CN118105501A - 一种在体构建CAR-M细胞疗法的靶向性mRNA-LNP递送系统及制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在体构建CAR‑M细胞疗法的靶向性mRNA‑LNP递送系统及制法和应用，所述递送系统以表达嵌合抗原受体CAR的mRNA为核心，外层包覆由复合脂质组成的靶向性脂质纳米颗粒LNP脂质膜而得；本发明的mRNA‑LNP递送系统能够实现在体CAR‑M的高效制备，通过有效吞噬、杀伤肿瘤细胞或者成纤维细胞，达到治疗肿瘤或者纤维化的效果。

Description

一种在体构建CAR-M细胞疗法的靶向性mRNA-LNP递送系统及 制法和应用

技术领域

本发明涉及一种靶向性mRNA-LNP递送系统，尤其涉及一种在体构建CAR-M细胞疗法的靶向性mRNA-LNP递送系统，还涉及上述递送系统的制法和应用。

背景技术

CAR-T细胞疗法即嵌合受体T细胞疗法，是将细胞在体外培养，并使用病毒载体编辑使之形成嵌合受体，筛选、扩增后回输体内治疗疾病的免疫细胞疗法。近年来，细胞免疫疗法发展迅速，其中嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在治疗恶性肿瘤，特别是血液瘤中取得了重大突破，然而CAR-T疗法也存在无法进入实体瘤、肿瘤免疫抑制微环境、价格昂贵、生产工艺复杂等局限性，截止到目前为止，CAR-T疗法仍然无法有效治疗实体瘤。

嵌合受体巨噬细胞疗法(CAR-M)，作为免疫细胞疗法又一创新，可以克服CAR-T细胞疗法的固有局限。巨噬细胞与恶性肿瘤的发生、发展与纤维化进程密切相关，同时，巨噬细胞具有穿透力强、可塑性高，能克服肿瘤乏氧、营养匮乏和免疫抑制，有效吞噬、杀伤靶细胞的特点，因此，CAR-M细胞可以直接杀伤肿瘤细胞，具有穿透性强、可塑性高，可以改善免疫抑制微环境，激活适应性免疫，协同其他免疫细胞浸润等特点。

目前主流的CAR-T和CAR-M疗法仍由病毒载体离体制备产生，其中以美国生物制药公司Carisma Therapeutics研发的CAR-M疗法“CT-0508”发展最为迅速，目前已进入临床试验阶段。然而，应当指出的是，由于巨噬细胞无法进行体外扩增，并且是天然的病毒清除者，传统慢病毒介导的离体型CAR-M面临着比CAR-T(可扩增)更为严峻的工艺复杂(巨噬细胞需现用现提取)、劳动密集、价格昂贵、病毒载体抗性及其导致的编辑效率低下的问题。因此，使用靶向性mRNA-LNP递送系统，在体构建CAR-M不仅可以解决CAR-M生成效率低的问题，还可以克服工艺复杂、劳动密集、成本高昂等问题，以较低的价格满足广大临床治疗需求。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种高效、安全的在体构建CAR-M细胞的靶向性mRNA-LNP递送系统，规避现有CAR细胞疗法的缺陷，克服传统细胞疗法中工艺繁琐、价格昂贵、编辑效率低等技术问题，并提供上述mRNA-LNP递送系统的制法及其在治疗恶性肿瘤和纤维化疾病方面的应用。

技术方案：本发明的在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统，以表达嵌合抗原受体CAR的mRNA为核心，外层包覆由复合脂质组成的靶向性脂质纳米颗粒LNP脂质膜而得；所述复合脂质包括十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(8-壬氧基)-8-氧代辛基氨基)辛酸酯(M5)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、聚乙二醇(PEG)、胆固醇、甘露糖-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Mannose)或二肉豆蔻酰-sn-甘油聚乙二醇甘露糖(DMG-PEG-Mannose)。

其中，所述嵌合抗原受体为成纤维细胞活化蛋白FAP，所述表达嵌合抗原受体CAR的mRNA，是通过构建重组质粒，提取定量得到质粒DNA，进行PCR扩增，纯化并体外转录而得。

其中，所述嵌合抗原受体的靶蛋白可为传统离体型CAR细胞疗法中靶蛋白的任意一种或者多种。所述表达CAR的mRNA，其靶蛋白为GPC3、MUC1或FAP中的一种或多种；具体为，所述嵌合抗原受体的靶蛋白为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Glypican-3(GPC3)或Mucin-1(MUC1)中的一种或多种。

