CN116286990A - 特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法与应用 - Google Patents

特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法与应用。本发明通过基因工程构建CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞株，体外抽提细胞膜、修饰AS1411适配体及装载化疗药物多柔比星(Doxorubicin，DOX)，制备工程化纳米囊泡药物递送系统。本发明制备的工程化纳米囊泡药物递送系统，通过体内体外实验证明：兼具靶向三阴性乳腺癌、抑制转移及诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡等多重作用。本发明填补了细胞外囊泡作为药物载体的不足，为三阴性乳腺癌的临床治疗提供了新的思路和科学依据。

Description

特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种兼具靶向恶性乳腺癌、抑制转移及诱导恶性乳腺癌细胞凋亡等多重作用的工程化纳米囊泡。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性的健康。与其他亚型相比，三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)的异质性及恶性程度较高，更容易出现转移和复发，预后更差，确诊后前5年内死亡率高达40％。由于缺乏重要的表达受体，新型的干预疗法，例如内分泌治疗、HER-2靶向治疗、免疫疗法及新辅助化疗等对其治疗作用有限，因此长期以来手术辅助化疗仍是其主要疗法。但由于缺乏化疗特异性靶向，常规的手术后辅助放化疗难以清除全部的病灶，遗留的小部分转移灶最终仍会导致肿瘤的复发。因此迫切需要寻找新的治疗靶点及治疗方案。
细胞膜来源纳米囊泡类似于外泌体(exosomes)，来源于细胞，具有良好的生物相容性；且在细胞膜抽提过程中可有效将核酸等具有风险的遗传物质彻底去除；此外，相较于外泌体，抽提细胞膜，再通过超声破碎、挤压等处理，可大规模制备纳米囊泡，实现药物载体的标准化。因此，细胞膜来源的纳米囊泡未来可能代替外泌体成为新一代有潜力的药物载体。外泌体和细胞膜来源的纳米囊泡作为药物载体，由于缺乏特异靶向性是其应用的关键瓶颈。恶性肿瘤的复发转移是目前肿瘤治疗的难点，迫切需要新的治疗靶点和治疗策略。
发明内容
本发明的目的在于通过制备肿瘤特异靶向和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡运载化疗药物，为恶性肿瘤治疗提供一个新的策略。本发明通过基因工程构建肿瘤转移抑制分子CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞株，体外抽提细胞膜、修饰核酸适配体AS1411及装载化疗药物DOX，制备工程化纳米囊泡运载化疗药物。通过体内体外实验证明，该囊泡兼具靶向恶性肿瘤细胞、抑制转移及诱导恶性肿瘤细胞凋亡等多重功能。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案如下：
特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法，包括：
步骤1、制备富集肿瘤转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE细胞膜；
通过基因工程克隆人源CD82分子的全长cDNA片段，插入慢病毒表达载体pLV-EF1α-MCS-IRES Bsd上，包装慢病毒并感染细胞正常肺上皮HBE细胞，通过Blasticidin抗生素筛选获得稳定过表达CD82分子的HBE细胞株。将体外抽提的细胞膜通过超声制备成细胞膜悬液，获得过表达肿瘤转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE细胞膜悬液。
步骤2、制备特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡；
通过化学方法合成核酸适配体AS1411并共价结合胆固醇分子，合成的AS1411适配体偶联至步骤1制备的富集转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE细胞膜，获得特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜悬液。通过探头超声破碎，将超声破碎后的细胞膜悬液4℃存放10-20小时，便于细胞膜的恢复；使用Avanti脂质体挤出机，推动细胞膜悬液通过200nm膜10-15次，获得直径为200nm的特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡。
