de activación no conjugado. © La columna de afinidad se lavó alternativamente con solución de lavado ácida (NaAc 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 4.0) y solución de lavado alcalina (Tris 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 8.0) al menos 3 veces para eliminar el exceso de Rp215.

Purificación de RP215-IgG con columnas de afinidad de RP215: se incubaron aproximadamente 5 mg de IgG tumoral que se ajustó a 1 pg/pL en PBS con la columna de afinidad a 4°C durante la noche para unir RP215 en la columna de afinidad a la IgG tumoral. © Después de lavar con al menos 5 volúmenes de columna de PBS, el procedimiento de elución se realizó usando Tris-glicina 0.1 M (pH 2.4). El eluato se recogió y se concentró con ultrafiltración en PBS para su posterior análisis. El eluato concentrado contenía la IgG separada, que se marcó como RP215-IgG.

2. Análisis de glicosilación de IgG.

Liberación de N-glicano

Se añadieron 50 pg de RP215-IgG, 2.5 pL de DTT 200 mM y 150 pL de tampón de bicarbonato de amonio 20 mM a un reactor de ultrafiltración (PALL, EE. UU.), se incubaron a 50 °C durante 1 hora y luego se añadieron 10 pL de lAA 200 mM a la solución. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad para desnaturalizar la proteína. La proteína desnaturalizada se lavó dos veces con 200 pL de tampón de bicarbonato de amonio 20 mM. Se añadieron al reactor 1 pL de PNGasa F y 200 pL de tampón de bicarbonato de amonio 20 mM. Luego, la mezcla se incubó adicionalmente a 37 °C durante la noche para lograr la liberación compleja de N-glicano.

Después de la centrifugación, se recogió la solución liberada que contenía N-glicano. Antes de la derivatización, la solución se liofilizó.

Análisis por UPLC-HRMS de N-glicano:

Antes del análisis por UPLC-HRMS, el N-glicano recogido se añadió a la solución de derivatización. La solución de derivatización incluía 10 pL de solución acuosa que contenía 1 pL de ácido acético al 10 %, 7 pL de isopropanol que contenía 30 mg/mL de 2,4-bis(dietilamino)-6-hidrazino-1,3,5-triazina y 2 pL de agua. La reacción de derivatización se completó a 37 °C durante 2 horas.

Los productos derivatizados se analizaron directamente mediante UPLC-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) sin ninguna purificación adicional. La fase móvil A era una solución acuosa de formiato de amonio 10 mM. La fase móvil B era acetonitrilo. La fase móvil A aumentó del 20% al 50% en 15 minutos y se mantuvo durante 5 minutos. Luego, la fase móvil A disminuyó al 20% en 5 minutos y se mantuvo durante 5 minutos. El caudal fue de 0.4 mL/min, la temperatura de la columna fue de 10°C y el volumen de inyección fue de 3 pL. El voltaje del ESI se ajustó a 3.2 kV para la recopilación de datos de calidad, y se aplicaron 35 gases envolventes arb y 10 gases auxiliares arb para estabilizar el ESI. Los oligosacáridos derivatizados se detectaron de forma positiva. El rango completo de calidad de escaneo fue de 800 a 3000 m/z.

Los resultados mostraron que se detectaron 28 tipos de N-glicano, incluidos la fucosa y el ácido siálico, que no se encontraban comúnmente en la IgG circulante. Cuatro tipos de glicanos: N5M3FG2 y N5M3FG1 (ambos sin ácido siálico), y N4M3FG1S1 y N5M3FG1S1 (ambos conteniendo un residuo de ácido siálico terminal) tenían un mayor componente no unido en RP215, mientras que la proporción de N5M3FG2S2 (con una estructura biantenaria de sialilación) en los componentes no unidos de RP215 fue significativamente reducido (Fig. 1-1B). Por el contrario, N5M3FG2S2 tuvo una mayor abundancia en los componentes de unión a RP215 (Fig. 1-1B).

3. Análisis de sitios de epítopos de IgG.

Análisis de glicosilación de sitios de reconocimiento:

La RP215-IgG purificada se desglicosiló.

Se tomó como muestra el eluyente de la sección 1 anterior (que contenía RP215-IgG, etiquetado como elución). Para digerir los glicanos unidos a N y unidos a O, la muestra se añadió al tampón de desnaturalización y se desnaturalizó a 100 °C durante 10 minutos. Luego, la mezcla anterior se incubó en tampón de reacción G7 que contenía NP-40 y una cantidad apropiada de glicosidasa durante 2 horas a 37 °C para digerir la proteína.

La glicosidasa fue N-glicosidasa (PNGasa F) (NEB, EE. UU.). La PNGasa F podría hidrolizar casi toda la cadena de N-carbohidratos; La O-glicosidasa (NEB, EE. UU.) podría hidrolizar la cadena de O-carbohidratos;

Para digerir el ácido siálico, las muestras se digirieron en tampón de reacción G1 que contenía neuraminidasa (Sialidasa) (NEB, EE. UU.) durante 2 horas a 37 °C.

Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 1-1D. Después del tratamiento con PNGasa F y neuraminidasa, la banda reconocida por RP215 desapareció y el reconocimiento de RP215 no se vio alterado después de la digestión con O-glicosidasa. Además, encontramos que el peso molecular de todos los carbohidratos unidos a N entre los residuos GlcNAc y Asn más internos de RP215-IgG disminuyó de 55 kD a 50 kD, mientras que la IgG tratada con O-glicosidasa permaneció sin cambios. Los resultados anteriores indicaron que el epítopo reconocido por RP215 estaba relacionado con el residuo de ácido siálico de N-glicano en IgG.

