KR100654029B1 - 대장균 균주 ｄｓｍ 6601의 플라즈미드가 없는 클론 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라즈미드가 없는 대장균 DSM 6601 균주의 클론, 상기 균주의 제조 방법 및 상기 균주의 클로닝 운반체로서의 용도에 관한 것이다.

Description

대장균 균주 ＤＳＭ 6601의 플라즈미드가 없는 클론{PLASMID-FREE CLONE OF E. COLI STRAIN DSM 6601}

본 발명은 대장균 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론, 이의 제조 방법 및 이렇게 제조된 상기 균주의 클로닝 운반체로서의 용도에 관한 것이다.

자연계, 특히 인간 및 동물의 장 내에 존재하는 대장균은 이미 오래전부터 미생물학 및 유전 공학과 관련한 연구들의 대상이 되어왔으며, 유전 공학에서는 특히 특정 유전자 내지는 단백질을 클로닝하고/하거나 발현시키기 위해 사용된다.

대부분의 에스케리챠(Escherichia)속 균주는 장의 내강의 외부에서 병원성을 가지며, 일반적으로 침범된 부위에서 감염을 유발한다. 비병원성 대장균속 균주로는 독일 미생물 수집기관(German Collection for Microorganisms)에 기탁된 균주 DSM 6601이 있으며, 이 균주는 나머지 다른 대장균 균주들과 몇몇 유전적 특징에서 차이가 있다. 상기 균주는 매우 까다로운 환경에서만 유전자 조작이 가능하고, 부분적으로는 유전자 조작이 전혀 불가능하기 때문에 간단한 클로닝 수단으로 사용할 수 없는 것으로 밝혀졌다.

대장균 균주 DSM 6601은 본질적으로 3177kb 및 5552kb의 크기를 갖는 2개의 플라즈미드를 가지며, 상기 플라즈미드는 각각 pMUT1 또는 pMUT2로 표기된다. 상기 플라즈미드 및 이들의 DNA 서열은 예컨대 미국 특허 제 6,391,631호에 기술되어 있다.

본 발명의 목적은, 플라즈미드가 없는 것을 제외하고는 게놈 DNA에 있어서 원 균주와 유전적으로 완전히 동일한 대장균 균주를 개발하는 것이며, 이는 대장균의 병원성 및 비병원성은 공지되어 있는 것처럼 부분적으로 상기 대장균의 플라즈미드에 의해 제어된다는 고찰 및 부분적으로 발생하는 대장균 균주의 "유전자 내성" 또한 상기 대장균 균주의 잠재 플라즈미드와 관련될 수 있다는 고찰을 토대로 한다.

상기 목적은 대장균 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론을 이용가능하게 함으로써 그리고 상기 클론의 제조 방법을 통해 달성된다.

도 1은 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론을 제조하는 방법의 개략도이다.

도 2는 플라즈미드 pMut1-Tc의 물리적 지도이다.

도 3은 플라즈미드 pMut2-Kn의 물리적 지도이다.

본 발명의 토대가 된 장기간에 걸친 연구 결과, 일반적인 유전 공학 기법으로는 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론을 결코 제조할 수 없거나, 그러한 클론을 생성하기 위해서는 특별한 방법이 취해져야 할 정도로 매우 어렵게 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 야생형 균주는 게놈 DNA 외에도 크기가 상이한 2개의 플라즈미드를 갖기 때문에, 상기 플라즈미드를 제거하는 것은 부분적으로 병렬적으로 일어나는 여러 단계에 걸쳐 수행되어야 한다.

본 발명에 따른 클론을 제조하기 위해, 본 발명의 방법에 따라 제 1 단계에서 대장균 균주 DSM 6601 내에 천연적으로 존재하는 플라즈미드 pMut1 및 pMut2에 각각 항생제 내성이 표지(marking)된다. 이를 위해 종래의 방법에 따라 플라즈미드가 단리되고, 요망되는 위치에 내성 유전자가 삽입된다. 한 바람직한 구체예에 따르면, 내성 유전자는 항시성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터를 함유하는 발현 카세트(expression cassette)와 함께 각각의 플라즈미드 내로 삽입된다.

