JP5836940B2 - ソリシジン由来ペプチドならびにｔｒｐｖ−６がんの検出および薬剤送達のための方法 - Google Patents

ソリシジン由来ペプチドならびにｔｒｐｖ−６がんの検出および薬剤送達のための方法 Download PDF

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Description

本発明は、一過性受容体電位バニロイド6(TRPV6)を発現するがんの検出および診断に関する。本発明の特定の実施形態はさらに、診断薬または薬物送達に使用するためのTRPV6発現細胞を標的とするTRPV-6結合化合物に関する。
ソリシジン(NCBI受託番号P0C2C6)は、ブラリナトガリネズミ(Northern Short-tailed Shrew)(Blarina brevicauda)の顎下唾液腺から単離された、54アミノ酸の麻痺性ペプチドである。米国特許第7,119,168号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)はソリシジン、その疼痛および神経筋疾患の治療などの病態に対するこのペプチドの麻痺活性および有用性を記載している。米国特許第7,273,850号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)は、ソリシジンが麻痺活性を有しており、とりわけ、ソリシジンが2種の卵巣がん細胞系においてカルシウムの取り込みを阻害するというデータを提供していることを記載している。
がんに関係するカルシウムイオンチャネルの一群が、無脊椎動物および脊椎動物にわたって見出される一過性受容体電位(TRP)チャネルである。TRPスーパーファミリーの一過性受容体電位バニロイド(TRPV)のメンバーは、それらがバニロイド(例えば、唐辛子由来のカプサイシン)の存在下で活性化されるという発見にちなんで名付けられた。試験されたこれらの受容体の最初の4つ(TRPV1、TRPV2、TRPV3およびTRPV4)はいずれもカプサイシンに応答し、さらに温度および他の環境シグナルの変化の検出に関与した。TRPVサブファミリーの残りの2つ、TRPV5およびTRPV6は、上皮型またはその由来する組織で主として見出され、カルシウムイオンの細胞への流入に関与していた。米国特許第7,7205,108号は、TRPV8、9および10をコードする遺伝子ならびにがんに対するバイオマーカーとしてのそれらの使用および関連する診断法および治療法におけるそれらの使用について記載している。
TRPV6は、腸上皮組織へのカルシウムの移入、したがって、食事からのカルシウムの取り込みに関与するものとして同定された。また、これらのチャネルは、さまざまな量で他の多くの組織中に存在するが、腸上皮細胞、腎臓、胎盤および膵臓に最も顕著に存在することも示された。多くのがん組織およびいくつかの公知の卵巣、乳房、前立腺および白血病がん細胞系において、きわめて高いTRPV6の発現が測定された(Pengら、2000年; Zhuangら、2002年)。
米国特許第7,119,168号 米国特許第7,273,850号 米国特許第7,7205,108号 米国特許第5,688,681号 米国特許第5,688,657号 米国特許第5,683,693号 米国特許第5,667,781号 米国特許第5,665,356号 米国特許第5,591,628号 米国特許第5,510,241号 米国特許第5,503,987号 米国特許第5,501,988号 米国特許第5,500,345号 米国特許第5,496,705号 米国特許第5,512,282号 米国特許第4,828,985号 米国特許第5,225,331号 米国特許第5,124,147号 米国特許第6,348,317号 米国特許出願第20070218502号 米国特許出願第20070020264号
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したがって、TRPV6発現細胞を検出するための化合物および関連する方法が必要とされている。さらに、がんの診断または治療に有用な薬剤の送達のための、TRPV6発現細胞を標的化できる組成物および方法もまた必要とされている。
本発明者らは、TRPV6カルシウムイオンチャネルと結合する化合物を合成した。これらの化合物は、ソリシジンのC末端ペプチドからの連続する一続きのアミノ酸に対して同一性を有する配列の少なくとも一部を有する。特定の場合において、ペプチド成分は化合物全体を意味するが、他の場合、例えば、化合物が薬物または検出可能な標識とコンジュゲートしたペプチドを含む場合、ペプチドは化合物の成分である。
カルシウムチャネル阻害活性を提供するソリシジンの構造が、麻痺活性を引き起こす構造とは別であることは、以前は知られていなかった。本明細書に記載の化合物の蛍光コンジュゲートは、TRPV6抗体との共局在実験において、TRPV6タンパク質を発現する細胞と結合する。TRPV6は、いくつかのがん組織試料および細胞系において過剰発現されることが示されている。TRPV6結合化合物は、がんの同定およびTRPVを発現する細胞に対する抗がん薬活性の標的化に有用である。さらなる態様は、がんの同定および診断におけるTRPV6抗体の使用およびTRPVを発現する細胞に対する抗がん薬活性の標的化のためのTRPV6抗体の使用を含む。加えて、蛍光標識されたTRPV6結合化合物は、in vivoで腫瘍の画像化および同定に有用であることが示されている。さらに、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドは、腫瘍細胞などのTRPV6発現細胞に対する生体分子の標的化に有用であることが示されている。
したがって、いくつかの実施形態は、生体分子にコンジュゲートした一過性受容体電位バニロイド6(TRPV6)結合ペプチドを含む化合物を含む。場合により、化合物は、アミノ酸配列EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(配列番号1)を有するペプチドの全体または一部を含んでもよい。一実施形態において、化合物は配列番号1の9から27個のアミノ酸を含む。一実施形態において、化合物は、配列番号1のC末端配列の連続部分を含む。一実施形態において、化合物は、配列番号1の少なくとも9個の連続するアミノ酸、配列番号1の少なくとも10個の連続するアミノ酸または配列番号1の10個を超える連続するアミノ酸を含む。一実施形態において、化合物は、HPSKVDLPR、KEFLHPSKVDLPRまたはEGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(配列番号1)の1つに対して少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%の同一性を有するTRPV6結合ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、アミノ酸配列のHPSKVDLPRまたはKEFLHPSKVDLPRを含む。
いくつかの実施形態において、生体分子にコンジュゲートしたTRPV6に対する抗体を含む化合物を提供する。
一実施形態において、化合物は、検出可能な標識を有する生体分子を含む。いくつかの実施形態において、生体分子は蛍光物質で、放射活性物質でまたは免疫学的に標識される。一実施形態において、検出可能な標識は、磁気共鳴画像法(MRI)の造影剤を含む。一実施形態において、検出可能な標識は、超常磁性酸化鉄(SPIO)である。
一実施形態において、生体分子は治療薬である。場合により、治療薬は抗がん剤、例えば、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤またはプラチナ系薬剤である。
いくつかの実施形態において、生体分子は小さい薬剤分子、オリゴ糖、抗体、抗体エピトープ、ナノ金属クラスター、放射活性物質で標識された分子、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、プラチナ系薬剤、抗生物質、抗がん剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤もしくは抗レトロウイルス剤、またはホウ素錯体、内在性抗体もしくは治療的に投与された抗体に対するエピトープ、シグナル伝達ペプチドまたは免疫細胞、例えばキラーT細胞を動員するオリゴ糖である。
一実施形態において、TRPV6結合ペプチドと生体分子は、スペーサーを介して結合される。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、複数の生体分子または複数の型の生体分子にコンジュゲートされる。
本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを含有する化合物および医薬として許容可能な担体を含む組成物をさらに含む。場合により、医薬組成物は、生体分子または複数の生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む。
一実施形態は、試料と、EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(配列番号1)を含むペプチドの全体または一部を含むTRP結合ペプチドとを接触させるステップ、およびTRPV6結合ペプチドを検出するステップを含む、試料中のTRPV6タンパク質を検出する方法を含む。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、TRPV6結合ペプチドと選択的に結合する抗体を使用して検出される。
別の実施形態は、試料と、生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む化合物とを接触させるステップおよび次いで生体分子を検出するステップを含む、試料中のTRPV6タンパク質を検出する方法を含む。例えば、一実施形態において、生体分子がフルオロフォアであり、TRPV6結合ペプチドを含む化合物はフルオロフォアを検出することによって検出される。
さらなる実施形態は、試料中のTRPV6の検出に対する本明細書に記載の化合物の使用を含む。一実施形態において、試料は体液、例えば、血液、唾液または尿である。
いくつかの実施形態は、試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質を検出するステップおよび試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量を、対照試料と比較するステップを含み、対照と比較した試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパクの量の増加ががんの指標である、対象由来の試料中のがんを同定する方法に関する。一実施形態において、試料は体液である。いくつかの実施形態において、TRPV6タンパク質は、in vivo、ex vivoまたはin vitroで検出される。TRPV6タンパク質は、本明細書に記載の化合物またはTRPV6に対する抗体を使用して検出され得る。いくつかの実施形態において、TRPV6 mRNAは、PCR、RT-PCRまたはリアルタイム定量的RT-PCRを使用して検出される。いくつかの実施形態において、前記がんは、I期またはII期のがんなどの早期がんである。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物であってよい。試料は、体液、排泄物、組織試料、腫瘍試料または微小胞を含み得る。一実施形態において、体液は、血液、尿、唾液、血漿、脳脊髄液、粘液、膣分泌物、リンパ液または胸膜液である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、乳がん、卵巣がん、血液のがん、脳腫瘍、網膜のがん、肝臓がん、甲状腺がん、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、グリアのがん、白血病または子宮内膜がんの同定に使用される。一実施形態において、がんは転移がんまたはリンパ節転移がんである。
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、がんの病期決定に使用される。いくつかの実施形態において、本方法は、試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量を、対照試料またはI期、II、IIIもしくはIVのがんを有する試料と比較するステップを含む。
別の実施例において、本明細書に記載の方法は、がん細胞または腫瘍のグレードを決定するために使用される。いくつかの実施形態において、がんは卵巣がんである。一実施形態において、本明細書に開示の方法は、グレードIの卵巣がんを有する対象を同定する。
さらなる実施形態は、生体分子と、TRPV6結合ペプチドまたはTRPV6抗体とをコンジュゲートするステップを含む、本明細書に開示の化合物の1つを製造する方法を含む。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、生体分子と共有結合でコンジュゲートされている。例えば、一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、配列番号1の全体または一部を含み、生体分子は、配列番号1の14位に対応するシステインチオールを介して結合している。一実施形態において、生体分子は、活性化マレイミドを介してペプチドにコンジュゲートしている。
さらに別の実施形態は、細胞と、生体分子にコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドまたは生体分子にコンジュゲートしたTRPV6抗体を含む化合物とを接触させるステップを含む、生体分子を、TRPV6発現細胞に送達する方法を含む。一実施形態において、生体分子は検出可能な標識または治療薬を含む。細胞と化合物とを接触させるステップは、in vivo、in vitroまたはex vivoで実施できる。いくつかの実施形態において、TRPV6発現細胞は、組織、腫瘍または微小胞を含む。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の方法を実施するための試薬および使用のための指示書を含む、試料中のTRPV6を検出するためのキットを含む。他の実施形態は、本明細書に記載の方法を実施するための試薬および使用のための指示書を含む、がんを診断するためのキットを含む。
別の態様において、対象中のがん腫瘍を同定する方法を提供する。一実施形態において、がん腫瘍はTRPV6を過剰発現する。いくつかの実施形態において、本方法は、TRPV6結合ペプチドまたは本明細書に記載のTRPV6に対する抗体を含む化合物を対象に投与するステップを含む。次いで、TRPV6結合ペプチドまたはTRPV6に対する抗体を検出し、TRPV6の存在を示す。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、ペプチドにコンジュゲートした生体分子を検出することによって検出される。場合により、TRPV6のレベルが増加した対象の領域を特定し、ここで、TRPV6のレベルの増加が腫瘍の指標となる。一実施形態において、TRPV6のレベルを、非がん性組織において観察されたレベル、所定の対照レベルまたは対象を通して得られた平均レベルなどの対照レベルと比較する。一実施形態において、TRPV6は例えば、TRPV6結合ペプチドまたはTRPV6に対する抗体にコンジュゲートした蛍光標識を検出することによってin vivoで検出される。一実施形態において、TRPV6は、磁気共鳴画像法(MRI)およびTRPV6結合ペプチドにコンジュゲートしたMRI造影剤を使用して検出される。いくつかの実施形態において、がん腫瘍は、前立腺腫瘍、乳房腫瘍または卵巣腫瘍である。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内でさまざまな変形および改良が、詳細な説明から当業者には明らかになると思われるため、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示の目的で示してあると解釈されるべきである。
本発明の実施形態を、図面との関連でここに説明するものである。