El electroferograma de la Fig. 1-1A mostró que el producto de elución purificado (que contiene la IgG diana) podía ser reconocido por RP215, y la banda de entrada de la solución de muestra que no pasó a través de la columna se mostraba ligeramente, mientras que el líquido de flujo continuo no podía ser reconocido por RP215.

La Fig. 1-1C mostró los resultados de la prueba para identificar si la columna de afinidad de RP215 podría enriquecer la IgG de sialilación usando lectinas que podrían reconocer específicamente el ácido siálico-aglutinina de Sambucusnigra (SNA) que reconocía principalmente el ácido siálico unido por a2,6, leucoaglutinina I de Maackiaamurensis (MAL I) que reconocía principalmente ácido siálico unido por a2,3. Los resultados mostraron que el eluyente contenía ácido siálico unido por a2,6 y a2,3.

4. Análisis de sitios de reconocimiento de sialilación de RP215-IgG.

El fragmento Fab de IgG está compuesto por Ch1 y la región variable. La región variable muestra una gran diversidad. Suponemos que los posibles sitios de N-glicano reconocidos por RP215 pueden estar ubicados en Ch1. De acuerdo con nuestros estudios previos, RP215 puede reconocer IgG de diferentes tejidos de cáncer epitelial que tienen diferentes patrones de recombinación de VDJ, por lo que se especula que el epítopo reconocido por RP215 no está en la región variable, sino que debería estar en Ch1. Por lo tanto, los motivos de glicosilación atípicos TVSWN162SGAL (S160A y N162C) encontrados en el dominio Ch1 se introdujeron con mutaciones específicas del sitio para la exploración preliminar. Al mismo tiempo, el sitio de glicosilación clásico asparagina (N) 297 en el dominio Ch2 también se introdujo, que se reemplazó con glutamina (Q) como control.

Los sitios de mutación se muestran en la Fig. 1-2A, de los cuales, WT representó el tipo silvestre; Cnlmu representó la mutación del sitio 162: S160A y N162C; Cn2mu representó la mutación del sitio 297: N 297 Q.

Se fusionaron dos regiones constantes con sitios de mutación con regiones variables V ii5-51/D3-9/Jh4 (secuencias de expresión predominantes detectadas en células de carcinoma escamoso de pulmón), denominadas C<h>Iit i<u>y C<h>2it i<u>, respectivamente, al mismo tiempo, la IgG de tipo silvestre (WT) con dominios Ch1 y Ch2 coit io control. En primer lugar, estos plásmidos IgG recombinantes (WT, ChIit iu y Ch2it iu) se sobreexpresaron en células 293T Se utilizó transferencia Western para detectar el reconocimiento de IgG de tipo silvestre y mutante por RP215. Los resultados mostraron que RP215 podía reconocer WT y Ch2it iu, pero no pudo reconocer ChIit iu (Fig. 1-2B).

A continuación, verificamos el epítopo reconocido por RP215 en la línea celular de carcinoma escamoso de pulmón NCI-H520, eliminando así la interferencia de RP215-IgG endógeno. Construimos un plásmido de IgG recombinante con una etiqueta Flag y luego usamos perlas anti-Flag para IP para obtener IgG de tipo silvestre o mutante que expresa exógenamente. Similar a los resultados de 293T, RP215 podría reconocer WT o C<h>2it i<u>en células NCI-H520 muy bien, pero podría reconocer ligeramente ChI itiu (véase la Fig. 1-2C).

El epítopo reconocido por RP215 en RP215-IgG se ubicó en el sitio de N-glicosilación no clásico Asn162 del dominio C<h>1, no el clásico sitio de N-glicosilación Asn297.

Por lo tanto, el dominio C<h>1 con modificación de ácido siálico N-glicosilado en el sitio Asn162 podría usarse como un epítopo único para IgG no derivada de células B.

Ejemplo 2. Identificación de IgG no derivada de células B que tiene la capacidad de promover la proliferación, migración e invasión de células tumorales usando epítopo de IgG como diana.

El ejemplo 1 confirmó el epítopo único de IgG no derivada de células B, que podría ser reconocido específicamente por RP215, por lo que, usando este epítopo como un sitio de reconocimiento específico, se usó RP215 para detectar las funciones de IgG no derivadas de células B (RP215-IgG).

Líneas celulares de LSCC: A549 (células epiteliales basales alveolares humanas de adenocarcinoma), Calu-3 (células de adenocarcinoma de pulmón humano), NCI-H1299 (células de cáncer de pulmón humano), NCI-H520 (células de cáncer de pulmón humano), SK-MES-1 (células de carcinoma escamoso de pulmón humano).

En primer lugar, detectamos la expresión de RP215-IgG en las diversas líneas celulares de LSCC anteriores y descubrimos que la RP215-IgG que podía expresarse y secretarse mediante la línea celular LSCC estaba localizada en la superficie celular y en la ECM (que se muestra en la Fig. 2-1).

