CN102229898B - 用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法 - Google Patents

用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌的保藏编号为CGMCC No.4697。本发明提供的大肠埃希氏菌CGMCC No.4697均有很好的调节肠道菌群失调状态的功效，并且可以巩固肠道屏障。利用该菌株可以根据菌群失调程度的不同(II度菌群失调症、I度菌群紊乱症、II度菌群紊乱症、III度菌群紊乱症)制备不同浓度(1.5-9.0×108CFU/ml)和液量(25-50ml)的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，然后再根据粪便菌群分析调整治疗方案，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。该治疗个体化、灵活化、有效、经济，且操作简单、方便，易于推广和规范化。

Description

用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物制剂，具体地说是一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌、制剂及其制备方法。
背景技术
目前临床常采用微生态制剂治疗肠道菌群失调症，是利用肠道益生菌作为种子，通过发酵工程等扩大其数量制成的活菌制剂，均为口服剂型。该类制剂采用的是工程菌，不能根据个体菌群失调程度的不同调整给菌量，且口服剂型的生物利用度较低。
人类的整个肠腔内都存在着大量细菌，正常情况下这些细菌并不致病，是肠道的正常菌群即生理性细菌，为人体提供生物拮抗、增强免疫、营养等有益作用。但随着抗生素、免疫抑制剂、介入手段等的广泛使用，耐药菌株、菌群失调已无法克服，抗感染治疗遇到了前所未有的困难，使得感染的防治必然从“抗菌时代”向“促菌时代”转变，而唯一的出路就是用微生态技术解决这个难题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种治疗菌群失调症菌群紊乱症效果优异的大肠埃希氏菌。
本发明的再一目的在于利用上述菌株制备灌肠用菌剂。
本发明的第三目的在于给出一种灌肠菌剂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的发明思路为：发明人依托实验室优势，首先对临床患者粪便标本进行肠道菌群分析，根据菌群失调程度的不同（Ⅱ度菌群失调症、Ⅰ度菌群紊乱症、Ⅱ度菌群紊乱症、Ⅲ度菌群紊乱症），使用拟被灌肠患者粪便中分离的正常的大肠埃希氏菌即宿主自身生理性细菌，通过大量筛选优化得到了一株治疗效果非常好的大肠埃希氏菌CGMCC No.4697。利用该菌株制备不同浓度（1.5-9.0×108CFU/ml）和液量（25～50ml）的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。
本发明所采用的具体技术方案如下：
一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌(Escherichia coli）GC-01,于2011年3月18日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.4697，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101。
一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的灌肠制剂，所述制剂包含有上述的保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01。
所述灌肠制剂可以根据实际用药情况制备成栓剂或灌肠液。
所述栓剂或灌肠液中含有保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01的菌液，菌液浓度为1.5×108～9.0×108CFU/ml。
一种灌肠制剂的制备方法，具体步骤为：
（1）挑取保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01菌落，接种到5ml营养肉汤中，置30～35℃电热恒温培养箱培养6h；
（2）用营养肉汤调制成0.5～3.0麦氏浊度大肠埃希氏菌液，得到活菌终浓度为1.5×108～9.0×108CFU/ml的大肠埃希氏菌液。
（3）分装即得。
所述保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在使用前进行纯培养，方法为：接种保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在血琼脂平板和麦康凯平板上，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h后进行菌种鉴定。
菌种鉴定方法为：挑取血琼脂平板上的灰白色菌落或麦康凯平板上乳糖发酵菌落，涂片革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，做双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白试验，若产酸/产气、不产硫化氢、尿素酶阴性，吲哚阳性、枸橼酸盐阴性、赖氨酸阳性，鉴定为大肠埃希氏菌；经VITEK鉴定仪确认为大肠埃希氏菌，并经血清学检测最终确认为非引起肠道感染的大肠埃希氏菌。