マウスにおけるリンパ節の位置を示す線画である。CD1マウスに各標識ペプチド100ugをi.v.注射した4時間後に、SorC13-Cy5.5化合物およびSorC27-Cy5.5化合物の有意な蓄積が、以下の図1中の標識されたリンパ節おいて観察された:1.浅頚リンパ節;4.腋窩リンパ節;5.上腕リンパ節;8.腸間膜リンパ節;9.近位リンパ節。 i.v.注射4時間後の、CD1マウスにおけるSorC13-Cy5.5化合物の分布を示す図である。Y軸は全組織で測定された合計蛍光のうちのパーセントである。 i.v.注射4時間後の、CD1マウスにおけるSorC27-Cy5.5化合物の分布を示す図である。Y軸は各組織で測定された合計蛍光である。 i.v.注射後一定時間を超えて、潅流し、体液を洗い流した後の、CD1マウスにおけるSorC13-Cy5.5化合物の分布を示す図である。Y軸は全組織で測定された合計蛍光のうちのパーセントである。SorC13-Cy5.5化合物の(合計蛍光)に対する最も高いパーセントの取り込みは、肝臓、肺および腎臓において観察された。潅流によってリンパ液が洗い流されたため、リンパ節は示していない。パネルAはi.v.注射の4時間後の分布を示す。 i.v.注射後一定時間を超えて、潅流し、体液を洗い流した後の、CD1マウスにおけるSorC13-Cy5.5化合物の分布を示す図である。Y軸は全組織で測定された合計蛍光のうちのパーセントである。SorC13-Cy5.5化合物の(合計蛍光)に対する最も高いパーセントの取り込みは、肝臓、肺および腎臓において観察された。潅流によってリンパ液が洗い流されたため、リンパ節は示していない。パネルBはi.v.注射の24時間後の分布を示す。 卵巣がん細胞(SKOV-3)におけるTRPV6の免疫局在を示す図である。SKOV-3細胞にTRPV6-GFP融合タンパク質をトランスフェクトした。内在性TRPV6およびTRPV6-GFPの両方を、TRPV6 N末端領域に対する一次抗体およびFITC(緑色蛍光標識)で標識されたIgGに対する二次抗体の組み合わせを用いて検出した。視野の中の1つの細胞は、トランスフェクトされたTRPV6-GFPタンパク質およびTRPV6に対する抗体の明るい蛍光の共局在を示す図である。視野の中の他の細胞(トランスフェクトされていない)は、細胞膜をマーキングするコムギ胚芽凝集素の赤い蛍光および一次抗TRPV6抗体を検出するために使用されるFITCを用いて標識された二次抗体を示す、緑色蛍光の免疫局在を示す。 HEK-293細胞において発現されたTRPV6タンパク質と、TRPV6に対する抗体およびSorC27-cy5.5との共局在を示す図である。TRPV6発現ベクターをトランスフェクトされていないHEK293細胞は、SorC27-cy5.5と一緒にインキュベートしても蛍光を示さなかった(図6A、陰性対照)。図6Bは、緑色TRPV-抗体を用いて画像化された細胞を示し、一方図6Cは赤色SorC27-cy5.5を用いて画像化された細胞の同じ視野を示す。図6Dは両方を重ね合わせた画像およびTRPV6ベクターをトランスフェクトされた細胞中のTRPV6およびSorC27-cy5.5の共局在を示す。 前立腺がん細胞系PC-3におけるSorC27-cy5.5および蛍光標識されたTRPV6抗体の共局在を示す図である。画像のAシリーズは、A1:TRPV6-抗体免疫蛍光、A2:SorC27-cy5.5を用いた標識およびA3:A1とA2とのオーバーラップを示す。画像のBシリーズは、Aシリーズと同じ並びのPC-3細胞を示すが、TRPV6発現ベクターをトランスフェクトし、細胞により発現されるTRPV6のレベルを増加させている。画像の両方のシリーズは、SorC27-cy5.5およびTRPV6の共局在を示す。TRPV6の免疫蛍光およびSorC27-cy5.5の蛍光のレベルは、両方ともトランスフェクトされた細胞において増加しており、図の7Aのシリーズの細胞と比較して図の7BのシリーズにおいてTRPV6の発現の増加が示されている。 乳がん細胞系T47DにおけるSorC27-cy5.5および蛍光標識されたTRPV6抗体の共局在を示す図である。画像のAシリーズは、A1:免疫蛍光、A2:SorC27-cy5.5を用いた標識およびA3:A1とA2とのオーバーラップを示す。画像のBシリーズは、Aシリーズと同じ並びのPC-3細胞を示すが、TRPV6発現ベクターをトランスフェクトし、細胞により発現されるTRPV6のレベルを増加させている。画像の両方のシリーズは、SorC27-cy5.5およびTRPV6の共局在を示す。TRPV6の免疫蛍光およびSorC27-cy5.5の蛍光のレベルは、両方ともトランスフェクトされた細胞において増加しており、図の8Aのシリーズの細胞と比較して図の8BのシリーズにおいてTRPV6の発現の大幅な増加が示されている。 卵巣がん細胞系SKOV-3におけるSorC27-cy5.5および蛍光標識されたTRPV6抗体の共局在を示す図である。画像のAシリーズは、A1:免疫蛍光、A2:SorC27-cy5.5を用いた標識およびA3:A1とA2とのオーバーラップを示す。画像のBシリーズは、Aシリーズと同じ並びのPC-3細胞を示すが、TRPV6発現ベクターをトランスフェクトし、細胞により発現されるTRPV6のレベルを増加させている。画像の両方のシリーズは、SorC27-cy5.5およびTRPV6の共局在を示す。TRPV6の免疫蛍光およびSorC27-cy5.5の蛍光のレベルは、両方ともトランスフェクトされた細胞において増加しており、図の9Aのシリーズの細胞と比較して図の9BのシリーズにおいてTRPV6の発現の大幅な増加が示されている。 多数のヒト卵巣腫瘍生検から抽出された全RNAから作成されたcDNAライブラリーに存在する、TRPV6 cDNAのPCR検出を示す図である。レーン1:ブランク、2:LTL320 TRPV6、3:LTL320β-アクチン、4:LTL317 TRPV6、5:LTL317β-アクチン、6:LTL269 TRPV6、7:LTL269β-アクチン、8:100塩基対のラダー、9:TRPV6陰性対照、10:β-アクチン陰性対照。Table 1（表1）に報告するように3種のTRPV6アンプリコンのバンド密度の順位は、LTL320(+)、LTL317(+++)、LTL269(++++)である。TRPV6アンプリコンは、およそ370塩基対であり、β-アクチンアンプリコンは50塩基対である。 多数のヒト卵巣がん細胞系から抽出された全RNAから作成されたcDNAライブラリーに存在する、TRPV6 cDNAのPCR検出を示す図である。レーン1-ブランク、2-100塩基対のラダー、3-陽性対照、4-OVCAR3、5-SKOV3、6A-著しく劣化したOVC13、6B-いくらかのTRPV6シグナルを示すOVC13の反復、7-HEYC2、8-OV2008、9-陰性対照、10-100bpのラダー。TRPV6アンプリコンはおよそ370塩基対である。レーン7および8は、非常に小さい試料サイズ(細胞数が低い)から単離し、したがって弱いシグナルを示す。 多数のヒト乳がん細胞系から抽出された全RNAから作成されたcDNAライブラリーに存在する、TRPV6 cDNAのPCR検出を示す図である。レーン1:HCC 1954β-アクチン、2:T47Dβ-アクチン、3:MCF10Aβ-アクチン、4:100塩基対のラダー、5:HCC1954 TRPV6、6:T47D TRPV6、7:汚染された試料、8:TRPV6を含有する発現ベクター(pcAGGS-TRPV6)由来のTRPV6陽性対象。 ヒト乳がん細胞系MB423から抽出された全RNAから作成されたcDNAライブラリーに存在する、TRPV6 cDNAのPCR検出を示す図である(100bpのラダーの右側)。TRPV6アンプリコンはおよそ370塩基対である。 ヒト前立腺がん細胞系(PC-3)から抽出された全RNAから作成されたcDNAライブラリーに存在する、TRPV6 cDNAのPCR検出を示す図である。TRPV6アンプリコンはおよそ370塩基対である。分子量ラダーは、100bpのラダーである。レーン1:ブランク、レーン2:PC-3細胞由来のcDNAライブラリーのPCR、レーン3:ブランク、レーン4:MWラダー、レーン5:ブランク。 ヒト卵巣がん、乳がんおよび前立腺がんの細胞系由来の抽出物における、TRPV6タンパク質の過剰発現の検出を示すウェスタンブロットの図である。レーン1:分子量スタンダード、2:ブランク、3:HEP G2(陽性対照)、4:乳がん細胞系T 47D、5：卵巣がん細胞系SKOV-3、6:前立腺がん細胞系PC-3。レーン3において、HEP G2(肝芽腫)溶解物は2つのバンドを示す:上のバンドはグリコシル化されていないTRPV6であり、一方、完全にグリコシル化されたTRPV6が第2のバンドに示される。脱グリコシル化TRPV6が、3種すべてのがん細胞型において重度に産生された。膜結合TRPV6の脱グリコシル化が、膜におけるイオンチャネルを捕捉し、チャネルの活性を増加することが示された(Luら、2008年)。 18例のヒト卵巣腫瘍試料由来の抽出物における、TRPV6タンパク質の検出を示すウェスタンブロットの図である。各個別の患者/腫瘍に英数字のコードを引用した。すべての項において、画像右側の上の矢印は、TRPV6のグリコシル型の位置を示し、一方、下の矢印はTRPV6タンパク質の脱グリコシル型の位置を示す。図15A:レーン1:分子量スタンダード、2:LTL-175、3:LTL-205、4:LTL-234、5:LTL- 237、6:LTL-246、7:HEP G2(陽性対照); 8:分子量スタンダード。 図15B:レーン1:分子量スタンダード、2:LTL-247、3:LTL-258、4:LTL-259、5:LTL-260、6:LTL-269、7:HEP G2(陽性対照)、8:分子量スタンダード。 図15C:レーン1:分子量スタンダード、2:LTL-273、3:LTL-284、4:LTL-290、5:LTL-300、6:PC-3、7:ブランク、8:分子量スタンダード。 図15D:レーン1:分子量スタンダード、2:LTL-305、3:LTL-315、4:LTL-317、5:LTL-320、6:PC-3、7:ブランク、8:分子量スタンダード。PC-3は、卵巣腫瘍生検タンパク質の添加量(50ug)に一致するようにタンパク質の添加量が少なく(50ug)、非常に弱いシグナルを示し、15Dにおいてはほとんど可視化されない(例えば、HEP G2に関する図14のレーン3およびPC-3に関するレーン6を参照されたい)。捕捉された、脱グリコシル化TRPV6は、試験した個々の卵巣腫瘍試料において観察された優勢な型である。HEP-G2対照のバンドは、添加されたタンパク質のこの量に対して非常にわずかであり、試験した生検中のTRPV6の過剰発現をさらに示す。 ヒトグリオブラストーマ(U87MG)、ヒト結腸(CaCo-2)および膵臓の癌腫細胞(Panc1)の抽出物におけるTRPV6タンパク質の過剰発現の検出を示すウェスタンブロットの図である。レーン1:75kDaの明るく薄いバンドの分子量マーカー;2:U87MG細胞、3:CaCo-2細胞、4:2代継代培養のPanc1細胞;5:5代継代培養のPanc1細胞、6:7代継代培養のPanc1細胞。最後の3つのレーンにおいて、継代数が増えれば増えるほど、脱グリコシル化TRPV6の量が増加すると思われる。上のバンドはイオンチャネルのグリコシル型であり、下のバンドはTRPV6の脱グリコシル型である。 組織マイクロアレイに基づく免疫組織化学(IHC)スコアのグレード決定の較正および対応する代表的試料画像を示す図である。 TRPV6抗体染色に対して陰性である、またはグレードI、グレードII、またはグレードIIIのがんを有する漿液性乳頭腺がん組織試料と比較して正常な卵巣組織試料に対する染色強度スコアが≧1である、組織マイクロアレイのスライドのパーセントを示す図である。漿液性乳頭腺がん組織試料の100%は染色強度スコアが≧1であり、これと比較して正常卵巣組織ではわずか約24%である。 正常卵巣組織のマイクロアレイ試料およびグレードI、IIおよびIIIの漿液性乳頭腺癌腫の試料におけるTRPV6の免疫組織化学的検出を示す図である。TRPV6-抗体染色強度スコア(-、-/+、+、++、+++または++++)を、各試料にさらに与えた。 グレードIIの漿液性乳頭腺がんの組織マイクロアレイ試料における、TRPV6に対する抗体および蛍光標識されたSorC27-cy5.5の共局在を示す図である。パネルAは、TRPV6に対する抗体を用いて染色された卵巣腫瘍生検を示し、一方パネルBは蛍光タグを付けたペプチドSOR-C27-cy5.5を用いて染色された同じ試料を示す。 卵巣がん腫瘍の異種移植マウスモデル(図21A)における、SorC27-cy5.5の時間依存性局在を示す図である。 前立腺がん腫瘍の異種移植マウスモデル(図21B)における、SorC27-cy5.5の時間依存性局在を示す図である。 図21Cは、卵巣腫瘍(SKOV-3;上)および前立腺腫瘍(DU145;下)の両方に対する、平面観察を示すマウスの3-D画像(左)、中心を通るマウスの2mmの切片の画像(中)および中心を通る垂直「切片」を示す画像(右)、を示す。 卵巣がん(A)の試料における、健康な対照と比較したTRPV6 mRNAの発現を示す図である。 前立腺がん(B)の試料における、健康な対照と比較したTRPV6 mRNAの発現を示す図である。 乳がん(C)の試料における、健康な対照と比較したTRPV6 mRNAの発現を示す図である。 TRPV6結合ペプチドSorC27にコンジュゲートされたMRI増強剤(SPIO-SorC27)の、CD-1ヌードマウスに異種移植されたSKOV-3由来卵巣腫瘍への局在を示す図である。パネルAは、白い矢印で示される、SPIO対照ビーズ注射前および注射24時間後の腫瘍を示す図である。 TRPV6結合ペプチドSorC27にコンジュゲートされたMRI増強剤(SPIO-SorC27)の、CD-1ヌードマウスに異種移植されたSKOV-3由来卵巣腫瘍への局在を示す図である。パネルBは、SPIO-SorC27注射前および注射24時間後の腫瘍(白い矢印)ならびに腫瘍部位への造影剤の局在(点線の白い矢印)を示す図である。 健康な対照およびさまざまながんの病期の前立腺がん(図24A)の患者に由来する血液試料から単離された、TRPV6 mRNAの量のRT-PCR分析を示す図である。TRPV6 mRNAのRT-PCRにより、I期がんを有する対象と、健康な対照とは容易に識別される。 健康な対照およびさまざまながんの病期の乳がん(図24B)の患者に由来する血液試料から単離された、TRPV6 mRNAの量のRT-PCR分析を示す図である。TRPV6 mRNAのRT-PCRにより、I期がんを有する対象と、健康な対照とは容易に識別される。 健康な対照およびさまざまながんの病期の卵巣がん(24C)の患者に由来する血液試料から単離された、TRPV6 mRNAの量のRT-PCR分析を示す図である。TRPV6 mRNAのRT-PCRにより、I期がんを有する対象と、健康な対照とは容易に識別される。 I期またはII期の卵巣がんのいずれかを有する女性と比較した、健康な女性の血漿における、RT-PCRにより決定されたTRPV6 mRNAの量を示す図である。このデータは、試料由来のアンプリコンの統合されたバンド密度の読み取り値を表す。試料は、各試料について3重に決定した。I期(p<0.0001)およびII期(p= 0.047)の両方のTRPV6レベルは、健康な女性由来の血漿において観察されるものより統計的に有意に高かった。 I期およびII期の卵巣がんを有する女性と比較した、健康な女性由来の血漿の、試料中のTRPV6タンパク質レベルに関するウェスタンブロットのデータを示す図である。図は、TRPV6抗体染色の定量されたバンド密度を示す。I期(p=0.0001)およびII期(p = 0.0210)両方のTRPV6レベルは、健康な女性由来の血漿において観察されるものよりも有意に高かった。 健康な血漿およびI期およびII期(「早期」卵巣がん)のデータの組み合わせのウェスタンブロットに由来するバンド密度を比較する図である。I期およびII期のがん患者を組み合わせた血漿は、健康な女性より統計的に有意に高い量のTRPV6タンパク質を含有した(p = 0.0006)。
本発明者は、TRPV6カルシウムチャネルの発現が、特定の細胞、例えば卵巣がん細胞において上方制御され、この過剰発現ががんの指標であることを決定した。本明細書は、がんの同定および/または診断のために、TRPV6の過剰発現を検出する新しい方法を提供する。本出願は、TRPV6タンパク質またはがん細胞などのTRPV6発現細胞を標的とする新しい化合物および方法をさらに提供する。
一実施形態において、本発明者は、カルシウムチャネル、特にTRPV6カルシウムチャネルと結合する化合物を合成した。本明細書に記載のTRPV6結合化合物は、ソリシジンの一部と配列同一性を有するが、麻痺活性は示さない。この化合物が、麻痺活性が存在しなくてもTRPV-6結合活性は維持していることは驚くべきことである。ソリシジンがその構造中に2つの機能性ドメイン、カルシウムチャネルと結合する1つの部分およびナトリウムチャネルと結合する別の部分を有することは今まで知られていなかった。さらに、ナトリウムチャネル結合麻痺活性からカルシウムチャネル検出/結合活性を分離したペプチドが調製できることもまた知られていなかった。
