KR20240010698A - 앵커단백질로 엔지니어링된 세포 유래 베지클 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물전달체로 활용 가능한 엔지니어링된 세포 유래 베지클 (Cell-derived vesicles, CDVs)로서, CDV의 고유의 특성에 부합하고, 생물학적 활성분자의 안정적인 도입을 매개할 수 있는 4종의 앵커단백질들을 발굴하여 완성된 것이다. 상기 앵커단백질들은 CDV 특이적으로 풍부하게 존재하는 막단백질로서, 본 앵커단백질을 포함하는 CDV는 생물학적 활성분자를 더욱 안정적으로 탑재할 수 있는 것이 확인되었다. 예컨대, 형광단백질을 이용하여 비교실험을 수행한 결과, 앵커단백질이 도입된 CDV는 앵커단백질이 없는 CDV에 비해 더욱 효과적으로 형광단백질이 탑재되는 것이 확인되었다. 또한, 암세포 표적 항체를 본 발명의 엔지니어링된 CDV에 탑재하였을 때 암세포 표적능이 증가할 뿐만 아니라 암세포에 더욱 효과적으로 흡수되는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명의 CDV는 앵커단백질로 엔지니어링된 바이오드론 (BioDrone)으로서 다양한 생물학적 활성분자를 안정적으로 탑재하고 원하는 표적으로의 전달이 가능한 바, 다양한 약물의 약물전달 및 치료 플랫폼으로 활용될 것으로 기대된다.

Description

앵커단백질로 엔지니어링된 세포 유래 베지클 및 이의 용도 {Cell-derived vesicles engineered with anchor proteins and the use thereof}

본 발명은 앵커단백질로 엔지니어링된 세포 유래 베지클 및 이의 약물 전달 용도 등에 관한 것이다.

대부분의 약물은 몸속에서 확산되어 병변이 없는 곳의 세포나 조직에 부작용을 유발할 수 있다. 이러한 부작용을 최소화하기 위해 약물전달시스템 (Drug delivery system, DDS)을 이용한 능동적 표적화 (active targeting) 연구가 활발히 이루어지고 있다. 약물전달체는 약물의 불필요한 분포를 억제하여 비표적 부위는 보호하고 표적 부위로만 약물을 전달하는 의약 기술이다. 핵산, 단백질, 또는 기타 저분자의 흡수, 분포 및 배출을 조절하여 부작용을 최소화하면서 목적하는 작용 부위에서 치료 효과를 증진하기 위해 다양한 약물 전달 기술이 활용된다. 효과적인 약물전달체는 신약 개발을 위한 비용 및 시간을 절감해줄 수 있으므로, 미국이나 일본 등에서는 80년대부터 신약 개발뿐만 아니라 약물전달 시스템의 개발에 전력을 쏟아왔다.

현재까지 리포좀 (liposome), 바이러스, 재조합 단백질, 양이온성 고분자, 및 다양한 나노물질들이 약물 전달을 위한 담체로 사용되어 왔다. 그러나, 양이온성 고분자 및 이들에 기반한 리포좀들은 세포 독성이 지나치게 높아 임상에 적용하기에는 부적합한 문제가 있다. 또는, 핵산이 직접 세포막을 안정적으로 통과할 수 있도록 핵산분자를 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되어 왔으나, 이와 같은 방법은 비용적, 시간적 소모가 크고, 복잡한 공정을 요구하므로 마찬가지로 임상 적용에는 부적합하다. 또한 그래핀양자점, 자성입자, 금속 나노입자와 같은 다양한 나노입자 기반의 약물전달 시스템이 개발되었으나, 이와 같은 입자들은 세포 독성이 높고 핵산분자와 같은 생체 고분자의 세포 내 도입에 불리한 구조를 가지며, 세포 내 전달 효율도 낮다는 단점이 있었다. 따라서, 핵산을 포함한 다양한 생물학적 물질을 세포 내로 효과적으로 전달할 뿐만 아니라, 생체에 적합하여 부작용 위험이 낮은 약물전달체 개발에 대한 요구가 계속해서 존재하는 실정이다.

세포외소포체 (extracellular vesicles)는 단백질 등의 세포 물질을 세포 사이에서 전달하여 세포간 커뮤니케이션을 매개하는 나노-규모의 막 (membrane) 구조체이다. 생체 친화적이며 세포간 신호전달 기능이 있는 세포외소포(extracellular vesicle, EV)가 DDS로 주목을 받고 있으며 소포체는 세포막 및 세포질 고유의 활성 물질을 보존할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 물질을 담지시킬 수 있으므로 다양한 생물학적 활성을 발휘할 수 있다. 특히, 세포외소포체 표면에 표적 조직-특이적 결합 능력을 가진 단백질을 발현시킨다면 생체 내 목표부위의 표적능을 극대화할 수 있으므로 차세대 약물전달체로 기대되고 있다.

그러나 천연 소포체는 세포에서 분비되는 양이 극히 적고, 수집 및 농축에 상당한 노력이 요구되기 때문에 상용화에 대한 한계점이 있다. 따라서, 다량 압출방식을 통해 간편하게 대량 수득할 수 있는 인공 세포 유래 베지클 (Cell derived vesicles, CDVs)이 활용된다. 세포 유래 베지클은 엑소좀 (exosome)이나 세포외소포와 같은 기타 소포들과는 구별되는 것으로서, 다양한 연구 및 산업 분야에서 엑소좀 및 엑토좀 등의 천연 세포외 소포체의 유사체로 활용되고 있다. 이후, Crude-CDV에서 불순물을 분리 및 정제하여 손쉽게 대량의 CDV를 수득할 수 있다. CDV의 막단백질 및 지질은, CDV의 모세포의 원형질막 (plasma membranes) 또는 세포소기관 (organelle mebranes)으로부터 유래하므로, 세포가 발현하던 생리학적 활성 분자 (단백질, 지질, 당 등)를 막 또는 막 내부에 포함한다. 또한, 세포 유래 베지클은 세포로부터 유래한 활성물질의 기능과 더불어 다양한 특성의 의약품을 추가로 봉입 내지 결합시킬 수 있으므로, 치료 효능을 극대화할 수 있다는 장점이 있다. 세포유래소포를 DDS로 개발하기 위해서는 표적화 리간드 (targeting ligand)와 치료용 약물을 안정적이고 효율적으로 도입할 수 있는 기술이 요구된다.

대한민국 등록특허공보 제10-0963831호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 연구한 결과 안출된 것으로서, 세포 유래 베지클 (CDV)의 고유의 특성에 부합하고, 생물학적 활성분자의 안정적인 탑재를 매개할 수 있는 앵커 막 단백질 (anchor membrane proteins; 앵커단백질로도 지칭됨)을 발굴하여 완성되었다. 본 발명에 따른 CDV 상기 앵커단백질들이 과발현된, 엔지니어링된 CDV로서, 과발현된 앵커단백질들을 통해 치료 약물 또는 표적형 리간드와 같은 다양한 분자를 안정적으로 탑재하고, 원하는 타겟에 상기 분자를 효과적으로 전달할 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포 (또는 세포주)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 유래 베지클의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클 (cell-derived vesicles, CDVs)로서, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 앵커단백질은 세포 유래 베지클의 막에 삽입되어 있을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 앵커단백질이 과발현된 세포로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 세포를 압출하여 수득되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 줄기세포, 면역세포, 혈구세포, 배아세포, 지방세포, 및 배아 신장세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앵커단백질은 상기 세포 유래 베지클이 기원한 세포 또는 상기 세포로부터 생산되는 엑소좀 (exosome)과 비교하여 상기 세포 유래 베지클에 더 높은 수준으로 존재할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앵커단백질은 글리코실화 되거나 되지 않을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 앵커단백질은 생물학적 활성분자와 결합될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성분자는 상기 세포 유래 베지클의 막 외부 또는 내부에 위치할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 바이러스, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 및 독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질은 항체, 항체 단편, 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 신호 (signaling) 단백질, 링커 단백질, 바이러스 단백질, 자연 단백질, 재조합 단백질, 단백질 복합체, 형광 단백질, 치료 단백질, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, 미니바디, 디아바디, 및 나노바디로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 활성분자는 표적형 리간드 (targeting ligands)이고, 상기 세포 유래 베지클은 상기 표적형 리간드의 표적을 발현하는 세포에 결합할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 (S1) 세포에 앵커단백질-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 및

(S2) 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 압출하여 세포 유래 베지클을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 세포 유래 베지클의 제조방법으로서,

상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 재조합 벡터의 상기 세포로의 도입은 상기 재조합 벡터를 포함하는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 단순포진바이러스, 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포는 1 내지 30 MOI (Multiplicity of infection)의 바이러스에 의해 감염되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 생물학적 활성분자-코딩 유전자를 더 포함하고, 상기 생물학적 활성분자는 상기 앵커단백질에 결합된 상태로 발현되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 상기 생물학적 활성분자 및 앵커단백질은 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포로서, 외인성의 앵커단백질-코딩 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포를 압출하여 수득되는 세포 유래 베지클을 제공한다.

또한, 본 발명은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물 (또는 약물전달체)로서, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약물 전달용 조성물 (또는 약물전달체)을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 약물 전달을 위한, 상기 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클의 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 약물 전달용 조성물 (또는 약물전달체)의 제조를 위한, 상기 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클의 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 이를 필요로 하는 개체, 세포, 조직, 및/또는 기관에 투여하는 단계를 포함하는, 개체, 세포, 조직, 및/또는 기관으로의 약물 전달 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 질병의 예방 또는 치료용 약제가 탑재된 것이고, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 질병은 암이고, 상기 약제는 항암제일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 질병은 뇌질환이고, 상기 약제는 뇌질환 치료제일 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 질병의 예방 또는 치료를 위한, 상기 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클의 용도로서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 질병의 예방 또는 치료용 약제가 탑재된 것인 세포 유래 베지클의 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 질병의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클의 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 질병의 예방 또는 치료방법으로서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 질병의 예방 또는 치료용 약제가 탑재된 것인, 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 약물은 항체 또는 이의 단편, 치료 단백질, 및 치료 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 약물은 상기 세포 유래 베지클의 앵커단백질에 결합되거나; 또는 상기 세포 유래 베지클의 내부 또는 막에 탑재된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 유래 베지클은 표적형 리간드를 더 포함하는 것이고, 상기 표적형 리간드는 상기 앵커단백질에 결합되어 상기 세포 유래 베지클의 막 외부에 위치할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포 유래 베지클은 상기 표적형 리간드의 표적을 발현하는 세포에 결합할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암제는 앵커단백질에 결합될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 약물전달체로 활용 가능한 엔지니어링된 세포 유래 베지클 (Cell-derived vesicles, CDVs)로서, CDV의 고유의 특성에 부합하고, 생물학적 활성분자의 안정적인 도입을 매개할 수 있는 4종의 앵커단백질들을 발굴하여 완성된 것이다. 상기 앵커단백질들은 CDV 특이적으로 풍부하게 존재하는 막단백질로서, 본 앵커단백질을 포함하는 CDV는 생물학적 활성분자를 더욱 안정적으로 탑재할 수 있는 것이 확인되었다. 예컨대, 형광단백질을 이용하여 비교실험을 수행한 결과, 앵커단백질이 도입된 CDV는 앵커단백질이 없는 CDV에 비해 더욱 효과적으로 형광단백질이 탑재되는 것이 확인되었다. 또한, 암세포 표적 항체를 본 발명의 엔지니어링된 CDV에 탑재하였을 때 암세포 표적능이 증가할 뿐만 아니라 암세포에 더욱 효과적으로 흡수되는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명의 CDV는 앵커단백질로 엔지니어링된 바이오드론 (BioDrone)으로서 다양한 생물학적 활성분자를 안정적으로 탑재하고 원하는 표적으로의 전달이 가능한 바, 다양한 약물의 약물전달 및 치료 플랫폼으로 활용될 것으로 기대된다.