Cuando los ARNip que se dirigen a la región constante de la cadena pesada en las células NCI-H520 y las células SK-MES-1 subregularon la IgG, el tamaño de los clones formados por estas células se redujo y el número de clones formados también se redujo significativamente. Además, en los ensayos Transwell y Transwell recubiertos con Matrigel, la capacidad de migración e invasión de las células se redujo significativamente (Fig. 2-2, Fig. 2-3). Además, experimentos similares indicaron que la IgG sialilada se asociaba con la migración celular, la invasión y la metástasis en el ADC de pulmón, el cáncer de mama y el cáncer de riñón.

En experimentosin vitro,la sobreexpresión de IgG de tipo silvestre (WT) aparentemente podría promover la migración celular, la invasión y la capacidad de formación de clones. Después de mutar el sitio de glicosilación del dominio C<h>1, en comparación con WT, IgG con Ch1 mutante tenía una capacidad significativamente reducida para promover la migración celular, la invasión y la formación de colonias, y su actividad tuvo un efecto promotor de la migración en comparación con el grupo de vectores vacíos, pero no hubo diferencias significativas en la capacidad de invasión entre ellos (Fig. 2-4).

Además, establecimos modelos tumorigénicos subcutáneos de células NCI-H520 que expresan de forma estable IgG, de tipo silvestre, con Ch1 mutante y vector vacío en ratones desnudos, para observar la capacidad de promoción del crecimiento tumoral de la IgG de tipo silvestre e IgG con Ch1 mutante. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de IgG de tipo silvestre podría promover significativamente el crecimiento de tumores, mientras que las células crecieron lentamente en el grupo de Ch1it iu, y su número, volumen y peso de los tumores formados fueron todos significativamente menores que los del grupo WT, pero no fueron significativamente diferentes de los del grupo de vector vacío (Fig. 2-5).

En resumen, los experimentos in vivo e in vitro han demostrado que RP215-IgG puede promover la supervivencia, migración e invasión del carcinoma de células escamosas de pulmón, y su actividad biológica depende del sitio de glicosilación no clásico del dominio C<h>1.

Ejemplo 3. Sialiltransferasa ST3GAL4 implicada en la sialilación de RP215-IgG

La biosíntesis de secuencias de oligosacáridos de sialilación está catalizada por una familia de enzimas llamadas sialiltransferasas, y cada sialiltransferasa tiene su sustrato específico.

Estudios anteriores demostraron que el ácido siálico unido al N-glicano en el sitio de N-glicosilación clásico (Asn297) estaba mediado por la sialiltransferasa ST6GAL-1, y el ácido siálico estaba conectado con el residuo de N-glicano p-D-galactopiranosilo (Gal) por a 2,6-.

Hemos determinado que el ácido siálico unido al N-glicano en el sitio de N-glicosilación no clásico (Asn162) estaba conectado al residuo p-D-galactopiranosilo (Gal) a través de MALI, por lo tanto, las tres sialiltransferasas (ST3GAL3, ST3GAL4 , ST3GAL6, implicados en el enlace a-2,3 de ST3p-galactósido) y ST6GAL1 (como control) fueron los candidatos para una evaluación adicional.

Para determinar qué sialiltransferasa estaba implicada en la síntesis de RP215-IgG, se utilizó RP215 en la transferencia Western del silenciamiento de cuatro sialiltransferasas. Los resultados mostraron que tanto la inactivación de ST3GAL4 como ST3GAL6 redujeron la expresión de RP215-IgG, y la sobreexpresión de ST3GAL4 y ST3GAL6 resultó en un aumento en la IgG reconocida por RP215. Cabe señalar que no hubo cambios en la transferencia Western del anticuerpo anti-IgG comercial, lo que indica que la IgG reconocida por RP215 se vio muy afectada por el ácido siálico (Ejemplo 3-1).

Para identificar la relación entre la IgG sialilada (es decir, RP215-IgG) y ST3GAL4/ST3GAL6, analizamos el perfil de expresión y la distribución en NSCLC. Los resultados inmunohistoquímicos mostraron tinción con RP215-IgG y ST3GAL4 en células basales epiteliales bronquiales en tejidos de adenocarcinoma de pulmón y tejidos de carcinoma de células escamosas de pulmón, mientras que la tinción positiva de ST3GAL6 no estaba restringida. Los resultados de IHC mostraron que ST3GAL4 estaba más relacionado con la sialilación de RP215-IgG (Ejemplo 3-2).

Por lo tanto, bloquear la actividad de la enzima ST3GAL4 puede prevenir la sialilación de IgG y, por lo tanto, inhibir su función en la migración e invasión de células tumorales, y prevenir el crecimiento, la migración y la invasión de células tumorales.

Ejemplo 4. RP215-IgG interactuó con la integrina a6p4 y se entrecruzó con c-Met

Para explorar el mecanismo por el cual RP215-IgG promueve la proliferación, migración e invasión del carcinoma de células escamosas de pulmón, primero buscamos la proteína que interactúa con RP215-IgG. Se extrajo la proteína de de la línea celular de carcinoma escamoso de pulmón NCI-H520 y se usó RP215 para la inmunoprecipitación (inmunoprecipitación, IP), luego todas las proteínas obtenidas por el anticuerpo RP215 y se analizaron por IP del anticuerpo de control mIgG mediante LC-MS/MS.