本発明者は、麻痺機能を有するのはソリシジンのN末端ドメインであり、カルシウムチャネル阻害機能、より具体的にはTRPV6結合活性を有するのがC末端ドメインであることを決定した。ソリシジンをN末端で切断することにより、カルシウムチャネル結合/検出活性を維持し、麻痺活性を示さないペプチドの作製に成功した。したがって、ナトリウムチャネルは本化合物と結合できず、循環から除去するので、本化合物は、in vivoでTRPV6と結合する可能性が高い。同様に、カルシウムチャネル結合活性を、ナトリウムチャネル結合の望ましくない副作用を伴わずに得ることができ、麻痺および他の潜在的副作用を回避する。生体系において二機能性の巨大タンパク質および酵素は一般的であるが、具体的にはペプチドの一方の末端がカルシウムチャネルに結合し、ペプチドの他方の末端がナトリウムチャネルに結合する、固有の二機能性は小分子ペプチドにおいては非常に珍しい現象であることを考えれば、本明細書に記載の実施形態の驚くべき性質が強調される。二機能性の参考文献における報告は、例えば、2種の異なるペプチドが科学的に融合された人工の製品から通常もたらされる(Anesら、2006年; Yamamotoら、2008年)。
本明細書に記載の化合物は、ソリシジンの半分の長さまたはそれより短いペプチド成分を通常有する。一実施形態において、ペプチドはTRPV6結合活性を維持する。いくつかの実施形態において、ペプチド成分は化合物の全体であり、一方、他の実施形態において、例えば、化合物が薬剤または検出可能な標識とコンジュゲートされたペプチドを含む場合、ペプチド成分は化合物の成分である。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(「SorC27」と呼ばれる、配列番号1)を含むペプチドの全体または一部を含む。TRPV6結合ペプチドは、配列番号1の連続する部分を場合により含む。いくつかの実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、配列番号1のC末端配列の連続部分を含む。場合により、TRPV6結合ペプチドは、配列番号1の少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本化合物は、その全長にわたって配列番号1の一部に対して少なくとも50%の同一性を有するTRPV6結合ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本化合物は、本化合物は、その全長にわたって配列番号1の一部に対して少なくとも70%、80%または90%の同一性を有するTRPV6結合ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、アミノ酸配列:HPSKVDLPR(「SorC9」と呼ばれる、配列番号1のアミノ酸番号19〜27)、KEFLHPSKVDLPR(「SorC13」と呼ばれる、配列番号1のアミノ酸番号15〜27)またはEGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPR(「SorC27」、配列番号1)を場合により含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。SorC9の9個のアミノ酸配列HPSKVDLPRは、TRPV6四量体のカルシウムチャネルへの入り口に存在する4つの負に帯電したアスパラギン酸との相互作用が期待される、生理学的pHにおける3つの正電荷を含有する(den Dekkerら、2003年)。
いくつかの実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、通常35または30アミノ酸またはそれより少なく、場合により27、25、20、15または13未満のアミノ酸長であるが、場合により少なくとも9アミノ酸長である。TRPV6結合ペプチドは、少なくとも9〜13、10〜15、15〜20、20〜25または20〜27個のアミノ酸を場合により含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドに付加され得る。30、35、40または45アミノ酸長まで(例えば、ソリシジンアミノ酸配列に対応するさらなるアミノ酸、例えば、ソリシジンのSorC27のN末端セグメント(SILARPAELNTETCILEC 配列番号:2)に早急に向かう1つまたは複数のアミノ酸、標的配列または他のアミノ酸)またはそれより長くあり得るTRPV6結合ペプチドを作るために、SorC27配列にさまざまなさらなるアミノ酸を付加することによって容易により長いペプチドを作ることができる。
いくつかの実施形態において、本化合物は、直接またはスペーサーを介してのいずれかで生体分子にコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含み、生体分子は場合により第2のタンパク質またはペプチドである。いくつかの実施形態において、スペーサー分子は、炭素含有物質であり得る。例えば、スペーサーは、3個のアミノ酸(Gly-Gly-Gly)もしくはそれを超えるアミノ酸などの短鎖ペプチドまたは炭素鎖、例えばnが1から5、1から10もしくは10を超える(CH2)nであってよい。他の実施形態において、場合によりスペーサーはポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、糖、脂質などである。
上記のように、本発明のTRPV6結合ペプチドは、カルシウムチャネル結合活性を有すると思われる。このような活性を有するペプチドは、ペプチドとTRPV6との結合を測定する適切な任意の公知のアッセイを用いて容易に同定される。例えば、一実施形態において、カルシウムチャネル阻害活性を有するペプチドは、カルシウムチャネルを通るカルシウムの流れを減少させる(すなわち、部分的または完全な阻害)ことにより、ペプチドがカルシウムチャネル活性を低下させることを決定することにより、場合により同定される。TRPV6結合活性は、カルコフロールの内在化(FURA-2amなど)、カルシウム電流の阻害を電気生理学的に測定するホールセルパッチクランプ、放射性または蛍光性のタグなどの検出可能なタグで標識されたペプチドを使用する平衡結合アッセイおよび/または「結合」ペプチドおよび「非結合」ペプチドのNMR決定などの方法を使用してもまた測定され得る。いくつかの実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、i)カルシウムチャネルの遮断およびii)麻痺活性の喪失をさらに有する。
カルシウムチャネル結合活性は、TRPV6のための発現ベクターをトランスフェクトされた容易に利用可能な細胞系(例えば、ヒト胎児肝臓細胞系-HEK293)を使用することによって、場合により同定される。このようなトランスフェクトされた細胞は、容易にアリコートをとり、必要になるまで保存される(通常-80℃)。これは、細胞におけるカルシウムイオンチャネルの検出およびこれらのイオンチャネル活性の阻害に関する試験のための、標準のトランスフェクトされた細胞調製物を提供する。場合により、ペプチドは、LNCaP、HEK293またはSKOV-3の細胞モデルにおいて1000nM、150nMまたは100nM未満の平衡阻害定数を有する。例えば、LNCaPモデルにおけるSorC27に関する平衡解離定数(Kd)は140nMであり、SorC13に関しては100nMである。アミノ酸の数との直線関係に基づいて、SorC9に関するKdはおよそ90nMであると期待される。
本明細書に記載のTRPV6結合ペプチは、前述のペプチドの類似体を場合により含む。本発明のタンパク質の類似体は、限定するものではないが、1つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失および/または突然変異を含有するアミノ酸配列を、場合により含む。アミノ酸の置換は、保存的または非保存的性質であってよい。保存的アミノ酸置換は、本発明のペプチドの1つまたは複数のアミノ酸を、同様の電荷、サイズおよび/または疎水特性のアミノ酸で置き換えることを伴う。保存的置換だけが行われた場合、得られた類似体は機能的に等価であるはずである。非保存的置換は、アミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸を、異なる電荷、サイズおよび/または疎水特性を有する1つまたは複数のアミノ酸で置き換えることを伴う。類似体は、場合によりペプトイドであり、これは、アミノ酸のR基がN原子に結合したN-置換ポリグリシンである。別の類似体は、場合により、天然のL-アミノ酸ではなく、D-アミノ酸から合成されたペプチドである。
1つまたは複数のアミノ酸の挿入は、場合により本発明のTRPV6結合ペプチド配列に導入される。アミノ酸の挿入は、単一アミノ酸残基または例えば2から15アミノ酸長に及ぶ連続アミノ酸からなる。
欠失は、ペプチドのアミノ酸配列からの、1つもしくは複数のアミノ酸または分離した部分の除去からなる。欠失されたアミノ酸は連続であっても、連続でなくてもよい。
本発明のTRPV6結合ペプチドの類似体は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって、場合により調製される。本発明のタンパク質の類似体の発現のために構築されたヌクレオチド配列の突然変異は、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、突然変異は、ハイブリダイズでき、ループ、ヘアピンなどのmRNAの二次構造を作り出し、mRNAの翻訳に悪影響を与え得る相補的領域を生み出さないことが好ましいと思われる。
突然変異は、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、天然配列の断片にライゲーション可能な制限部位に隣接する特定の遺伝子座に、場合により導入される。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
または、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発手順を用い、要求される置換、欠失または挿入に従って改変された、特定のコドンを有する改変された遺伝子を提供する。本発明のペプチドの欠失またはトランケーションもまた、所望の欠失に隣接する都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、容易に達成される。制限の後に、オーバーハングを充填し、DNAが再度ライゲートされ得る。上記の改変の作製の例示的方法は、Sambrookらによって開示されている(Sambrook Jら、2000年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Third Edition)、Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
加えて、本発明のTRPV6結合ペプチの類似体は、固相合成(Merrifield、1964年、J. Am. Chem. Assoc. 85:2149〜2154頁)または均一溶液における合成(Houbenweyl、1987年、Methods of Organic Chemistry、E. Wansch編、Vol.15 IおよびII、Thieme、Stuttgart)などのタンパク質の化学において周知の技術を使用して、化学的合成によって容易に調製される。本発明のTRPV6結合ペプチドは、本発明のペプチドに対する配列同一性を有するペプチド、本明細書に記載の突然変異ペプチドおよび/またはそれらのトランケーションをさらに含む。このようなペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下(本明細書のストリンジェントなハイブリダイズ条件の考察を参照されたい)で、本発明のペプチドを得るために使用されるプローブとハイブリダイズする核酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。配列同一性を有するペプチドは、多くの場合、タンパク質の特徴である領域を有すると思われる。
本発明の他の有用なペプチドは、多くの場合、本明細書に記載の配列番号1の全体または一部に対する、少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を、場合により含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなり、このペプチドはTRPV6結合活性を有する。配列同一性は、通常BLASTバージョン2.1プログラム-アドバンスドサーチ(上記のパラメーター; Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.およびLipman, D．J.(1990年)「Basic local alignment search tool.」J. Mol. Biol. 215:403〜410頁)によって評価される。BLASTは、米国生物工学情報センター(U.S. National Center for Biotechnology Information)(National Library of Medicine Building 38A Bethesda、MD 20894)を通してオンラインで利用可能な一連のプログラムである。advanced Blast searchはデフォルトパラメーターに対して設定される。the Blast Programsに関する参考文献はAltschul, S. F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.およびLipman, D.J.(1990年)「Basic local alignment search tool.」J. Mol. Biol. 215:403〜410頁; Gish, W. & States, D．J.(1993年)「Identification of protein coding regions by database similarity search.」Nature Genet. 3:266〜272頁; Madden, T.L.、Tatusov, R.L.およびZhang, J.(1996年)「Applications of network BLAST server」Meth. Enzymol. 266:131〜141頁; Altschul, S.F.、Madden, T.L、Schaffer, AA、Zhang, J.、Z
hang, Z.、Miller, W.およびLipman, D．J.(1997年)「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁); Zhang, J.およびMadden, T.L.(1997年)「PowerBLAST:A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.」Genome Res. 7:649〜656頁)を含む。さらなる実施形態において、生体分子とコンジュゲートしたTRPV6に対する抗体を含む化合物を提供する。
抗体の調製
一態様において、TRPV6に対する抗体は、本明細書に記載の実施形態に従って有用である。別の態様において、TRPV6結合ペプチドに対する抗体またはTRPV6結合ペプチドを含む化合物に対する抗体は、被検試料中のペプチドの存在を特定するために有用である。ペプチドの密度/位置について報告するであろう抗体を標識する任意の方法は有用であると思われる(例えば、放射活性物質で標識されたペプチドまたは蛍光タグ付きペプチド)。抗体は通常モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。抗体は、ペプチドの免疫精製にとっても価値がある。例えば、生体試料と抗体を、抗体と、抗体により認識されるペプチドの間に免疫学的複合体を形成できる条件下で接触させ、免疫学的複合体の有無を検出し、試料中の本発明のペプチドの存在を検出できる。本発明は、抗体、抗体と、抗体により認識されるペプチドの間の免疫学的複合体の形成に適した培地および免疫学的複合体を検出し、TRPV6、本発明のTRPV6結合ペプチドまたは類似のペプチドの存在を確定できる試薬を含む組成物をさらに含むことが好ましい。