도 1a는 세포 또는 엑소좀 대비 세포 유래 베지클 (Cell-derived vesicles, CDVs)에 풍부하게 존재하는 것으로 확인된 후보 앵커단백질들을 정리한 표이다.
도 1b는 후보 앵커단백질들의 발현을 위한 렌티바이러스 백터의 유전자 개략도이다.
도 2a 및 2b는 HEK293 세포에 후보 앵커단백질들의 발현용 벡터를 형질주입 (transfection) 한 후, 형질주입 효율 (도 2a) 및 벡터에 포함된 EGFP 유전자의 발현 수준 (도 2b)을 유세포분석법으로 확인한 결과이다.
도 3은 최적의 형질전환 조건을 확인하기 위해, 부착형의 HEK293 세포 (상단) 또는 부유형의 HEK293 세포 (하단)에 후보 앵커단백질 (GFP, PTGFRN, 및 RAB7A)을 발현하는 바이러스 입자를 MOI를 달리하여 처리한 후, 다양한 조건에서 GFP 양성 세포 및 GFP 형광 강도 등을 유세포분석으로 검출하여 형질전환 효율을 비교한 결과이다.
도 4a 및 4b는 후보 앵커단백질들을 발현하는 세포주 구축을 위해, 세포에 최적 조건(MOI5)으로 렌티바이러스를 형질전환시킨 후 형질전환 효율을 확인한 결과이다. 도 4a는 형질전환 24시간 후 GFP 형광을 검출한 결과를, 도 4b는 유세포분석으로 형질도입 효율 (좌측 그래프) 및 GFP 강도 (우측 그래프)를 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 융합단백질을 높은 수준으로 발현하는 세포들을 선별하기 위해, 유세포분석을 이용하여 GFP 발현 세포를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6a 내지 6d는 렌티바이러스를 이용하여 구축된 세포주에서 각 융합단백질 (후보 앵커단백질)들의 과발현을 확인한 결과이다. 형질전환 효율 (도 6a) 및 GFP 강도 (도 6b)는 세포 분류 (cell sorting) 후 유세포분석으로 확인하였고, GFP ELISA를 이용하여 GFP를 정량했다 (도 6c). 후보 앵커단백질들의 발현은 각 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴블롯을 통해 평가했다 (도 6d).
도 7a 내지 7c는 후보 앵커단백질을 발현하는 세포에서 세포 유래 베지클 (앵커-CDV)을 수득한 후, CDV에 존재하는 후보 앵커단백질들을 확인한 결과이다. 도 7a는 GFP 양성 CDV의 nanoparticle flow cytometer 측정 결과로부터 확보된 히스토그램을, 도 7b 및 7c는 각각 앵커-GFP 융합단백질을 발현하는 CDV의 GFP 신호 강도 및 정량 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 바이오드론 플랫폼을 위해 선별된 앵커단백질을 포함하는 CDV를 나타낸 그림이다. 도 8a는 HEK2593 세포에서 선별된 앵커단백질 및 이들의 GFP 형광을 나타낸 개략도이다. 도 8b는 nanoparticle flow cytometer 및 ELISA를 이용하여 앵커단백질들을 평가한 결과를 나타낸다. GFP(+) 입자 및 CDV 당 GFP 단백질의 수를 표에 나타냈다.
도 9는 멤브래인 필터 또는 깊이 필터를 이용하여 세포로부터 앵커-CDV을 압출하는 과정을 나타낸 흐름도 (상단), 및 2가지 앵커단백질 과발현 세포 (HEK-BSG 및 HEK-LAMP1)의 CDV 압출 조건을 정리한 표 (하단)이다.
도 10a 내지 10c는 바이오드론 앵커-CDV의 압출방법에 따른 특성을 비교한 결과를 나타낸다. 도 10a는 GFP(+) 입자의 히스토그램을, 도 10b는 멤브래인 필터 압출 또는 깊이 필터로 압출된 앵커-CDV 중 GFP(+) 입자의 수 및 GFP 강도를, 도 10c는 웨스턴블롯을 이용한 앵커단백질 검출 결과를 나타낸다.
도 11은 프로테아제 절단 분석을 통한 앵커단백질의 토폴로지 분석 결과를 나타낸다. 바이오드론 앵커-CDV에 다양한 농도의 Proteinase K (PK)를 처리하고, 웨스턴블롯을 통해 각 태그 단백질을 검출했다. HRP 접합된 항-Flag 또는 항-HA를 이용하여 앵커단백질 N-말단의 3x Flag tag 및 C-말단의 HA tag를 각각 검출했다.
도 12a는 앵커단백질-trastuzumab scFv (scTTZ) 융합단백질을 발현하는 재조합 벡터의 유전자 개열 지도이다.
도 12b는 앵커단백질-scTTZ 융합단백질의 대표예로서, LAMP1-scTTZ 융합단백질의 구조를 나타낸 그림이다. 융합단백질의 검출을 위해 C-말단에 miRFPnano3 및 nanoLuciferase를 첨가하였다.
도 13a 내지 13c는 렌티바이러스를 이용하여 앵커단백질-scTTZ 융합단백질을 발현하는 형질전환 세포주를 제작한 후, 상기 융합단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 13a는 형질전환 24시간 후 세포의 miRFPnano3 형광을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다. puromycin selection으로부터 3주 후 miRFPnano3 형광 강도 (도 13b) 및 루시퍼레이즈 활성 (도 13c)을 측정하여 융합단백질의 발현율이 90% 이상임을 확인하였다.
도 14는 Expi293F에서 발현된 scTTZ 융합 단백질의 웨스턴블롯 분석 결과를 나타낸다. 융합 단백질은 각 앵커 (BSG, ATP1B3, LAMP1, LAMP2)를 표적으로 하는 항체, 항-Flag 항체, 및 단백질 L을 사용하여 검출되었다.
도 15a 및 15b는 앵커단백질-trastuzumab scFv (scTTZ) 융합단백질의 타겟 (HER2) 결합 여부를 확인한 결과를 나타낸다. 도 15a는 상기 융합탄백질과 FITC-표지 HER2 재조합 단백질 (HER2-FITC)의 결합을 나타낸 그림이다. 도 15b는 유세포분석을 이용하여 앵커단백질-scTTZ 발현 세포에 결합하는 HER2-FITC 검출하고, FITC의 상대 평균 형광 강도 (mean fluorescence instensity, MFI)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 ssTTZ가 CDV로 안정적으로 도입되는지 확인하기 위해, 전체 CDV 입자 중 RFP+ 소포의 비율을 평가한 결과를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 scTTZ가 도입된 LAMP1-CDV의 특성을 분석한 결과를 나타낸다 (도 17a, 웨스턴블롯 결과; 도 17b, RFP+ 소포 대비 HER2-FITC와 결합된 소포의 비율 분석 결과).
도 18은 앵커단백질 LAMP1의 글리코실화 (glycosylation) 여부에 따른 영향을 확인하기 위해, scTTZ-gLAMP1-CDV 및 scTTZ-LAMP1-CDV의 HER2-FITC 결합을 유세포분석으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 19는 암세포별 HER2 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 20은 scTTZ가 도입된 앵커-CDV의 HER2 발현 세포에 대한 결합력을 확인하기 위해, CT26 (HER2 음성 세포주) 또는 CT26/hHER2 (인간 HER2 유전자 발현 세포주)에 scTTZ가 도입되거나 도입되지 않은 gLAMP1-CDV를 처리한 후 유세포분석으로 CDV의 세포 결합 정도를 측정한 결과이다.
도 21a 내지 21c는 HER2 고발현 세포주 (BT-474, SK-BR-3) 및 HER2 음성 세포주 (MDA-MB-231)에 scTTZ가 도입되거나 도입되지 않은 gLAMP1-CDV를 처리한 후 CDV의 세포 결합 정도를 비교한 결과이다 (도 21a, CFSE-표지된 CDV 결합에 의한 형광 피크 이동의 히스토그램; 도 21b 각 세포주에 대한 CDV 결합의 정량 결과; 도 21c, HER2 고발현 세포주에서 형광 측정을 통해 확인한 CDV 결합 정도).
도 22a 및 22b는 scTTZ가 도입된 앵커-CDV의 HER2 발현 세포로의 흡수 정도를 시간 경과에 따라 확인한 결과 (도 22a) 및 세포로 흡수된 gLAMP1-CDV 대비 scTTZ-gLAMP1-CDV의 배수 변화를 확인한 결과 (도 22b)를 나타낸다.
도 23은 cetuximab이 CDV로 안정적으로 도입되었는지 확인하기 위해, 전체 CDV 입자 중 RFP+ 소포의 비율을 평가한 결과를 나타낸다.
도 24는 형광단백질인 GFP를 본 발명의 앵커단백질을 이용하거나 이용하지 않고 CDV에 도입시킨 후 형광 신호 분석을 통해 CDV로의 GFP 도입율을 비교한 결과이다.

본 발명은 약물전달체로 활용 가능한 엔지니어링된 세포 유래 베지클 (Cell-derived vesicles, CDVs)로서, CDV의 고유의 특성에 부합하고, 생물학적 활성분자의 안정적인 도입을 매개할 수 있는 4종의 앵커단백질들을 발굴하여 완성된 것이다. 상기 앵커단백질들은 CDV 특이적으로 풍부하게 존재하는 막단백질로서, 본 앵커단백질을 포함하는 CDV는 일반적인 CDV와 비교하여 생물학적 활성분자를 더욱 안정적으로 탑재할 수 있는 것이 확인되었다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 CDV의 단백체 분석을 통해 세포 또는 엑소좀 대비 CDV에 풍부하게 존재하는 앵커 막단백질 후보 12종을 선별하고, 이들 후보 앵커단백질을 과발현하는 세포주를 구축하고 이를 압출하여 상기 앵커단백질을 발현하는 CDV를 수득하였다. 각 CDV에서 앵커단백질의 발현 정도 및 분포 등을 비교하여 CDV에 가장 효과적으로 도입되는 단백질 4종 (BSG, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2)을 선별하였으며, 선정된 앵커단백질들은 CDV에서 세포에서와 마찬가지로 토폴로지가 유지되며, CDV의 압출방법과 무관하게 특성을 유지하는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 4종 단백질은 CDV 입자 상에 안정적으로 존재하는 막단백질로서 표적화 리간드를 융합시키거나, 치료활성 카고 (therapeutic cargo)를 도입하는 등의 CDV 변형에 유용히 활용할 수 있는 것으로 확인된 바, 본 발명의 CDV의 엔지니어링을 위한 앵커단백질로 선정하였다 (실시예 1).

이에, 상기 선별된 앵커단백질을 발현하는 CDV가 실제로 생물학적 활성분자의 전달을 위한 바이오드론으로 활용 가능한지 확인하였다. HER2 단백질에 대한 항체 trastuzumab의 scFv 부위를 표적형 리간드로 사용하였으며, 상기 표적형 리간드와 앵커단백질의 융합단백질을 과발현하는 세포주를 제작하고 이를 압출하여 HER2 표적형 CDV를 제작하였다 (HER2-앵커 CDV). CDV 분석 결과 HER2 표적 scFv가 안정적으로 CDV에 도입된 것을 확인하였으며, 상기 CDV는 표면에 탑재된 scFv를 통해 HER2 발현 암세포를 효과적으로 표적화하고, 결합하는 것이 확인되었다 (실시예 2).

또한, 형광단백질인 GFP가 탑재된 CDV를 제조한 결과, 본 발명의 앵커단백질이 도입된 CDV는 앵커단백질이 도입되지 않은 CDV 대비 GFP를 더욱 효과적으로 탑재하는 것이 확인된 바, 본 발명의 앵커단백질을 이용하면 활성성분 또는 카고를 CDV에 더 높은 효율로 탑재할 수 있음을 확인하였다 (실시예 3).

이와 같이, 본 발명의 CDV는 앵커단백질로 엔지니어링된 바이오드론 (BioDrone)으로서 다양한 생물학적 활성분자를 안정적으로 탑재하고 원하는 표적으로의 전달이 가능한 바, 다양한 약물의 약물전달 및 치료 플랫폼으로 활용될 것으로 기대된다.

이하, 본 발명에 대해 구체적으로 서술한다.

본 발명은 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클 (cell-derived vesicles, CDVs)을 제공하는 것을 주요 목적으로 한다.

본 발명에 있어서, “세포 유래 베지클 (Cell derived vesicles, CDVs)”이란 유핵세포에서 인위적으로 제조된 베지클을 지칭한다. CDV는 거의 모든 종류의 세포에서 세포막으로부터 유리되어 생성될 수 있고, 세포막의 구조인 이중 인지질 (phospholipid) 막 형태를 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 세포 유래 베지클은 세포로부터 자연적으로 분비되는 베지클, 예를 들어 엑소좀 (exosome)과는 구별된다. 본 명세서 전반에 있어서, 용어 “베지클 (vesicles; 또는 “소포”)”은 유래한 세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질, 핵산 및 세포 성분 등을 가지고 있으며, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 세포 유래 베지클은 마이크로미터 수준의 크기를 가진다. 예를 들어 CDV의 직경은 0.2 ㎛ 미만일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 CDV의 직경은 10 내지 100 nm, 20 내지 100 nm, 50 내지 100 nm, 50 내지 300 nm, 50 내지 400 nm, 50 내지 500 nm, 50 내지 250 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 180 nm, 50 내지 160 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 100 nm, 100 내지 300 nm, 100 내지 250 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 180 nm, 120 내지 300 nm, 150 내지 300 nm, 또는 130 내지 170 nm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 CDV는 나노미터 내지 마이크로미터 수준의 크기를 가질 수 있다. 예컨대, 상기 CDV의 직경은 50 내지 500 nm, 50 내지 400 nm, 50 내지 300 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 100 내지 500 nm, 100 내지 400 nm, 100 내지 300 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 150 nm, 130 내지 500 nm, 130 내지 400 nm, 130 내지 300 nm, 또는 130 내지 200 nm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 CDV는 표면 전하가 양전하일 수 있다. 예컨대, 상기 CDV의 제타 전위는 -20 내지 +50 mV, -20 내지 +30 mV, -20 내지 +20 mV, -20 내지 +10 mV, -20 내지 +0 mV, -20 내지 -5 mV, -20 내지 -10 mV, -15 내지 -5 mV, -15 내지 -10 mV, -13 내지 -10 mV, -12 내지 -10 mV, +10 mV 내지 +50 mV, +20 mV 내지 +50 mV, +30 mV 내지 +50 mV, 또는 +40 mV 내지 +50 mV 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 CDV는 유핵세포를 포함하는 현탁액을 압출, 초음파 분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 화학 물질 처리, 기계적 분해 및 외부적으로 세포에 힘을 가한 물리적 자극의 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 CDV는 세포를 포함하는 현탁액을 압출기를 사용하여 압출하는 방법으로 수득될 수 있다. CDV를 제조하기 위하여 가하는 압출기의 압출력은 5 내지 200 psi, 10 내지 150 psi, 10 내지 100 psi, 10 내지 50 psi, 10 내지 40 psi, 또는 50 내지 100 psi일 수 있다.