本发明同时提供了特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡作为药物载体运载化疗药物的应用，所述应用为利用上述方法制备的纳米囊泡作为药物载体装载化疗药物制备特异性靶向肿瘤和转移抑制恶性乳腺癌的化疗制剂。可选的，本发明使用的化疗药物为多柔比星(Doxorubicin,DOX)，药物装载方法是：按纳米囊泡和DOX的质量比为1:2，取125μL的400μg/mL DOX溶液，加入200μg偶联AS1411适配体的CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞的细胞膜悬液，补1×PBS至250μL，即DOX终浓度为200μg/mL，混匀后，室温孵育4小时，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL1×PBS重悬，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL 1×PBS重悬，4℃储存；获得装载DOX的偶联AS1411适配体的CD82过表达HBE细胞膜；按照步骤2所述方法制备装载DOX的偶联AS1411适配体和CD82过表达的细胞膜来源载药纳米囊泡，获得特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源DOX载药纳米囊泡。
本发明的优点和有益效果：
本发明公开了一种制备特异靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法和应用，通过基因工程构建CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞株，体外抽提细胞膜、修饰AS1411适配体，获得具有特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡。该纳米囊泡具有特异性靶向肿瘤，和有效抑制肿瘤细胞转移的功能，可以有效克服目前恶性肿瘤治疗中缺乏针对肿瘤转移的治疗瓶颈；此外，该纳米囊泡可应用于药物载体，装载化疗药物可选的，可以有效装载化疗药物DOX，特异性靶向肿瘤可以有效提高化疗药物的治疗效果和降低化疗副作用。通过体内体外实验证明：该纳米囊泡兼具特异性靶向恶性乳腺癌、抑制转移及装载化疗药物DOX诱导恶性乳腺癌细胞凋亡等多重作用。
附图说明
图1：实施例2中的CD82过表达结果，蛋白印迹实验检测HBE-WT及过表达CD82的HBE-CD82细胞系和细胞膜来源纳米囊泡的膜蛋白表达情况和外源CD82表达情况。
图2：实施例3中的核酸适配体AS1411偶联结果，(A)核酸适配体AS1411偶联细胞膜来源纳米囊泡的连接效率。(B)单个细胞膜来源纳米囊泡偶联核酸适配体AS1411的数目。(C)暗场显微镜验证细胞膜来源纳米囊泡的连接核酸适配体AS1411，胞膜来源纳米囊泡带有Dil染色，AS1411带有FAM荧光分子。
图3：实施例4中的DOX装载结果，(A)细胞膜来源纳米囊泡装载化疗药物多柔比星(Doxorubicin,DOX)的装载效率和纳米囊泡的封装效率。(B)装载DOX的纳米囊泡在PH 5.0和PH 7.4环境下的药物释放效率。
图4：实施例5中的体外纳米囊泡靶向结果，体外荧光共聚焦显微镜检测富集CD82细胞膜来源的纳米囊泡和偶联核酸适配体AS1411的富集CD82细胞膜来源的纳米囊泡对恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231及正常乳腺上皮细胞MCF-10A的靶向情况。比例尺＝20μm。
图5：实施例6中的体外纳米囊泡转移抑制结果，体外细胞穿孔迁移实验检测富集CD82的纳米囊泡对恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的影响。比例尺＝200μm。
图6：实施例7中的体外纳米囊泡装载DOX诱导肿瘤细胞凋亡结果，(A)体外免疫荧光蛋白剪接体Caspase3和TUNEL实验法检测纳米囊泡装载DOX处理恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞36h后，诱导细胞凋亡的情况。比例尺＝20μm。(B)体外蛋白印迹实验检测纳米囊泡装载DOX处理恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞36h后，诱导细胞凋亡的情况。
图7：实施例8中的小鼠体内纳米囊泡靶向肿瘤结果，(A)体内小鼠乳腺癌原位瘤模型构建及偶联核酸适配体AS1411细胞膜来源纳米囊泡靶向肿瘤细胞验证实验示意图。(B)体内小鼠乳腺癌原位瘤模型肿瘤组织情况及肿瘤肿瘤重量情况。(C)小鼠器官组织样本成像显示纳米囊泡在不同组织的分别情况，及肿瘤组织相对荧光强度统计结果。
图8：实施例9中的小鼠体内纳米囊泡抑制肿瘤转移结果，(A)体内小鼠乳腺癌原位瘤模型构建及过表达CD82细胞膜来源纳米囊泡抑制肿瘤转移验证实验示意图。(B)体内小鼠乳腺癌原位瘤模型监测小鼠体重及肿瘤体积变化情况，以及两组肿瘤组织重量情况。(C)野生型和过表达CD82细胞膜来源纳米囊泡处理小鼠后肝脏转移及原发灶肿瘤组织样本图像，白色箭头示肝脏转移灶位置。(D)肝脏组织HE染色结果及转移灶数量统计，黑色箭头示转移灶位置，以及两组转移灶统计情况。
