CN111484982A - 一种人结直肠腺癌细胞trpv1基因敲除细胞株及应用 - Google Patents

一种人结直肠腺癌细胞trpv1基因敲除细胞株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。所述细胞株命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO‑2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.C202024。是基于CRISPR/cas9技术利用SEQ ID NO：2‑3所示的一对gRNA构建的质粒载体电转染待敲除细胞，经抗性和测序筛选而获得。本发明设计的gRNA能够精确且高效的敲除TRPV1基因，有效的构建了一种敲除TRPV1基因的人结直肠腺癌细胞系。TRPV1基因敲除细胞系的建立，为研究辣椒素作用机理提供了有效的基因素材和基因工具。

Description

一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是一种高效、可编程的基因组编辑工具，它的最新发展彻底改变了基础科学研究，已被证明是一项重大的科学突破。基于CRISPR/Cas9系统的技术为研究人员提供了新的强大工具，可以创建精确的人类疾病细胞和动物模型。与TALENs和ZFs使用的蛋白质引导的DNA裂解不同，CRISPR/Cas9依赖于一个小RNA来来识别敲除靶点,从而引入一个位点特异性的双链DNA断裂，它的开发使基因编辑变得更加容易。CRISPR/Cas9技术从诞生之始就在新型动物模型上的得到广泛的应用，在此之前，敲基因动物模型的构建是一个耗时、费力，昂贵的过程，减慢了基因工程动物模型的产生,而CRISPR/Cas9技术实现了对多种细胞模型和动物模型进行快速基因修饰的作用，而且还可以同时靶向多个基因，获得多基因敲除的细胞和动物模型。
人结直肠腺癌细胞（Caco-2）是一种常用的细胞模型。虽然Caco-2细胞虽然起源于结肠，但看起来像人小肠粘膜细胞，在基底外侧和顶室有紧密的连接、刷状边界、外排和摄取转运蛋白。在标准培养条件下，在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的Caco-2可融合并分化为与肠上皮具有相同功能和形态的连续的人结肠癌的细胞层。由于具有相同的生物活性和模拟人体肠道的微绒毛结构，Caco-2细胞模型常被用来进行模拟体内药物转运和吸收机制实验。在过去的几十年里，很多学者对Caco-2细胞单层的细胞通透性进行了广泛的研究。结果发现与其他亲代细胞模型相比，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，比较适合用于吸收机制的研究。辣椒素对肠道脂类吸收的影响的体外实验常采用Caco-2作为模型细胞。
TRPV1是瞬时受体电位家族的一员，是一种无选择的阳离子通道。其作为一个多调受体，可在多种物理、化学因素刺激下激活或致敏，从而介导肌肉收缩、神经元活动、递质释放、细胞增殖和凋亡等多种细胞的基本活动。TRPV1是辣椒素的受体，它的激活是辣椒素发挥其降糖降脂作用关键，因此，TRPV1基因对于研究辣椒素的作用机理至关重要。
目前对于辣椒素功能机理的研究多采用TRPV1受体拮抗剂作为对照试验。拮抗剂辣椒卓平的使用虽然广泛，但是其有一定的局限性。第一，实验中拮抗剂的用量很难掌握，要经过不同剂量的试验，才能找到合适的抑制浓度；第二，拮抗剂本身对试验动物或细胞具有一定的毒性作用，用量过多的话又导致实验失败的可能；第三，拮抗剂在试验动物体内或者细胞中的与辣椒素的代谢速度不同，代谢速度大于辣椒素，会导致拮抗作用失效，影响实验结果。
因此，有必要提供一种商品化的TRPV1敲基因细胞模型。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.C202024。
本发明还公开了一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还公开了一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。
本发明还公开了一种上述的sgRNA的识别序列和/或gRNA引物对在敲除TRPV1基因中的应用。
本发明还公开了一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的构建方法，通过CRISPR/Cas9技术构建，将核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的单链DNA进行退火反应，得到双链DNA短片段，连接入CRISPR/Cas9载体，获得重组敲除载体，将重组敲除载体电转染到人结直肠腺癌细胞系中，经抗性和测序筛选获得人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO。
本发明还公开了一种含有SEQ ID NO：2～3所示的gRNA引物对的质粒载体。
本发明还公开了一种上述的质粒载体在构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明利用gRNA，精确且高效的敲除了TRPV1基因，有效的构建了一种TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系，解决了使用辣椒素受体拮抗剂的缺陷，为辣椒素降脂、降糖、抗炎症等功能的机理研究奠定物质基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明靶点序列的设计位点图；