그렇게 하여 얻은 플라즈미드는 종래의 방법, 예컨대 CaCl₂ 법 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 따라 적절한 숙주 내로 도입되어 그곳에서 클로닝되며, 이때 각각의 플라즈미드 내로 삽입된 내성 유전자는 플라즈미드를 함유하는 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다. 내성 유전자를 함유하는 플라즈미드의 클로닝에 적절한 숙주는 예컨대 대장균 균주 DH5α 또는 대장균 HB101이다.

내성 유전자를 함유하는 플라즈미드가 단리된 다음, 또 다른 마커가 이용가능하도록 상기 플라즈미드 내로 sacB 유전자가 도입된다.

그렇게 하여 수득한 표지된 플라즈미드가 대장균 균주 DSM 6601 내로 도입된다.

대장균 DSM 6601 균주는 형질전환된 후, 선행 단계에서 플라즈미드 내로 도입되었던 내성 유전자에 의해 내성을 가지게 된 항생제(들)를 함유한 배지상에서 배양된다.

이와 같이 항생제를 함유한 배지에서 배양함에 따라, 상기 배지 내에 함유되어 있는 항생제에 내성을 갖는 클론만이 증식된다. 또한, 상기 세균이 증식을 위해 본래의 플라즈미드 pMut1 및 pMut2를 더 이상 필요로 하지 않아서 상기 세균은 과잉 유전 물질을 잃게 되는데, 상기 세균은 결과적으로 (내성 유전자(들) 및 sacB 유전자를 함유하는) 변형된 플라즈미드 pMut1 및 pMut2만을 함유하게 된다.

다음 단계에서는 배양된 세균이 sacB를 함유한 세균의 증식을 억제하는 배지 내로 옮겨지고, 이때 실질적으로 sacB 유전자를 상실한 세균의 증식만을 허용하는 선택 압력이 가해진다. 이는 30℃에서 10%의 수크로오스의 존재 하에 균주를 배양함으로써 이루어질 수 있는데, 그 이유는 상기 조건하에서 sacB 유전자를 함유하는 플라즈미드를 상실한 클론만이 복제될 수 있기 때문이다.

결과적으로, 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 유도체가 얻어진다.

이제, 플라즈미드의 소실을 전제로 할 때 본 발명에 따른 클론이 게놈 DNA의 변화를 전혀 겪지 않았고, 놀랍게도 클로닝 운반체로서 용이하게 사용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

따라서 본 발명에 따른 클론은 실험실에서 다수의 유전자 및 단백질의 클로닝 및 발현을 위한 숙주 세포로서 안전하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 균주 DSM 6601 (ΔpMut1/2)를 사용한 실험에서, 외래 DNA가 단리된 형태로 존재하는 자기 고유의 플라즈미드 내로 통합되는 경우, 즉, 이로써 상기 고유의 플라즈미드가 외래 DNA의 클로닝 벡터로 작용하는 경우, 본 발명에 따른 균주 DSM 6601이 상기 외래 DNA의 매우 우수한 수용체가 된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 상기 균주는 비병원성 균주로부터 유도되기 때문에, 동물 및 인간의 위장관 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이를 위해 상기 균주는, 요망되는 경우, 점막으로의 세균 유착을 촉진하는 외래 유전자들에 의해 형질전환될 수 있으며, 그러한 외래 유전자로는 임의적으로 숙주 동물 특이적으로 예컨대 소 및/또는 돼지의 점막으로 세균의 유착을 촉진함으로써 다른 병원성 미생물의 증식을 방해하는 어드히신이 있다.

본 발명은 실시예를 참고로 하여 하기에 더 상세히 설명된다.

실시예 1

pMut1의 변형

야생형 DSM 6601의 2개의 천연 플라즈미드 pMut1과 pMut2를 퀴아젠사의 플라즈미드-미디프렙-프로토콜(QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002, 16-20p.)에 따라 단리하였다.

플라즈미드 pMut1의 표지를 위해 벡터 pBR322로부터 유래된 테트라사이클린 내성 카세트를 선택하였다. 플라즈미드 pASK75로부터 관련 프로모터를 추출하였다. 상기 클로닝의 결과로 얻어진 플라즈미드를 pKS-tetA^tetp/o라고 명명하였다. 인서트 tetA^tetp/o (인서트 크기: 1.5 kb)를 제한 효소 XbaI 및 HindIII로 절단하였다. 상기 XbaI/HindIII 단편을 NdeI 절단 부위를 통해 플라즈미드 pMut1 내로 삽입하였다.