또한, 세포 유래 베지클은 세포를 포함하는 시료를 미세공극에 압출하는 단계 이전에 세포의 핵을 제거하는 단계를 먼저 수행할 수 있다. 상기 세포 핵은 원심분리를 통해 제거할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 베지클은 세포를 포함하는 시료를 미세공극에 압출하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 미세공극의 크기가 큰 것으로부터 미세공극의 크기가 작은 것을 사용하여 세포를 순차적으로 압출함으로써 수득할 수 있다. 상기 미세공극의 직경은 0.01 내지 100 μm, 0.01 내지 80 μm, 0.01 내지 60 μm, 0.01 내지 40 μm, 0.01 내지 20 μm, 0.01 내지 15 μm, 0.01 내지 10 μm, 0.01 내지 7 μm, 0.01 내지 3 μm, 0.01 내지 1 μm, 0.01 내지 0.5 μm, 0.01 내지 0.1 μm, 0.1 내지 20 μm, 또는 0.1 내지 0.5 μm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 순차적인 압출은 공극 직경이 5 내지 20 μm인 필터, 2 내지 7 μm인 필터, 0.7 내지 3 μm인 필터, 및 0.1 내지 0.5 μm인 필터를 순차적으로 이용하여 이루어질 수 있다. 상기 미세공극의 크기는 사용하는 세포의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 상기 과정을 통해 수득한 CDV는 추가 정제 과정을 거칠 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 베지클은 세포를 포함하는 시료를 깊이필터 (depth filter)에 통과시켜 압출하는 단계를 포함하는 제조방법을 통해서도 제조될 수 있다. 상기 깊이필터의 retention rate (유지율)은 0.1 내지 1 μm, 0.1 내지 0.9 μm, 0.1 내지 0.8 μm, 0.1 내지 0.7 μm, 0.1 내지 0.65 μm, 0.2 내지 1 μm, 0.4 내지 1 μm, 0.5 내지 1 μm, 0.6 내지 1 μm, 0.2 내지 0.8 μm, 0.4 내지 0.8 μm, 0.4 내지 0.7 μm, 0.5 내지 0.7 μm, 또는 0.6 내지 0.7 μm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 깊이필터의 압출력은 5 내지 200 psi, 10 내지 150 psi, 10 내지 100 psi, 10 내지 50 psi, 10 내지 40 psi, 또는 50 내지 100 psi 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 세포 유래 베지클은 세포의 압출을 위해 깊이필터를 장착한 어셈블리에 세포를 포함하는 현탁액을 투입한 후, 압력을 가하여 압출함으로써 수득될 수 있다. 상기 압력은 질소 (N₂) 가스의 압력일 수 있다. 예컨대, 세포를 깊이필터에 통과시켜 CDV를 제조하는 경우, 질소가스 압력을 0.1 내지 5 bar, 0.1 내지 4 bar, 0.1 내지 3 bar, 0.1 내지 2.5 bar, 0.3 내지 3 bar, 0.1 내지 2.5 bar, 또는 1 내지 2.5 bar의 압력으로 가하여 상기 CDV를 압출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 과정을 통해 수득한 CDV는 추가 정제 과정을 거칠 수 있다.

상기 정제 과정은, 본 발명의 CDV 외에 기타 물질 (본 발명의 CDV 보다 작은 크기의 베지클 혹은 단백질, 핵산 등 기타 오염물질)을 제거하고 목적하는 CDV만을 수득하기 위한 것으로서, 바람직하게는 세포 유래 베지클 및 리포좀 혼합 용액의 전체 부피 대비 1 내지 5배, 1 내지 4배, 또는 1 내지 3배 부피의 완충액을 첨가하여 이루어질 수 있다.

구체적으로, 상기 압출 단계를 거쳐 생성된 CDV를 접선 유동 여과 (tangential flow filtration, TFF) 과정을 통해 정제할 수 있다. 이 때 사용되는 멤브레인은 800 kDa, 750 kDa, 700 kDa, 650 kDa, 600 kDa, 500 kDa, 450 kDa, 400 kDa, 350 kDa, 또는 300 kDa 이상의 컷오프(cut off)를 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 접선 유동 여과 과정에서 CDV 현탁액의 농도를 5배 이상으로 농축시키는 농축 단계 및 버퍼 교환 단계가 수행된다. 상기 과정을 통해 CDV는 농축되고 불순물은 제거된다.

상기 접선 유동 여과 과정을 CDV를 수득한 후, 추가 정제를 위해 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 과정을 더 수행할 수 있다. 이 때 회수 범위가 약 35 내지 350 nm 또는 70 내지 1,000 nm인 컬럼을 사용하는 것이 바람직하며, CDV는 비교적 크기가 큰 입자에 해당하므로, 상기 컬럼을 통해 용출되는 분획을 수집함으로써 CDV를 수득할 수 있다. 이와 같은 정제과정을 통해, CDV보다 작은 크기의 베지클 및 기타 단백질과 같은 불순물을 제거하고, 고순도의 균일한 나노 사이즈의 세포 유래 베지클을 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, “세포를 포함하는 시료”는 유핵세포 또는 이의 형질전환된 세포를 포함하는 시료일 수 있으며, 상기 세포의 배양액, 현탁액, 희석액 등을 모두 포함하는 개념이다. 여기서 세포는 베지클의 제조가 가능한 세포라면 제한 없이 포함하는 개념이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 “세포”는 세포 유래 베지클의 분리가 가능한 세포라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포를 모두 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 유핵세포이다. 또한, 상기 세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물, 식물 유래일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세포 유래 베지클을 수득할 수 있는 세포의 종류에는 특별히 제한이 없으나, 예를 들면, 상기 세포는 줄기세포, 면역세포, 혈구세포, (인간) 배아세포, 지방세포 및/또는 배아 신장세포일 수 있다. 더 구체적인 예로, 본 발명에 따른 세포는 줄기세포, 신장세포, 배아 신장세포, 핵세포 (HEK293), 암세포, 선포세포, 근상피세포, 적혈구, 면역세포, 단핵구, 수지상 세포, 자연살해 세포, T 세포, B 세포, 대식세포, 내피세포, 표피세포, 신경세포, 신경아교세포, 성상세포, 근육세포, 및 혈소판 등으로부터 상기 세포 유래 베지클을 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포는 다양한 종류의 면역세포, 종양세포, 줄기세포, 선포세포, 근상피세포 또는 혈소판일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아줄기세포 및 침샘 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 줄기세포는 지방세포 유래의 중간엽 줄기세포 또는 제대 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “앵커단백질 (anchor protein)”이란 CDV의 막에 위치하며, 생물학적 활성분자의 CDV에의 탑재를 매개하는 막단백질 (membrane protein)을 의미한다. 상기 앵커단백질은 CDV 막에 위치하여 생물학적 활성분자와의 결합을 통해 상기 분자를 CDV에 탑재시킨다. 상기 생물학적 활성분자는 앵커단백질을 발현하는 CDV의 제조 후 상기 앵커단백질에 결합할 수 있고, 혹은 앵커단백질과 결합한 형태 (즉, 융합단백질)로 세포에서 발현되어 CDV에 탑재될 수 있다. 본 발명의 앵커단백질은 CDV의 모세포로부터 유래되는 것으로서, 상기 세포의 원형질막 (plasma membrane)의 막단백질일 수 있으며, 리소좀 (lysosome)과 같은 세포소기관의 막으로부터 유래한 막단백질일 수 있다. 본 발명의 앵커단백질은 막관통 단백질로서, 세포외 도메인 (exctracellular domain), 막관통 도메인 (transmembrane domain), 및 세포내 도메인 (cytoplasmic domain)을 포함하는 구조일 수 있다. 따라서, 본 발명의 앵커단백질은 CDV의 막에 삽입 (또는 관통)된 상태로 존재하며, 막 외부에 위치하는 세포외 도메인에는 기타 생물학적 활성분자가 결합할 수 있다. 또한, 막 내부에 위치하는 세포내 도메인에는 상기 앵커단백질의 검출을 위한 기타 표지 단백질 (형광단백질, 태그 등) 등이 결합될 수 있다. 본 명세서에서, 앵커단백질을 포함하는 CDV는 앵커-CDV, 바이오드론 CDV 등으로 지칭될 수 있다. 본 발명에 있어서, “앵커단백질이 과발현된 CDV”란 유전자 엔지니어링을 통해 과량의 앵커단백질을 포함하게된 CDV를 의미하는 것으로서, 동일한 모세포로부터 자연적으로 유래하는 원래의 CDV와 비교하여 더 높은 수준의 앵커단백질을 포함하는, 엔지니어링된 CDV를 지칭한다. 상기 앵커단백질은 CDV에 직접 과발현될 수도 있으나, 바람직하게는 앵커단백질로 엔지니어링된 모세포로부터 과량의 앵커단백질이 CDV에 전달됨으로써 CDV 또한 앵커단백질로 엔지니어링될 수 있다. 본 발명에 있어서, 엔지니어링이란 외인성의 유전자가 도입되어 발현되거나, 외인성의 단백질이 도입되는 것을 의미한다.

본 발명의 앵커단백질은 CDV 특이적인 단백질이다. 예컨대, 상기 앵커단백질은 세포나 기타 세포 유래 소기관 또는 세포 유래 소포체에 비해 CDV에 특히 높은 수준으로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 앵커단백질은 CDV가 기원한 모세포 또는 상기 모세포로부터 생산되는 엑소좀 (exosome) 또는 세포외소포 (extracellular vesicles)와 비교하여 CDV에 더 높은 수준으로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 앵커단백질은 모세포에서 자연적으로 존재하여 CDV로 전달된 천연 단백질일 수 있고, 혹은 모세포에 도입된 외인성 유전자로부터 발현되어 CDV로 전달된 외인성 단백질일 수 있다. 또한, CDV에 도입된 앵커단백질은 글리코실화 (glycosylation) 되거나 되지 않은 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 앵커단백질은 Basigin (BSG), ATP1B3 (ATPase Na+/K+ transporting subunit beta 3), LAMP1 (Lysosomal-associated membrane glycoprotein 1), 및 LAMP2 (Lysosomal-associated membrane glycoprotein 2)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다. Basigin은 cyclophilin 단백질 등을 포함한 다양한 리간드와 결합할 수 있는 원형질막의 막관통 당단백질이다. Basigin에 대한 일반적인 정보는 유전자 데이터베이스인 NCBI에서 Gene ID 682로 확인할 수 있다. ATP1B3은 Na⁺/K⁺ 및 H⁺/K⁺ ATPases beta chain proteins의 하위 분류로, 막을 경계로 Na 및 K 이온의 전기화학적 분배를 적절히 유지하는 막단백질로서, 삼투압 조절, 유/무기 분자의 수송, 신경의 전기적 흥분에 필수적이다. ATP1B3에 대한 일반적인 정보는 NCBI에서 Gene ID 483으로 확인할 수 있다. LAMP1 및 LAMP2는 리소좀의 막에 존재하는 당단백질로, 리소좀의 생합성, 오토파지, 콜레스테롤 항상성 등에 관여한다. LAMP1 및 LAMP2에 대한 일반적인 정보는 각각 NCBI에서 Gene ID 3916 및 Gene ID 3920으로 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 앵커단백질 ATP1B3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또는 상기 ATP1B3 단백질은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되거나 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 앵커단백질 BSG는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또는 상기 BSG 단백질은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되거나 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 앵커단백질 LAMP1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또는 상기 LAMP1 단백질은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되거나 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 앵커단백질 LAMP2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또는 상기 LAMP2 단백질은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자에 의해 코딩되거나 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 본 명세서에서 특정 서열로 표시된 폴리펩티드 (혹은 핵산 분자)는 해당 서열뿐만 아니라 이의 생물학적 균등물을 포함할 수 있다. 즉, 폴리펩티드 (핵산 분자)의 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 일 양상의 폴리펩티드 (또는 핵산 분자)는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 구체적으로, 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)을 포함하는 폴리펩티드 (핵산 분자)는 해당 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)에만 제한되지 않으며, 상기 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)로 이루어진 폴리펩티드 분자 (핵산 분자)란, 이를 구성하는 폴리펩티드 분자 (핵산 분자)의 작용성 등가물, 예를 들어, 폴리펩티드 분자 (핵산 분자)의 일부 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 해당 폴리펩티드 (핵산 분자)와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 본 발명에 개시된 폴리펩티드 (핵산 분자)는 특정 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열 (뉴클레오티드 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 (핵산 분자)를 포함한다. 폴리펩티드 (핵산 분자)에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리펩티드 서열 (뉴클레오티드 서열)의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 앵커단백질은 생물학적 활성분자가 결합될 수 있으며, 이를 통해 상기 생물학적 활성분자를 CDV에 탑재시킬 수 있다.