图9：实施例10中的小鼠体内纳米囊泡诱导肿瘤细胞凋亡结果，(A)体内小鼠乳腺癌原位瘤模型构建及偶联核酸适配体AS1411过表达CD82并装载DOX细胞膜来源纳米囊泡治疗肿瘤示意图。(B)治疗期间小鼠体重变化和肿瘤体积变化情况。(C)经过治疗后原位瘤组织样本图像与肿瘤重量差异情况。
图10：实施例8中的小鼠体内纳米囊泡靶向肿瘤结果，蛋白免疫印迹实验验证肿瘤组织凋亡相关蛋白表达情况。
图11：实施例8中的小鼠体内纳米囊泡靶向肿瘤结果，体内免疫荧光蛋白剪接体Caspase3和TUNEL实验法检测偶联核酸适配体AS1411过表达CD82并装载DOX细胞膜来源纳米囊泡治疗恶性乳腺癌肿瘤组织细胞凋亡情况。比例尺＝20μm。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步具体说明：
实施例1、制备转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡
通过基因工程方法，克隆人源肿瘤转移分子CD82的全长cDNA在正常肺上皮HBE细胞中过表达，构建CD82过表达细胞株。体外抽提野生型肺上皮细胞HBE细胞和CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞的细胞膜，获得野生型肺上皮细胞HBE细胞膜和富集肿瘤转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE细胞膜悬液；通过探头超声破碎，将超声破碎后的细胞膜悬液4℃存放10-20小时，便于细胞膜的恢复；使用Avanti脂质体挤出机，推动细胞膜悬液通过200nm膜10-15次，获得直径为200nm的纳米囊泡，包括野生型和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡，为以下实施例提供对照和实验材料。
实施例2、检测实施例1制备的转移抑制细胞膜来源纳米囊泡的CD82分子表达情况
通过蛋白质印迹技术实验，检测实施例1制备的野生型和富集CD82分子的转移抑制细胞膜来源纳米囊泡的CD82分子表达情况，以野生型HBE细胞膜及其来源的纳米囊泡为对照，结果表明过表达CD82分子高度富集于细胞膜及其来源的转移抑制纳米囊泡，见图1。
实施例3、制备特异靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡
本发明提供偶联核酸适配体AS1411至细胞膜悬液的方法，可选的，通过胆固醇将AS1411适配体偶联至细胞膜悬液的方法为：订购生工生物工程(上海)股份有限公司合成的核酸适配体AS1411共价结合胆固醇分子，将核酸适配体AS1411偶联至野生型及过表达CD82分子的HBE细胞膜上，分别制备特异靶向肿瘤的野生型和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡。将订购化学合成的AS1411适配体用ddH2O稀释为10μM的工作液，分别取2.5μL，5μL，10μL，20μL工作液加入250μg细胞膜悬液中，终体积为200μL，混匀后，置于37℃水浴中15min；4℃，14000g，离心30min；沉淀加入200μL 1×PBS重悬，4℃储存，获得偶联AS1411适配体的野生型及富集CD82细胞膜悬液；将偶联AS1411适配体的野生型及富集CD82的细胞膜悬液置于盛满冰水的烧杯中，进行探头超声破碎，超声破碎后的细胞膜悬液4℃存放10-20小时，便于细胞膜的恢复；使用Avanti脂质体挤出机，推动细胞膜悬液通过200nm膜10-15次，得到约200nm的偶联AS1411适配体的野生型及富集CD82细胞膜来源的纳米囊泡。制备特异靶向肿瘤的野生型和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡，AS1411适配体和纳米囊泡的连接效率及单个纳米囊泡连接AS1411适配体数目，相关实验验证结果如图2所示，0.02nM的适配体AS1411连接100μg纳米囊泡，其连接效率超过95％，且单个纳米囊泡连接适配体AS1411的数量超过1000足够达到特异靶向肿瘤细胞的能力。
实施例4、制备特异靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源载药纳米囊泡
本发明提供制备特异靶向肿瘤和转移抑制载药纳米囊泡的方法，可选的，纳米囊泡作为良好的化疗药物载体，具有对恶性肿瘤特异靶向、抑制转移及装载化疗药物促进细胞凋亡的三重作用。装载化疗药物，可选的，本发明使用的化疗药物为多柔比星(Doxorubicin,DOX)，药物装载方法是：按纳米囊泡和DOX的质量比为1；2，取的DOX溶液，分别加入200μg偶联AS1411适配体的CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞的细胞膜悬液，补1×PBS至250μL，即DOX终浓度为200μg/mL，混匀后，室温孵育4小时，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL 1×PBS重悬，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL 1×PBS重悬，4℃储存；获得装载DOX的偶联AS1411适配体的CD82过表达HBE细胞膜；使用Avanti脂质体挤出机，将细胞膜悬液推动通过200nm膜制备偶联AS1411适配体和富集CD82分子装载DOX药物的细胞膜来源纳米囊泡。获得多功能纳米囊泡递送化疗药物辅助肿瘤治疗。DOX装载效率和纳米囊泡的包封效率检测及纳米囊泡荷载DOX在不同PH值环境下的释放效率检测，见图3。