本発明のTRPV6結合ペプチドを認識するために、ペプチド中の特有のエピトープの範囲に対する抗体を作製できる。場合により、TRPV6結合ペプチドを含む化合物を認識するために、化合物中の特有のエピトープの範囲に対する抗体を作製できる。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、本出願の説明および当分野において公知の技術に従って調製される。モノクローナル抗体の調製方法および使用の例に関しては、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第5,688,681号、第5,688,657号、第5,683,693号、第5,667,781号、第5,665,356号、第5,591628号、第5,510,241号、第5,503,987号、第5,501,988号、第5,500,345号および第5,496,705号を参照されたい。ポリクローナル抗体の調製および使用の例は、米国特許第5,512,282号、第4,828,985号、第5,225,331号および第5,124,147号に開示されており、これらは参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、TRPV6または本発明のTRPV6結合ペプチドとさらに特異的に反応するその断片を含む。抗体は、従来の技術を使用して断片化でき、断片は、上記と同じ手段で有用性に関してスクリーニングできる。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシンで処理することによって作製できる。得られたF(ab')2断片を処理し、ジスルフィド架橋を減らし、Fab'断片を作ることができる。
一実施形態において、TRPV6タンパク質は、試料とTRPV6結合ペプチドとを接触させ、その後TRPV6結合ペプチドと選択的に結合する抗体を用いてTRPV6結合ペプチドを検出することによって、試料中に検出できる。いくつかの実施形態において、この抗体は、TRPV6結合ペプチドまたは本発明の化合物を選択的に結合するが、ソリシジンとは結合しない。
生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドの化合物
本明細書に記載の実施形態は、生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む新規の化合物を含む。本明細書で使用する場合、「生体分子」は、化学的、生物学的または物理的手段を介して検出可能、または化学的または生物学的活性を示す任意の原子または分子を含む。いくつかの実施形態において、「生体分子」は、ホウ素クラスターならびに鉄、金、銀およびニッケルのナノ構造などの無機分子を含む。一実施形態において、生体分子は、検出可能な標識または治療薬を含む。一実施形態において、生体分子は、本化合物のTRPV6結合成分と識別可能な化合物の部分である。
本明細書で使用する場合、「生体分子とコンジュゲートした」は、TRPV6結合ペプチドと生体分子との連結を指す。いくつかの実施形態において、連結は、TRPV6結合ペプチドと生体分子との間の化学結合の結果である。一実施形態において、連結は共有結合である。TRPV6結合ペプチドは、核酸配列がTRPV6結合ペプチドとタンパク質生体分子との両方をコードする、組み換え遺伝子技術の使用を介してもまた生体分子とコンジュゲートできる。いくつかの実施形態において、TRPV6結合分子は生体分子と直接連結される。他の実施形態において、TRPV6結合ペプチドと生体分子との連結にスペーサーが使用される。いくつかの実施形態において、TRPV6結合分子はまた、生体分子を含むように、例えば放射活性物質で標識されたTRPV6結合ペプチドにより、化学的に修飾され得る。一実施形態において、生体分子は、一般的な加水分解酵素によって加水分解され得る結合を介して、TRPV6結合ペプチドとコンジュゲートされる。
本明細書に記載の化合物および組成物を使用し、in vivo、in vitroまたはex vivoでTRPV6タンパク質を検出できる、またはTRPV6タンパク質と結合できる。いくつかの実施形態において、本化合物は、検出可能な標識を含む生体分子を含む。当分野において公知の任意の適切な生体分子標識系を使用して、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを検出可能に標識できる。いくつかの実施形態において、標識は、放射性同位元素、生物発光性化合物、化学発光性化合物、蛍光性化合物、金属キレートおよび酵素からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生体分子は、蛍光性、放射性または免疫学的な標識を含み得る。本明細書で使用する場合、「蛍光標識」または「フルオロフォア」という用語は、特定の波長のエネルギーを吸収し、異なる特定の波長においてエネルギーを再放射できる分子または部分を指す。例えば、蛍光標識の例は、限定するものではないが、Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Texas Redまたはローダミンを含む。いくつかの実施形態において、本化合物は、TRPV6結合ペプチドとコンジュゲートした複数の生体分子を含む。
本明細書に記載の化合物を使用して、診断的または治療的に有用な生体分子を、TRPV6を産生する腫瘍、組織または細胞に送達できる。いくつかの実施形態において、本化合物は、ポジトロン放出断層撮影(Positron Emission Tomography)(PET)、放射測定検出または磁気共鳴画像法(MRI)によって検出可能な生体分子を含む。
一実施形態において、TRPV6結合ペプチドとコンジュゲートした生体分子は、金属ナノクラスターを含む。いくつかの実施形態において、SPIO(超常磁性酸化鉄)などの金属クラスターを、TRPV6に富んだ腫瘍、組織および細胞の一次検出に使用できるMRI(磁気共鳴画像法)を使用する、非常に精度が高い検出のために提供する。実施例28および図23に示すように、TRPV6結合ペプチドのSorC27はSPIOの標的腫瘍とコンジュゲートし、in vivoでがん腫瘍を同定するために使用できる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物および方法は、腫瘍体積またはその後のがんの治療過程の間の腫瘍体積の変化を推定できる。TRPV6に富んだ腫瘍から脱落した微小胞および体液中に存在する微小胞もまた、金属-TRPV6結合ペプチドコンジュゲートによって容易に検出される。
別の実施形態において、TRPV6結合ペプチドを、18F含有生体分子などの放射性分子である生体分子とコンジュゲートさせる。これらの化合物は、TRPV6発現腫瘍、細胞または組織を標的とし、TRPV6を発現する腫瘍、細胞または組織のPETスキャニング(ポジトロン放出断層撮影)を使用して、in vitro、ex vivoまたはin vivoで検出できる(Chengら、J. Nucl. Med. 48:987〜994頁、2007年)。同様に、TRPV6に富んだ腫瘍から脱落した微小胞ならびに血液、他の体液および排泄物中に存在する微小胞は、TRPV6結合ペプチドの18F誘導体によって検出され得る。
さらなる実施形態において、125I含有生体分子とコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチドは、TRPV6を発現する腫瘍、細胞または組織を、in vitro、ex vivoまたはin vivoでこのような化合物を標的とし、放射分析法を使用したこのような腫瘍、細胞または組織の検出を可能にする(Boltonら、Biochem. J.、133、529〜539頁、1973年)。同様に、TRPV6に富んだ腫瘍から脱落した微小胞ならびに血液、他の体液または排泄物中に存在する微小胞は、本明細書に記載の化合物を使用して検出され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示の化合物は、治療薬である生体分子を含む。本明細書で使用する場合、「治療薬」は、疾患、障害または病態の治療、治癒、予防または抑制に使用される物質である。治療薬は、疾患、障害または病態に関連する任意の症状の治療、治癒、予防または抑制にも使用され得る。
いくつかの実施形態において、治療薬は抗がん剤である。抗がん剤の例は、限定するものではないが、タキサン系薬剤、プラチナ系薬剤、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、シクロホスファミド)、トポイソメラーゼII阻害剤(例えばエトポシド)、アルキル化剤(例えばイホスファミド)、植物性アルカロイド(例えばビノレルビン)および代謝拮抗薬(例えばフルオロウラシル)を含む。
いくつかの実施形態において、生体分子は小さな薬剤分子、オリゴ糖、抗体、抗体エピトープ、ナノ金属クラスター、放射活性物質で標識された分子、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、プラチナ系薬剤、抗生物質、抗生物質、抗がん剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤もしくは抗レトロウイルス剤またはホウ素錯体である。
いくつかの実施形態において、本化合物は、スペーサーを介して生体分子と結合しているTRPV6結合ペプチドを含む。一実施形態において、生体分子はタンパク質またはペプチドであり、化合物はTRPV6結合ペプチドと生体分子との融合タンパク質である。場合により、この融合タンパク質は、TRPV6結合ペプチドと生体分子との間のペプチドスペーサーを含む。
本発明は、本発明のTRPV6結合ペプチドをコードする単離核酸、例えば、配列番号1をコードする核酸または本明細書に記載のその断片の1つをさらに含む。本発明は、本発明のペプチドに対する単離抗体にもさらに関する。一実施形態において、この抗体は本発明のペプチドに場合により選択的に結合するが、ソリシジンとは結合しない。
生体分子とコンジュゲートしたTRPV6抗体の化合物
別の態様において、生体分子とコンジュゲートしたTRPV6抗体を含む化合物を提供する。これらの化合物は、生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む化合物に関して本明細書に記載のように作製でき、使用できる。例えば、TRPV6抗体は、検出可能な標識または抗がん剤などの生体分子と、直接またはスペーサーを介してコンジュゲートされ得る。
実施例3および25に示すように、TRPV6に対する抗体および蛍光標識されたTRPV6結合ペプチドSorC27-cy5.5は、組み換えTRPV6を発現するHEK293細胞およびグレードIIの漿液性乳頭腺がんの試料において、共局在する。
TRPV6の検出
本明細書に記載の化合物はTRPV6カルシウムチャネルと結合し、いくつかの実施形態において、細胞、組織、腫瘍または微小胞におけるカルシウムチャネルの同定に有用である。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、TRPV6を発現しない細胞、腫瘍、組織または微小胞の同定に有用である。さらなる実施形態において、本ペプチドは、カルシウムチャネルを大量に発現する細胞、組織、腫瘍または微小胞の同定または標識に有用である。一実施形態において、本明細書に記載の化合物は、試料中のTRPV6の量の定量に有用である。
したがって、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、試料と本明細書に記載のTRP結合化合物とを接触させるステップおよびTRPV6結合化合物を検出するステップを含む、試料中のTRPV6タンパク質を検出する方法を含む。一実施形態において、TRPV6結合化合物は、TRPV6結合ペプチドと選択的に結合する抗体を使用して検出できる。
検出可能な標識を含む本明細書に記載の化合物は、TRPV6タンパク質またはTRPV6タンパク質を発現する細胞、組織、腫瘍または微小胞の検出にもまた有用である。したがって、本明細書に記載の実施形態は、試料と、本明細書に記載の検出可能な生体分子を含む化合物の任意の1つとを接触させるステップおよびTRPV6結合ペプチドとコンジュゲートした生体分子を検出するステップを含む、試料中のTRPV6タンパク質を検出する方法を含む。
本明細書で使用する場合、「試料」は、生物または生物の一部を表す生体試料を指す。試料の例は、限定するものではないが、生体液、血液、組織試料、組織生検、組織培養から採取した試料、生体液、組織抽出物、新鮮に収穫した細胞、微小胞および細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解物を含む。さらに「試料」は、in vivoまたはex vivoの生物の規定の範囲または体積、例えば磁気共鳴画像法のための試料体積または範囲を指してもよい。一実施形態において、試料は対象由来のin vitro試料、例えば対象から採取した血液試料である。
本明細書で使用する場合、「試料を接触させるステップ」という語句は、限定するものではないが、典型的には本明細書に記載の化合物と試料とを混合またはインキュベートするステップを含み、試料はバッファー、溶液または試験試薬などのさらなる成分を含んでよい。「試料を接触させるステップ」は、本明細書に記載の化合物を生物に注射するステップまたは投与するステップもまた含み得る。
がんの同定および診断
多数のがん細胞系においてTRPV6が過剰発現されることが示されている。したがって、本明細書に開示のTRPV6結合化合物はTRPV6が過剰発現された細胞の検出、したがって腫瘍またはがんのin vivo、ex vivoまたはin vitroの同定または診断にとって有用である。
本明細書に記載のTRPV6結合化合物は、in vitroでTRPV6と結合することおよびTRPV6と共局在することが示されている。図6および実施例3に示すように、赤外線蛍光タグとコンジュゲートされたSorC27を含む化合物は、発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、HEK293細胞において発現されたTRPV6と結合するが、TRPV6を発現するベクターをトランスフェクトしないHEK293細胞とは結合しない。図6は、TRPV6結合化合物が、蛍光物質で標識されたTRPV6に対する抗体と共局在することをさらに示す。図7〜9は、SorC27が、前立腺がん細胞系PC-3、乳がん細胞系T47Dおよび卵巣がん細胞系SKOV-3においてTRPV6と共局在することをさらに示す。
TRPV6はヒト卵巣腫瘍生検から採取した試料において発現される。図10および実施例4に示すように、TRPV6の転写産物は、ヒト卵巣組織腫瘍生検由来のcDNAライブラリーにおいて同定された。各試料中のTRPV6の量を推定し、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンのレベルに関してさらにデンシトメトリーによって定量的に測定した。Table 1（表1）は、卵巣腫瘍を有する18例の患者に関する腫瘍型、TRPV6/β-アクチンの比およびTRPV6の定性レベルを提供する。
図11に示すように、OVCAR3、SKOV3、OVC13、HEYC2およびOV2008を含むヒト卵巣がん細胞系の全RNA抽出物から調製された、多数のcDNAライブラリーにおいて、TRPV6 cDNAをさらに同定した。
図12Aおよび12Bに示すように、T47D、HCC1954およびMB468を含む一連の乳がん系において、TRPV6の発現を、ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチンの発現との関連でさらに決定した。多数の乳がん細胞系および卵巣がん細胞系に関するTRPV6 mRNAの状態の結果をTable 2（表2）に示す。
図13に示すように、TRPV6 cDNAを、ヒト前立腺がん細胞系から作製されたcDNAライブラリーにおいて、さらに検出した。
さらに、図14〜16および実施例5に示すように、TRPV6タンパク質のレベルは、多数の異なるがん細胞系および卵巣腫瘍試料において過剰発現されることが示された。