본 명세서에 있어서, “생물학적 활성분자”란 생물학적 또는 약학적 활성을 가지는 물질들을 총칭하며, 이는 특정 단백질을 표적화 (targeting)하는 물질 (예를 들어, 항체 또는 리간드 등)이나, 세포 내 (세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것, 또는 세포로 운반되어 작용하는 것으로서 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질 등을 의미한다. 본 발명의 생물학적 활성분자는 앵커단백질과 결합하여 CDV에 탑재되어서도 고유의 생물학적 활성을 유지하는 것을 특징으로 한다. 에컨대, 상기 생물학적 활성분자는 표적형 리간드 (targeting ligands) 또는 치료학적 카고 (therapeutic cargos)일 수 있다. 본 발명에서, 표적형 리간드란 특정 물질 (예를 들어, 항원)을 특이적으로 인식하고 표적화할 수 있는 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 표적형 리간드는 특정 항원 등을 표적화하여 상기 리간드가 탑재된 CDV가 상기 특정 항원 등을 발현하는 세포에 결합하도록 유도할 수 있다. 본 발명에서, 치료학적 카고란 질병에 대한 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 있는 물질을 지칭한다. 상기 물질의 종류에는 제한이 없다.

본 발명에 있어서, 상기 생물학적 활성분자는 상기 앵커단백질과의 결합을 통해 CDV에 탑재되며, 이 때 상기 생물학적 활성분자는 CDV의 막 외부 (즉, CDV의 외부), CDV의 막 내 (즉, 지질이중층 내부), 또는 CDV의 내부에 위치할 수 있다. 즉, 상기 생물학적 활성분자는 상기 CDV의 막 외부 또는 내부에 위치할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 생물학적 활성분자는 앵커단백질의 세포외 도메인과 결합하여 CDV의 막 외부에 위치할 수 있다.

상기 생물학적 활성분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 바이러스, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 독소, 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 생물학적 활성분자는 단백질, 당단백질, 또는 펩타이드 등이다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항체 단편, 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 신호 (signaling) 단백질, 링커 단백질, 바이러스 단백질, 자연 단백질, 재조합 단백질, 단백질 복합체, 형광 단백질, 치료 단백질, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 핵산의 비-제한적인 예시에는 DNA, RNA, ASO (Antisense oligonucleotide), 마이크로RNA (microRNA; miRNA), 작은 간섭 RNA (small interfering RNA; siRNA), 앱타머 (aptamer), LNA (locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 및 모폴리노 (morpholino) 등이 포함된다.

상기 화합물의 비-제한적인 예시에는 치료 약물, 독성 화합물, 및 화학적 화합물 등이 포함된다. 상기 "약물"은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다. 즉, 본 발명에 따른 세포 투과성 펩타이드는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약물의 전달체로 사용될 수 있다.

이 밖에도, 본 발명의 생물학적 활성 분자에는 콜레스테롤, 화학요법제 (chemotherapeutics), 비타민, 보조인자 (co-factors), 2,5-A 키메라 (chimeras), 알로자임 (allozymes), 앱타머 (aptamers), 폴리아민 (polyamines), 폴리아미드 (polyamides), 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에테르와 같은 중합체의 약물동태학 (pharmacokinetics) 및/또는 약동학 (pharmacodynamics)을 조절할 수 있는 분자 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 생물학적 활성분자는 항체 또는 이의 단편이다. 본 발명에 있어서, "항체 (antibody)"란 면역학적으로 특정 항원 (에피토프)과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 다클론 항체 (polyclonal antibody), 단클론 항체 (monoclonal antibody) 및 이의 기능적인 단편 (fragment)를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 (예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체 (예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함할 수 있다. 상기 항체는 구성 중 중쇄 (heavy chain) 및/또는 경쇄 (light chain)의 가변 영역 (variable region)을 포함한다 (VH, 중쇄 가변영역; VL, 경쇄 가변영역). 상기 가변 영역은 1차 구조로서 항체 분자의 항원 결합 부위를 형성하는 부분을 포함하며, 본 발명의 항체는 상기 가변 영역을 포함하는 일부 단편으로 구성될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 사이에는 링커가 위치할 수 있다. 상기 “링커 (Linker)”는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 이들의 본래 항원 결합 특성을 손상하지 않으면서, 이들을 서로 연결시키는 폴리펩타이드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, 미니바디, 디아바디, 및 나노바디로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 항체의 "단편 (fragments)"이란 항체의 항원 결합 기능을 보유하고 있는 (기능성) 단편을 의미하며, 바람직하게는 상기 항체의 항원 결합 단편이다. 상기 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 뿐만 아니라 미니바디, 디아바디, 나노바디, 또는 이들의 단편 등을 포함하는 의미로 사용된다. 상기 단편들의 정의는 당업계에 잘 알려져 있다.

보다 구체적으로, "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 서열로 이루어진 링커 (linker)로 연결한 단백질을 의미한다. 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 (chain) 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.

상기 “나노바디 (nanobody)”는 중쇄만으로 구성된 항체 가변 도메인으로서, VHH 도메인으로도 지칭된다. 나노바디는 기존 항체 대비 작은 크기 및 안정된 구조를 가져 조직 침투성 및 항원 접근성이 향상될 뿐만 아니라, Fc에 의한 면역 부작용이 최소화된 이점이 있다.

항체는 가변영역의 서열 변화에 따라 항원 특이성이 나타나게 된다. 항원 결합 부위의 가변영역은 가변성이 적은 구조 영역 (Framework region: FR)과 가변성이 큰 상보성 결정 영역 (Complementarity determining region: CDR)으로 나눠지고, 중쇄와 경쇄 모두 CDR1, 2, 및 3으로 나뉘어지는 3개의 CDR 부위와, 4개의 FR 부위를 가진다. 상기 상보성 결정 영역은 항체의 가변영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위이다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 명명되고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 발명에 따른 CDV는 2종 이상의 생물학적 활성분자를 포함할 수 있다. 각 생물학적 활성분자는 동일한 종류이거나, 서로 다른 종류일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 CDV는 생물학적 활성분자로서 세포, 조직, 또는 기관을 표적화하기 위한 표적형 리간드와 함께 치료학적 약물을 포함할 수 있다. 혹은, 본 발명의 CDV는 생물학적 활성문자로서 표적형 리간드 또는 치료학적 약물과 함께 상기 CDV를 표지하기 위한 표지 단백질을 포함할 수 있다. 각 생물학적 활성분자는 하나의 앵커단백질에 함께 결합된 형태이거나, 서로 다른 앵커단백질에 각각 결합된 형태이거나, 제1 생물학적 활성분자가 앵커단백질에 결합하고 제2 생물학적 활성분자는 CDV의 막 또는 내부에 탑재된 형태일 수 있다. 2종 이상의 생물학적 활성분자가 하나의 앵커단백질에 함께 결합된 형태인 경우, 상기 생물학적 활성분자들은 상기 앵커단백질의 일측 말단에 순차적으로 결합된 형태이거나, 상기 앵커단백질의 양측 말단에 각각 결합된 형태일 수 있다.

당업자는 목적에 따라 적절한 생물학적 활성분자를 선택하고, 본 발명의 앵커단백질을 통해 CDV에 탑재시킬 수 있다. 예컨대, 생물학적 활성분자는, 특정 조직, 장기, 세포를 표적화하는 표적형 리간드 (targeting ligands)일 수 있다. 따라서, 표적형 리간드가 탑재된 CDV는 상기 리간드의 타겟을 특이적으로 인식할 수 있다. 예컨대, 상기 표적형 리간드가 항체 또는 이의 단편인 경우, 상기 리간드가 탑재된 CDV는 상기 리간드의 표적 (항원)을 발현하는 세포를 인식하고 결합할 수 있다. 예컨대, 뇌세포 또는 BBB (Blood-brain barrier) 내피세포를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편이 탑재된 CDV의 경우 상기 항체 또는 단편을 통해 뇌조직으로의 이동이 가능하므로, 뇌질환 치료제 등을 추가로 담지하여 뇌 특이적으로 치료제를 전달할 수 있다.

또한, 상기 생물학적 활성분자는 암세포를 표적화하는 종양항원-특이적 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 예컨대, 상기 생물학적 활성분자는 표적항암제일 수 있다. 상기 종양항원은 암세포에서만 발현되는 종양특이적 항원 (tumor-specific antigens)은 물론, 정상세포에서도 발현될 수 있지만 암세포에서 특히 높은 빈도로 발현되거나 더욱 활성이 높은 종양 관련 항원 (tumor-associated antigens)을 모두 포함한다. 예컨대, 상기 종양항원은 암세포에서만 발현되거나 암세포에서 더 높은 빈도로 발현되는 표면 단백질일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예로서, HER2를 표적으로 하는 trastuzumab의 단편 (scFv)을 생물학적 활성분자로 하여 상기 단편이 탑재된 HER2 특이적 CDV를 제조하였으며, 상기 CDV가 HER2 발현 암세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

상기 생물학적 활성분자는 앵커단백질과 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 펩타이드 결합, 또는 자기조립화로 연결되거나, 매개체 (예를 들어, 링커)를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결 (결합)될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 생물학적 활성분자 및 앵커단백질은 서로 융합 (fusion)된 상태로 발현되어 생성된 복합체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 생물학적 활성분자를 코딩하는 유전자와 앵커단백질을 코딩하는 유전자를 함께 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 생물학적 활성분자 및 앵커단백질이 융합 단백질 (fusion protein)로서 발현될 수 있다. 또한, 융합 단백질로 발현될 때, 상기 생물학적 활성분자와 앵커단백질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포 (또는 세포주)를 제공한다. 세포에 대한 구체적인 설명은 전술하였으므로 생략한다.

구체적으로, 상기 세포는 외인성의 앵커단백질-코딩 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포는 상기 앵커단백질이 과발현된 세포일 수 있다.

상기 앵커단백질-코딩 유전자는 재조합 벡터에 삽입되어 세포에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 CDV를 제조하기 위한 재조합 벡터로서, 상기 앵커단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 앵커단백질-코딩 유전자와 함께 생물학적 활성분자-코딩 유전자를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 생물학적 활성분자는 상기 앵커단백질에 결합된 상태로 발현될 수 있다. 예컨대, 상기 앵커단백질-코딩 유전자 및 생물학적 활성분자-코딩 유전자는 상기 재조합 벡터로부터 융합단백질의 형태로 발현될 수 있다.

본 발명에 있어서, "재조합 벡터 (recombinant vector)"란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 목적 단백질 (본 발명에서는, 프로그래뉼린 단백질 또는 이의 단편들)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다.

본 발명에 따른 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터 (promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그 (최소 5개 이상의 히스티딘 잔기로 구성된 아미노산 모티프), 신호 펩타이드 (signal peptide) 유전자, 소포체 잔류 신호 펩타이드 (endoplasmic reticulum retention signal peptide), 클로닝 사이트 (cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있고, 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 상기 각 유전자들의 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된 (operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터는 바이러스 생산세포, 즉, 패키징 세포 (packaging cell line)에 형질주입 또는 트랜스펙션 (transfection)될 수 있다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산 (DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 목적 유전자 (앵커단백질을 코딩하는 유전자 또는 생물학적 활성분자 및 앵커단백질의 융합단백질을 코딩하는 유전자)를 포함하는 바이러스는 상기 패키징 세포주 내에서 증식하여 세포 외로 방출될 수 있으며, 상기 바이러스는 목적세포 (즉, 본 발명의 CDV를 생산하는 세포)에 트랜스덕션 (transduction; 형질전환)될 수 있다. 세포 내로 형질전환된 바이러스의 핵산은 세포의 게놈에 삽입되거나 혹은 삽입되지 않은 채로 목적 단백질 (앵커단백질; 또는 앵커단백질 및 생물학적 활성분자의 융합단백질)을 생산하는 데 사용된다.

본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터가 도입된 (형질전환, 형질감염, 형질주입 등), 단리된 세포를 제공할 수 있다. 여기서의 세포는 최종적으로 CDV를 생산하는 세포가 아닌, 상기 재조합 벡터를 증식 (증폭)하기 위한 세포를 의미한다. 즉, 상기 세포는 전술한 핵산 분자 또는 재조합 벡터가 직접 형질도입/형질전환/형질감염된 숙주세포를 나타낸다. 예컨대, 상기 발현 벡터가 바이러스 벡터인 경우, 상기 세포는 상기 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스를 생성하기 위한 패키징 세포일 수 있다. 적합한 숙주의 선택은 본원의 시사내용으로부터 당업계의 통상의 기술자에게 자명한 것으로 여겨진다.

또한, 본 발명은 (S1) 세포에 앵커단백질-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 및

(S2) 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 압출하여 세포 유래 베지클을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 유래 베지클의 제조방법을 제공한다.

상기 (S1) 단계는 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에 도입 (형질전환, 형질주입, 형질감염 등) 시켜, 세포 내부에서 발현 벡터가 복제되거나, 상기 발현 벡터로부터 단백질 등이 발현되도록 유도하는 단계이다. 당업자는 벡터 및 세포의 종류에 따라 적절한 도입 방법을 선택할 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터가 바이러스성 벡터인 경우, 상기 재조합 벡터를 포함하는 바이러스를 세포에 감염시켜 상기 벡터를 세포 내로 도입시킬 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 상기 재조합 벡터를 포함하는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 단순포진바이러스, 및/또는 백시니아 바이러스에 의해 세포 내로 도입될 수 있으며, 바람직하게는, 렌티바이러스에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 이 때, 상기 세포는 1 내지 30 MOI (Multiplicity of infection), 1 내지 20 MOI, 1 내지 15 MOI, 1 내지 10 MOI, 1 내지 8 MOI, 1 내지 7 MOI, 또는 1 내지 5 MOI의 바이러스(상기 재조합 벡터를 포함하는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 단순포진바이러스, 및/또는 백시니아 바이러스) 에 의해 감염됨으로써 상기 재조합 벡터가 도입될 수 있다. 당업자는 재조합 벡터의 세포로의 도입에 2종 이상의 바이러스를 사용할 경우, 1 내지 30 MOI, 1 내지 20 MOI, 1 내지 15 MOI, 1 내지 10 MOI, 1 내지 8 MOI, 1 내지 7 MOI, 또는 1 내지 5 MOI의 범위 내에서 바이러스를 적절하게 조합하여 상기 재조합 벡터를 세포로 도입할 수 있다.