实施例5、体外实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡的化疗靶向
通过纳米囊泡吞噬实验，检测AS1411适配体对不同细胞的靶向能力。AS1411适配体3’端有绿色FAM荧光基团修饰，且两种细胞来源的2种纳米囊泡(HBE-CD82-Exo、AS1411-HBE-CD82-Exo)经DiI染色后，分别与恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231及正常乳腺细胞MCF-10A在37℃培养箱中孵育60min。结果显示，连接AS1411适配体的纳米囊泡(AS1411-HBE-CD82-Exo)显著提高靶向恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231，但对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的靶向能力没有变化。没有适配体AS1411修饰的纳米囊泡(HBE-CD82)对MDA-MB-231及MCF-10A细胞的靶向能力没有显著差异，见图4。
实施例6、体外实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡的抑制细胞迁移
将无血清培养的恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231用野生型纳米囊泡和过表达转移抑制分子CD82纳米囊泡处理24小时。随后通过Transwell实验检测纳米囊泡抑制细胞迁移效果，结果表明，野生型纳米囊泡HBE-WT-Exo组与对照组迁移细胞数一致，即正常上皮细胞膜来源纳米囊泡对细胞迁移无明显影响；而过表达转移抑制分子CD82纳米囊泡HBE-CD82-Exo组迁移细胞数明显减少，证明富集CD82的纳米囊泡在体外试验中能够有效抑制恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移，见图5。
实施例7、体外实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡装载DOX的诱导肿瘤细胞凋亡
通过TUNEL实验的检测整体细胞凋亡情况，结果表明，Free-DOX及AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡装载DOX组处理后的恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231几乎都有绿色荧光凋亡信号，凋亡细胞比例接近100％，见图6。免疫荧光检测细胞凋亡分子Cleaved caspase-3在细胞内的表达与定位，与对照组相比，Free-DOX及AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组细胞内Cleaved caspase-3的表达显著上调，证明特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡装载DOX后能够在体外与游离DOX发挥相似的药效，见图6。通过蛋白印迹实验，检测细胞凋亡过程中具体蛋白水平的变化。与对照组相比，Free-DOX及AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组处理MDA-MB-231细胞中促凋亡相关蛋白PARP,Cleaved PARP,Caspase-3、Cleaved caspase-3表达量显著升高，同时抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达显著下调，显著诱导细胞凋亡，见图6。
本发明提供特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡作为良好的化疗药物载体的应用，可选的，在体外实验中，纳米囊泡可特异靶向恶性乳腺癌细胞而对正常乳腺上皮细胞几乎没有靶向、显著抑制恶性乳腺癌细胞的迁移、有效诱导恶性乳腺癌细胞的凋亡。
实施例8、体内小鼠实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡的肿瘤特异靶向