したがって、本明細書に開示の実施形態は、試験試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質を検出するステップおよび場合により、試験試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量を、対照試料と比較するステップを含む、対象由来の試験試料においてがんを同定または診断する方法を含む。一実施形態において、対照試料と比較した試験試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量の増加ががんの指標である。一実施形態において、少なくとも10%の最小の増加ががんの指標である。別の実施形態において、対照試料と比較した試験試料中のmRNAまたはタンパク質の少なくとも20%、50%または100%の増加量ががんの指標である。いくつかの実施形態において、対照試料と比較した試験試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量が3倍増加することが、がんの指標である。対照中にTRPV6が存在するであろう組織の例は、結腸、腎臓、前立腺および乳房である。他の組織、例えば任意の内皮由来組織において、TRPV6は全く発現されず、したがって、試験試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の存在の検出が、がんの存在の指標である。場合により、対照試料の比較を使用せずに試験試料中のTRPV6を検出することによって、このような方法をこのような組織において実施する。
DU145などのいくつかの前立腺がん細胞系はTRPV6を発現しないにもかかわらず、TRPV6に富んだ腫瘍は、ほとんど独占的に上皮性起源である。TRPV6に富んだがんの型は、限定するものではないが、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、肝臓がん、子宮内膜がん、グリアのがん、結腸がん、膵臓がんおよび白血病を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、in vivo、ex vivoまたはin vitroで使用される。
本明細書で使用する場合、「対照試料」という用語は、基底レベルまたは正常レベルを確立するために使用できる任意の試料を含み、健康な人間または組織から採取した試料を含むことができる。いくつかの実施形態において、「対照試料」は、既定の標準化された対照である。いくつかの実施形態において、「対照試料」は、既定の値、閾値または範囲である。
本明細書で使用する場合、「がんを同定する」という語句は、正常な調節機序を失い、無秩序な増殖を有する対象由来の試料における細胞の検出を含む。場合により、対象由来の試料において「がんを同定する」ことは、対象におけるがんの診断を指すことができる。
一実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して、腫瘍またはがんに関するさらなる情報を提供できる。がんの病期または型の決定は、通常、がんの病期(例えば腫瘍の病期)またはがんの型に関する情報の決定を含む。一実施形態において、がんの病期は、腫瘍、リンパ節、転移(Tumor, Node, Metastasis)(TNM)システムを使用して、当分野において公知のように決定される。T(腫瘍)は、原発腫瘍のサイズおよびそれがどこに位置するかを表し、N(リンパ節)は腫瘍がリンパ節に広がっているかどうかを表し、M(転移)はがんが転移しているかどうかを表す(例えば、AJCC Cancer Staging Manual、第7版(2010年) Springer - Verlag New Yorkより出版を参照されたい、参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、一実施形態において、がんは卵巣がんであり、以下の病期分類のガイドラインを使用できる:
I期(卵巣がん):T1、N0、M0およびサブI期 A、B、C(NおよびMは依然として「0」である)
II期(卵巣、骨盤浸潤の1つまたは両方):T2、N0、M0およびサブII期 A、B、C(NおよびMは依然として「0」である)
III期(卵巣、骨盤領域および腹膜範囲への広がり>2cm:T3 N0、M0およびサブIII期 A、B、C(NおよびMは依然として「0」である);III期C(リンパ節への広がり):T、N1、M0
IV期(遠位器官への広がり):任意のT、任意のN、M1
場合により、本明細書に記載の方法は、腫瘍の体積、腫瘍の位置、または腫瘍の型の推定を提供することによって、腫瘍をさらに特徴付けするために有用である。いくつかの実施形態において、がんの診断は、治療応答の情報、例えば、通常腫瘍体積として測定される腫瘍サイズについての抗がん療法過程の結果の決定を得るステップを含む。
実施例24に示すように、正常な組織の試料と比較して、がんを有する対象由来の組織試料において、TRPV6のレベルは高い。より具体的には、図18および表3は、グレードI、IIおよびIIIの漿液性乳頭腺がんの組織マイクロアレイ試料が、正常な卵巣組織の試料と比較してTRPV6のより多くの発現を示したことを示す。TRPV6のレベルは、正常試料と比較して、早期グレードIがんとの識別に有用である。したがって、抗体を使用するTRPV6の検出または本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを使用するTRPV6の検出は、がんを有する対象またはがんの発生の可能性が大きい対象の同定または診断に有用である。場合により、TRPV6の発現レベルは、がんのグレード決定または増殖速度のより速いがんの同定に有用である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法を使用して、乳がん、卵巣がん、血液のがん、脳腫瘍、網膜のがん、肝臓がん、甲状腺がん、結腸がん、前立腺がん、膵臓がん、グリアのがんまたは子宮内膜がんを同定または診断する。
一実施形態において、試料または細胞系の細胞中で産生されたTRPV6 mRNAまたは対応するcDNA転写産物の量の測定を介したtrpv6遺伝子の発現の測定は、試料中のがんを同定する診断ツールを提供する。いくつかの実施形態において、対象由来の試料中のTRPV6 mRNAまたは転写産物の存在または量は、診断に使用され、または対象におけるがんの病期を示す。例えば、図24は、血液中のTRPV6 mRNAの相対的レベルは、健康な対照におけるレベルと比較して、がんを有する対象において有意に高かったことを示す。したがって一実施形態において、対象由来の試料中のTRPV6 mRNAまたは転写産物の存在または量は、対象におけるがんの同定に有用である。一実施形態において、試料中のTRPV6 mRNAまたは転写産物の存在または量は、対象における卵巣がん、乳がんまたは前立腺がんの同定に有用である。
図25に示すように、TRPV6タンパク質の相対量は、健康な対照と比較して、I期またはIIの卵巣がんを有する対象由来の血漿の試料においてもまた高い。したがって、一実施形態において、TRPV6タンパク質の検出は、対象におけるがんの特定に有用である。例えば一実施形態において、対象由来の試験試料中のTRPV6タンパク質のレベルを、健康な対照由来の対応する試料中のTRPV6タンパク質レベルと比較し、試験試料中のTRPV6のレベルがより高いことが、がんの指標である。一実施形態において、試験試料は、血液または血漿試料であり、健康な対照由来の対応する試料におけるレベルより2倍高いTRPV6レベルががんの指標である。
実施例1および図1から3に説明するように、TRPV6結合ペプチドは、リンパ節に優勢に局在するが、肺、肝臓および腎臓にも局在し、これらは転移性がんが局在する一般的な部位である。したがって、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドは、グリオブラストーマを含む転移性がんおよび肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓および骨髄に広がったがんの検出に有用であり、これらに結合する。
本明細書に記載のペプチドおよび化合物は、リンパ節転移の検出に特に有用であり、これらと結合する。「リンパ節転移」は、場合により肺がん(Mujoomdar et al, 2007)、胃がん、子宮頸がん(Lyshchikら、2007年)、外陰部がん(Vernooijら、2007年)、子宮内膜がん(Aaldersら、2007年)、頭頸部扁平上皮がん(Venessら、2007年)、食道がんおよび咽頭がん、鼻咽腔がん(Maら、2007年)、消化管がん(Windら、2006年)、胆嚢がん、脳腫瘍(Mujoomdarら、2007年)、甲状腺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、グリア細胞がんおよび結腸直腸がんを含む。したがって、本発明のペプチドは、がんI、II、IIIまたはIV期のいずれかの、哺乳動物におけるがんの検出に有用である。
TRPV6結合ペプチドおよび本明細書に記載の組成物は、血液中を循環する腫瘍から脱落し微小胞に存在する無傷のTRPV6チャネルまたは血液中を循環するがん細胞の検出にもまた有用である。いくつかの実施形態において、TRPV6発現腫瘍から脱落した微小胞または体液または排泄物中を循環するがん細胞は、PCRに基づく(例えば、RT-PCRまたはQ-RT-PCR)または抗体に基づく方法(例えば、ウェスタンブロット、体液または排泄物中の細胞または微小胞などの生検または体における免疫蛍光検出)によって検出される。例えば、腫瘍細胞由来であり、体液または排泄物中に存在する無傷微小胞は、TRPV6抗体または検出可能な生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを用いて処理した場合、TRPV6チャネルの集団を示すであろう。例えば、図24から26は、I期を含むがんを有する対象から採取した血液および血漿試料は、健康な対照と比較して、有意により高いレベルのTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質を有することを示す。したがって、TRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質に関して血液または血漿などの体液を試験することにより、例えば、腫瘍検出およびがん細胞の存在に関する腫瘍生検の試験と比較して、がんの早期の検出のための比較的単純な試験が提供される。
TRPV6結合ペプチドに対して開発された抗体は、検出可能な実体(蛍光タグ、放射性タグなど)を用いてTRPV6結合ペプチド抗体にタグ付けをすることによる、腫瘍、組織または細胞におけるin vitroまたはex vivoのTRPV6結合ペプチド/TRPV6複合体の検出に有用である。同様に、TRPV6に富んだ腫瘍から脱落し、体液または排泄物中に存在する微小胞は、このような抗体またはTRPV6結合ペプチドのコンジュゲートにより容易に検出される。
薬剤送達および製造方法
本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドおよび化合物は、生体分子を、TRPV6を発現する腫瘍、細胞または組織に送達するために有用である。実施例26および28に示すように、TRPV6結合ペプチドは、TRPV6発現細胞を標的にでき、化合物を腫瘍部位にin vivoで送達できる。
したがって、一実施形態は、生体分子とTRPV6結合ペプチドとをコンジュゲートすることによる医薬化合物の製造方法を含む。生体分子は、TRPV6結合ペプチドまたはTRPV6結合ペプチドに対する抗体と、当分野において公知の方法、例えば実施例1、11〜13、16、19〜23、26および28に説明する方法によって容易にコンジュゲートされる。
生体分子は、TRPV6結合ペプチドと生体分子とを直接または間接のいずれかによって連結することによってTRPV6結合ペプチドとコンジュゲートできる。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは、マレアミド活性化反応を介して、単一のシステインチオールにおいてCy5.5とコンジュゲートされる。他の実施形態において、生体分子は、ペプチドのC末端またはN末端のいずれかと連結される。他の実施形態において、生体分子は、任意の別の適切な分子部位、例えばペプチドの官能基側鎖を介して連結される。
また、生体分子は、エステル結合またはアミド結合などの化学的修飾を介してもTRPV6結合ペプチドとコンジュゲートできる。ペプチドと生体分子とをコンジュゲートするさまざまな方法が、例えば、Peng Liら、Biopolymers 87:225〜230頁、2007年;米国特許第6,348,317号および米国特許出願第20070218502号および米国特許出願第20070020264号に開示されている。
別の態様において、生体分子とTRPV6抗体とをコンジュゲートするステップを含む、医薬化合物の製造方法を提供する。
別の実施形態は、細胞と、i)生体分子にコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチドおよびii)担体を含む化合物とを接触させるステップを含む、TRPV6発現細胞に医薬組成物を送達する方法を含む。医薬組成物の送達方法は、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを含む組成物を送達するための方法を含む。
一実施形態において、本化合物は、電磁放射が照射された場合、金属クラスターの近辺の細胞を加熱し、死滅させるナノ金属クラスター(例えば、金ナノ粒子、ナノスフェア、ナノチューブまたは他のナノ構築体)を、腫瘍、組織または細胞に送達するために化学的に改変されたTRPV6結合ペプチドを場合により含む。
別の実施形態において、本化合物は、緩慢な熱中性子が照射された場合、近隣の細胞を殺す、エネルギーを有するアルファ粒子を生み出すホウ素クラスター(例えば、closo-ホウ素、12個のホウ素原子を含有するクラスター)を送達するために化学的に改変されたTRPV6結合ペプチドを含む。
他の化合物は、TRPV6を産生する腫瘍、細胞または組織に、TRPV6に富んだ腫瘍、組織または細胞に対する既存の抗体を動員するために機能する抗原を送達するために化学的に改変された本発明のTRPV6結合ペプチドを含む。このことは、順に、免疫細胞系による破壊のためにがんをマークすることになる。
本明細書に記載の化合物はまた、TRPV6を産生する腫瘍、細胞または組織に、それに対するモノクローナル抗体が特異的に開発され投与される新規の抗原を送達して、TRPV6に富んだがんに抗体でタグ付けするのにも有用である。このことにより、免疫細胞系により破壊されるがんをマークすることになる。
本明細書に記載の化合物はまた、治療放射線量を、TRPV6チャネルに富んだ腫瘍、組織または細胞に送達する、共有結合された、放射活性物質で標識された分子の送達に有用である。
記載の化合物は、TRPV6を産生する腫瘍、細胞または組織に、共有結合された治療薬、例えばタキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤、プラチナ系薬剤または他の治療用分子を、場合により送達する。本明細書に記載の方法および化合物はまた、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤および抗レトロウイルス剤または任意の他の治療薬を、TRPV6発現細胞またはリンパ節、肺、肝臓および/または腎臓に送達するためにも有用である。
対象におけるがん腫瘍の検出
実施例26および28ならびに対応する図21および23に示すように、TRPVの検出を使用して、in vivoで対象中のがん腫瘍を同定できる。本明細書で使用する場合、「がん腫瘍の同定」は、がん腫瘍を有する試料または対象中の領域の局在化または検出を指す。本明細書で使用する場合「がん腫瘍」は、正常な調節機序を失い、無秩序な増殖を有する細胞の異常な成長により形成された新生物または充実性病変を指す。多くのがんが、TRPV6を過剰発現し、したがってTRPV6に富んだ腫瘍を生成することが示されている(実施例4および5を参照されたい)。したがって、一態様において、TRPV6結合ペプチドまたはTRPV6に対する抗体を含む化合物を対象に投与するステップを含む、がん腫瘍を検出する方法を提供する。好ましくは、化合物は、対象におけるTRPV6の検出を容易にする、検出可能な標識をさらに含む。例えば、一実施形態において、TRPV6結合ペプチドはSorC27であり、検出可能な標識はCy5.5である。別の実施形態において、TRPV6結合ペプチドは磁気共鳴画像法(MRI)の造影剤、例えば超常磁性酸化鉄にコンジュゲートされ、MRIを使用して、試料またはTRPV6のレベルが上昇した対象中の領域を検出する。TRPV6のレベルの上昇を示す対象の領域は、その領域中のTRPV6に富んだ腫瘍の指標である。対象にわたるTRPV6の分布を比較する数学モデルは、TRPV6に富んだ腫瘍の指標であるTRPV6のレベルが上昇した対象の、特定の領域の同定に容易に適用される。いくつかの実施形態において、対象を通して観察されたTRPV6の平均レベルは、TRPV6レベルの正規化およびTRPV6の発現が上昇した特定の領域の同定に使用される。他の実施形態において、TRPV6のレベルを、事前に標準化された対照のレベルまたはTRPV6に富んだがん腫瘍を含有しないことが既知である対象における対応する領域において観察されたレベルと比較する。