Si bien se analizaron por MS las proteínas potencialmente interactuantes, cuantificamos la abundancia relativa de estas proteínas mediante el método de cuantificación sin etiquetas (LFQ). La proteína obtenida con IP de RP215 se comparó con la proteína obtenida con la IP negativa del anticuerpo de control mIgG, y concluimos que solo las proteínas con un valor de LFQ de cero en el grupo de mIgG eran proteínas que podían interactuar específicamente con RP215-CIgG. A continuación, se realizó un análisis de ontología genética (GO) para todas las proteínas seleccionadas de la base de datos https://david.ncifcrf.gov/, es decir, análisis de componentes celulares de ontología génica. Los resultados mostraron que los componentes proteicos que interactuaban específicamente con RP215-IgG eran principalmente proteínas relacionadas con la membrana celular, que estaban involucradas en las uniones de adhesión célula-célula, adherencias focales y formación de hemidesmosomas (Fig. 4-1A). Analizamos más a fondo los componentes proteicos en estos términos GO y comparamos sus puntuaciones de MS (los resultados se muestran en la Fig. 4-1B), finalmente decidimos centrarnos en la familia de las integrinas, que desempeñó un papel importante en la promoción de la tumorigénesis y la metástasis según varios informes de los últimos años.

Para confirmar nuestros hallazgos de MS, realizamos IP (inmunoprecipitación) con RP215 y encontramos que la IgG sialilada (es decir, RP215-IgG) interactuaba con la integrina p4 o la integrina a6, pero no tenía interacción con la integrina p1. Al mismo tiempo, se realizó inmunoprecipitación con la integrina p4 o la integrina a6, y se detectó RP215-IgG en sus fracciones de elución por afinidad, lo que indica la interacción específica entre la IgG sialilada y el complejo de integrina a6p4 (Fig. 4-2).

Para aclarar si la expresión de IgG sialilada está relacionada con la expresión de la integrina p4, primero utilizamos tejidos de carcinoma de células escamosas de pulmón clínico para detectar el patrón de distribución tisular de la IgG sialilada y la integrina p4 en secciones de parafina adyacentes mediante inmunohistoquímica. Descubrimos que tanto el RP215 como el anticuerpo anti-integrina p4 tenían una fuerte tinción positiva en la membrana celular del carcinoma de células escamosas de pulmón, y sus patrones de distribución eran muy similares (Fig. 4-3).

Además, exploramos la correlación entre los niveles de expresión de RP215-IgG y la integrina p4 a nivel celular. Digerimos el tejido tumoral del modelo PDX de carcinoma de células escamosas de pulmón con colagenasa IV y ADNasa I para obtener una suspensión de células individuales, y luego analizamos sus expresiones en la membrana celular mediante citometría de flujo. Después de obtener células viables con puertas negativas para 7-AAD, RP215-IgG se expresó altamente en tumores PDX. La citometría de flujo adicional mostró que la tasa positiva de integrina p4 en la población de células positivas para RP215-IgG (79.3 % - 92.6 %) fue significativamente mayor que la tasa positiva de integrina p4 en la población de células negativas para RP215-IgG (14.1 % - 57.2 %) (Fig. 4-4A).

Además, evaluamos la expresión de la integrina p4 en células positivas para RP215-IgG en líneas celulares de carcinoma escamoso de pulmón. Utilizamos clasificación por citometría de flujo para obtener dos grupos de células con alta expresión de IgG sialilada (RP215-IgGalta) y baja expresión de IgG sialilada (RP215-IgGbaja) mediante enriquecimiento de la línea celular NCI-H520, luego los niveles de expresión de integrina p4 en los dos grupos de células se detectaron mediante transferencias Western. Los resultados mostraron que RP2l5-IgG se correlacionaba positivamente con el nivel de expresión de la proteína integrina p4 en la línea celular LSCC (Fig. 4-4B).

Finalmente, detectamos la localización de RP215-IgG y la integrina p4 en células mediante el método de inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que RP215-IgG se expresaba en la membrana celular y el citoplasma, la integrina p4 se expresaba principalmente en la membrana celular y tenían una colocalización obvia en la membrana celular (Fig. 4-5).

En resumen, encontramos que RP215-IgG y la integrina p4 se coexpresaron y colocalizaron a nivel tisular y celular, lo que proporcionó una base para la interacción entre ellos en condiciones naturales.

La coexpresión y colocalización de RP215-IgG y la integrina p4 también demostró que la integrina p4 podría usarse como marcador para caracterizar la distribución y expresión de RP215-IgG, que podría usarse para la detección de RP215-IgG. Dado que RP215-IgG podría promover la proliferación, migración e invasión de tumores epiteliales, la integrina p4 podría usarse como marcador para preparar fármacos para la detección auxiliar de tumores epiteliales.

En las células tumorales malignas, se ha demostrado que la integrina a6p4 está asociada con múltiples receptores tirosina quinasas (RTK), que pueden amplificar las señales para promover la invasión y metástasis de las células tumorales. Usamos el anticuerpo RP215 para realizar inmunoprecipitación en células NCI-H520 y usamos espectrometría de masas para encontrar proteínas que interactúan con RP215-IgG. Los resultados mostraron que también se detectaron c-Met y EGFR de la familia RTK en los componentes unidos a RP215, y sus puntuaciones fueron relativamente altas, lo que sugiere que existe interacción entre RP215-IgG y la familia de RTK (Fig. 4-7).