其中，当靶蛋白为GPC3，所述表达GPC3CAR的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示；当靶蛋白为MUC1，所述表达MUC1CAR的mRNA序列如SEQ ID NO.2所示；当靶蛋白为FAP，所述表达FAPCAR的mRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所述脂质纳米颗粒，M5、DSPC、PEG、胆固醇、DSPE-PEG-Mannose的摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2，或M5、DSPC、PEG、胆固醇、DMG-PEG-Mannose的摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2。

上述在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统的制备方法，包括以下步骤：

(1)合成表达嵌合抗原受体CAR的mRNA；

(2)取M5、DSPC、PEG、胆固醇、DSPE-PEG-Mannose或DMG-PEG-Mannose混合，采用无水乙醇配制成Lipid混合液；

(3)取步骤(1)制得的mRNA稀释在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，配制成mRNA稀释液；

(4)采用微流控技术，取步骤(3)制得的mRNA稀释液和步骤(2)制得的Lipid混合液按照1～3:0～1的流速比进行自组装，得到mRNA脂质纳米制剂，超滤纯化后得到在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统。

其中，步骤(1)中，所述mRNA的合成，具体为设计序列后构建重组质粒、合成、PCR扩增后经体外转录(IVT)和加帽制备得到。

其中，步骤(2)中，M5、DSPC、PEG、胆固醇、DSPE-PEG-Mannose的摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2，或M5、DSPC、PEG、胆固醇、DMG-PEG-Mannose的摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2。

其中，步骤(3)中，mRNA稀释在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，制得的mRNA稀释液为0.05 -0.1mg/mL。

其中，步骤(4)中，所述自组装的mRNA稀释液和Lipid混合液流速比为1～3:0.5～1.5。

上述mRNA-LNP递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中，所述肿瘤为恶性实体肿瘤，所述mRNA-LNP递送系统联合抗肿瘤药物达到抗肿瘤效果的提升，所述抗肿瘤药物为吉西他滨GEM或PD-1抑制剂。

上述mRNA-LNP递送系统在制备治疗纤维化疾病药物中的应用。

发明原理：本发明提出开发一种在体CAR-M细胞疗法用于杀伤肿瘤细胞或成纤维细胞，治疗临床上亟待解决的恶性肿瘤和纤维化疾病，解决目前CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的局限和传统抗纤维化药物疗效不佳等问题，满足重大临床需求。相较于传统的脂质纳米颗粒递送系统LNP无法实现特定器官、组织、细胞的靶向，本发明通过筛选并优化Mannose修饰(巨噬细胞上CD206受体特异性结合)的DMG-PEG或者DSPE-PEG以及LNP各脂质的成分和比例，获得了具有高效靶向M2巨噬细胞的mRNA-LNP递送系统，实现mRNA精准编辑M2巨噬细胞，在体内高效生成CAR-M。

有益效果：本发明和现有技术相比，具有如下优点：(1)通过靶向性mRNA-LNP递送系统，高效地在体内制备CAR-M，可克服基于慢病毒载体的传统离体型CAR-M的编辑效率低、劳动密集、工艺复杂、价格高昂等问题，显著提高CAR-M的编辑效率，以较低的价格满足广大的临床治疗需求；(2)靶向性mRNA-LNP递送系统制备的在体CAR-M，具有高效的肿瘤内巨噬细胞靶向能力，相比于非靶向性的mRNA LNP递送系统，其制备的CAR-M在肿瘤中的蓄积和存活时间都显著延长；(3)制备的FAP CAR-M抗纤维化作用大幅增强，对于肿瘤细胞外基质的吞噬作用增强；(4)FAP CAR-M联合胰腺癌一线化疗药物(吉西他滨)和PD-1免疫检查点抑制剂，可显著增敏化疗、免疫治疗的疗效，可为临床胰腺癌治疗提供新的治疗策略。