实验小鼠为BALB/c裸鼠(nu/nu)小鼠(4-5周龄，雌性)购自Vital River实验动物技术有限公司(中国北京)，并保存在南开大学的无病原体设施中。所有动物实验均经南开大学动物保护和使用委员会批准，并根据《南开大学动物保护指南》进行处理。构建小鼠肿瘤异种移植模型，将1.5×106个恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下注射到4-5周龄的雌性裸鼠第三对乳房脂肪垫中(每组n＝3)。细胞注射后3周，通过尾静脉分别注射DiR标记的纳米囊泡HBE-CD82-Exo与AS1411-HBE-CD82-Exo，每只小鼠注射30μg细胞膜来源纳米囊泡(约7.5×108个，体系为100μL)，24小时后处死小鼠，并分离肝脏、肺、脾脏、心脏、肾脏、小肠、胃及肿瘤组织，并进行小动物器官样本荧光成像分析，检测纳米囊泡在体内不同器官的分布情况。结果表明AS1411适配体修饰后的纳米囊泡(AS1411-HBE-CD82-Exo)在小鼠荷瘤模型中能够高效靶向肿瘤组织，而没有AS1411适配体修饰的对照组纳米囊泡靶向肿瘤组织较少。在肝脏、肺、脾脏等组织中富集纳米囊泡，且在不同的纳米囊泡组中没有显著差异。即AS1411适配体修饰后的纳米囊泡可以显著提高特异靶向肿瘤组织，见图7。
实施例9、体内小鼠实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡的肿瘤转移抑制能力
实验小鼠为BALB/c裸鼠(nu/nu)小鼠(4-5周龄，雌性)，构建小鼠肿瘤异种移植模型，将1.5×106个恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下注射到4-5周龄的雌性裸鼠第三对乳房脂肪垫中，待其肿瘤大小约400mm3后(约注射肿瘤细胞3周后)，随机将其分为两组，即AS1411-HBE-WT-Exo组与AS1411-HBE-CD82-Exo组(每组n＝3)。每三天分别通过尾静脉注射50μg不同的细胞膜来源纳米囊泡。每三天测量一次体重及肿瘤体积，并使用标准方程式计算：V＝1/2×L×W2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度，W是肿瘤宽度。6周后处死小鼠，取主要组织，并检测分析肿瘤细胞转移情况。结果表明，两组肿瘤肝脏转移有显著差异，纳米囊泡AS1411-HBE-WT-Exo处理组的肝脏组织形成多个明显肉眼可观察到的转移灶，而纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-Exo组的肝脏组织表面光滑，未见明显的转移灶。此外，两组肺组织都没有观察到明显肿瘤转移的情况。为进一步确定肿瘤转移情况，对肝脏组织进行HE染色，以便检测及统计转移灶的数量。结果表明，纳米囊泡AS1411-HBE-WT-Exo组的三只小鼠肝脏组织中都出现显著转移灶，而纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-Exo组仅有一只出现了轻微的转移灶，具体转移灶数量统计表明显著差异，相关实验数据见图8。
实施例10、体内小鼠实验验证特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡诱导肿瘤细胞凋亡
实验小鼠为BALB/c裸鼠(nu/nu)小鼠(4-5周龄，雌性)，构建小鼠肿瘤异种移植模型，将1.5×106个恶性乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下注射到4-5周龄的雌性裸鼠第三对乳房脂肪垫中，待其肿瘤大小约100mm3后(约10天)，随机将其分为三组(每组n＝4)。每三天分别尾静脉注射PBS，3mg/kg Free-DOX及3mg/kg DOX相当量的特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo装载DOX，共注射五次，期间记录小鼠体重及肿瘤体积。结果显示，与对照组相比，Free-DOX组及特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组的小鼠肿瘤体积显著减小，特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组比Free-DOX组更加显著，表明特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组显著诱导肿瘤细胞凋亡，装载DOX的纳米囊泡比游离DOX的治疗效果更好，相关实验结果见图9。
进一步，通过蛋白印迹与免疫荧光实验，从蛋白水平验证肿瘤组织内凋亡相关蛋白的具体变化。结果表明，促凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved PARP及Bax在AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组表达量显著升高。抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达在AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组也有下调的趋势。P53的表达在AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组明显提高，表明显著促进了细胞凋亡，相关实验结果见图10。