Para estudiar la RTK específica activada por IgG sialilada, inactivamos IgG en NCI-H520 y SK-MES-1, y detectamos EGFR, HER2, c-Met en la familia de RTK y el nivel de fosforilación de estas moléculas clave relacionadas con RTK después de la transducción de señales mediante chips de fosforilación. Los resultados mostraron que, después de la inactivación de IgG en dos líneas celulares, el nivel de fosforilación en el sitio Tyr1234/1235 de c-Met se subreguló significativamente, mientras que los niveles de fosforilación de EGFR y HER2 no mostraron cambios significativos (Fig. 4-8). Al mismo tiempo, los niveles de fosforilación de Ras-MAPK en la parte posterior de RTK y las moléculas clave MEK, Erk1/2 y Akt de la vía de PI3K-Akt disminuyeron significativamente. Además, confirmamos los resultados de los chips de fosforilación mediante transferencias Western (Fig. 4-9).

Dado que la inactivación de IgG redujo en gran medida la fosforilación de tirosina Met, exploramos cómo la IgG sialilada formaba complejos con la integrina p4 o Met en LSCC.

Primero, confirmamos la interacción entre RP215-IgG y c-Met en células NCI-H520 mediante coinmunoprecipitación endógena. Posteriormente, exploramos las interacciones entre RP215-IgG, integrina a6p4 y c-Met mediante el método de coinmunoprecipitación. Eliminamos c-Met y la integrina p4 en células NCI-H520 respectivamente, y luego usamos RP215 para la inmunoprecipitación. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo NC sin inactivación, la inactivación de c-Met no afectó la interacción entre RP215-IgG y la integrina p4, pero después de la inactivación de la integrina p4, la interacción entre RP215-IgG y c-Met desapareció (Fig. 4-10B, C). En conclusión, sugirió que la IgG sialilada y la integrina p4 deben formar un complejo antes de interactuar con Met.

Las vías de señalización de integrina-FAK y Met estuvieron involucradas en la proliferación y migración celular regulada por IgG sialilada.

Posteriormente, estudiamos el mecanismo molecular de la IgG sialilada para promover la proliferación y migración de líneas celulares de LSCC. La familia de las integrinas, como receptor de proteínas de la matriz extracelular, no tiene actividad tirosina quinasa intrínseca, pero realiza principalmente transducción de señales mediante el reclutamiento y activación de tirosina quinasas no receptoras. Cuando se une al ligando correspondiente, la integrina p4 puede reclutar quinasa de adhesión focal (FAK) a través del dominio de su región citoplasmática, para fosforilar el sitio Tyr397 de FAK, luego unirse al dominio SH2 de Src y promover la fosforilación del sitio Tyr416 de Src; después de la fosforilación de Src, el sitio Tyr925 de FAK puede fosforilarse mediante regulación por retroalimentación, lo que eventualmente conduce a una reacción en cascada de Ras-MAPK o PI3K-Akt más adelante.

Para identificar si la IgG sialilada estaba involucrada en la señalización de FAK o Met, se silenció la IgG en líneas celulares de LSCC mediante ARNip. Aparentemente, después de inactivar la IgG con dos ARNip diferentes, los niveles de fosforilación de los sitios relacionados con FAK y Src podrían subregularse significativamente, lo que indica que la subregulación del nivel de expresión de RP215-IgG podría conducir a la inactivación de la transducción de señal de FAK-Src. Además, como miembro del complejo de adhesión focal, la paxilina es una diana de activación directa de FAK, y la sobrerregulación del nivel de fosforilación en el sitio Tyr118 puede activar la paxilina y funcionar como una proteína adaptadora citoesquelética, activando así el movimiento celular o las rutas de señal relacionadas con la polarización. También descubrimos que cuando se inactivaba la IgG, el nivel de fosforilación de paxilina en el sitio Tyr118 también se inhibía significativamente (como se muestra en la Fig. 4-6).

Debido a que la IgG sialilada podría secretarse en el sobrenadante y co-localizarse con la integrina p4 en la membrana celular del LSCC, utilizamos el anticuerpo monoclonal RP215 para bloquear y destruir el complejo formado por la IgG y la integrina p4, para investigar si los cambios observados en la señal de FAK en las células de LSCC silenciadas con IgG fueron inducidas por IgG secretada. En comparación con el control de isotipo, después del tratamiento con RP215, la fosforilación de FAK, Src, paxilina y Akt se redujo significativamente de manera dependiente de la concentración y el tiempo, y la activación de Erk1/2 mediada por la transducción de señales de Met se redujo considerablemente (los resultados experimentales se muestran en la Fig. 4-10).

Para verificar aún más los efectos de la IgG secretora, se añadió IgG sialilada exógena (RP215-IgG) purificada de tumores PDX de LSCC mediante cromatografía de afinidad de RP215 al medio de cultivo de células NCI-H520 para rescatar la transducción de señales de FAK causada por la adición exógena de RP215 o inactivación de IgG. Se descubrió que al incubar con RP215-IgG en una dosis mayor, la inhibición de la transducción de señal de FAK se revertía gradualmente. Además, la adición exógena de RP215-IgG podría rescatar significativamente la disminución en la formación clonal y la capacidad de migración causada por la inactivación de IgG, pero los componentes de IgG del líquido de flujo continuo en la cromatografía de afinidad de RP215 no pudieron lograr esta función (Fig. 4-11 y Fig. 4-12).