当業者は、多くの画像技術および対応する検出可能な標識が、本説明に従ったTRPV6に富んだ腫瘍の検出に適切であることを認識するであろう。例えば、TRPV6結合ペプチドは、場合により放射活性物質で標識され、シンチレーションカウンターを使用して検出される。または、TRPV6結合ペプチドは、蛍光物質で標識され、光学的検出システムを使用して検出される。一実施形態において、TRPV6結合ペプチドは造影剤とコンジュゲートされる。本明細書で使用する場合、「造影剤」は、医用画像において対象の試料内の構造または細胞のコントラストを増強するために使用される物質である。一実施形態において、造影剤はMRI造影剤、例えば近隣に位置するプロトンのT1またはT2緩和時間を改変する薬剤である。MRI造影剤の例は、常磁性ガドリニウム、常磁性マンガンまたは超常磁性酸化鉄(SPIO)を含む。
ペプチドのさらなる特性
SorC13およびSorC27などの本明細書に記載の化合物のTRPV6結合ペプチドは、通常、4℃において水溶液中で少なくとも3週間安定であり、HPLCにより測定して純度の変化はない。乾燥固体の場合、ペプチドは、通常-80℃において少なくても1.5年安定である。
TRPV6結合ペプチドはまた、中枢神経系の保護障壁、血液脳関門を通過する物質の能力に関係する医薬品の主要な有害事象も回避する。本発明のペプチドはこの保護障壁を通過する能力がないため、中枢神経系に対する潜在的毒性を未然に防ぐ。
本発明のペプチド、特にSorC13などの短いペプチドは通常、抗原性が低い。抗原性に対する実験的カットオフ(通常、一般的にペプチドに対して13アミノ酸であると考えられる)と同じ、またはそれ未満の数のアミノ酸を有するペプチドは、抗原性を保有しない。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の任意の方法を実施するために必要な試薬のいくつかまたは全部を含む、あらかじめパックされたキットを含む。場合により、本キットは、1つまたは複数の対照試料を含み得る。いくつかの実施形態において、対照試料は、TRPV6を発現する、またはTRPV6を含有することが公知である(陽性対照)。他の実施形態において、対照試料は、TRPV6を発現しない、またはTRPV6を含有しないことが公知である陰性対照である。さらなる実施形態において、対照試料は、特定のレベルのTRPV6を発現する、もしくは含有することが公知である、またはがんの特定の型または病期に対応することが公知である。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを含む少なくとも1種の化合物およびバッファー溶液を含む。いくつかの実施形態において、本キットは、ポリメラーゼ連鎖反応においてTRPV6 mRNAを増幅するまたは検出するための核酸プライマーを含み得る。いくつかの実施形態において、本キットは、本発明の方法に有用なヌクレオチド、酵素およびバッファーならびにbpラダーなどの電気泳動用マーカーもまた含み得る。いくつかの実施形態において、本キットは、本明細書に記載の方法を実施するための詳細な指示書を含むものと思われる。
(実施例)
以下の実施例は本発明の実施形態を例示するが、本発明の範囲を限定するものではない。
(実施例1)
SorC13およびSorC27の組織分布
SorC13およびSorC27を、近赤外プローブのCy5.5を用いて標識した。SorC13は、リジン-1およびリジン-8において赤外蛍光プローブのcy5.5を用いてCy5.5 NHSエステル活性化プロセスを用いた反応を介して標識した。SorC27は、単一のシステインチオールにおいてCy5.5マレイミド活性化反応により標識した。標識されたペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィーおよびHPLCを組み合わせて精製した。標識のCy5.5は、走査型レーザーにより励起後、赤外領域において蛍光を発する。低エネルギーレーザーは約1cmまで動物を貫通でき、したがって腹臥および仰臥の位置をスキャンすることによって、タグを付けたペプチドの存在を3次元で定量できる。
Cy5.5標識ペプチドを、100uL中100ug/動物でCD1マウス(各化合物に対し4匹)に静脈内注射し、動物を、光学画像システム、Optix eXplorer(GE Healthcare Systems)を使用して、さまざまな時点(30分、90分、4時間)で生きたまま画像化した。一部の動物を、血液(およびリンパ液)を潅流して除去し、24時間後に観察した。さまざまな器官および組織における標識したペプチドの生体内分布を、光学画像分析により可視化し、相対的に定量した。このプロトコルは、標識されたペプチドの位置および継時的に位置がどのように変化するかを可視化できる。図1は、マウス中のリンパ節の位置を示す。標識されたペプチドが蓄積されたリンパ節を、直線1(浅頚リンパ節)、直線4(腋窩リンパ節)、直線5(上腕リンパ節)、直線8(腸間膜リンパ節)および直線9(近位リンパ節)によって示す。図2、3および4は、ex vivoのさまざまな器官における標識されたペプチドの量を示す。総合するとこれらの実験は、
いずれのC-ペプチドも、血液脳関門を通過しなかった。
タグを付けたSorC13およびSorC27は、リンパ節、肺、肝臓および腎臓に優勢に局在する。
タグを付けたSorC13およびSorC27は、潅流の24時間後にこれらの組織において未だ検出可能であった。
さまざまな器官における蛍光の寿命の測定により、Cy5.5はペプチド/Cy5.5付加物より寿命が短いので、標識されたペプチドが肝臓および腎臓において代謝されると思われることが示された。
TRPV6結合ペプチドは、これらの組織に送達され得るペプチドと連結された「積荷」を有するTRPV6を標的化できる。
(実施例2)
TRPV6抗体および蛍光物質により標識された、ヒトがん細胞において発現されたTRPV6の共局在
図5に示すように、がん細胞系(SKOV-3)またはex vivo試料において発現されたTRPV6は、場合により、TRPV6タンパク質に対する一次抗体を使用し、その後、それ自体が検出可能である二次抗体を使用して検出される。さらに、がんは、検出可能な分子とコンジュゲートした、または検出可能な分子のタグを付けられたTRPV6結合ペプチドを使用することによって、容易に検出される。または、TRPV6結合ペプチドに対して開発された抗体は、検出可能な実体、例えば蛍光タグまたは放射性タグを用いて容易にタグを付けられる。
同様に、TRPV6結合ペプチドに対する抗体は、組織(in vitro)、腫瘍、細胞または微小胞に関する古典的な免疫化学様式において容易に開発され、使用される。
(実施例3)
HEK269細胞における蛍光物質で標識されたTRPV6結合ペプチドおよびTRPV6に対する抗体の共局在
HEK-293細胞にTRPV6発現ベクターをトランスフェクトし、TRPV6のN末端ペプチドに対する、蛍光物質で標識された抗体および蛍光物質で標識されたSorC27(SorC27-cy5.5)と一緒にインキュベートした。TRPV6発現ベクターをトランスフェクトしなかったHEK-293細胞もまた、陰性対照として、蛍光物質で標識された抗TRPV6およびSorC27-cy5.5と一緒にインキュベートした(図6A)。
図6Bから6Dに示すように、SorC27-cy5.5および抗TRPV6の共局在によって示されるようにSorC27-cy5.5はTRPV6と結合した。この実験は、本明細書に記載の化合物がTRPV6を標的とし、これに結合することを示し、さらに生体分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む化合物は、TRPV6発現細胞に有効に局在することを示す。
(実施例4)
がんの診断としての、およびがんの病期分類のための、がん細胞系および腫瘍生検におけるTRPV6 mRNAの発現
図10〜13に示すように、TRPV6転写産物を対象とするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、ヒトがん性腫瘍のがん細胞または生検の全RNA抽出物から作成されたcDNAライブラリーにおいて、TRPV6 mRNAの上方制御が検出される。
試料中のTRPV6転写産物の相対量を定量するために、転写産物をさらに増幅し、ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチンを検出し、観察されたTRPV6β-アクチンの比を記録した。
本明細書に参照されるすべてのがんの型は全部上皮組織に由来するので、それらにおいては共通の機序が働いている。Pengらは、前立腺がんにおいて、正規化されたTRPV6 mRNAの量が、グリソンスコアが5〜7の対象由来の試料において良性の過形成の試料と比較して約2倍高く、グリソンスコアが8〜9の試料において約3倍高かったことを示した。
図10〜13は、卵巣がんなどのがん細胞系の試料においてTRPV6の発現が有意に増加したことを示す。したがって、TRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質のどちらかのレベルを検出する本明細書に記載の方法は、卵巣がんなどのがんの病期分類にとって有用である。
（実施例5）
がん細胞におけるTRPV6タンパク質の分析
TRPV6に対して開発された抗体を使用するウェスタンブロットを使用して、多数のがん細胞においてTRPV6タンパク質の発現を検出した。
図14に示すように、TRPV6を発現することが公知である胚芽腫HEP G2対照細胞系由来の抽出物と比較して、卵巣がん(SKOV-3)、乳がん(T47D)および前立腺がん(PC-3)の細胞系由来の抽出物においてTRPV6タンパク質が過剰発現された。
図15Aから15Dは、ヒト卵巣腫瘍由来の抽出物もまたTRPV6タンパク質を過剰発現し、卵巣腫瘍においてTRPV6が上方制御されることを示す。
図16は、TRPV6が、ヒトグリオブラストーマ(U87MG)、ヒト結腸癌腫細胞(CaCo-2)および膵臓癌腫細胞(Panc1)由来の抽出物において過剰発現されることを示す。さらに、Panc1における脱グリコシル化の程度は、培養継代の数が増加するにつれて増加する。
まとめると、図14から16のデータは、TRPV6タンパク質が、多くのがん細胞および卵巣腫瘍試料において過剰発現されることを示す。
(実施例6)
がんの病期を決定するためのTRPV6抗体の使用
TRPV6に対する抗体を使用して、免疫局在法を使用して腫瘍(例えば卵巣腫瘍)の病期を決定する。卵巣腫瘍の病期分類された組織マイクロアレイを、蛍光物質で標識されたTRPV6抗体を用いて探査する。
結果
腫瘍の病期はI期からIV期へ進むので、実験は、組織中のTRPV6チャネルの集団の増加を示す、免疫蛍光シグナルの密度の増加が存在することを示す。
(実施例7)
がんの病期を決定するための、蛍光物質をタグ付けしたTRPV6結合ペプチドの使用
蛍光物質のタグを付けたTRPV6結合ペプチドは、組織マイクロアレイ(TMA)とペプチド試薬との直接インキュベーションによる腫瘍の病期決定に有用である。SorC27-cy5.5化合物を対象由来の細胞と一緒にインキュベートし、蛍光レベルを対照である病期分類された腫瘍試料のレベルと比較する。
結果
腫瘍の病期はI期からIV期へ進むので、実験は、cy5.5をタグ付けしたSorC27を含む、タグ付けした化合物と、増加したTRPV6チャネルの集団との結合による、蛍光シグナルの強度の増加が存在することを示す。
(実施例8)
がんの病期を決定するための、TRPV6結合ペプチドを含む化合物に対する、蛍光物質をタグ付けした抗体の使用
TRPV6結合ペプチドに対する、蛍光物質をタグ付けした抗体を使用して、有効な卵巣がん組織マイクロアレイのTRPV6チャネルと結合したTRPV6結合ペプチドを検出する。
結果
TMAとTRPV6結合ペプチドの1種とをインキュベートし、次いでTRPV6結合ペプチドに対して開発された、蛍光物質をタグ付けした抗体を配置した後、蛍光シグナルの強度とI期からIV期までのがんの病期との間に正の相関が存在する。
(実施例9)
蛍光物質で標識されたTRPV6結合ペプチドは、マウスに異種移植されたTRPV6に富んだ腫瘍と結合する
卵巣のTRPV6に富んだ腫瘍(SKOV-3細胞)を異種移植されたマウスに、蛍光物質で標識されたTRPV6結合ペプチドのSorC27-cy5.5を注射する。
結果
TRPV6チャネルを過剰発現する卵巣腫瘍を、TRPV6腫瘍(例えば卵巣腫瘍)を異種移植されたマウスに投与後、SorC27-cy5.5化合物によってin vivoで検出する。TRPV6に富んだ、異種移植されたSKOV-3細胞に由来する腫瘍塊は、遠赤外において強く蛍光を発するので、バックグラウンドの組織から明らかに識別される。
(実施例10)
TRPV6産生細胞を検出するための、超常磁性酸化鉄(SPIO)により標識されたTRPV6結合ペプチドの使用
SPIO-SorC27などの超常磁性酸化鉄とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む化合物を、SKOV-3細胞(TRPV6陽性)およびHEK293細胞(TRPV6陰性)と一緒にインキュベートする。その後、細胞を磁気共鳴画像法を使用して画像化する。
結果
TRPV6チャネルを過剰発現するSKOV-3細胞は、SPIO-SorC27などのMRI増強剤によってin vitroで検出される。TRPV6に富んだSKOV-3細胞は、強力に増強された磁気共鳴シグナルおよび画像によって、TRPV6陰性HEK293細胞と明らかに識別可能である。
(実施例11)
SPIOにより標識されたTRPV6結合ペプチドは、TRPV6発現腫瘍と結合するが、TRPV6陰性腫瘍とは結合しない
SKOV-3 TRPV6に富んだ卵巣腫瘍を異種移植されたマウスに、SPIO-SorC27を投与し、磁気共鳴画像法を使用して画像化した。
結果
結果は、SPIOをコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチドは、ヒト卵巣がん細胞系SKOV-3由来のTRPV6に富んだ腫瘍と結合し、磁気共鳴画像法を使用して画像化できる。実験は、TRPV6チャネルを過剰発現する卵巣腫瘍が、マウスに投与後SPIO-SorC27などのMRI増強剤によってin vivoで検出されることを示す。TRPV6に富んだ異種移植された腫瘍塊は、強力に増強された磁気共鳴シグナルおよび画像によって、バックグラウンド組織と明らかに識別される。
(実施例12)
18F含有放射性分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドの使用
18F含有放射性分子を用いて共有結合的に標識されたTRPV6結合ペプチドを含む化合物は、このような分子が、TRPV6を発現する腫瘍、細胞または組織を標的とし、PETスキャニング(ポジトロン放出断層撮影)を使用する検出、およびこれらの腫瘍、細胞または組織の検出を可能にする(Chengら、J. Nucl. Med. 48:987〜994頁、2007年)。18F含有放射性分子とコンジュゲートしたSorC27を、SKOV-3細胞およびHEK293細胞と一緒にインキュベートする。次いで、この細胞を、PETスキャニングを使用して画像化する。
結果
18F-SorC27は、TRPV6陰性細胞(HEK293)と比較して、TRPV6に富んだSKOV-3細胞の同定を明らかに示す。
(実施例13)
125I含有放射性分子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドの使用
125I含有放射性分子を用いて共有結合的に標識されたTRPV6結合ペプチドを含む化合物は、このような分子が、TRPV6を発現する腫瘍、細胞または組織を標的とし、これらの腫瘍、細胞または組織の放射分析検出法を使用した検出を可能にする(Boltonら、Biochem. J., 133, 529〜539頁、1973年)。125I含有放射性分子とコンジュゲートしたSorC27を、SKOV-3細胞およびHEK293細胞と一緒にインキュベートする。次いで、この細胞を、PETスキャニングを使用して画像化する。
結果
125I-C-ペプチドは、TRPV6陰性細胞(HEK293)と比較して、TRPV6に富んだSKOV-3細胞の同定を明らかに示す。
(実施例14)
血液、他の体液または排泄物の試料から単離された微小胞におけるTRPV6 mRNAの検出