따라서, 상기 (S1) 단계는 세포 내로 도입된 목적 유전자가 세포에서 발현되도록 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은, 상기 재조합 벡터가 세포 내로 도입된 후, 세포 내에서 목적 단백질이 발현되기에 충분한 기간 동안 이루어질 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 배양은, 세포에서 상기 목적 단백질이 발현되고, 상기 목적 단백질을 포함하는 CDV가 생성되기에 충분한 기간 동안 이루어질 수 있다.

상기 (S2) 단계는 상기 재조합 벡터가 도입되어 본 발명에 따른 앵커단백질 및/또는 생물학적 활성분자를 과발현하는 세포로부터 세포 유래 베지클을 수득하는 단계이다. 상기 CDV는 세포를 포함하는 시료를 압출하여 수득할 수 있다. 상기 압출은 미세공극을 포함하는 필터 또는 깊이필터를 이용하여 수행될 수 있다. 세포 압출을 통한 CDV 수득 과정은 전술하였으므로 생략한다. 상기 (S2) 단계로부터 수득된 CDV는 상기 재조합 벡터로부터 발현된 앵커단백질 (및 생물학적 활성분자)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (S2) 단계를 통해 수득된 CDV는 상기 재조합 벡터가 도입된 세포 (모세포), 또는 이로부터 생성되는 엑소좀 대비 앵커단백질의 수준이 더 높은 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 (S2) 단계를 통해 수득된 CDV의 앵커단백질의 수준은 모세포 또는 이의 엑소좀의 앵커단백질 대비 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 수준을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, “전달”이란 표적 세포, 조직, 또는 기관 내로의 전달을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 약물은 구체적인 종류로 제한되지 않으며, 특정 질병에 대한 예방, 개선, 및/또는 치료 활성을 갖는 것 (단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 핵산, 화합물 등)이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 상기 약물은 항체 또는 이의 단편, 치료 단백질, 및 치료 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약물은 본 발명에 따른 생물학적 활성분자로서, 앵커단백질에 결합된 형태로 표적 세포/조직/기관에 전달될 수 있다. 이 경우, 상기 약물은 특정 질병의 예방/개선/치료를 위한 약리학적 활성을 가질 뿐만 아니라, 타겟의 표적화 기능을 함께 가질 수 있다. 예컨대, 상기 약물은 항체 기반 항암제 (항암항체)이다. 즉, 본 발명의 CDV는 앵커단백질에 결합된 항암항체를 통해 암세포를 표적화하고, 항암 활성을 발휘할 수 있다. 상기 항암항체는 구체적인 종류로 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 상기 항암항체는 cetuximab, trastuzumab, rituximab, cixutumumab, ganitumab, dalotuzumab, figitumumab, teprotumumab, robatumumab, AVE1642, BIIB022, isiratumab, 또는 이들의 단편일 수 있다.

상기 약물은 앵커단백질에 결합되지 않고 CDV의 막 또는 내부에 별도로 탑재되어 표적에 전달될 수 있다. 이 경우, 상기 CDV는 앵커단백질에 결합된 생물학적 활성분자로서 세포/조직/기관을 표적화하기 위한 표적형 리간드를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 약물이 항암제인 경우, 상기 CDV는 표적형 리간드로서 종양항원을 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있으며, 상기 표적형 리간드를 통해 암세포에 특이적으로 결합하여 상기 약물을 전달할 수 있다. 혹은, 상기 약물이 뇌질환 치료제인 경우, 상기 CDV는 뇌세포를 표적으로 하는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있으며, 상기 표적형 리간드를 통해 뇌조직으로 이동하여 상기 약물을 전달할 수 있다.

또한 본 발명의 CDV는 2종 이상의 생물학적 활성분자를 가질 수 있으며, 각각 앵커단백질에 결합된 형태일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 CDV는 표적화를 위한 표적형 리간드 및 약물 (예컨대, 치료 단백질, 치료 펩타이드 등)을 모두 포함하는 것으로서 각각 앵커단백질에 결합될 수 있다. 따라서, 상기 CDV는 표적형 리간드를 통해 타겟을 표적화하고, 해당 타겟에 약물을 전달하여 치료 활성을 발휘할 수 있다.

상기 약물 전달용 조성물은 특정 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 약물이 탑재된 것으로서 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

예컨대, 본 발명에 따른 생물학적 활성분자가 특정 질병에 대해 예방, 개선, 및/또는 치료 효능을 갖는 것인 경우, 상기 생물학적 활성분자가 탑재된 CDV는 상기 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 이 때, 상기 약물은 치료 활성을 가질 뿐만 아니라 그 자체가 표적화 기능을 가질 수 있다. 혹은, 상기 CDV가 표적형 리간드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 세포 유래 베지클은 생물학적 활성분자로서 표적형 리간드를 포함하고, CDV의 막 또는 내부에 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료를 위한 약물을 더 포함할 수 있다. 상기 표적형 리간드는 CDV가 질병의 예방, 개선, 및/또는 치료를 위해 약물이 전달되어야 하는 세포, 조직, 또는 기관을 표적화하도록 한다.

상기 질병은 상기 약물과 관련된 질병으로서, 상기 약물 투여시 예방, 치료, 및/또는 개선될 수 있는 질병이다. 따라서, 당업자는 예방, 치료, 및/또는 개선하고자 하는 질병에 따라 적절한 약물을 선택하여 본 발명에 적용할 수 있다.

예컨대, 상기 약물이 항암제인 경우, 상기 질병은 암일 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 세포 유래 베지클은 항암제가 탑재된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 항암제는 항암 활성은 물론, 암세포를 표적화하는 기능도 갖는 것일 수 있다 (예를 들어, 항암항체). 상기 항암제는 CDV 막의 앵커단백질에 결합된 것일 수 있으며, 앵커단백질과 분리된 형태로 CDV에 탑재될 수 있다 (예컨대, CDV의 막 또는 내부에 위치함). 예를 들어, 상기 항암제는 CDV 막의 앵커단백질에 결합된 상태로 CDV 외부로 노출되어 암세포를 표적화하고, CDV와 암세포의 결합을 유도하여, 암세포에 대해 항암활성을 발휘할 수 있다. 본 발명에 있어서 암의 구체적인 종류에는 제한이 없으나 대장암, 결장암, 갑상선암, 구강암, 인두암, 후두암, 자궁경부암, 뇌암, 폐암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 혀암, 유방암, 자궁암, 위암, 골암, 림프종, 혈액암, 편평상피세포암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 흑색종, 안구 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 위장암, 교아종, 난소암, 자궁내막암, 침샘암, 음문암, 및 두경부암 등으로부터 선택될 수 있다. 상기 항암제는 구체적인 종류로 한정되지 않고, 항암 활성을 갖는 것으로 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예컨대, 상기 항암제는 단백질 또는 펩타이드 기반 항암제일 수 있다. 또는, 상기 항암제는 항암 활성을 지닌 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 일 구현예로서, 본 발명은 trastuzumab 또는 이의 단편 (scFv 등)이 탑재된 것으로서, 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 trastuzumab 또는 이의 단편은 상기 앵커단백질에 결합될 수 있다.

또 다른 예로, 상기 질병은 뇌질환이고, CDV에 탑재되는 약물은 상기 뇌질환의 치료제일 수 있다. 상기 뇌질환은 구체적인 종류에 제한이 없으나, 퇴행성 뇌질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머, 경도인지장애, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocer ebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette`s Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich`s Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph`s d isease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dysto nia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 허혈성 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌경색, 및 중풍 등으로부터 선택될 수 있다. 상기 CDV는 뇌조직 표적화를 위한 표적형 리간드 (예컨대, 뇌세포 또는 BBB 특이적 항체 또는 이의 단편 등)를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 (약물 전달용 조성물, 약학적 조성물 등)을 특정 질환의 치료 목적으로 사용하는 경우, 상기 조성물 내의 상기 핵산분자 전달용 세포 유래 베지클의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 돼지, 양 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 앵커단백질을 포함하는 세포 유래 베지클 (앵커-CDV)의 제조

세포 유래 베지클 (Cell-derived vesicles, CDVs)를 이용한 바이오드론 플랫폼 (BioDrone platform)은 genetic engineering을 통해 표적형 리간드 (targeting ligand) 또는 활성 카고 (active cargo)를 세포유래소포에 도입하여 효과적인 약물전달시스템 (drug delivery system)을 구축하고자 하는 것이다. 바이오드론 플랫폼에 사용이 될 CDV는 세포외소포 (extracellular vesicles, EVs)와 물리, 화학적 유사성 때문에 기타 nano-sized carrier에 비해 높은 biocompatibility 및 낮은 immunogenicity를 갖고 있으며 생산성 측면에서도 EVs에 비해 큰 이점을 가진다. Genetic engineering을 통한 효율적인 CDV의 변형에 있어, CDV 특이적으로 안정적이고 풍부하게 존재하는 앵커단백질 (anchor protein)의 규명은 본 발명의 바이오드론 플랫폼 개발에 매우 중요한 기본 단계이다.

1-1. 재조합 벡터를 이용한 후보 앵커단백질의 발현

이전 연구에서 진행된 세포유래소포의 proteome analysis를 통하여 세포 및 엑소좀 (exosome) 대비 CDV에 풍부하게 존재하는 막단백질 12종을 후보 앵커단백질로 선별하였다 (도 1a). 총 12개의 후보 막단백질과 2개의 비교 단백질 (Codiak Biosciences 사에서 선정한 scaffold protein)을 기반으로 융합단백질을 설계하였다. 상기 단백질들 각각의 과발현 세포를 빠르게 제작하고자 lentiviral vector를 사용하였다. 클로닝 및 바이러스 입자의 제작은 VectorBuilder에서 진행하였으며 VectorBuilder에서 제공하는 3세대의 lentiviral vector 시스템에 도 1b와 같은 디자인의 융합단백질 유전자를 클로닝하였다. 각 단백질들의 발현 확인 및 기타 다양한 분석을 위해 N-말단에는 3×Flag 태그를, C-말단에는 EGFP와 HA 태그를 각각 삽입하였다 (도 1b). 관심 유전자 (gene of interest, GOI)는 CMV 프로모터 하에 위치하도록 설계되었다. 또한, 형광을 통한 발현 확인 및 ELISA를 이용한 정량 분석을 위해 EGFP를 포함시켰다. 즉, 각각의 후보 앵커단백질들은 GFP에 융합되므로, GFP를 통해 간접적으로 후보 앵커단백질들을 검출할 수 있다.

제작된 plasmid 및 바이러스 입자를 이용한 융합단백질의 발현은 VectorBuilder의 제작 과정에서 확인되었지만 자체적으로 융합단백질의 발현을 검증하고자 하였다. 제공받은 plasmid와 Lipofectamine을 이용해 Human embryonic kidney에서 유래한 세포주인 HEK293 세포를 형질전환 하였고 형광 발현을 분석하여 단백질 발현을 검증하였다. 그 결과, 모든 plasmid에서 형광 단백질의 발현이 확인되었는데, 형질전환 효율은 plasmid에 따라 30 ~ 95 %를 보였다 (도 2a). 그리고, 형광 세기 분석에서는 BASP1, RAB7A, CNP와 GNAI2의 융합단백질이 약 20,000 이상의 형광 세기를 보여 높은 발현을 확인할 수 있었다 (도 2b).

1-2. 후보 앵커단백질을 발현하는 세포주 (stable cell lines)의 제작

본 실시예에서는 후보 앵커단백질을 안정적으로 발현하는 stable cell lines를 구축하였다. 형질변형을 통한 세포주 제작에 앞서, 세포 유형 (부착형 혹은 부유형) 및 MOI (multiplicity of infection)에 따른 형질전환 효율을 확인하고자 하였다. 상기 실시예 1-1에서 형질전환 효율 50 % 이상을 나타냈던 EGFP, PTGFRN 그리고 RAB7A 융합단백질의 바이러스 입자를 MOI를 달리하여 부착형 및 부유형의 HEK293 세포에 각각 처리한 후 형질변형 효율을 비교하였다. 그 결과, 세포 유형에 따른 유의미한 차이는 나타나지 않았지만, MOI에 따른 효율 및 발현 증가를 확인할 수 있었다 (도 3). 높은 MOI가 단기적인 효율에는 유리하겠지만, 바이러스에 의한 세포 독성 우려가 있어 MOI 5를 선택하였고 항생제 처리 후 형질변형이 되지 않은 세포의 제거에 유리한 부착형 HEK293 세포로 세포주 제작을 진행하기로 결정하였다.