이를 위해, 적절한 효소에 의한 플라즈미드의 제한적 분해 이후에, 절단된 상기 플라즈미드를 컬럼(Quiagen, PCR Purification Kit)을 통해 정제하고, 평활 말단(blunt end)을 만들기 위해 클레나우(Klenow) 처리를 하였다. 플라즈미드 pMut1의 재결합을 막기 위해, 제한효소 NdeI로 선형화되고 클레나우 효소로 처리된 플라즈미드의 탈인산화(dephosphorization)를 수행하였다. 이어서 벡터 pMut1 및 인서트 tetA^tetp/o를 결합시키고, 이를 사용하여 대장균 K-12 균주 DH5α를 형질전환시켰다.

컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하기 위해, 150ml LB 배지(Luria-Bertani medium)에 1.5ml의 배양물을 접종하여 하룻밤 동안 배양하고, 37℃에서 OD₆₀₀=0.5가 될 때까지 교반시켰다. 그런 다음 상기 세균 배양물을 얼음 상에서 20분간 인큐베이션한 후, 4℃에서 10분간 4000rpm으로 원심 분리하였다. 상기 세균 펠릿을 무균 상태인 10% 빙냉 글리세린에서 3회 세척하였는데, 먼저 처음 부피의 100%로, 그 다음에는 50%로, 마지막으로 10%로 세척하였다. 세척된 펠릿을 300㎕의 10% 글리세린에 재현탁하여, 분취한 후(40 ㎕) -80℃에서 보관하였다. 세균 세포의 형질전환을 위해, 1 내지 2㎕의 플라즈미드 DNA(1 내지 100 ng)를 얼음 상에서 해동된 40㎕의 컴피턴트 세포와 혼합하고, 5분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 사전 냉각된 무균 상태의 2mm 일렉트로포레이션 큐벳의 2개의 전극 사이에서 상기 혼합물을 기포 없이 피펫팅하였다. 상기 큐벳을 잘 건조시키고, 전극 홀더 내로 삽입하였다. 2.5kV, 200Ω및 25㎌에서 전기충격을 수행한 후, 1ml의 LB 배지로 세균 현탁액을 큐벳으로부터 세척하고, 교반기 내에서 1 내지 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 상기 세균을 원심분리하고, 상청액을 100㎕까지 제거하였다. 침강물을 남은 100㎕에 재현탁시키고, Tc를 함유한 선택 평판상으로 플레이팅하고, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

개별 세균 클론의 각각의 플라즈미드의 미니-프레퍼레이션(mini-preparation)에 의해 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. 테트라사이클린 카세트로 표지된 플라즈미드 pMut1을 pMut1-Tc라고 명명하였다. 도 2에 상기 플라즈미드 pMut1-Tc의 물리적 지도가 도시되어 있다. 이는 테트라사이클린 내성을 부여하는 DNA 단편의 삽입 부위(본래 단일 NdeI 부위)를 나타낸다. 또한, 상기 DNA 단편은 클로닝에 적합한 단일 EcoRI 서열을 함유한다. 또한, PCR에 의한 상기 플라즈미드의 특이적 입증에 적합한 프라이머 Muta 5 및 Muta 6의 결합 부위가 표시되어 있다.