TRPV6に富んだがん(例えば卵巣がん)を有する患者の血液、他の体液または排泄物の試料から単離された微小胞において、TRPV6 mRNAを検出する。エンドサイトーシスプロセスを介して腫瘍から脱落した微小胞を含有する血液分画を、対象から得た試料から単離する。次いで、これらの微小胞からRNAを抽出し、PCRに基づく技術によってその後分析する。
結果
Q-RT-PCRは、TRPV6に富んだがんを有さない人々との比較において、がん患者の血液試料中に過剰なTRPV6 mRNAの存在を示す。したがって、TRPV6発現の相対量の検出は、卵巣がんなどのTRPV6に富んだがんの診断に有用である。
(実施例15)
体液または排泄物から単離された微小胞におけるTRPV6タンパク質の検出
TRPV6タンパク質を、TRPV6に富んだがん(例えば卵巣がん)を有する患者の、血液、リンパ液などの体液または排泄物の試料から単離された微小胞において検出する。エンドサイトーシスプロセスを介して、腫瘍から脱落した微小胞を含有する試料の分画を単離する。次いで、タンパク質をこれらの微小胞から抽出し、ウェスタンブロットおよび抗体に基づく技術によってその後分析し、TRPV6タンパク質を検出する。または、単離された微小胞を、抗TRPV6抗体またはTRPV6結合ペプチドのどちらかを用いて処理して検出できる。
結果
ウェスタンブロットは、TRPV6に富んだがん、例えば卵巣がんを有さない人々との比較において、がん患者の血液試料中に過剰なTRPV6タンパク質の存在を示す。全微小胞は、 TRPV6に対する抗体を使用する免疫蛍光法および適切に標識されたTRPV6結合ペプチドを使用することによって、TRPV6を示す。
(実施例16)
タキサンとコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドIn Vivo使用
TRPV6結合ペプチドを含む化合物が、TRPV6を発現する組織および細胞に結合したフルオロフォアのシアニジンクラス(cy5.5)の送達に有用であることは、実施例1に説明した生体内分布の研究により明らかである(図6から9を参照されたい)。したがって、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドを含む化合物を使用して、他の分子を、TRPV6発現細胞または組織に送達できる。
化合物は、ペプチドのTRPV6標的化機能を使用して、薬剤をTRPV6に富んだ腫瘍またはがん細胞に直接送達するために、タキサンなどの制癌剤とTRPV6結合ペプチドとの共有結合によって調製される。このような薬剤と化合物の結合のための化学は、当分野において公知である(例えば、Peng Liら、Biopolymers 87:225〜230頁、2007年を参照されたい)。
パクリタキセルを、4個の炭素のスペーサー分子を介して、第1級アミンまたは遊離のチオール基においてSorC27ペプチドに結合させる。次いで、SorC27とコンジュゲートされたタキサンを、TRPV6に富んだ腫瘍を異種移植されたマウスに投与する。対照マウスには生理食塩水溶液を投与する。
結果
マウスにおけるin vivo実験は、パクリタキセルとコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチドを含む化合物が、生理食塩水溶液を投与された対照マウスと比較した場合、パクリタキセルの腫瘍部位への適切な送達、腫瘍の退縮およびがん細胞の死をもたらすことを示す。
(実施例17)
TRPV6結合ペプチドとコンジュゲートされた抗ウイルス剤の送達
抗ウイルス剤または抗レトロウイルス剤は、HIVの保有者の治療のために、TRPV6結合ペプチドと容易に共有結合される。ヒトにおけるHIV一次保有所は腸間膜リンパ節である(Cumontら、Cell Death and Differentiation、14、1747〜1758頁、2007年; Estaquier and Hurtrel. Medical Science(Paris)24(12):1055〜1060頁、2008年)。タグ付けしたペプチドのi.v.注射後、これらのリンパ節における蛍光の存在により示されるように、蛍光タグを担持するTRPV6結合ペプチドを含む化合物は、腸間膜リンパ節に蓄積される(図1を参照されたい)。
抗ウイルスまたは抗レトロウイルスは、本明細書に記載のTRPV6結合ペプチドと共有結合される。SorC27-抗ウイルス剤コンジュゲートを含む化合物は、次いで、実施例1に説明したプロトコルに従ってマウスに投与される。
結果
結果は、抗ウイルス剤コンジュゲートがリンパ節組織において検出されることを示す。抗ウイルス活性が得られ、HIVの再生を遮断し、その結果HIVを治療する。
(実施例18)
抗菌薬とコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチド
抗菌薬とTRPV6結合ペプチドとの共有結合は、細菌感染の保有者の治療にとって有用である。タグ付けしたペプチドのiv注射後、これらのリンパ節における蛍光の存在によって示されるように、蛍光タグとコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチドを含む化合物は、リンパ節に蓄積される(図1を参照されたい)。同様に、場合により、抗菌薬は当分野において公知の方法によってTRPV6結合ペプチドに共有結合され、リンパ節の標的化に使用される。
結果
結果は、薬剤が、抗菌薬-TRPV6結合コンジュゲートを用いて処置したマウスから単離されたリンパ節組織において検出され、微生物を殺すと思われることを示す。
(実施例19)
ホウ素錯体とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチド
TRPV6結合ペプチドと共有結合したホウ素錯体を含む化合物は、がんの療法にとって有用である。TRPV6結合ペプチドは、TRPV6に富んだ細胞を標的とし、これと接触し、ここにおいてホウ素錯体の濃縮を引き起こす(それぞれが複数のホウ素原子を有する、例えば12個のホウ素のcloso-ホウ素錯体)。熱中性子の放射により、10個のホウ素原子による中性子の捕捉がもたらされ、高エネルギーのα粒子が組織へ移行することで腫瘍細胞を殺す。本発明のこの態様は、腫瘍を標的化する大量のホウ素クラスターを提供する。閾値は、約20ug B/g腫瘍であることが提示される(Barthら、Clinical Cancer Research、11(11) 3987〜4002頁、2005年)。ホウ素化合物とタンパク質の錯体を結合する化学は、十分確立されている(Guanら、Proc. Natl. Acad. Sci.、95 13206〜13210頁、1998年)。
TRPV6結合ペプチドにコンジュゲートしたホウ素を、TRPV6に富んだ腫瘍を異種移植されたマウスに投与する。次いで、腫瘍に熱中性子を放射する。
結果
TRPV6-に富んだ腫瘍、例えば卵巣腫瘍においてホウ素の濃度が非常に増加する。腫瘍への熱中性子の放射は、腫瘍細胞を殺す。ホウ素-ペプチド化合物は、腫瘍細胞を殺すことにとって有用である。
(実施例20)
エピトープとコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチド
TRPV6結合ペプチドに対する広範囲な抗体の公知かつ/または認識されたエピトープの共有結合はTRPV6を発現する腫瘍およびがん細胞に対するこれらの既存の抗体を動員する。この錯体(抗体-エピトープ-TRPV6結合ペプチド)は、腫瘍(例えば卵巣)の成長比率が低い異種移植実験において示されるように、免疫細胞によるTRPV6発現細胞の検出および破壊をもたらす。
(実施例21)
抗原またはエピトープとコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチド
新規の抗原またはエピトープとTRPV6結合ペプチドとの共有結合およびマウスへの化合物の投与により、エピトープ/TRPV6結合ペプチド錯体が、TRPV6を抱く腫瘍へ向かう。その後、特定のエピトープに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を投与することにより、どちらかの抗体とTPRV6に富んだ細胞、組織または腫瘍との結合がもたらされる。その後、免疫細胞(例えば、キラーT細胞)の活発化によりこれらのペプチドの標的細胞の死および腫瘍の縮小がもたらされる。
(実施例22)
免疫活性化因子とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチド
TRPV6結合ペプチドと、免疫系の細胞、特にキラーT細胞上の受容体により認識され、これと結合する分子との共有結合により、このような細胞がTRPV6-に富んだ腫瘍またはがん細胞に向かう。キラーT細胞のような細胞の活発化は、がん細胞または腫瘍を破壊する。この実験は、TRPV6結合ペプチドはTRPV6チャネルを標的とするが、TRPV6結合ペプチドの他方の末端に結合した「ベイト分子」は免疫細胞を活発にし、この生成物の投与により、腫瘍(例えば異種移植された卵巣腫瘍)の縮小が引き起こされることを示す。
(実施例23)
金属ナノ構造とコンジュゲートしたTRPV6結合ペプチド
金属ナノ構造(例えばナノ金粒子)とTRPV6結合ペプチドとの共有結合は、がん細胞および腫瘍に対するペプチドのTRPV6結合機能を介して、金属ナノ粒子または他の構築体(球、棒状など)を標的とする。例えばナノ金粒子の固有の特性のため、ラジオ周波数の照射または赤外線照射が粒子の加熱を引き起こす。その後のがん細胞または腫瘍の加熱により細胞または腫瘍の死が引き起こされる。金属ナノ粒子とペプチドなどの分子とを結合する化学は、十分確立されている。実験は、ナノ金コンジュゲートが、TRPV6に富んだ、異種移植された腫瘍(例えば、卵巣腫瘍)を標的とすること、その後の照射が腫瘍塊の縮小を引き起こすことを示す。
(実施例24)
がんの検出およびグレード決定のためのTRPV6抗体の使用
4種の組織マイクロアレイ(TMA)(US Biomax、Inc. Rockville、MD 20850、USAより入手したOV483、OV802、T112、BCN721)にわたる146の独立した生検の組織切片を含む試料を、TRPV6抗体、二次抗体を使用するTRPV6の免疫組織化学染色およびホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を使用する比色検出に関して試験した。試料は、卵巣がんのすべての主要な型を代表する18種の異なる卵巣がん型および21種の正常な卵巣組織の試料を含んだ。多くの試料はすでにグレード決定されたがんを表す。図17は、TRPV6染色の強度を評価するために使用される、(-)から(++++)までの6ポイントのスケールについてTMA試料の較正および代表的グレード決定を示す。Table 3（表3）に示すように、個々の146種の試料を、この6ポイントのスケールにしたがってランク付けした。
図18は、グレードI、グレードIIまたはグレードIIIのがんを有する漿液性乳頭腺がん組織試料と比較して、非常に少ないパーセントの正常な卵巣組織試料が、TRPV6染色強度スコア≧1+を有したことを示す。例えば、100%の漿液性乳頭腺がん組織試料が染色強度スコア≧1を有することと比較して、正常な卵巣組織はわずか約24%である。したがって、抗体染色などによるTRPV6の検出は、試料中のがんの可能性の予測または診断に有用である。さらに、TRPV6の検出は、正常な卵巣組織試料と比較して、グレードI(早期)がんを有する試料の同定に有用である。
図19は、正常な卵巣組織のマイクロアレイ試料およびグレードI、IIおよびIIIの漿液性乳頭腺がんの試料における、TRPV6抗体を使用するTRPV6の免疫組織化学的検出の例を示す。図19は、よりグレードの高いがんを有する試料における、TRPV6染色の増加の観察された傾向を示す。
がんの染色データは、多くの組織アレイ試料に関しても利用可能である。がんは、当分野において公知の腫瘍、リンパ節、転移(TNM)システムに従って病期分類した。TRPV6抗体、二次抗体を使用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を使用する比色検出による、(-)から(++++)までの5ポイントのスケールについて評価した個々の試料に関するTRPV6の免疫組織化学染色強度をTable 4（表4）に提供する。
Table 4（表4）に示すように、正常な卵巣組織試料のわずか23.8%(5/21)が、+1以上のTRPV6染色強度スコアを有した。対照的に、95.7%(44/46)のI期〜IV期のがんを有する試料が+1以上のTRPV6強度スコアを有した。早期がん(I期およびII期)は、+1以上のTRPV6染色強度スコアを有する早期がんの92.9%(26/28)が容易に検出された。したがって、免疫組織化学法などによるTRPV6の検出は、がん、特に早期のがんの検出に使用できる。
(実施例25)
グレードIIの漿液性乳頭腺がんにおける、TRPV6および蛍光物質で標識されたSorc27の共局在
タグ付けしたSorC27ペプチドがその結合標的TRPV6に向かう有効性を試験するために、標準的免疫組織化学およびSorC27-cy5.5の結合プロトコルを、多くの卵巣がん腫瘍切片の組織マイクロアレイに適用した。両方の方法によるTRPV6チャネルの検出は、さまざまな卵巣がんマイクロアレイ試料にわたって観察された。
結果
図20は、TRPV6に対する抗体およびcy5.5を用いて蛍光標識したSorC27(SorC27-cy5.5)を用いて染色された、グレードII漿液性乳頭腺がんの組織マイクロアレイ試料のTRPV6抗体の検出および蛍光検出を示す。したがって、蛍光物質で標識されたTRPV6結合ペプチドの使用はTRPV6イオンチャネルの標準的免疫組織化学検出に相当し、TRPV6結合ペプチドは、TRPV6またはTRPV6発現細胞または組織の確実な検出に有用である。
(実施例26)
in vivoで異種移植されたがん腫瘍におけるSorC27の局在
TRPV6に富んだ卵巣腫瘍(SKOV-3細胞)および前立腺腫瘍(DU 145細胞)を異種移植されたマウスに、蛍光物質で標識されたTRPV6結合ペプチドのSorC27-cy5.5を(腹腔内)注射した。SorC27を、近赤外プローブCy5.5を用いて単一のシステインチオールにおいて、Cy5.5マレイミド活性化反応を使用して標識した。標識されたペプチドを、サイズ排除クロマトグラフィーおよびHPLCを組み合わせて精製した。Cy5.5は、走査型レーザーにより励起後、赤外領域において蛍光を発する。低エネルギーレーザーは約1cmまで動物を貫通でき、したがってスキャンすることによって、タグの付いたペプチドの存在を3次元で定量できる。Cy5.5標識ペプチドを、ヌードCD1マウスに100ug/動物で腹腔内注射し、動物を、光学画像システム、Optix eXplorer(GE Healthcare Systems)を使用して、さまざまな時点(30分、90分、4時間)で生きたまま画像化した。
結果
TRPV6チャネルを過剰発現する卵巣腫瘍および前立腺腫瘍は、注射の少なくとも24時間後、in vivoで明らかに検出される。TRPV6に富んだ、異種移植された腫瘍塊は、遠赤外において強く蛍光を発するので、バックグラウンドの組織から明らかに識別される。図21Aは、卵巣腫瘍におけるSorC27-cy5.5の時間依存性局在を示すが、一方、図21Bは、前立腺腫瘍におけるSorC27- cy5.5の時間依存性局在を示す。これらの2つの画像において、腎臓も強調される。スキャン装置の3D性は、動物の2mm切片を単離することによって、腫瘍と可視的腎臓組織との明確な識別を可能にする。同様に、腫瘍を通る「切片」(Z切片)は、蛍光を発する腫瘍の中心領域の明確な観察を可能にする。
(実施例27)
がん組織におけるTRPV6 mRNAの定量的RT-PCR
TRPV6 mRNAに関する定量的RT-PCRを、卵巣がん、前立腺がんおよび乳がんの生検および15例の健康な個体由来の対応するプールされた対照試料について実施した。18例の卵巣腫瘍生検、4例の前立腺腫瘍生検および3例の乳房腫瘍生検を試験した。3種の異なるRT-PCRプライマーセット(A、BおよびC)を、前立腺試料の試験に使用した。結果を、ハウスキーピング遺伝子ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HPRT)の発現レベルに対して標準化し、腫瘍試料由来の標準化されたシグナルと15例の健康な組織のプールされた試料由来の標準化されたシグナルの比として表した。
結果