图2为本发明电转化条件优化图；
图3为本发明构建的pGK1.1载体图谱；
图4为本发明质粒酶切和PCR检测电泳图；其中，a代表质粒酶切电泳图，a中泳道1是原质粒对照，M为marker，泳道2-4为切开的载体；b代表PCR检测电泳图，b中M为marker，1-6为构建的载体样本扩增的片段；
图5为本发明Cruiser酶切电泳图；其中，M代表marker，1-25代表克隆样本；
图6为本发明阳性细胞株测序结果；
图7为本发明敲击因细胞TRPV1 蛋白表达量；
图8为本发明Caco-2（WT）和Caco-2(KO)两种细胞的生长曲线；
图9为本发明Caco-2（WT）和Caco-2(KO)两种细胞的形态。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1 TRPV1基因敲除的人结直肠腺癌细胞系的构建
1、实验方法
（1）嘌呤毒素（Puro）对细胞的最小全致死浓度测定
用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，对Caco-2细胞悬液进行计数，24孔板每孔接种50000个细胞，每孔500μL，待细胞贴壁后向其中加入0、0.5、0.75、1、2、4μg/mL不同浓度的Puro，2-3天后镜下观察细胞，选择对细胞全致死的最低浓度作为后续实验的药物筛选浓度。
（2）单克隆生长验证试验
用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，取Caco-2细胞悬液，计数后进行有限稀释，使最终96孔板中每孔细胞数为1个，将稀释后的细胞于37℃，5%CO2培养箱中静置培养；7-10天后镜下观察细胞是否有增殖趋势且能形成细胞簇。
（3）电转条件筛选
用胰酶消化Caco-2细胞，制备得到Caco-2细胞悬液，取100μL细胞悬液放入细胞活力检测仪器测定细胞活力（活细胞率＞95%方能进行电转），取9×106个细胞悬液于无菌管中，1000 rpm离心4 min，弃上清；细胞沉淀中加入DPBS和18μg pEGFP-N1质粒，使总体积为360μL；混匀后用电转枪头分别加入3个0.4cm的电击杯中，杯口液面凸起，杯内无气泡，加盖标记后进行电转。电转电压条件为：800V、700V和600V；（30ms，1pulse）；混匀电击后细胞转入预热6孔板中，加入2.5mL DMEM培养基，培养24-48h后倒置显微镜明场及荧光视野下拍照，选择细胞存活率及绿色荧光细胞百分率高的电转条件。
（4）CRISPR9敲除靶位点设计及合成
在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中，设计一对扩增片段长度为272bp的检测引物（双下划线，见图1），用麻省理工学院的在线工具设计（CRISPRDesign：http://crispr.mit.edu/）进行靶位点的设计，设计的3个靶点（波浪下划线，见图1）在NCBI上的打分为：1号点位92分、2号点位88分、3号点位83分。
引物合成需在靶序列头部添加额外的碱基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，如果靶序列的第一个碱基不是G，可自行在靶序列前加一个G，然后送上海生工生物工程有限公司合成，靶序列引物设计如下：
H- TRPV1-1F:CACCGTCCTCGTGAGGGCAATCCAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
H- TRPV1-1R:AAACGTGGATTGCCCTCACGAGGAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
1号点位的靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即为sgRNA的序列，H- TRPV1-1F是在SEQ ID NO.1的基础上加了CACC四个碱基，H- TRPV1-1R的序列是H- TRPV1-1F的互补序列。
H- TRPV1-2F:CACCGAGAGCCGCACCCGGCTCTTT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
H- TRPV1-2R:AAACAAAGAGCCGGGTGCGGCTCTC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
H- TRPV1-3F:CACCGAGCTGCGGACCCACTCCAAA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
H- TRPV1-3R :AAACTTTGGAGTGGGTCCGCAGCTC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
（5）敲除载体构建