실시예 2

pMut2의 변형

플라즈미드 pMut2의 표지를 위해 벡터 pACYC177로부터 유래된 카나마이신(kanamycin) 내성 카세트를 선택하였다. 이를 위해 상기 벡터로부터 내성 카세트(크기: 1.34kb)를 제한 효소 StuI로 절단하고, 이를 BglII 제한 절단 부위를 통해 플라즈미드 pMut2 내로 삽입하였다. 적절한 효소에 의한 플라즈미드의 제한 분해 이후, 절단물을 컬럼(Quiagen, PCR Fraction Kit)을 통해 정제하고, 클로닝을 위한 평활 말단을 만들기 위해 플라즈미드 pMut2를 클레나우 처리하였다. 플라즈미드 pMut2의 재결합을 막기 위해, 제한효소 BglII로 선형화되고 클레나우 효소로 처리된 플라즈미드의 탈인산화를 수행하였다. 이어서 벡터 pMut2와 카나마이신 카세트를 결합시키고, 대장균 K-12 균주 DH5α를 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 Kn을 함유한 LB 한천 평판상으로 플레이팅하였다. 개별 세균 클론의 각각의 플라즈미드 DNA의 미니-프레퍼레이션에 의해 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. 카나마이신 카세트로 표지된 플라즈미드 pMut2를 pMut2-Kn이라고 명명하였다.

도 3에 상기 플라즈미드 pMut2-Kn의 물리적 지도가 도시되어 있다. 클로닝 부위로서 적합한 단일 EcoRI 서열 뿐만 아니라 카나마이신 내성 카세트에 대한 삽입 부위 (본래 단일 BglII 부위)가 표시되어 있다. 또한, PCR에 의한 상기 플라즈미드의 특이적 입증에 적합한 프라이머의 서열에 대해 상보적인 영역들이 Muta 7 내지 Muta 10으로 특징화되어 있다.

실시예 3

sacB 유전자의 도입

내성 카세트에 의해 표지된 플라즈미드 pMut1-Tc 및 pMut2-Kn 내로 sacB 유전자 (레반(Levan) 수크로오스를 코딩함)를 도입하기 위해, 상기 두 플라즈미드에서 특정한 단일 EcoRI 제한 절단 부위를 선택하였다. 플라즈미드 pCVD442로부터 제한효소 PstI를 이용하여 sacB 유전자(크기: 2.6kb)를 단리하였다. 벡터 pMut1-Tc 및 pMut2-Kn을 제조하기 위해 상기 플라즈미드를 EcoRI로 선형화한 후, 평활 말단을 형성하기 위해 클레나우 처리하고, 탈인산화하였다. 제한 분해 이후 인서트 sacB를 PstI로 정제하고, 클레나우 효소로 처리하였다. 선형화된 벡터와 인서트를 결합시키고, 이를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 컴피턴트하게 된 대장균 K-12 균주 DH5α를 형질전환시켰다. 개별 세균 클론의 플라즈미드 DNA의 미니-프레퍼레이션 및 후속 제한 분석(restriction analysis)에 의해 클로닝의 성공 여부를 테스트하였다. sacB 유전자로 표지된 플라즈미드 pMut1-Tc 및 pMut2-Kn을 pMut1-TcSac 및 pMut2-KnSac라고 명명하였다.

실시예 4

대장균 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론의 제조

먼저 플라즈미드 pMut1-TcSac를 실시예 1에 기재된 바와 같이 일렉트로포레이션에 의해 상기 균주 내로 형질전환시켰다. 일렉트로포레이션 후, 플라즈미드 pMut1-TcSac을 균주 DSM 6601 내로 전달하기 위해 상기 혼합물을 Tc(50 ㎍/ml)를 함유한 LB 평판상으로 플레이팅하였다. 그 결과 얻어진 테트라사이클린 내성 세균 클론이 pMut1-TcSac 플라즈미드를 갖고 있는지, 그리고 그와 결부하여 본래 존재했던 플라즈미드 pMut1가 소실되었는 지를 검사하였다. 플라즈미드 DNA를 제조하고, 이를 제한효소 EcoRI를 이용하여 절단 분해한 후, 선형화된 플라즈미드를 전기영동적으로 분리하여 pMut1을 나타내는 DNA 밴드의 부재를 확인함으로써 플라즈미드 pMut1이 소실되었음을 입증하였다.