세포주 제작을 위해 각 융합단백질의 바이러스 입자를 처리하고 24시간 후 형질전환 효율을 확인하였고 (도 4a 및 4b), 2일 후부터는 2 μg/mL의 puromycin을 처리하여 세포 선별을 시작하였다. 항생제에 내성을 보이는 세포를 1×10⁷ cells까지 배양한 후 Cell Sorter를 이용한 추가 선별을 진행하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 형광세기가 높은 세포를 선별적으로 수득한 후, 세포 안정화를 위해 3 내지 5일 후 항생제를 추가하여 배양을 유지하였다. 이렇게 선별된 세포를 분석한 결과, 모든 세포에서 90% 이상의 형질변형 효율이 확인된 바, 융합단백질을 발현하는 세포의 선별이 성공적으로 이루어 졌음을 확인할 수 있었다 (도 6a). 융합단백질의 발현 정도는 세포마다 달랐는데, BASP1, RAB7A 그리고 CNP의 융합단백질을 발현하는 세포는 높은 형광 세기를 보였고 ATP1A1와 NCSTN 세포는 형광 세기가 낮게 나타났다 (도 6b).

융합단백질의 발현을 GFP ELISA (Abcam, Cambridge, UK)를 이용해 분석한 결과, 형광 세기 평가 결과와는 상이한 경향성이 나타났다. RAB7A, BSG, BASP1, GNAI3, CNP, LAMP1, 및 PTGFRN의 융합단백질의 경우 높은 발현을, ITGB1, NCSTN, ATP1B3, KTN1, LAMP2, SCARB2, 및 ATP1A1은 상대적으로 낮은 발현이 나타났다 (도 6c). 또한, 정성적 분석을 위해 각 막단백질을 인지하는 항체를 이용한 웨스턴블롯 분석을 진행한 결과, 정도의 차이는 있지만 모든 막 단백질들이 과발현된 것으로 나타난 바, 융합단백질 (후보 앵커단백질)이 연구의 목적에 부합하게 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 6d).

1-3. 앵커단백질 과발현 세포로부터 분리된 CDV의 특성 확인 및 최종 앵커단백질의 선별

본 실시예에서는 상기 실시예를 통해 확보된 형질전환 세포로부터 세포 유래 베지클 (cell-derived vesicles, CDVs)를 분리하고, 그 특성을 확인하였다. 상기 실시예를 통해 확보된 형질변형 세포를 배양하여 CDV의 생산을 유도하였으며 (앵커-CDV), 각 세포에서 발현되는 후보 앵커단백질이 CDV에 전달된 효율을 확인하였다. GFP (+) 소포의 비율은 nanoparticle flow cytometer (NanoFCM, Inc.; Xiamen, China) 를 통해 분석하였고 GFP ELISA를 이용하여 융합단백질의 양을 정량했다.

그 결과, 융합단백질에 따라 GFP (+) 소포의 비율은 3.1 내지 69.5 %로 다양하게 나타났고 (도 7a), 융합단백질의 양은 그 편차가 더욱 큰 것으로 확인됐다. LAMP1, LAMP2, BSG, 및 ATP1B3 융합단백질은 CDV에 많은 양이 도입되었는데, 세포에서 발현이 높았던 CNP 및 GNAI3은 소포에 도입되는 비율이 낮은 것으로 나타났다 (도 7b 및 7c).

비교를 위해 선정한 Codiak Biosciences 사의 PTGFRN 및 BASP1은 CDV에서의 양 및 도입 비율이 다른 막단백질 대비 낮은 것으로 확인됐는데, 이는 CDV 및 세포외소포 (Extracellular vesicles, EVs)의 생성 원리가 달라 도입 양상이 다르게 나타난 것으로 추측된다.

이러한 분석 결과를 토대로 모세포의 변형을 통한 CDV의 엔지니어링을 위해서는 CDV에 특화된 막단백질이 필요함을 확인할 수 있었으며, ATP1B3, BSG, LAMP1, 및 LAMP2를 BioDrone platform을 위한 앵커단백질로 선정하였다.

1-4. 바이오드론 플랫폼을 위한 최종 앵커단백질의 확인

HEK-CDV의 후보 앵커단백질들의 특성화를 통해 선별된 최종 4종 바이오드론 앵커 (BioDrone Anchor)는 원형질막 기원 단백질인 ATP1B3 및 BSG, 그리고 리소좀막 (lysosome membrane) 기원 단백질로 알려진 LAMP1과 LAMP2이다.

각각의 선별된 앵커단백질이 HEK293 세포에서 안정적으로 발현되는 것을 여러 세대에 걸쳐 확인하였고, original topology를 기반으로 각 앵커-CDV의 개략도를 도 8a에 나타냈다. 더 나아가, nanoparticle flow cytometer 분석 결과인 GFP (+) 입자 비율과 ELISA 분석 결과인 GFP 정량 값을 바탕으로 GFP (+) CDV particle 하나당 존재하는 GFP molecule의 수 (즉, 간접적으로 앵커단백질의 분자 수)를 이론적으로 계산하여 나타냈다 (도 8b). 그 예로, BSG-CDV와 LAMP1-CDV 하나당 각각 152개와 122개의 GFP 분자가 존재함을 확인하였다.

1-5. CDV의 압출방법에 따른 앵커-CDV의 특성 비교

바이오드론 플랫폼에 사용될 세포유래소포 압출방법은 다양하게 존재하지만, 앵커단백질 선정을 위한 테스트에서는 멤브래인 필터 (membrane filter; NanoSizer MINI Liposome Extruder)를 사용하여 소규모로 진행하였다. 이는 신속하게 여러 가지 후보 앵커단백질을 테스트하기 위험이었으나, 바이오드론 플랫폼의 개발 및 활용시 CDV의 효율적인 대량 생산이 필요하므로, 가장 적절한 CDV 생산 방법을 도출하기 위해 압출 방법에 따른 CDV의 특성 변화여부를 확인하였다. 선정된 앵커단백질이 과발현된 2 종의 세포주 (HEK-BSG 및 HEK-LAMP1)으로부터 각각 멤브래인 필터 (ES-50) 또는 깊이필터 (depth filter)를 이용하여 CDV의 압출을 진행하고 (도 9), 압출 방법에 따라서 세포유래소포 특성이 변화하는지 확인하였다.

각각 다른 방법으로 압출된 CDV로 단일 입자 (single particle) 수준에서 GFP (+) 입자의 분포 정도를 분석하였고 (도 10a 및 10b), 웨스턴블롯을 통해 앵커단백질의 풍부도 (enrichment)를 비교하였다 (도 10c). 그 결과, 본 발명의 앵커단백질은 압출 방법에 상관없이 비슷한 경향을 보이며 각각의 CDV에 존재하는 것이 확인되었다. 즉, 앵커단백질의 종류에 따라 앵커단백질 도입율 등에는 차이가 다소 있을 수 있으나, 압출 방법에 따른 차이는 없는 것으로 확인되었다.

1-6. CDV에 도입된 앵커단백질의 토폴로지 분석

본 실시예에서는 앵커단백질의 토폴로지 (topology) 분석을 수행하였다. 이를 위해 proteinase K를 앵커-CDV에 처리하여 CDV 막에 존재하는 단백질의 외부 부위 (extra-part)를 제거한 후, 웨스턴블롯으로 각 단백질 토폴로지를 확인했다.

Plasmid construct를 설계할 때, 앵커단백질의 토폴로지 분석에 사용하고자 N- 또는 C-terminal에 각각 다른 tag (각각, Flag tag 및 HA tag)를 도입하였다. 전반적인 실험의 개요는 proteinase K를 처리하여 막 단백질의 소포 외 (extra-vesicular) 부분의 digestion을 유도한 후, N- 또는 C-terminal에 도입된 서로 다른 tag에 대항하는 항체로 앵커단백질이 검출되는 정도를 확인한다. 앵커단백질의 extra-vesicular에 해당하는 부분이 N-terminal이라면 proteinase K를 처리함에 따라 anti-Flag로 detection되는 앵커단백질의 정도가 감소하고, C-terminal이라면 anti-HA로 detection되는 앵커단백질의 정도가 감소한다. BSG-CDV 및 LAMP1-CDV에 proteinase K 처리 후, anti-HA로 단백질을 검출하면 original size에 해당하는 단백질의 검출 정도가 감소되며, 소포 외부의 단백질 digestion후, 내부에 남아있는 작은 size의 단백질의 검출 정도는 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, BSG과 LAMP1은 CDV 도입 후에도 original topology가 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 11). 상기 결과는 본 발명의 앵커단백질들은 CDV에 도입되었을 때에도 그 특징이 달라지지 않는다는 것을 보여준다.

결론적으로, 상기 실시예들을 통해 CDV의 엔지니어링을 위한 4종의 앵커단백질로 ATP1B3, BSG, LAMP1, 및 LAMP2가 선별되었으며, 상기 앵커단백질들은 CDV 입자상에 안정적으로 존재하는 것이 확인된 바, 이들을 활용하여 표적형 리간드 (targeting ligand)를 융합시키거나, 치료학적 카고 (therapeutic cargo)를 도입하여 CDV에 도입할 수 있으므로, 약물전달을 위한 효과적이고 효율적인 CDV 엔지니어링에 다양하게 활용될 수 있다.

실시예 2. HER2 표적형 앵커-CDV의 개발

본 발명에 따른 앵커-CDV가 약물전달체로서 활용 가능한지 확인하기 위해, 표적형 리간드 (targeting ligand) 또는 활성 카고 (active cargo)를 앵커단백질과 융합단백질 형태로 발현시켜 CDV에 도입시킨 후 상기 CDV의 타겟세포의 표적화 여부 및 세포와의 결합 내지 흡수 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 본 실시예에서는 HER2 (human epidermal growth factor receptor2; 표피 성장인자 수용체)를 표적하는 CDV를 제조하고 이의 효과를 확인하였다. CDV의 표적 지향성을 부여하기 위해, 표적형 리간드로 HER2 단백질 특이적 항체인 trastuzumab의 scFv (single-chain variable fragment) 부위를 사용하였다. trastuzumab의 scFv (scTTZ)를 과발현하는 세포주를 구축하여 이로부터 HER2 표적형 scFv가 도입된 앵커-CDV를 수득한 후, HER2 양성 종양 동물 모델에서 상기 앵커-CDV의 종양 표적능을 평가했다.

2-1. 렌티바이러스 기반 형질전환을 이용한 trastuzumab 과발현 세포주의 제조

앞선 실시예를 통해 바이오드론 앵커단백질로 선정된 4가지 막단백질을 이용하여 표적형 리간드를 CDV에 도입하고자 하였다. 이를 위해 먼저 HER2 항체인 trastuzumab의 scFv (scTTZ)를 발현하는 세포주를 제작하였다. 선정된 4가지의 막단백질(BSG, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2)의 경우, 세포 또는 exosome 대비 CDV에 풍부하게 존재하므로, 상기 앵커들을 이용하여 표적형 리간드를 과발현시켰을 때 보다 안정적으로 CDV에 도입될 것으로 기대하였다. 렌티바이러스 형질전환 (Lentiviral transduction)을 이용하여 세포주를 제작하기 위해, 앵커 및 trastuzumab scFv (scTTZ)를 융합된 형태로 발현할 수 있는 vector construct를 디자인하여, 렌티바이러스 입자를 제작하였다 (도 12a 및 12b).

제작된 렌티바이러스 입자로 형질전환을 통해 대조군을 포함하여 총 9개의 세포주를 제작하였다. 형질전환 후 24시간이 지났을 때 형광 현미경을 통해 miRFPnano3 형광을 관찰할 수 있었고 유세포분석 결과 형광을 나타내는 세포는 약 30 - 95 % 수준으로 확인되었다 (도 13a). 형질전환 세포는 일주일 정도 배양하며 viability가 약 90% 수준으로 5.0×10⁵ cells/mL 농도로 30 mL 확보되었을 때 puromycin을 2 μg/mL으로 처리하여 scTTZ 및 앵커단백질을 발현하는 세포를 선별할 수 있었다. 약 3주 정도 세포 상태를 관찰하며 puromycin 농도를 2 μg/mL에서 5 μg/mL까지 조절하였고, 모든 세포주에서 90% 이상의 발현을 확인하였다.

또한, 선별된 세포에 대해 miRFPnano3 형광의 세기와 luciferase activity를 비교한 결과, 세포 간 형광 세기와 luciferase activity가 유사한 경향을 나타냄을 확인하였다 (도 13b 및 13c). 즉, 형광 세기 분석을 통해 scTTZ와 앵커단백질의 발현 수준을 간접적 평가하였으며, C-terminal에 fusion된 miRFPnano3과 luciferase 모두 안정적으로 발현하였음을 확인하였다.

다음으로 웨스턴블롯을 통해 앵커단백질, scTTZ, 및 Flag tag의 발현을 분석하였다 (도 14). 이전 결과와 같이 세포마다 발현 수준은 다르게 나타났지만 단백질 크기와 밴드 두께를 확인하였을 때 모든 단백질이 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다. miRFPnano3 및 luciferase activity 결과를 함께 고려했을 때, 앵커단백질 중에서도 특히 LAMP1 및 LAMP2가 scTTZ fusion protein을 안정적으로 발현하는 것으로 확인되었다.