Para estudiar más a fondo si la activación de la transducción de señal de FAK neutralizada por IgG sialilada dependía de su modificación de sialilación con N-glicano, se digirió RP215-IgG con neuraminidasa. Cuando se incubaron con 10 |jg/mL de RP215 durante 36 horas, no observamos el efecto de RP215-IgG sobre la actividad de FAK después de la digestión con neuraminidasa, lo que indica que la actividad funcional de la IgG sialilada dependía de su estructura de ácido siálico.

En resumen, la transducción de señales de integrina-FAK es el mecanismo molecular clave de la IgG sialilada para promover la proliferación y migración de células cancerosas.

Estudios anteriores han demostrado que la IgG sialilada se une a la integrina a6p4 para formar un complejo para promover la activación de la vía de señalización de integrina-FAK. Por lo tanto, la IgG sialilada se puede utilizar como ligando de la integrina a6p4 para preparar fármacos para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades mediadas por la vía de a6p4-FAK. Por supuesto, el sitio Asn162 del dominio Ch1 de la IgG está modificado por ácido siálico N-glicosilado.

Ejemplo 5. Marcado específico de cáncer de pulmón de células no pequeñas con RP215-IgG

Muestras de pacientes:

Se obtuvieron secciones de tejido de cáncer de pulmón fijadas con formalina e incluidas en parafina de 242 pacientes en el Hospital Oncológico de la Universidad Médica de Harbin (Harbin, provincia de Heilongjiang). Las características clínico-patológicas estuvieron disponibles a partir de la revisión de historias clínicas. El diagnóstico y la clasificación histológica de las muestras tumorales se basaron en la clasificación de la OMS. El estadio de la metástasis tumoral en los ganglios linfáticos (TNM) se determinó de acuerdo con las directrices del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC).

Todos los pacientes tenían entre 25 y 82 (56.6 ± 10.6) años, incluidos 121 casos de SCC (carcinoma de células escamosas), 76 casos de ADC (adenocarcinoma de pulmón), 21 casos de SCLC (cáncer de pulmón de células pequeñas), 5 casos de cáncer de pulmón de células grandes, 5 casos de carcinoma broncoalveolar y 14 casos de carcinoma no diferenciado. Sesenta y dos pacientes (25.6%) eran mujeres. En términos de clasificación histopatológica, el 26.8% de las muestras (65 casos) estaban bien diferenciadas (grado I), el 49.2% (119 casos) moderadamente diferenciadas (grado II) y el 24.0% (58 casos) poco diferenciadas (grado 3). De acuerdo con los criterios de estadificación de TNM, 134 pacientes (55.4%) estaban en estadio I, 50 pacientes (20.7%) estaban en estadio II, 56 pacientes (23.1%) estaban en estadio III y 2 pacientes (0.8%) estaban en estadio IV.

La IgG sialilada se determinó con el anticuerpo monoclonal RP215 en 242 tejidos cancerosos de pacientes con diferentes tipos de cáncer de pulmón.

Primero encontramos una alta expresión de IgG sialilada en NSCLC (140/221, 63%), pero no se encontró en SCLC (0/21). Además, la IgG sialilada se expresó con alta frecuencia en SCC (102/121,84.3%) en casos de NSCLC; mientras que se expresa con baja frecuencia en ADC (28/76, 36.8%), cáncer de pulmón de células pequeñas (2/5, 40.0%) y cáncer no diferenciado (8/14, 57.1%); no se observó tinción en el carcinoma broncoalveolar (0/5).

Comparamos el patrón de expresión y la puntuación patológica de la IgG sialilada y descubrimos que todas las células cancerosas, especialmente la superficie celular, mostraban una tinción muy fuerte (puntuación: 110.9) en tejidos positivos para IgG sialilados de<s>C<c>. Sin embargo, solo unas pocas células cancerosas mostraron una tinción débil o moderada en tejidos que no eran SCC (puntuación: 21.1), lo que indica que la IgG sialilada también podría promover la progresión del NSCLC, y la IgG sialilada en la superficie celular del SCC podría usarse como diana para la terapia del SCC de pulmón.

Posteriormente, exploramos si la IgG sialilada podría expresarse en tejidos pulmonares normales. Al drenar los ganglios linfáticos de la autopsia (6 casos) o los tejidos cancerosos adyacentes (23 casos), encontramos que las células epiteliales ciliares columnares pseudoestratificadas, las células epiteliales alveolares normales y los linfocitos de los ganglios linfáticos de drenaje no estaban teñidos. Sin embargo, se observó tinción periférica en las células basales de las células epiteliales bronquiales. Hasta ahora, se considera que el LSCC se deriva de esta población de células, especialmente de las células basales de hiperplasia bronquial adyacentes al tejido canceroso (Fig. 5A-C).

Ejemplo 6. Marcado específico de otros tumores epiteliales con RP215-IgG

Muestras de pacientes:

Las secciones de tejido canceroso incluyeron 100 pacientes con cáncer colorrectal, 200 pacientes con cáncer de mama, 87 pacientes con cáncer de próstata, 70 pacientes con cáncer de riñón, 45 pacientes con cáncer de vejiga, 80 pacientes con cistadenocarcinoma de glándulas salivales, 70 pacientes con cáncer gástrico, 20 pacientes con cáncer de páncreas y 50 pacientes con cáncer de esófago; y se adquirieron a través de Shaanxi Chaoying Biotechnology Co., Ltd. y Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd. Las características clínico-patológicas estaban disponibles a partir de la revisión de registros médicos. El diagnóstico y la clasificación histológica de las muestras tumorales se basaron en la clasificación de la OMS. El estadio de la metástasis tumoral en los ganglios linfáticos (TNM) se determinó de acuerdo con las directrices del Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC).