最后，通过TUNEL实验和免疫荧光实验验证肿瘤组织细胞凋亡情况。结果表明，AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组中凋亡细胞数所占比例显著高于Free-DOX组及对照组。肿瘤组织的Cleaved caspase-3的免疫荧光染色结果表明，AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组中Cleaved caspase-3的表达量显著提高。证明AS1411-HBE-CD82-DOX-Exo组中显著诱导肿瘤细胞的凋亡情况，见图11。
综上，体外实验和小鼠体内肿瘤模型的结果表明，特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡修饰特异靶向适配体AS1411可以有效促进纳米囊泡特异靶向肿瘤细胞，富集转移抑制分子CD82的可以有效抑制肿瘤细胞的体外迁移和体内转移，荷载DOX的特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡可以有效提高肿瘤治疗效果，同时抑制肿瘤转移。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
本发明提供特异靶向肿瘤和转移抑制纳米囊泡作为良好的化疗药物载体的应用，可选的，通过构建小鼠荷瘤模型，验证纳米囊泡在体内实验中的抗肿瘤作用，结果表明纳米囊泡可高效靶向恶性乳腺癌的肿瘤病灶、抑制恶性乳腺癌转移灶的形成、高效运载抗肿瘤药物至恶性乳腺癌肿瘤病灶抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞凋亡。

Claims (5)

1.制备转移抑制分子CD82过表达细胞膜的方法，其特征在于，通过基因克隆CD82分子的全长cDNA片段，插入慢病毒表达载体pLV-EF1α-MCS-IRES Bsd上，包装慢病毒并感染肺上皮细胞HBE细胞，通过Blasticidin抗生素筛选获得CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞；体外抽提CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞的细胞膜，获得富集肿瘤转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE细胞膜悬液。
2.特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡的制备方法，其特征在于，通过化学方法合成核酸适配体AS1411并共价结合胆固醇分子，合成的AS1411适配体再偶联至权利要求1制备的富集肿瘤转移抑制分子CD82肺上皮细胞HBE的细胞膜，获得偶联AS1411适配体和富集CD82细胞膜的悬液；通过探头超声破碎，将超声破碎后的细胞膜悬液4℃存放10-20小时，便于细胞膜的恢复；使用Avanti脂质体挤出机，推动细胞膜悬液通过200nm膜10-15次，获得150-250nm的特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡。
3.权利要求2所述的制备方法制备的特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源纳米囊泡作为药物载体运载化疗药物的应用，其特征在于，所述应用为利用所述纳米囊泡作为药物载体装载化疗药物制备特异性靶向肿瘤和转移抑制恶性乳腺癌的化疗制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为多柔比星(Doxorubicin,DOX)。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用所述纳米囊泡装载化疗药物多柔比星的方法为：按纳米囊泡和DOX的质量比为1:2，取125μL的400μg/mL DOX溶液，加入200μg偶联AS1411适配体的CD82过表达肺上皮细胞HBE细胞的细胞膜悬液，补1×PBS至250μL，即DOX终浓度为200μg/mL，混匀后，室温孵育4小时，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL 1×PBS重悬，4℃，14000g，离心30min，沉淀加入250μL 1×PBS重悬，4℃储存；获得装载DOX的偶联AS1411适配体的CD82过表达HBE细胞膜，由权利要求2所述的方法制备装载DOX的偶联AS1411适配体和CD82过表达的细胞膜来源载药纳米囊泡，获得特异性靶向肿瘤和转移抑制的细胞膜来源DOX载药纳米囊泡。
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