각 세포에 발현된 scTTZ이 타겟 단백질과 결합하는지 확인하기 위해 FITC 표지된 recombinant human HER2와 결합을 확인하였다 (도 15a). scTTZ 없이 앵커만을 가지는 세포를 대조군으로 하여 진행하였을 때, 4 가지 앵커단백질 모두 scTTZ와 결합되는 HER2에 의해 FTIC 형광 신호가 증가하는 것을 확인하였다 (도 15b). 특히, LAMP1 및 LAMP2는 리소좀 막단백질임에도 불구하고, 과발현시 원형질막에서도 많은 양이 발현됨에 따라, 세포를 permeabilization 하지 않았음에도 HER2가 많이 결합되는 것을 확인할 수 있었다.

2-2. trastuzumab (scFv)가 도입된 앵커-CDV의 제조

scTTZ 및 앵커단백질을 발현하는 세포주에 대해 ES-50을 이용하여 압출을 진행하여 CDV를 생산하였다. CDV는 SEC 정제와 Amicon 농축을 통해 최종 5.0×10¹⁰ - 1.5×10¹¹ ps/mL 농도로 수득할 수 있었다. CDV 생산 단계 별 파티클 농도 및 부피(수율)은 표 1에 나타내었다.

압출된 CDV는 nanoparticle flow cytometer로 분석하여 CDV 중 miRFPnano3 positive particle의 비율을 확인하였고, 앵커에 따라 형광을 나타내는 비율은 4 내지 38%로 다소 차이는 있으나 모든 앵커-CDV가 형광을 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 앵커단백질로 LAMP1을 사용한 경우에 ssTTZ의 도입율이 높았으며, 글리코실화된 LAMP1 (glycosylated LAMP1, gLAMP1)을 이용하면 ssTTZ의 CDV로의 도입율이 더욱 높아지는 것이 확인되었다 (도 16). 따라서, 이후의 실험은 대표예로서 LAMP1-CDV 및 gLAMP1-CDV를 이용하여 진행하였다.

LAMP1을 앵커로 하여 scTTZ를 갖는 CDV의 융합단백질 발현을 웨스턴블롯으로 통해 확인하고 (도 17a), 재조합 HER2 (FITC-HER2)와의 결합을 nanoparticle flow cytometer 으로 확인하였다 (도 17b). CDV에서도 LAMP1의 두꺼운 밴드를 관찰할 수 있었고 protein L로 확인하였을 때 glycosylated LAMP1을 앵커로 사용한 CDV에서 상대적으로 더 두꺼운 밴드를 확인할 수 있었다. nanoparticle flow cytometer 분석 결과에서도 AMP1과 비교하여 glycosylated LAMP1을 이용한 CDV가 miRFPnano3 (PC₅ 형광 사용)을 5% 더 높은 비율로 발현하는 것으로 나타났다. FITC 표지된 HER2와 CDV를 결합시켰을 때, 대조군인 gLAMP1-CDV에서는 0.5 %의 CDV만이 형광을 나타냈고 이는 non-specific한 결합으로 생각된다. 반면 scTTZ-gLAMP1 및 LAMP1-CDV에서는 각각 44.5% 및 35.5%의 CDV에서 FITC 형광이 확인되었는데, 이는 miRFPnano3 positive CDV의 비율을 고려하였을 때, scTTZ를 가지는 CDV는 대부분 HER2와 효과적으로 결합하였음을 보여준다.

LAMP1의 glycosylation 유무에 따른 scTTZ-CDV의 차이를 확인하기 위해 aldehyde/sulfate latex beads에 CDV를 붙인 후, FITC-HER2 단백질을 여러 농도로 반응시켜 EC50 값을 비교하였다 (도 18). 먼저, 두 종류의 CDV 모두 농도 의존적인 HER2 결합을 확인할 수 있었고, 이를 이용하여 EC50을 계산한 결과 gLAMP1-CDV는 0.94 μg/mL, LAMP1-CDV는 0.88 μg/mL로 확인됐다. 각 CDV에 따라 scTTZ를 가지는 비율을 고려하면 EC50의 차이는 크지 않은 것으로 생각되며 glycosylation 여부에 따른 영향은 관찰되지 않았다.

2-3. trastuzumab (scFv)가 도입된 앵커-CDV의 in vitro 평가

(1) 타겟세포 결합 분석

scTTZ-CDV와 HER2 발현 세포 사이의 결합 평가에 앞서, BT-474, SK-BR-3, MDA-MB-231 세 종류의 유방암 세포와 CT26, CT26/hHER2 세포에서의 HER2 발현 수준을 확인하였다. BT-474 와 SK-BR-3 세포는 HER2 고발현 세포주로 알려져 있지만 doubling time이 2 - 3일로 증식 속도가 느려 종양 동물 모델을 만드는 것에 어려움이 있다. 이에 대한 대안으로 마우스 유래 세포에 human HER2를 발현하도록 제작된 CT26/hHER2를 사용하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, HER2 음성 세포주인 MDA-MB-231과 CT26 세포에서 HER2가 발현하지 않음을 확인하였다. 반면 HER2 양성 세포주인 BT-474, SK-BR-3에서는 99% 이상의 세포가 HER2를 발현하였으며, CT26/hHER2에서는 90% 이상의 세포가 hHER2를 발현하고 있었다. 또한 CT26/hHER2와 비교하여 BT-474와 SK-BR-3에서 약 2배 이상 높은 수준으로 hHER2를 발현하고 있음을 확인하였다.

이어서, CT26/hHER2에 대한 scTTZ가 도입된 CDV의 HER2에 대한 결합을 확인하였다. CFSE로 형광 표지된 scTTZ-gLAMP1-CDV 및 대조군인 gLAMP1-CDV를 CT26/hHER2 또는 대조군 CT26 세포와 함께 배양하고, 유세포 분석을 통해 형광 세기를 검출하여 상대적인 결합 정도를 비교하였다. 그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 HER2 음성 세포주인 CT26 세포에서는 scTTZ 유무에 관계없이 두 종류의 CDV에 의한 형광 차이가 관찰되지 않았다. 반면, CT26/hHER2 세포의 경우 scTTZ-gLAMP1-CDV의 결합으로 인해 유세포분석의 히스토그램 peak가 약 6% 이동한 바, scTTZ-gLAMP1-CDV가 세포에 결합한 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 HER2 고발현 세포를 이용하여 scTTZ-gLAMP1-CDV의 결합을 평가하였다. HER2 고발현 세포주인 BT-474, SK-BR-3를 이용하였으며, 대조군으로는 HER2 음성 세포주 MDA-MB-231 세포를 이용하였다. 그 결과, MDA-MB-231 세포에 대해 CDV 간 결합 차이는 관찰되지 않은 반면, BT-474와 SK-BR-3에서는 대조군 CDV 대비 scTTZ-gLAMP1-CDV에서 약 7.5 - 11 %의 peak shift를 확인할 수 있었다 (도 21a) 세포에 결합된 CDV의 형광 세기를 정량한 결과, SK-BR-3, BT-474 세포에는 각각 약 1.5 배, 1.8 배의 더 많은 CDV가 결합되었음을 확인하였다 (도 21b). 또한 HER2 고발현 세포주와 scTTZ-LAMP1-CDV의 결합을 형광 세기가 아닌 CDV에 fusion 되어있는 luciferase를 이용하여 activity를 비교하였을 때, SK-BR-3와 BT-474 세포에 대한 각 1.8배, 1.7배 향상된 결합을 확인할 수 있었다 (도 21c). 이와 같은 타겟 단백질에 대한 결합력은 scFv가 아닌 전장항체 등을 이용하면 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다. 상기 결과는 본 발명의 앵커-CDV는 항체 기반 약물을 앵커단백질을 통해 안정적으로 CDV에 도입시킬 수 있으며, 상기 항체를 기반으로 타겟 세포를 효과적으로 표적화할 수 있음을 보여준다.

(2) 타겟세포로의 흡수 (uptake) 분석

이어서, ssTTZ에 의한 CDV의 세포 내로의 흡수가 증가하는지 확인하기 위해 BT-474 세포에 DiO로 염색된 gLAMP1-CDV와 scTTZ-LAMP1-CDV를 처리한 후, 세포로의 흡수 양상을 확인하였다. 세포를 배양하며 15, 30, 60, 및 180 분 시점에서 세포 내로 uptake된 양을 차이를 확인하고자 유세포분석으로 DiO 형광을 비교하였고, 이때 시료 별 상대적인 형광 세기를 고려하여 결과를 분석하였다 (도 22a). 그 결과, scTTZ-LAMP1-CDV는 대조군과 비교하여 15분에서는 약 2.62배, 30분에서는 1.79배, 1시간에서는 1.65배, 3시간에서는 1.24배 많은 양이 세포 내로 흡수된 것을 확인하였다. 또한 초기 15분에서 가장 큰 차이를 보이다 배양 시간에 따라 점차 그 차이가 감소하였는데 (도 22b), 이는 초기에 CDV에 도입된 scTTZ와 세포 표면의 HER2 결합 (receptor-mediated endocytosis)에 의해 세포 내로의 흡수가 증가하다가 시간이 지나면 scTTZ의 유무와 별개로 세포 내로 CDV의 흡수가 이루어졌음을 시사한다.

종합하여, 특정 단백질을 표적화할 수 있는 표적형 리간드를 본 발명의 앵커단백질을 매개로 CDV에 효과적으로 도입시킬 수 있으며, 표적형 리간드가 도입된 CDV는 타겟 단백질을 발현하는 암세포에 결합 또는 흡수될 수 있음이 확인된 바, 이는 본 발명의 앵커-CDV가 효과적인 약물전달체로 활용 가능함을 시사한다. 특히, 앵커단백질을 이용한 표적형 리간드의 CDV로의 도입은 trastuzumab의 scFv 뿐만 아니라 cetuximab의 scFv에 의해서도 확인된 바 (도 23), 본 발명의 앵커-CDV는 다양한 표적형 리간드의 탑재 및 전달에 유용히 활용될 것으로 기대된다.

실시예 3. GFP가 도입된 앵커-CDV의 개발

본 발명에 따른 앵커-CDV의 활용도를 확인하기 위해, 형광단백질인 GFP가 도입된 앵커-CDV를 제조하여 상기 형광단백질이 CDV에 정상적으로 도입되는지 확인하였다. 이에, GFP를 본 발명의 앵커단백질 중 하나인 BSG와 융합된 형태로 발현할 수 있는 vector construct를 제작하여 렌티바이러스 입자를 제작한 후, HEK293 세포를 상기 렌티바이러스 입자로 형질전환 시켰다. 대조군으로, 앵커단백질 없이 GFP만 과발현하는 세포를 사용하였다. 각 세포로부터 CDV를 압출한 후, nanoparticle flow cytometer 및 ELISA를 이용하여 CDV의 형광을 검출한 결과, BSG-GFP가 도입된 CDV의 경우 75% 이상의 CDV에서 GFP의 형광이 검출된 반면, GFP만 도입된 CDV의 경우 약 13%의 CDV에서만 GFP 형광이 검출되었다 (도 24). 상기 결과는 본 발명의 앵커단백질을 이용하면 활성성분 또는 카고를 CDV에 더 효과적으로 도입시킬 수 있다는 것을 보여준다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

[서열목록]