将每个靶点合成后的2条引物稀释成10μM，退火形成dsDNA，用T4 DNA Ligase与线性化后的pGK1.1 linear vector载体连接，退火反应体系为：正向引物和反向引物各10μL，10ⅹAnnealing buffer 4μL，用ddH2O补足40μL。将以上体系置于PCR仪中95℃孵育3min，然后自然冷却20min，取1μL的杂交后的dsDNA进行连接。反应体系为：pGK1.1 linear vector载体1μL，退火后的dsDNA 1μL，T4 DNA Ligase 0.5μL，T4 DNA Ligase buffer1μL，用ddH2O补足10μL。混合瞬时离心后，置于PCR仪中16℃孵育30 min。
-80℃冰箱中取1管G10 感受态细胞，冰上融解后加入10μL连接产物，混合后冰上孵育30 min，再42℃水浴热击60 sec，迅速置冰上冷却3min，向管中加入800μL不含抗生素的SOC培养基，37℃摇床活化1h，3000 rpm离心10 min，弃掉上清，将100μL沉淀涂布于含Kan抗性的SOC固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。挑取长出的单个菌落，进行菌落PCR，筛选阳性克隆，阳性克隆PCR正确大小应为100 bp，阳性克隆接种含Kan抗性的SOC液体培养基扩繁，将阳性菌液送上海生工测序验证，测序正确的菌液提取质粒（1μg/μL浓度以上）-80℃备用。
（6）转染靶细胞及单克隆细胞制备
取含5×106的caco-2细胞悬液（细胞活力>95%）于15 mL离心管中，1000rpm离心5min弃上清，沉淀在1.5mL EP管中用210μL DPBS悬浮，再加入5-8μg构建好的3种敲除质粒，轻轻混匀。将混合液用电转枪头转移至电击杯中，避免产生气泡且液面凸起，加盖标记后按照优化条件进行电转。电转后转移至预热的培养基中。将药物筛选后的细胞用梯度稀释法稀释至10块96孔细胞板中，每个孔中为1个细胞，37℃、5% CO2培养箱中静置培养，两周后将有生长的细胞转移48孔细胞板中扩繁，当细胞长满二分之一后，挑选荧光信号强的细胞孔，取一部分细胞提取基因组备用。
（7）基因敲除阳性克隆筛选
用图1设计的检测引物（上游：CCAGCAAGGATGAAGAAAT；下游是ATCACCATCCAGAGGCCAGG的互补序列：CCTGGCCTCTGGATGGTGAT）进行PCR扩增，扩增获得野生型和突变型充分杂交的DNA 产物。扩增的反应体系为：10ⅹG-Taq buffer 2.5μL，Mg2+buffer 1.5μL，dNTP(10mM)0.5μL, 上下游引物各1μL，G-Taq DNA polymerase 0.25μL，野生型和突变型基因组DNA模板各2μL，用ddH2O补足25μL。反应条件为：95℃ 1.5min，95℃ 10sec、56℃ 10sec、72℃20sec 35个循环，72℃ 5min，95℃ 3min，自然冷却到40℃以下。PCR产物取2-3μL电泳检测，筛选单一明亮条带备用。按照以下体系配制酶切体系，PCR产物3μL，5ⅹCruiser Enzymebuffer 2μL，Cruiser Enzyme 1μL，用ddH2O补足10μL。45℃反应20min后立即向上述10 μL反应体系内加入2μL 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测。对酶切检测为阳性的细胞克隆进行测序，测序正确的细胞克隆进行扩繁，冻存备用。
2、实验结果
（1）药物杀菌浓度和单克隆验证结果
Puro作用细胞后2-3天，对细胞全致死的最低浓度为1μg/mL，作为后续实验的药物筛选浓度。有限稀释后，1个细胞/孔可以长出细胞簇，增殖趋势良好。
（2）电转条件优化结果
由图2可见，600V、700V和800V三个条件中，600V条件下活细胞数比较多，而且荧光信号也最强，电转效率较高，所以选600V条件为电转化的试验条件。
（3）载体构建结果
VSP primer序列位于载体的U6启动子区域内，序列为CATATGCTTACCGTAA CTTGAAAG。靶点序列的下游负链引物序列位于载体的双BbsI酶切位点上（图3），如果载体构建成功，它和VSP primer进行菌液PCR，可以扩增出长度为100bp的片段。
从图4质粒PCR的检测结果可以看出，均扩增出100bp的片段，表明成功地构建了载体，挑取1-2个阳性克隆测序，结果3个点位的测序结果均正确，成功构建基因敲除载体。
（4）质粒电转后pool细胞的敲除效率检测结果
将3个敲除载体电转Caco-2细胞，pool细胞药杀后测序，由3个位点pool测序峰图可知，序列从1号靶位点处出现轻微套峰现象较为明显，说明1号位点敲除效率较高，而且NCBI的评分1号位点的评分也最高，因此选择1号靶位点所对应的敲除载体电转Caco-2细胞。
（5）CRISPR/Cas9敲除后阳性克隆筛选结果
根据检测引物及理论敲除位点，检测引物扩增产物大小272bp，阳性突变株存在的DNA片段酶切后的条带大约在100bp或170bp，图5中上排泳道11、20和23，下排泳道14为疑似阳性克隆。将4个疑似阳性克隆提取的基因组测序结果显示（见图6）均在靶位点处缺失134个碱基，表明TRPV1基因敲除成功，获得基因敲除细胞株，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国武汉武汉大学，武汉市武昌珞珈山），保藏编号CCTCC NO.C202024。
实施例2 TRPV1基因敲除细胞株蛋白表达水平检验
1、实验方法