図22は、ヒトの卵巣がん(A)、前立腺がん(B)および乳がん(C)の生検から抽出された、健康な組織と比較したTRPV6 mRNAのQ-RT-PCRによる定量化の結果を示す。また、Table 5から7（表5から7）は、正常な対照と比較した個々の試料生検の定量的Q-RT-PCRの結果を提供する。腫瘍生検は、TRPV6 mRNAの発現レベルにおいて有意な増加を示した。対照組織と比較したTRPV6 mRNAの発現の増加は、1種の卵巣がん試料(LTL290)を除く、試験した個々のがん試料において見られた。卵巣がん試料は、健康な対照と比較してTRPV6 mRNAの発現が平均39倍の増加を示し、一方、前立腺がん試料および乳がん試料は、それぞれ、8.7倍および13倍の増加を示した。がん組織におけるTRPV6 mRNAの転写において観察された有意な増加は、卵巣がん、乳がんおよび/または前立腺がんを含むがんの同定のための、有用な診断ツールまたは予後予測ツールを提供する。
(実施例28)
TRPV6結合ペプチドコンジュゲート(SPIO-SorC27)のin vivo注射およびMRI画像法
SorC27とSPIOナノビーズとのコンジュゲーション
およそ120個のマレイミド基/ビーズにより官能化されたSPIO(超常磁性酸化鉄)ビーズ(製品番号77-96-201、micromod Partikeltechnologie GmbH、Germany)を、5倍モル過剰な緩衝化されたSor-C27(1mM、10×PBS、pH7.2)と1時間、室温において反応させた。ビーズを、遠心分離によって反応混合物から分離し、腫瘍を抱えるCD-1ヌードマウスに注射するために、ある量の滅菌ダルベッコPBSに懸濁した。SOR-C27ペプチド/ビーズの数を、上清の定量的1H NMR分析によって決定し、反応したペプチド分子の数を決定した。平均して、75分子のSOR-C27が各SPIO粒子にコンジュゲートした。ペプチドとSPIOとのコンジュゲーションを、SPIO-ペプチドコンジュゲートのトリプシン消化後、LC-MSによって確認した。その後、SPIO-SorC27コンジュゲートを、画像化の前にCD-1ヌードマウス内に異種移植されたSKOV-3由来卵巣腫瘍に腹腔内(i.p.)注射した。
MRI画像の取り込み
MRI画像を、305/210mmのOD/ID Magnex傾斜磁場コイルおよびDoty Incによる直径25mmのクワドラチャ・マウス用RFコイルを使用して、3T Varian Direct Drive Consoleにおいて獲得した。画像を、酸化鉄ナノ粒子に対する対比感度が最適になるように特に選択されたパルスシーケンスを使用して獲得した。酸化鉄は、これらの型の獲得に関して暗く見える(ネガティブコントラスト)。獲得は、3Dバランス定常自由歳差運動(3D balanced steady state free precession)(b-SSFP)のパルスシーケンスでTR/TEが8/4msおよび150ミクロンの画像解像度(3方向すべてにおいて150ミクロンのピクセル寸法)を使用した。
結果
図23は、CD-1ヌードマウスに異種移植されたSKOV-3に由来する卵巣腫瘍に対するMRI増強剤(SPIO-SorC27)のMRI画像および局在を示す。上段の対照パネル(A)は、SorC27をコンジュゲートしないSPIO対照ビーズの投与を示す。SPIO対照ビーズは、注射の24時間後までに腫瘍から消え去ってなくなった。下段のパネル(B)は、SPIO-SorC27化合物が腫瘍の皮質を注射の24時間後も標識することを示す。左側の画像に示された白い直線の矢印は、異種移植片中の腫瘍の位置を示す。下の右側のパネル中の点線の矢印は、腫瘍の皮質に結合したSPIO-SorC27構築体の、暗くなり、増強されたMRIシグナルを示す。上の右の対照パネルにおいて、鉄ナノ粒子の対応する蓄積は全く観察されない。右側のパネルはi.p.注射前のMRI画像を示し、一方、右側のものは対照または診断試薬の投与後24時間のMRI画像を示す。したがって、SorC27-コンジュゲートなどのコンジュゲートされたTRPV6結合ペプチドは、in vivoで腫瘍部位を有効に標的にできる。
(実施例29)
病期分類されたがん対象由来の血液のRT-PCR
前立腺がん、乳がんまたは卵巣がん(I期からIV期)を有する対象由来の試料を、RT-PCRを使用して、TRPV6 mRNAの発現に関して試験した。健康な男性(前立腺)または健康な女性(乳房および卵巣)から採取した血液の対照試料もまた試験した。RT-PCR産物をアガロースゲルに添加し、電気泳動を使用して分離した。次いで、統合されたバンド密度を、各試料および対照に関して、TRPV6 mRNA(約320bp)のアンプリコンに関して、アガロースゲル上で測定した。
結果
図24は、がんを有する患者から採取した血液試料中のTRPV6 mRNAの発現が、正常で健康な対照から採取した試料と比較して有意に高かったことを示す。図24Aは、I、II、IIIまたはIV期の前立腺がんを有する対象が、血液中のTRPV6の発現が最大6倍多かったことを示す。正常な試料と比較してTRPV6発現の有意な増加は、さまざまながんの病期を代表する試料においても見られる。図24Bは、乳がんを有する対象が血液中のTRPV6の発現において有意な増加を示すことを示す。図24Cは、卵巣がんを有する対象もまた、健康な女性の対照試料と比較して、TRPV6の発現において増加を示すことを示す。図24に表された統合されたシグナルは、100,000(24Aおよび24B)または10,000(24C)のいずれかの因子によって分割される。したがって、血液中のTRPV6 mRNAの発現レベルの分析は、I期の前立腺がん、乳がんまたは卵巣がんの早期検出を含む、がんを有する対象の同定に有用である。
(実施例30)
I期またはII期の卵巣がんを有する対象由来の血漿試料中のTRPV6 mRNA
全RNAを、健康な女性(10例)およびI期(3例)またはII期(3例)の卵巣がんを有する女性に由来する血漿試料から、TRI Reagent(登録商標)LS法(Sigma Aldrich)を使用して抽出した。各試料から抽出されたRNAの等量からcDNAライブラリー(iScript、BioRad)の調製後、試料を標準PCRに供した。PCR反応を、E-Gel(登録商標) EX 1%アガロースゲルを使用して分析し、E-Gel(登録商標)iBaseゲル電気泳動ユニットにおいて泳動させた。プログラム7、E-Gel(登録商標)EX 1〜2%ゲルを、10分間使用した。TRPV6 mRNA(cDNA)アンプリコンを、Alpha Innotech FluorChem(登録商標) FC2撮影装置を用いて画像化し、フィルター位置1番(緑色フィルター)およびUV光(302nm)を使用し、Auto Exposeを使用して定量した。すべての試料を三連に分析し、データはスチューデントt検定および95%の信頼限界を使用して比較した。
結果
図25に示すように、I期またはII期の卵巣がんを有する対象から採取した血漿は、健康な対照由来の試料と比較して、有意に高いTRPV6 mRNAの発現を有した(p<0.0001 OVI; p=0.0475 OVII)
(実施例31)
I期およびII期の卵巣がんを有する対象におけるTRPV6タンパク質レベルの分析
健康な女性およびI期またはII期の卵巣がんの診断を受けた女性から、血漿試料を得た。TRI Reagent(登録商標) LS法(Sigma Aldrich)に従って血漿試料からタンパク質を単離した。PBS中1% SDSおよび15mMのジチオスレイトール(DTT)の溶液中で、沸騰したウォーターバスにおいて加熱することによって、TRI Reagent(登録商標)LS手順により、血漿タンパク質ペレットから溶解物を調製した。タンパク質抽出物を、Varian Cary 50 UV分光光度計において、280nmにおいて各溶解物の吸光度を測定することによって定量した。ウシ血清アルブミンタンパク質の標準曲線から、タンパク質の量をug/uLで推定した。タンパク質抽出物を、NuPage(登録商標)Novex 4〜12% Bis-Tris Gel 1.5mmウェル(Invitrogen)において145Vで55分電気泳動にかけた。ゲルを、iBlot(登録商標) Transfer Stack、PVDFレギュラー(Invitrogen)上に10分間、Invitrogen iBlot転写システムを使用して転写した。PVDFブロッキング、抗体インキュベーションおよび洗浄を、SNAP i.d.タンパク質検出システム(Millipore)を使用して実施した。その後、PVDF膜を、0.5% ECLアドバンスドブロッキングバッファー(Fisher)を用いて30秒間ブロックした。PVDF膜を、1/30希釈のTRPV6(H-90)一次抗体(Santa Cruz)中で10分間インキュベートし、30 mLのTBS-Tを用いて3回洗浄した。次いで、PVDFを、1/1500希釈のヤギ、抗ウサギIgG HRP二次抗体(Santa Cruz)中で10分間インキュベートし、30mLのTBS-Tを用いて3回洗浄した。TRPV6のバンドを、15mlのルミノールを用いて3分間検出した。ゲルを画像化し、バンド密度を、Alpha Innotech FluroChem撮影装置を用いて10分間定量した。すべての試料を三連に分析し、データはスチューデントt検定および95%の信頼限界を使用して比較した。
結果
図26Aに示すように、TRPV6タンパク質のレベルは、I期(p=0.0001)またはII期(p=0.0270)の卵巣がんを有する対象から採取した血液試料において、健康な対照から採取した試料と比較して、有意に高かった。図26Bは、I期およびII期の卵巣がん(早期がん)がともに、健康な対照と比較して、TRPV6タンパク質のレベルの増加を示すと考えられることを示す(p = 0.0006)。
本発明は、現時点で好ましい実施例であると考えられることに関して記載したが、本発明が開示した実施例に限定されるものではないことを理解すべきである。それとは反対に、本発明は添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるさまざまな改良および同等の配置を含むことを意図する。
すべての出版物、特許および特許出願は、各個別の出版物、特許または特許出願が、具体的かつ個別に参照によりその全体が組み込まれることが示されるのと同じ程度で、参照により本明細書にそれらの全体が組み込まれる。
(参考文献)

Claims (35)

  1. 生体分子とコンジュゲートした一過性受容体電位バニロイド6(TRPV6)結合ペプチドを含み、TRPV6結合ペプチドがアミノ酸配列KEFLHPSKVDLPRを含みかつ麻痺活性を示さない化合物。
  2. TRPV6結合ペプチドが配列番号1の13から27個のアミノ酸を含む、請求項1に記載の化合物。
  3. TRPV6結合ペプチドが配列番号1のC末端配列の連続部分を含む、請求項1または2に記載の化合物。
  4. TRPV6結合ペプチドが、アミノ酸配列EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPRに対して少なくとも70%の同一性を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. TRPV6結合ペプチドがアミノ酸配列EGKLSSNDTEGGLCKEFLHPSKVDLPRを含む、請求項1に記載の化合物。
  6. TRPV6結合ペプチドが３５個より少ないアミノ酸からなる、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. TRPV6結合ペプチドが３０個より少ないアミノ酸からなる、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
  8. TRPV6結合ペプチドが配列番号１のＣ末端配列の14、15、16、17、18、19または20個の連続するアミノ酸からなる、請求項１に記載の化合物。
  9. 生体分子が検出可能な標識を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記検出可能な標識がフルオロフォアまたは磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項9に記載の化合物。
  11. 前記磁気共鳴画像法の造影剤が、超常磁性酸化鉄である、請求項10に記載の化合物。
  12. 生体分子が、治療薬を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物。
  13. 治療薬が抗がん剤である、請求項12に記載の化合物。
  14. 前記抗がん剤が、タキサン系薬剤、アントラサイクリン系薬剤またはプラチナ系薬剤である、請求項13に記載の化合物。
  15. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物および医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  16. a)試料と、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物とを接触させるステップ、
    b)TRPV6結合ペプチドとコンジュゲートした生体分子を検出し、その結果TRPV6タンパク質を検出するステップ
    を含む、試料中のTRPV6タンパク質を検出するin vitroの方法。
  17. 生体分子がフルオロフォアを含み、生体分子を検出するステップがフルオロフォアを検出するステップを含む、請求項16に記載の方法。
  18. 試料が体液である、請求項16に記載の方法。
  19. 体液が血液または血漿である、請求項18に記載の方法。
  20. a)血液または血漿試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質を検出するステップ、
    b)血液または血漿試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量を、対照試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量と比較するステップ
    を含み、対照と比較した血液または血漿試料中のTRPV6 mRNAまたはTRPV6タンパク質の量の増加ががんの指標である、対象由来の血液または血漿試料中のがんを同定する方法。
  21. TRPV6タンパク質を検出するステップが、試料と、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップを含む、請求項20に記載の方法。
  22. 血液または血漿試料が微小胞を含む、請求項20または21に記載の方法。
  23. がんが、I期のがんまたはII期のがんである、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. がんが、卵巣がん、乳がんまたは前立腺がんである、請求項20から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 対象中のTRPV6結合ペプチドを検出し、その結果TRPV6を検出し、そして
    対照レベルと比較してTRPV6のレベルが増加した対象の領域を同定することにより、対象においてがん腫瘍を同定するための、請求項1から11のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物であって、TRPV6のレベルの増加が、がん腫瘍の指標である組成物。
  26. がん腫瘍が、卵巣がん腫瘍、乳がん腫瘍または前立腺がん腫瘍である、請求項25に記載の組成物。
  27. TRPV6結合ペプチドを含む化合物が、磁気共鳴画像法の造影剤を含み、TRPV6結合ペプチドを検出するステップが、磁気共鳴画像法(MRI)を含む、請求項25または26に記載の組成物。
  28. 磁気共鳴画像法の造影剤が、超常磁性酸化鉄(SPIO)である、請求項27に記載の組成物。
  29. TRPV6結合ペプチドを含む化合物が、フルオロフォアを含み、TRPV6結合ペプチドを検出するステップが、フルオロフォアを検出するステップを含む、請求項25または26に記載の組成物。
  30. 請求項1から14のいずれか一項に記載の化合物を含む、生体分子を、TRPV6発現細胞に送達するための組成物。
  31. 生体分子が治療薬を含む、請求項30に記載の組成物。
  32. 治療薬が抗がん剤を含む、請求項31に記載の組成物。
  33. 生体分子が検出可能な標識を含む、請求項30に記載の組成物。
  34. 検出可能な標識がフルオロフォアまたは磁気共鳴画像法の造影剤である、請求項33に記載の組成物。
  35. 細胞を接触させるステップがin vivoで実施される、請求項30に記載の組成物。
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