구분	서열	서열번호
ATP1B3	TKNEKKSLNQSLAEWKLFIYNPTTGEFLGRTAKSWGLILLFYLVFYGFLAALFSFTMWVMLQTLNDEVPKYRDQIPSPGLMVFPKPVTALEYTFSRSDPTSYAGYIEDLKKFLKPYTLEEQKNLTVCPDGALFEQKGPVYVACQFPISLLQACSGMNDPDFGYSQGNPCILVKMNRIIGLKPEGVPRIDCVSKNEDIPNVAVYPHNGMIDLKYFPYYGKKLHVGYLQPLVAVQVSFAPNNTGKEVTVECKIDGSANLKSQDDRDKFLGRVMFKITARA	1
BSG	AAGTVFTTVEDLGSKILLTCSLNDSATEVTGHRWLKGGVVLKEDALPGQKTEFKVDSDDQWGEYSCVFLPEPMGTANIQLHGPPRVKAVKSSEHINEGETAMLVCKSESVPPVTDWAWYKITDSEDKALMNGSESRFFVSSSQGRSELHIENLNMEADPGQYRCNGTSSKGSDQAIITLRVRSHLAALWPFLGIVAEVLVLVTIIFIYEKRRKPEDVLDDDDAGSAPLKSSGQHQNDKGKNVRQRNSS	2
LAMP1	AMFMVKNGNGTACIMANFSAAFSVNYDTKSGPKNMTFDLPSDATVVLNRSSCGKENTSDPSLVIAFGRGHTLTLNFTRNATRYSVQLMSFVYNLSDTHLFPNASSKEIKTVESITDIRADIDKKYRCVSGTQVHMNNVTVTLHDATIQAYLSNSSFSRGETRCEQDRPSPTTAPPAPPSPSPSPVPKSPSVDKYNVSGTNGTCLLASMGLQLNLTYERKDNTTVTRLLNINPNKTSASGSCGAHLVTLELHSEGTTVLLFQFGMNASSSRFFLQGIQLNTILPDARDPAFKAANGSLRALQATVGNSYKCNAEEHVRVTKAFSVNIFKVWVQAFKVEGGQFGSVEECLLDENSMLIPIAVGGALAGLVLIVLIAYLVGRKRSHAGYQTI	3
LAMP2	LELNLTDSENATCLYAKWQMNFTVRYETTNKTYKTVTISDHGTVTYNGSICGDDQNGPKIAVQFGPGFSWIANFTKAASTYSIDSVSFSYNTGDNTTFPDAEDKGILTVDELLAIRIPLNDLFRCNSLSTLEKNDVVQHYWDVLVQAFVQNGTVSTNEFLCDKDKTSTVAPTIHTTVPSPTTTPTPKEKPEAGTYSVNNGNDTCLLATMGLQLNITQDKVASVININPNTTHSTGSCRSHTALLRLNSSTIKYLDFVFAVKNENRFYLKEVNISMYLVNGSVFSIANNNLSYWDAPLGSSYMCNKEQTVSVSGAFQINTFDLRVQPFNVTQGKYSTAEECSADSDLNFLIPVAVGVALGFLIIVVFISYMIGRRKSRTGYQSV	4
trastuzumab scFv	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGSSRSSSSGGGGSGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK	5
ATP1B3	ACGAAGAACGAGAAGAAGTCCCTCAACCAGAGCCTGGCCGAGTGGAAGCTCTTCATCTACAACCCGACCACCGGAGAATTCCTGGGGCGCACCGCCAAGAGCTGGGGTTTGATCTTGCTCTTCTACCTAGTTTTTTATGGGTTCCTGGCTGCACTCTTCTCATTCACGATGTGGGTTATGCTTCAGACTCTCAACGATGAGGTTCCAAAATACCGTGACCAGATTCCTAGCCCAGGACTCATGGTTTTTCCAAAACCAGTGACCGCATTGGAATATACATTCAGTAGGTCTGATCCAACTTCGTATGCAGGGTACATTGAAGACCTTAAGAAGTTTCTAAAACCATATACTTTAGAAGAACAGAAGAACCTCACAGTCTGTCCTGATGGAGCACTTTTTGAACAGAAGGGTCCAGTTTATGTTGCATGTCAGTTTCCTATTTCATTACTTCAAGCATGCAGTGGTATGAATGATCCTGATTTTGGCTATTCTCAAGGAAACCCTTGTATTCTTGTGAAAATGAACAGAATAATTGGATTAAAGCCTGAAGGAGTGCCAAGGATAGATTGTGTTTCAAAGAATGAAGATATACCAAATGTAGCAGTTTATCCTCATAATGGAATGATAGACTTAAAATATTTCCCATATTATGGGAAAAAACTGCATGTTGGGTATCTACAGCCATTGGTTGCTGTTCAGGTCAGCTTTGCTCCTAACAACACTGGGAAAGAAGTAACAGTTGAGTGCAAGATTGATGGATCAGCCAACCTAAAAAGTCAGGATGATCGTGACAAGTTTTTGGGACGAGTTATGTTCAAAATCACAGCACGTGCA	6
BSG	GCTGCCGGCACAGTCTTCACTACCGTAGAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCCTCACCTGCTCCTTGAATGACAGCGCCACAGAGGTCACAGGGCACCGCTGGCTGAAGGGGGGCGTGGTGCTGAAGGAGGACGCGCTGCCCGGCCAGAAAACGGAGTTCAAGGTGGACTCCGACGACCAGTGGGGAGAGTACTCCTGCGTCTTCCTCCCCGAGCCCATGGGCACGGCCAACATCCAGCTCCACGGGCCTCCCAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCGTCAGAACACATCAACGAGGGGGAGACGGCCATGCTGGTCTGCAAGTCAGAGTCCGTGCCACCTGTCACTGACTGGGCCTGGTACAAGATCACTGACTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAACGGCTCCGAGAGCAGGTTCTTCGTGAGTTCCTCGCAGGGCCGGTCAGAGCTACACATTGAGAACCTGAACATGGAGGCCGACCCCGGCCAGTACCGGTGCAACGGCACCAGCTCCAAGGGCTCCGACCAGGCCATCATCACGCTCCGCGTGCGCAGCCACCTGGCCGCCCTCTGGCCCTTCCTGGGCATCGTGGCTGAGGTGCTGGTGCTGGTCACCATCATCTTCATCTACGAGAAGCGCCGGAAGCCCGAGGACGTCCTGGATGATGACGACGCCGGCTCTGCACCCCTGAAGAGCAGCGGGCAGCACCAGAATGACAAAGGCAAGAACGTCCGCCAGAGGAACTCTTCC	7
LAMP1	GCAATGTTTATGGTGAAAAATGGCAACGGGACCGCGTGCATAATGGCCAACTTCTCTGCTGCCTTCTCAGTGAACTACGACACCAAGAGTGGCCCTAAGAACATGACCTTTGACCTGCCATCAGATGCCACAGTGGTGCTCAACCGCAGCTCCTGTGGAAAAGAGAACACTTCTGACCCCAGTCTCGTGATTGCTTTTGGAAGAGGACATACACTCACTCTCAATTTCACGAGAAATGCAACACGTTACAGCGTCCAGCTCATGAGTTTTGTTTATAACTTGTCAGACACACACCTTTTCCCCAATGCGAGCTCCAAAGAAATCAAGACTGTGGAATCTATAACTGACATCAGGGCAGATATAGATAAAAAATACAGATGTGTTAGTGGCACCCAGGTCCACATGAACAACGTGACCGTAACGCTCCATGATGCCACCATCCAGGCGTACCTTTCCAACAGCAGCTTCAGCCGGGGAGAGACACGCTGTGAACAAGACAGGCCTTCCCCAACCACAGCGCCCCCTGCGCCACCCAGCCCCTCGCCCTCACCCGTGCCCAAGAGCCCCTCTGTGGACAAGTACAACGTGAGCGGCACCAACGGGACCTGCCTGCTGGCCAGCATGGGGCTGCAGCTGAACCTCACCTATGAGAGGAAGGACAACACGACGGTGACAAGGCTTCTCAACATCAACCCCAACAAGACCTCGGCCAGCGGGAGCTGCGGCGCCCACCTGGTGACTCTGGAGCTGCACAGCGAGGGCACCACCGTCCTGCTCTTCCAGTTCGGGATGAATGCAAGTTCTAGCCGGTTTTTCCTACAAGGAATCCAGTTGAATACAATTCTTCCTGACGCCAGAGACCCTGCCTTTAAAGCTGCCAACGGCTCCCTGCGAGCGCTGCAGGCCACAGTCGGCAATTCCTACAAGTGCAACGCGGAGGAGCACGTCCGTGTCACGAAGGCGTTTTCAGTCAATATATTCAAAGTGTGGGTCCAGGCTTTCAAGGTGGAAGGTGGCCAGTTTGGCTCTGTGGAGGAGTGTCTGCTGGACGAGAACAGCATGCTGATCCCCATCGCTGTGGGTGGTGCCCTGGCGGGGCTGGTCCTCATCGTCCTCATCGCCTACCTCGTCGGCAGGAAGAGGAGTCACGCAGGCTACCAGACTATC	8
LAMP2	TTGGAACTTAATTTGACAGATTCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCAGATGAATTTCACAGTACGCTATGAAACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGCACTGTGACATATAATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGAATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGTTCGGACCTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACTTATTCAATTGACAGCGTCTCATTTTCCTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGAAGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTTTTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCAATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATGTTGTCCAACACTACTGGGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACAAATGAGTTCCTGTGTGATAAAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACACCACTGTGCCATCTCCTACTACAACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACTTGTCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTCAGGATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAATACAACTCACTCCACAGGCAGCTGCCGTTCTCACACTGCTCTACTTAGACTCAATAGCAGCACCATTAAGTATCTAGACTTTGTCTTTGCTGTGAAAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGTATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTGGGATGCCCCCCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTAAGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACAAGGAAAGTATTCTACAGCTGAAGAATGTTCTGCTGACTCTGACCTCAACTTTCTTATTCCTGTTGCAGTGGGTGTGGCCTTGGGCTTCCTTATAATTGTTGTCTTTATCTCTTATATGATTGGAAGAAGGAAAAGTCGTACTGGTTATCAGTCTGTG	9
trastuzumab scFv	GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGGGGAAGCCTGCGGCTGAGTTGCGCCGCTTCTGGCTTCAACATCAAAGATACCTACATCCACTGGGTGAGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTGGCCAGAATCTACCCCACAAATGGCTACACCAGGTATGCCGATAGCGTCAAGGGCAGATTTACCATCAGCGCCGACACTTCAAAGAACACCGCCTATCTGCAGATGAACTCCCTGCGCGCCGAAGACACCGCCGTGTACTACTGTTCTCGGTGGGGCGGCGATGGCTTCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCTAGCGGGGGAAGCTCCAGGTCCAGCTCTTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGAGGAGGCGACATCCAGATGACCCAGTCACCAAGTTCTCTGAGCGCTTCCGTGGGCGATCGCGTGACCATCACCTGCCGGGCTTCACAGGACGTGAACACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCAAAGCCCCCAAACTCCTGATCTACTCCGCCAGTTTCCTGTATTCTGGCGTTCCTAGTAGATTTAGTGGAAGCAGGAGCGGGACTGATTTCACTCTGACCATTAGCTCTCTGCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTATTGCCAGCAGCACTACACCACCCCCCCAACTTTCGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAA	10

Claims (25)

1. 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클로서, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 앵커단백질은 세포 유래 베지클의 막에 삽입되어 있는 것인, 세포 유래 베지클.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 세포 유래 베지클은 상기 앵커단백질이 과발현된 세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 세포 유래 베지클.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 세포 유래 베지클은 상기 세포를 압출하여 수득되는 것인, 세포 유래 베지클.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 세포는 줄기세포, 면역세포, 혈구세포, 배아세포, 지방세포, 및 배아 신장세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 세포 유래 베지클.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 앵커단백질은 상기 세포 유래 베지클이 기원한 세포 또는 상기 세포로부터 생산되는 엑소좀 (exosome)과 비교하여 상기 세포 유래 베지클에 더 높은 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는, 세포 유래 베지클.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 앵커단백질은 생물학적 활성분자와 결합된 것인, 세포 유래 베지클.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 생물학적 활성분자는 상기 세포 유래 베지클의 막 외부 또는 내부에 위치하는 것인, 세포 유래 베지클.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 생물학적 활성분자는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 화합물, 천연물, 바이러스, 반합성 물질 (semi-synthetic drugs), 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome), 및 독소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 단백질은 항체, 항체 단편, 성장인자, 효소, 핵산분해효소, 전사인자, 항원성 펩타이드, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 신호 (signaling) 단백질, 링커 단백질, 바이러스 단백질, 자연 단백질, 재조합 단백질, 단백질 복합체, 형광 단백질, 치료 단백질, 화학적으로 개질된 단백질, 및 프리온 (prions)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포 유래 베지클.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 항체는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, 미니바디, 디아바디, 및 나노바디로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 세포 유래 베지클.
    
12. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 활성분자는 표적형 리간드 (targeting ligands)이고, 상기 세포 유래 베지클은 상기 표적형 리간드의 표적을 발현하는 세포에 결합하는 것을 특징으로 하는, 세포 유래 베지클.
    
13. (S1) 세포에 앵커단백질-코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 및
    (S2) 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 압출하여 세포 유래 베지클을 수득하는 단계를 포함하는, 제1항의 세포 유래 베지클의 제조방법으로서,
    상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클의 제조방법.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 재조합 벡터의 상기 세포로의 도입은 상기 재조합 벡터를 포함하는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 단순포진바이러스, 및 백시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상에 의한 것인, 세포 유래 베지클의 제조방법.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 1 내지 30 MOI (Multiplicity of infection)의 바이러스에 의해 감염되는 것인, 세포 유래 베지클의 제조방법.
    
16. 제13항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 생물학적 활성분자-코딩 유전자를 더 포함하고, 상기 생물학적 활성분자는 상기 앵커단백질에 결합된 상태로 발현되는 것인, 세포 유래 베지클의 제조방법.
    
17. 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포로서, 외인성의 앵커단백질-코딩 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 세포 유래 베지클을 생산하기 위한 세포.
    
18. 제17항의 세포를 압출하여 수득되는 세포 유래 베지클.
    
19. 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 약물 전달용 조성물로서, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약물 전달용 조성물.
    
20. 제19항에 있어서,
    상기 약물은 항체 또는 이의 단편, 치료 단백질, 및 치료 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 약물 전달용 조성물.
    
21. 제19항에 있어서,
    상기 약물은 상기 세포 유래 베지클의 앵커단백질에 결합되거나; 또는 상기 세포 유래 베지클의 내부 또는 막에 탑재된 것인, 약물 전달용 조성물.
    
22. 제19항에 있어서,
    상기 세포 유래 베지클은 표적형 리간드를 더 포함하는 것이고, 상기 표적형 리간드는 상기 앵커단백질에 결합되어 상기 세포 유래 베지클의 막 외부에 위치하는 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
    
23. 제22항에 있어서,
    상기 세포 유래 베지클은 상기 표적형 리간드의 표적을 발현하는 세포에 결합하는 것을 특징으로 하는, 약물 전달용 조성물.
    
24. 앵커단백질이 과발현된 세포 유래 베지클을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 세포 유래 베지클은 항암제가 탑재된 것이고, 상기 앵커단백질은 Basigin, ATP1B3, LAMP1, 및 LAMP2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
25. 제24항에 있어서,
    상기 항암제는 앵커단백질에 결합된 것인, 약학적 조성물.