附图说明

图1为DMG-MLNP递送EGFP-mRNA靶向Raw264.7来源的M2巨噬细胞的荧光成像；

图2为DMG-MLNP递送EGFP-mRNA靶向BMDM来源的M2巨噬细胞的荧光成像；

图3为LNP-mRNA诱导BMDM来源M2巨噬细胞表达FAP CAR的代表性流式图谱(A)和定量分析结果(B)；

图4为Mannose阻断后，巨噬细胞表达FAP CAR的代表性流式图谱(A)与定量分析结果(B)；

图5为FAP CAR-M吞噬靶细胞293T-FAP的代表性流式图谱；

图6为FAP CAR-M与Macrophage对照组吞噬靶细胞的荧光图像；

图7为静脉注射LNP mRNA(Luc)、DMG-MLNP mRNA(Luc)后不同时间点小鼠的小动物荧光成像结果；

图8为注射后60h各器官中的mRNA荧光表达成像与各器官中表达的Luc定量分析结果；

图9为静脉注射靶向性LNP-mRNA 12h后静脉注射依文思蓝(40mg/kg)，2h后肿瘤组织内的依文思蓝蓄积；

图10生理盐水、FAP CAR-M、PD-1、GEM、FAP CAR-M联合GEM不同治疗组初次给药22天后肿瘤组织羟脯氨酸(HYP)含量；

图11小鼠FC1242胰腺癌皮下瘤模型生理盐水、FAP CAR-M、PD-1、GEM、FAP CAR-M联合GEM不同治疗组随给药时间的肿瘤体积变化；

图12生理盐水、FAP CAR-M、PD-1、GEM、FAP CAR-M联合GEM末次给药2天后小鼠血清AST/ALT水平。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，实施例中所用的试验材料均可通过常规途径购得。

实施例1

mRNA的制备：

本实施例中嵌合抗原受体(CAR)为EGFP和FAP(EGFP增强绿色荧光蛋白和FAP成纤维细胞活化蛋白)，通过NCBI数据库查找EGFP和FAP mRNA序列，合理设计序列后，构建重组质粒pUC-EGFP和pUC-FAP质粒，合成并制备含重组质粒的大肠杆菌。蘸取含有EGFP和FAP目标质粒的大肠杆菌菌液适量，37℃培养箱过夜培养。挑取三个单克隆菌斑放入15mL离心管中，于37℃，220rpm/min条件下培养14～18h。观察到菌液浑浊后取出，用TIANGEN小提质粒试剂盒提取质粒。提取pEGFP和pFAP质粒并定量。混匀后37℃PCR仪2h。加入2μL DNase I,将PCR产物加无菌水补充至50μL，吹打混匀，37℃×15min，以去除DNA模板。向100μL样本中加入200μL RNA cleanup binding buffer。加入300μL无水乙醇，吹打混匀。将纯化柱置于收集管中，液体转移至纯化柱，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500μL RNA cleanup washbuffer，12000rpm，离心1min。重复上一步骤，将柱子转移到RNase-free 1.5mL离心管。使用100μL无菌水洗脱，静置5min，12000rpm继续离心1min，收集样本置于-80℃保存，得到相应mRNA。

实施例2

在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统的制备：

(1)合成表达CAR的mRNA；

(2)醇相配制：取脂质材料，溶于无水乙醇，浓度为20mg/mL，其中脂质材料M5、DSPC、PEG、Cholesterol、DSPE-PEG-Mannose按照摩尔比50:10:1.5:38:0.5或50:10:1.5:37.5:1的比例混合；或取脂质材料M5、DSPC、PEG、Cholesterol、DMG-PEG-Mannose按照摩尔比50:10:1.5:38:0.5或50:10:1.5:37.5:1比例混合溶液，之后用无水乙醇配制成浓度为2.85mg/mL Lipid混合液；

(3)水相配制：取1000μg mRNA(1mg/mL)稀释在10mM的pH 4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配制得到0.05mg/mL mRNA稀释液；

(4)采用微流控技术，取步骤(3)制得的mRNA稀释液和步骤(2)制得的Lipid混合液进行自组装，质量比mRNA/Lipid＝1/20，设置参数为Volume＝2.67mL；Flow rate ratio＝2:1，Total flow rate＝12mL/min，T＝30.0℃，Start waste＝0.35mL，End waste＝0.10mL，得到mRNA脂质纳米制剂；进行超滤纯化，用PBS(pH4)(1-3倍溶液体积)稀释，之后将其转移至超滤管进行离心超滤，超滤参数：4000rpm，4℃，30min。待离心管中样品剩余0.5-1.0mL时再次加入约2mLPBS，待离心管中样品剩余0.5mL以下时，收集样品放置于4℃冰箱保存，得到在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统。

实施例3

巨噬细胞靶向性LNP-mRNA递送系统筛选：

以LNP的粒径、包封率以及在巨噬细胞中的EGFP mRNA表达效率为指标，筛选LNP-mRNA靶向性递送系统。首先，使用纳米粒度仪和Zeta电位分析仪测定靶向性LNP(DSPE-MLNP、DMG-MLNP)的粒径与包封率，结果如表1所示：