所述保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01纯培养后的菌种直接使用或转种在脱脂牛奶中，-70℃保存，使用时复苏。
所述复苏步骤为：将保存在-70℃冰箱中的相应菌株取出转种血琼脂平板或麦康凯平板，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h，复苏后用于制备灌肠制剂。
上述的保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在制备治疗菌群失调症灌肠制剂或菌群紊乱症灌肠制剂中的应用。
本发明灌肠制剂推荐使用方法：每日灌肠使用一次，连续使用三天。还可以根据粪便菌群分析调整治疗方案，纠正肠道菌群失调状态。
本发明的有益效果：
本发明提供的大肠埃希氏菌CGMCC No.4697均有很好的调节肠道菌群失调状态的功效，并且可以巩固肠道屏障。利用该菌株可以根据菌群失调程度的不同（Ⅱ度菌群失调症、Ⅰ度菌群紊乱症、Ⅱ度菌群紊乱症、Ⅲ度菌群紊乱症）制备不同浓度（1.5～9.0×108CFU/ml）和液量（25～50ml）的大肠埃希氏菌液进行保留灌肠，然后再根据粪便菌群分析调整治疗方案，从而纠正肠道菌群失调状态，巩固肠道生物屏障，提高机体免疫能力，符合患者肠道生理环境要求。该治疗个体化、灵活化、有效、经济，且操作简单、方便，易于推广和规范化。
具体实施方式
在本具体实施方式中制备大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠液所需试剂、培养基、设备包括：
（1）设备：35℃电热恒温培养箱，-70℃超低温冰箱。
（2）培养基：血琼脂平板（购自天津金章科技发展有限公司）、麦康凯平板（购自天津金章科技发展有限公司）、脱脂牛奶（购自内蒙古蒙牛乳业股份有限公司）、营养肉汤（牛肉蛋白胨和牛肉粉购自中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限公司，氯化钠和磷酸氢二钾购自北京化工厂）。
（3）试剂：革兰染色液、氧化酶试剂、双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白、肠道感染大肠埃希氏菌血清型诊断试剂。
质量控制：
（1）试剂的质量控制
所有试剂用于检测标本前，必须质控以评估质量并记录质控结果，每配制一批自制试剂要求用阴性、阳性标准菌株或质控菌株评估其质量，只有质控合格才可使用。常用试剂质量控制见表1。
表1常用试剂质量控制
Figure GDA00001845504500031
Figure GDA00001845504500041
（2）培养基的质量控制
①购买有质量保证的培养基，应保存制造商所遵循的质量保证标准，以及每批号产品完成无菌试验、生长试验、生化反应及质量控制性能的合格证明等文件。
②自制培养基，每批号产品应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验等。
③外观检查：合格培养基的标准：完整、琼脂附于平板底部，血琼脂平板应不透明、没有溶血情况，平板颜色、湿润、无干裂、无污染、无浑浊或沉淀现象、无冻伤、无过热现象，琼脂厚度至少3mm。如发现与上述情况不符的培养基，不予使用。
④无菌试验：抽检培养基数量：100块以内，抽检5%；100块以上可随机取10块平皿进行无菌试验。35℃培养24h后观察是否有细菌生长，无细菌生长为合格。
⑤生长试验：选取质控菌株，35℃培养24h，用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位菌悬液。无菌生理盐水1：100稀释，每块平板接种10μl（浓度相当于103～104CFU/块平板）。培养24～48h。符合生长质控标准者方可使用。失控者必须记录失控情况并有相应的改正措施。见表2
表2培养基的生长质控
（3）自动化仪器质控
①鉴定卡的质控：每新进一批鉴定卡需用相应质控菌株做质控以检测生化反应的可靠性。
②药敏卡的质控：每新进一批药敏卡需用相应质控菌株做质控以检测药敏测定的可靠性。
③自动化仪器反应卡使用的质控菌株，见表3
表3反应卡使用的质控菌株
  反应卡种类   质控菌株
  GNI   阴沟肠杆菌(ATCC 700323)
  GPI   金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)
  AST-GN13   大肠埃希氏菌(ATCC 25922)
  AST-GN09   铜绿假单胞(ATCC 27853)
  AST-GP67   金黄色葡萄球菌(ATCC29213)
实施例1大肠埃希氏菌CGMCC No.4697菌株筛选
菌株来源：菌群失调症和菌群紊乱症患者粪便。
1.大肠埃希氏菌初次培养：
（1）挑取患者粪便标本接种在血琼脂平板和麦康凯平板上，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h后检查平板。
2.细菌鉴定：挑取血琼脂平板上的灰白色菌落和麦康凯平板上乳糖发酵菌落，涂片革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，做双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白试验，若产酸/产气、不产硫化氢、尿素酶阴性，吲哚阳性、枸橼酸盐阴性、赖氨酸阳性，鉴定为大肠埃希氏菌。经VITEK鉴定仪确认为大肠埃希氏菌，并经血清学检测最终确认为非引起肠道感染的大肠埃希氏菌。
上述鉴定方法为本领域技术人员公知方法，在此不赘述。
3.菌种功效实验