使用RIPA蛋白裂解液和蛋白磷酸酶抑制剂的混合物裂解细胞，离心后测定蛋白浓度，取20μg蛋白样品与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀后95℃煮沸10min，用12％的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳，80V 40min后100V 30min；湿转200A转膜1.5h；用含5％脱脂牛奶的TBST溶液中室温封闭1.5小时；anti-TRPV1多克隆抗体(Abcam)1：1000稀释。GAPDH (Abcam )1：10000稀释，室温下孵育2小时。TBST洗涤3次，每次10min。
2、实验结果
对细胞的TRPV1 蛋白表达量进行了检测。如图7所示，基因敲除细胞株的TRPV1 蛋白表达量显著低于野生细胞株细胞（p<0.05），说明了本发明所设计的sgRNA具有显著的切割活性和编辑效率。
实施例3 TRPV1基因敲除细胞株与野生株细胞增殖率比较
1、实验方法
分别将处于对数生长期的WT和KO细胞用消化液消化为细胞悬液，用细胞活力检测仪器进行计数，细胞浓度都调整为1.25×105活细胞/mL，然后分别接种6孔细胞板上，每孔2mL，放入37℃、5% CO2培养箱中静置培养，在接种后12h、24h、36h、48h分别取3孔细胞消化计数，绘制两种细胞的生长曲线，观察TRPV1基因敲除后对Caco-2细胞的生长效率是否有影响。
2、实验结果
为了评价TRPV1基因敲除后对Caco-2细胞的生长性能是否有影响，分别测定了两种细胞的生长速率，结果显示WT和KO细胞在接种数量相同，生长条件相同的情况下，两种细胞的生长速率在0-48h之间没有显著差异（见图8），最终获得细胞总数也无显著差异，细胞形态也没有显著的差异（见图9），表明TRPV1基因敲除后对Caco-2细胞的生长无显著影响，KO细胞可以用于后续试验研究。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 西南民族大学
<120> 一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株及应用
<130> 2020
<141> 2020-05-13
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gtcctcgtga gggcaatcca c 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
caccgtcctc gtgagggcaa tccac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aaacgtggat tgccctcacg aggac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
caccgagagc cgcacccggc tcttt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aaacaaagag ccgggtgcgg ctctc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
caccgagctg cggacccact ccaaa 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aaactttgga gtgggtccgc agctc 25

Claims (7)

1.一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株，其特征在于，命名为人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO，于2019年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.C202024。
2.一种用于敲除TRPV1基因的sgRNA的识别序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
3.一种用于构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的gRNA引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。
4.权利要求2所述的sgRNA的识别序列和/或权利要求3所述gRNA引物对在敲除TRPV1基因中的应用。
5.一种人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株的构建方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术构建，将核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的单链DNA进行退火反应，得到双链DNA短片段，连接入CRISPR/Cas9载体，获得重组敲除载体，将重组敲除载体电转染到人结直肠腺癌细胞系中，经抗性和测序筛选获得人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株CACO-2 KO。
6.一种含有SEQ ID NO：2～3所示的gRNA引物对的质粒载体。
7.权利要求6所述的质粒载体在构建人结直肠腺癌细胞TRPV1基因敲除细胞株中的应用。
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