表1、靶向性LNP(DSPE-MLNP、DMG-MLNP)的粒径与包封率检测

注：靶向性LNP组成比例为M5:DSPC:PEG:Cholesterol:X＝50:10:1.5:38.5-Y:Y

如图2所示，进一步构建了包裹EGFP-mRNA的靶向性LNP在Raw264.7来源和BMDM来源的M2巨噬细胞，并进行了荧光成像，M5/DSPC/PEG/胆固醇/DMG-PEG-Mannose(摩尔比为50/10/1.5/37.5/1)组显示出强烈的荧光强度，与表1共同说明，使用M5/DSPC/PEG/胆固醇/DMG-PEG-Mannose(摩尔比为50/10/1.5/37.5/1)形成的LNP，其粒径、包封率以及其递送的mRNA在细胞中的表达都较好，故优选该比例LNP进行后续研究。

实施例4

FAP CAR-M吞噬FAP过表达靶细胞能力评价：

采用流式细胞术研究靶向性LNP-mRNA体外诱导FAP CAR表达的能力，如图3所示，相比于LNP组，DMG-LNP组显著地提高了巨噬细胞表达CAR的效率。

为探究Mannose是否促进LNP-mRNA递送系统向巨噬细胞靶向，对于巨噬细胞进行Mannose预处理以阻断受体，如图4结果显示，Mannose预处理后，DMG-MLNP组的CAR表达显著下降，而对照组CAR表达水平降低较少，表明DMG-MLNP通过Mannose与巨噬细胞表面的CD206(Mannose)受体结合，进而提高CAR表达。

为研究FAP CAR-M细胞是否可以有效吞噬靶细胞，构建了过表达FAP的293T细胞，将FAP CAR-M细胞分别与293T和293T-FAP共孵育，如图5流式结果显示，相比于对照组细胞，FAP CAR-M细胞显著提高了对293T-FAP的吞噬效果，尤其是在效靶比为1:1时，特异性吞噬效率高达60％。

此外，如图6免疫荧光成像进一步证实了FAP CAR-M细胞对于靶细胞的特异性吞噬，而未经编辑的巨噬细胞吞噬效率较低，而CAR-M吞噬效率较高。以上结果显示，FAP CAR-M细胞可以有效吞噬过表达FAP的靶细胞。

实施例5

靶向性LNP-mRNA的体内肿瘤靶向研究：

使用胰腺癌模型评价靶向性LNP包裹的mRNA(Luc)的肿瘤靶向性研究。原位接种胰腺癌细胞14天后，静脉注射10mg/mouse的靶向性LNP-mRNA，通过小动物成像仪观察荧光素的分布以研究靶向性LNP的组织分布和体内靶向性。结果如图7所示，传统LNP显著富集于肝脏和胰腺癌组织中，而DMG-MLNP更倾向于在胰腺癌组织中富集。相比于LNP，DMG-MLNP在肿瘤组织中续集时间更长。

为了进一步确定靶向性LNP的体内分布，将小鼠的器官解剖出来进行荧光成像分析。结果如图8所示，DMG-MLNP组的胰腺癌中荧光表达强度显著高于LNP组小鼠的胰腺癌中荧光强度。相比于正常组织，靶向性DMG-MLNP的肿瘤靶向性提高了几百倍。这些结果表明相比于传统LNP递送系统，本发明构建的靶向性DMG-MLNP具有更强的胰腺癌靶向性。

实施例6

靶向性LNP-mRNA的体内抗纤维化作用：

使用胰腺癌模型评价靶向性LNP包裹的mRNA(Luc)的体内抗纤维化作用，构建了小鼠FC1242胰腺癌皮下瘤模型。胰腺癌肿瘤外致密的细胞外基质阻止依文思蓝染料的浸润，而FAP CAR-M细胞对于细胞外基质成分特异性吞噬增加依文思蓝瘤内蓄积。因此，发明人对皮下瘤荷瘤小鼠静脉注射靶向性LNP-mRNA 12h后，静脉注射依文思蓝(40mg/kg)，2h后进行解剖取肿瘤组织，粉碎后经DMF萃取，取上清液使用紫外分光光度计在620nm波长下检测各样本中依文思蓝浓度。

结果如图9所示，Mannose-LNP组肿瘤组织内依文思蓝显著蓄积，表明FAP CAR-M细胞对肿瘤细胞外基质的吞噬作用。纤维胶原(如I型胶原和III型胶原)是胰腺癌细胞外基质(ECM)中最丰富的ECM蛋白，其中羟脯氨酸(HYP)是胶原组织的主要成分之一，约占胶原氨基酸总量的13％。