이어서 상기 클론들 중 하나를 30℃에서 하룻밤 동안 10%의 수크로오스를 함유한 LB 배지에 흡수시킨 후, 10%의 수크로오스를 함유한 LB 평판상으로 플레이팅하였다(상기 LB 배지는 1ℓ의 증류수 당 카세인으로부터의 10g의 펩톤, 5g의 효모 추출물 및 5g의 염화나트륨으로 구성됨). 수크로오스를 함유한 LB 배지는, 살균 여과된 50%(중량/부피)의 수크로오스 모액을 45℃까지 냉각시킨 후 최종 농도가 10%가 될 때까지의 양을 멸균한 배지에 첨가함으로써 제조하였다. 상기 평판을 30℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 조건 하에서는 sacB를 더 이상 발현시키지 않는 클론, 즉 sacB 유전자를 함유하는 플라즈미드를 상실한 클론만 복제될 수 있다. 그렇게 하여 얻은 균주 DSM 6601ΔpMut1을 플라즈미드 pMut1-TcSac의 상실 여부에 대해 검사하였다.

그런 다음 일렉트로포레이션을 통해 플라즈미드 pMut2-KnSac를 균주 DSM 6601ΔpMut1 내로 도입하였다.

일렉트로포레이션 후, 플라즈미드 pMut2-KnSac을 균주 DSM 6601ΔpMut1 내로 전달하기 위해 상기 혼합물을 Kn(50㎍/ml)를 함유한 LB 평판상으로 플레이팅하였다. 그 결과 얻어진 카나마이신 내성 세균 클론이 플라즈미드 pMut2-KnSac를 갖고 있는지, 그리고 그와 결부하여 본래 존재했던 플라즈미드 pMut2가 소실되었는 지를 검사하였다. 이어서 상기 클론들 중 하나를 30℃에서 하룻밤 동안 10%의 수크로오스를 함유한 LB 배지에 흡수시킨 후, 10%의 수크로오스를 함유한 LB 평판 위에 플레이팅하였다. 상기 평판을 30℃에서 인큐베이션하였다. 그렇게 하여 얻은 균주 DSM 6601ΔpMut1/2가 pMut2-KnSac 플라즈미드를 상실하였는 지에 대해 검사하였다.

또한, 플라즈미드가 없는 균주 DSM 6601ΔpMut1/2의 염색체 변화를 배제시키기 위해, 펄스 필드 겔 전기영동을 수행하였다. 어떠한 변화도 없음을 증명할 수 있었으며, 추가의 검사들을 통해 플라즈미드가 없는 클론이 형태학적, 생화학적 또는 발효에 의한 변화를 전혀 보이지 않는다는 사실을 알아내었다.

Claims (8)

1. 대장균 균주 DSM 6601의 플라즈미드가 없는 클론.
2. a) 플라즈미드 pMut1 및 pMut2 내로 내성 유전자를 도입하는 단계,

   b) 상기 단계 a)에서 얻은 플라즈미드 내로 sacB 유전자를 도입하는 단계,

   c) 상기 단계 b)에서 얻은 플라즈미드를 대장균 균주 DSM 6601 내로 도입하고, 본래 존재하는 플라즈미드 pMut1 및 pMut2가 상기 단계 b)에서 얻은 플라즈미드로 대체되는 조건 하에서 상기 균주를 배양하는 단계, 및

   d) 상기 단계 c)에서 얻은 클론들을, sacB 유전자가 결핍된 세균만을 증식시키는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하여 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론을 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 내성 유전자가 발현 카세트 내에 존재하는 방법.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 내성 유전자가 테트라사이클린 내성 또는 카나마이신 내성 중에서 선택되는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 플라즈미드 pMut1를 테트라사이클린 내성 카세트 및 sacB 유전자로 표지(marking)하고, 본래의 플라즈미드 pMut2를 카나마이신 내성 카세트 및 sacB 유전자로 표지하는 방법.
6. 제 2항에 있어서, 테트라사이클린 내성 카세트 및 sacB 유전자로 표지된 플라즈미드 pMut1에 의해 형질전환된 세균들을 테트라사이클린을 함유한 평판상에서 배양한 후, 수크로오스를 함유한 평판상에서 배양하여, 제 1 단계로 플라즈미드 pMut1를 제거한 후, 상기 세균들을 카나마이신 평판상에서 배양하고 추가로 수크로오스 평판상에서 배양함으로써 플라즈미드 pMut2를 제거하는 방법.
7. 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론을 클로닝 균주로서 사용하는 방법.
8. 동물의 위장 장애를 치료하기 위한 수단을 제조하기 위해 제 1항에 따른 플라즈미드가 없는 클론을 사용하는 방법.

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