Se determinó RP215-IgG en diferentes tipos de tumores epiteliales utilizando el anticuerpo monoclonal RP215.

Los resultados mostraron que las frecuencias de expresión variaron en diferentes tejidos cancerosos: 74% (74/100) en cáncer colorrectal, 94.5% (189/200) en cáncer de mama, 85% (74/87) en cáncer de próstata, 77% (54/70) en cáncer de riñón, 100% (54/54) en cáncer de vejiga, 94% (75/80) en cistoadenocarcinoma de glándulas salivales, 86% (60/70) en cáncer gástrico, 100% (20/20) en cáncer de páncreas y 100% (50/50) en cáncer de esófago. Aparentemente, RP215-IgG se expresó altamente en una variedad de tumores de origen epitelial.

Al drenar los ganglios linfáticos de la autopsia (6 casos) o los tejidos cancerosos adyacentes (23 casos), encontramos que las células epiteliales ciliares columnares pseudoestratificadas, las células epiteliales alveolares normales (esquina superior izquierda de la Fig. 5C) y linfocitos del ganglio linfático de drenaje (esquina superior derecha de la Fig. 5C) no estaban teñidos. Sin embargo, se observó tinción periférica en células basales de células epiteliales bronquiales (dos figuras debajo de la Fig. 5C). Hasta ahora, se considera que el LSCC se deriva de esta población de células, especialmente las células basales de hiperplasia bronquial adyacentes a los tejidos cancerosos.

Comparamos la relación entre la frecuencia de expresión y la metástasis tumoral y el mal pronóstico, y encontramos que el nivel de expresión y la frecuencia de RP215-IgG se correlacionaron positivamente con la metástasis tumoral y el mal pronóstico. Esto sugirió que RP215-IgG está implicada en la aparición y metástasis de los tumores epiteliales anteriores, con una variedad de objetivos terapéuticos para los tumores epiteliales, y puede usarse para predecir metástasis tumorales y mal pronóstico (Fig. 5D).

Ejemplo 7. Tratamiento de cánceres mediante el bloqueo de RP215-IgG

El anticuerpo de bloqueo funcional RP215 mostró un efecto terapéutico en modelos PDX de LSCCin vivo.

Los resultados experimentales anteriores confirmaron que el grupo N-glicosilo en el sitio Asn162 del dominio C<h>1 de RP215-IgG pudo ser identificado por RP215 después de modificarlo con ácido siálico, y la modificación por glicosilación de IgG con esta estructura funcional estuvo mediada por la sialiltransferasa ST3GAL4. Se identificó que el anticuerpo monoclonal RP215 con estructura única se une a RP215-IgG para bloquear su función.

Estuvo involucrado en la migración e invasión de células tumorales.

Establecimiento de modelo tumoral PDX y terapia con anticuerpos:

Los ratones beige con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) se obtuvieron a través de Vital River Laboratories Technology Co., Ltd. (Beijing, China) a las 6 semanas. El cuidado y uso de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de medicación y enfermería animal del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín.

Los tejidos tumorales de 3 pacientes se obtuvieron de aquellos con carcinoma de células escamosas de pulmón que se sometieron a resección quirúrgica en el Hospital Oncológico de la Universidad de Pekín. La cuarta generación de PDX se utilizó para la terapia con anticuerpos. El tumor metastásico se colocó en una placa de Petri estéril que contenía RPMI 1640 y luego se cortó en bloques de tejido con un tamaño de 2 * 2 * 2 mm3. Normalmente, cada segmento se implantó en las áreas subcutáneas derecha e izquierda. La terapia con anticuerpos se inició cuando el tumor alcanzó unos 100 mm3. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a sus respectivos grupos de tratamiento. Se inyectó mIgG o RP215 (disuelto en PBS) a través de la vena de la cola a una velocidad de 5 mg/kg, dos veces por semana, durante 6 semanas. La condición de crecimiento del tumor se controló cada dos días.

Después de comprender las propiedades cancerígenas de RP215-IgG en LSCC, detectamos si RP215 podría establecer los efectos terapéuticos de los modelos PDX mediante inyección intravenosa.

Los tumores PDX retuvieron la mayoría de los genes clave expresados en el tumor primario y estaban más cerca del cáncer clínico original que de la línea celular establecida originalmente. En nuestro estudio, utilizamos los tumores de 3 pacientes con LSCC y el análisis histológico de los tumores trasplantados confirmó que los xenoinjertos mantuvieron el fenotipo de LSCC.

Como se muestra en la Fig. 6, en comparación con el control de mIgG, RP215 a una dosis de 5 mg/kg por ratón redujo el crecimiento del tumor preestablecido en un 60%. Al final del experimento, el peso promedio de los tumores en el grupo de tratamiento con RP215 fue de 0.31 ± 0.14 g, significativamente menor que el del grupo de control (0.81 ± 0. 29.g). Se observaron efectos similares en otras dos condiciones.

Ejemplo 8. Producción, control de calidad y estudio preliminar Micro-PET/CT de 124I-PR215

Se adquirió 124TeO<2>(99.0%) a través del Centro de Investigación Molecular de Rusia, se adquirió el ciclotrón Sumitomo HM-20 y el sistema de purificación de 124I (División de Equipos Industriales) a través de Sumitomo Corporation de Japón, el medidor de actividad de radiactividad se adquirió a través de US Capintec y el Micro-PET/CT se adquirió a través de Mediso Hungría. El diagrama esquemático de las etiquetas radiactivas se muestra en la Fig. 7A.