在治疗后22天取肿瘤组织，采用碱水解法，通过羟脯氨酸氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色原理，根据其呈色的深浅计算含量。结果如图10所示，单用FAP CAR-M治疗和联合吉西他滨(GEM)治疗显著降低了HYP水平。

实施例7

靶向性LNP-mRNA的体内抗肿瘤肿瘤疗效：

发明人使用胰腺癌模型评价靶向性LNP包裹的mRNA(Luc)的体内抗肿瘤疗效，构建了小鼠FC1242胰腺癌皮下瘤模型。将构建皮下瘤小鼠成功的小鼠分为6组，采用尾静脉注射的方式进行给药，分别给予生理盐水200μL/只、FAPCAR-M(mRNA 5mg/只)、PD-1 5mg/kg、GEM20mg/kg、FAPCAR-M(mRNA 5mg/只)联合GEM 20mg/kg。从给药第0天，每隔2天，使用测径器测量肿瘤大小。

结果如图11所示，单用FAPCAR-M治疗显示出较好的抗肿瘤疗效，联合吉西他滨(GEM)治疗显示出最佳的抗肿瘤效果。以上结果表明，通过靶向性LNP-mRNA用于体内生成FAP CAR-M细胞具有良好的抗肿瘤效果。

实施例8

靶向性LNP-mRNA的安全性验证：

在末次给药后2天，取小鼠血清检测AST/ALT水平，如图12所示，所有治疗组均未显示出与生理盐水对照组显著的AST/ALT水平差异，表明靶向性LNP-mRNA用于体内产生FAPCAR-M细胞的安全性较好。

Claims (10)

1.一种在体构建CAR-M细胞疗法的靶向性mRNA-LNP递送系统，其特征在于，所述递送系统以表达嵌合抗原受体CAR的mRNA为核心，外层包覆由复合脂质组成的靶向性脂质纳米颗粒LNP脂质膜而得；所述复合脂质包括庚烷-9-基-8-((2-羟乙基)(8-壬氧基)-8-氧代辛基氨基)辛酸酯(M5)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、聚乙二醇(PEG)、胆固醇、甘露糖-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Mannose)或二肉豆蔻酰-sn-甘油聚乙二醇甘露糖(DMG-PEG-Mannose)。

2.根据权利要求1所述的递送系统，其特征在于，所述嵌合抗原受体的靶蛋白可为传统离体型CAR细胞疗法中靶蛋白的任意一种或者多种。

3.根据权利要求2所述的递送系统，其特征在于，所述传统离体型CAR细胞疗法中靶蛋白为成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Glypican-3(GPC3)或Mucin-1(MUC1)等靶蛋白中的一种或多种；当靶蛋白为GPC3，所述表达GPC3CAR的mRNA序列如SEQ ID NO.1所示；当靶蛋白为MUC1，所述表达MUC1 CAR的mRNA序列如SEQ ID NO.2所示；当靶蛋白为FAP，所述表达FAPCAR的mRNA序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的递送系统，其特征在于，所述脂质纳米颗粒，为M5、DSPC、PEG、胆固醇、DSPE-PEG-Mannose，其摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2，或M5、DSPC、PEG、胆固醇、DMG-PEG-Mannose，其摩尔比为30-50：10：1-2：30-38：0.5-2。

5.一种权利要求1所述的在体构建CAR-M细胞疗法的靶向性mRNA-LNP递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成表达嵌合抗原受体CAR的mRNA；

(2)取M5、DSPC、PEG、胆固醇、DSPE-PEG-Mannose或DMG-PEG-Mannose混合，采用无水乙醇配制成Lipid混合液；

(3)取步骤(1)制得的mRNA稀释在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，配制成mRNA稀释液；

(4)采用微流控技术，取步骤(3)制得的mRNA稀释液和步骤(2)制得的Lipid混合液进行自组装，超滤纯化后得到在体构建CAR-M细胞的mRNA-LNP递送系统。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述mRNA的合成，具体为设计序列后构建重组质粒、合成、PCR扩增后经体外转录(IVT)和加帽制备得到。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述自组装的mRNA稀释液和Lipid混合液流速比为1～3:0.5～1.5。

8.一种权利要求1所述mRNA-LNP递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为恶性实体肿瘤。

10.一种权利要求1所述mRNA-LNP递送系统在制备治疗纤维化疾病药物中的应用。