Etiquetado y control de calidad:

1. Anticuerpo marcado: PR215, dosis: 0.2 mg, concentración de anticuerpos: 2.0 mg/mL.

2. 124I radioactivo: producido por los ciclotrones de la unidad, con número de lote 2018-I-124-003, concentración radiactiva: 5*37 MBq/mL.

3. Columna de purificación: Columna PD-10 de U.S. Sigma.

4. Agente oxidante: Bromosuccinimida (abreviada como NBS), U.S. Sigma.

5. Solución tampón de fosfato (abreviada como PB): Solución tampón de fosfato 0.1 y 0.01 M a pH 7.2 y pH 7.4, preparada por nosotros mismos.

6. Albúmina de suero humano (HSA): contenido del 10% (diluida con 20% de HAS), producida por North China Pharmaceutical Factory.

Instrumentos experimentales: medidor de actividad: (Instituto Nacional de Metrología, China), medidor de contaminación de superficies (Suecia), caja de guantes marcada con yodo radiactivo (Shanghai Tongpu Co., Ltd.)

Etiquetado de solución de anticuerpos:

7. Tomar 0.2 mg de PR215 (con un volumen de 200 j L), luego agregar 0.3 mL de PB 0.1 M a pH 7.4.

8. Se extrajeron 0.5 mL de la solución radiactiva requerida de Na124l, con una radiactividad de 2.5 x 37 MBq, se añadió a la solución de anticuerpo a marcar y se añadieron inmediatamente 10 jg de NBS (equivalente a añadir 50 jg de NBS por mg de anticuerpo, preparado con PBS 0.01 M). Después de la reacción durante 60 segundos, se agregaron 0.3 mL de HSA al 10 % para terminar la reacción y luego se tomaron muestras para determinar la tasa de marcaje, se purificaron y separaron a través de una columna PD-10. El volumen de la columna superior: 1.5 mCi, producción: 2.0 mCi, actividad específica de radiactividad: 10 mCi/mg; concentración de radiactividad: 1 mCi/mL.

9. Determinación de la tasa de etiquetado: utilizando agente revelador acetona. Se utilizó ITLC-SG como fase estacionaria para realizar la expansión del enlace ascendente, con el marcador en el origen y el 124I libre al frente. El recuento de radiactividad se determinó mediante Radio-TLC y se calculó la tasa de marcaje.

En la Fig. 7B se muestra el análisis de Radio-TLC de los radiomarcadores antes y después de la purificación.

Imágenes de Micro-PET de 24I-PR215

La solución salina fisiológica de 124I-PR215 de 18.5 MBq se inyectó en animales modelo PDX de carcinoma de células escamosas de pulmón humano a través de las venas de la cola. A las 20 h, 60 h, 80 h y 120 h después de la inyección del fármaco, se utilizó la máquina de anestesia de animales Matrx VIP 3000 para anestesiar a los ratones insuflando isoflurano al 3.0 % con 300 mL/min de oxígeno. Los ratones se fijaron en posición boca abajo sobre la cama de exploración y se mantuvieron en estado de anestesia insuflando isoflurano al 1.0-1.5 % con 150 mL/mL de oxígeno, y luego se realizó una exploración por Micro-PET/CT. La ventana de energía de escaneo fue de 350-700 KeV, el campo de visión transversal fue de 80 mm y la adquisición en modo 3D duró 15 minutos. Una vez completada la adquisición, se utilizó la corrección de atenuación aleatoria y de dispersión para reconstruir las imágenes 3d con el algoritmo de Osem. Después de la reconstrucción, el procesamiento de la imagen se realizó mediante el software MMWKS SUPERARGUS.

Después de inyectar la solución de 124I-PR215 preparada en ratones normales a través de las venas de la cola, se realizaron experimentos para obtención de imágenes mediante Micro-PET/CT Los resultados se mostraron en la Fig. 7C. A las 20 h, 60 h, 80 h y 120 h después de la inyección de solución de 124I-PR215 a través de las venas de la cola, el enriquecimiento radiactivo se enriqueció significativamente desde la sangre del corazón hasta el tumor, mientras que la concentración de radiactividad en otros tejidos y órganos normales fue baja. Además, el 124I se metabolizó principalmente desde la vejiga. Las imágenes de Micro-PET demostraron que el 124I-PR215 preparado en este estudio se ajustó a los comportamientos metabólicos de los anticuerpos monoclonales de la serie de yodoin vivoy mostró muy buena absorción radiactiva en tumores de animales modelo.

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Un epítopo de IgG, en el que el epítopo de IgG es un dominio Ch1 de IgG no derivada de células B y tiene una modificación de ácido siálico N-glicosilado en el sitio Asn162 del dominio C<h>1 y en el que la secuencia de aminoácidos del epítopo de IgG consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.1, para uso en diagnósticoin vivoy/o para uso en un método para el tratamiento de un paciente que tiene tumores como una diana farmacológica, en el que los tumores son tumores epiteliales.

2. El epítopo de IgG para uso de la reivindicación 1, en el que los tumores son cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer intestinal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cistadenocarcinoma de glándulas salivales, cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de esófago.