我们选择纯系Balb/c小鼠，雄性，20～22g，随机分为三组，每组10只，第一组为正常对照组，每日用生理盐水灌肠，0.2ml/只，每日一次，连续3天；第二组为大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠组，每日用大肠埃希氏菌CGMCCNo.4697制备浓度为1.5×108CFU/ml灌肠液，0.2ml/只，每日一次，连续3天；第三组为标准菌株ATCC25922大肠埃希氏菌灌肠组，每日用标准菌株ATCC25922大肠埃希氏菌制备浓度为1.5×108CFU/ml灌肠液，0.2ml/只，每日一次，连续3天。三组均在第四天处死，无菌取盲肠部粪便做肠杆菌计数，同时取回盲段组织做组织病理检查，进行菌种安全性实验、菌种粘附性实验。肠杆菌检测见表4。组织病理检查结果显示，正常对照组、大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠组和标准菌株ATCC25922大肠埃希氏菌灌肠组的小鼠肠粘膜绒毛均向肠腔突出，表面上皮细胞呈柱状，杯状细胞丰富，肌壁层厚度正常。
表4正常对照组、大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠组和标准菌株ATCC25922
大肠埃希氏菌灌肠组肠道肠杆菌检测结果（X±SD,lgCFU/g大便）
Figure GDA00001845504500061
注：大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠组与正常对照组p＜0.01，标准菌株ATCC25922大肠埃希氏菌灌肠组与正常对照组p＜0.01，大肠埃希氏菌CGMCCNo.4697灌肠组与标准菌株ATCC25922大肠埃希氏菌灌肠组p＜0.05。
上述实验证明，大肠埃希氏菌CGMCC No.4697菌种品质优良，无病原性、无毒副作用、生物学性能稳定、在肠道内定植能力强。
4.将最终得到的大肠埃希氏菌CGMCC No.4697菌种保存：将菌种转种在脱脂牛奶中，-70℃超低温保存。
5.大肠埃希氏菌复苏：制备灌肠液前，将保存在超低温冰箱中的菌株取出复苏，转种血琼脂平板和麦康凯平板，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h。
实施例2制备大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠液
根据个体菌群失调程度的不同，制备不同浓度和液量的大肠埃希氏菌灌肠液，保留灌肠，每日一次，连续三天，然后再根据粪便菌群分析调整治疗方案。见下述及表5。
具体方法为：挑取纯培养大肠埃希氏菌CGMCC No.4697菌落，接种到5ml营养肉汤中，置35℃电热恒温培养箱培养6h，然后用25ml～50ml营养肉汤调制成0.5～3.0麦氏浊度的大肠埃希氏菌液，即得到活菌终浓度为1.5×108～9.0×108CFU/ml、液体总量为25～50ml的大肠埃希氏菌液（菌液1）。
表5菌群失调程度与大肠埃希氏菌灌肠液浓度和用量关系表
Figure GDA00001845504500071
说明：菌液1：大肠埃希氏菌CGMCC No.4697
本发明大肠埃希氏菌CGMCC No.4697制备的灌肠制剂功效实验
本发明选择Ⅱ度菌群失调症患者30例，Ⅰ度菌群紊乱症患者30例，Ⅱ度菌群紊乱症患者30例，Ⅲ度菌群紊乱症患者30例，采用大肠埃希氏菌CGMCCNo.4697制备的灌肠液（菌液1）进行保留灌肠治疗3天后，肠道菌群分析结果显示：大肠埃希氏菌CGMCC No.4697灌肠组治疗后细菌总数、革兰阴性杆菌和革兰阳性杆菌的数量与治疗前比较均明显增加，提示大肠埃希氏菌CGMCCNo.4697调整菌群失调效果优异。
（1）Ⅱ度菌群失调症
1）Ⅱ度菌群失调症判定标准：粪便标本直接涂片革兰染色见①细菌总数减少或显著减少（＜100/每油镜视野）；②各类菌的比例改变明显（正常革兰阴性菌占绝对优势）；③或出现杆球菌比例明显改变或倒置（杆菌和球菌的比例正常为75：25）；④或出现类酵母菌或梭菌明显增多（正常0.25-2%）。
2）用1.5×108CFU/ml 25ml的菌液1对患者进行灌肠，每日一次，连续灌肠三日。
3）效果
表6大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）灌肠液治疗Ⅱ度肠道菌群失调症
病人的肠道菌群变化（X±SD,lgCFU/g大便）
  菌群   菌液1治疗前   菌液1治疗后#
  细菌总数   11.08±2.71   20.27±1.52
  双歧杆菌   3.58±2.98   9.58±1.43
  乳杆菌   4.07±1.84   8.11±1.11
  肠杆菌   4.35±2.37   8.13±1.24
  肠球菌   0.72±0.57   2.28±1.31
注：#，与大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）治疗前比较p＜0.01；治疗后肠杆菌数量比较p＜0.01。
（2）Ⅲ度菌群失调（菌群紊乱症）
1）Ⅰ度菌群紊乱症
a.Ⅰ度菌群紊乱症判定标准：①细菌总数明显减少；②各类菌比例明显改变，临床常见革兰阴性杆菌和阳性杆菌减少，以革兰阳性球菌或芽孢菌如难辨梭菌等为优势菌的现象。
b.用3.0×108CFU/ml 25ml的菌液1对患者进行灌肠，每日一次，连续灌肠三日。
c.效果
表7大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）灌肠液治疗Ⅰ度菌群紊乱症病人
的肠道菌群变化（X±SD,lgCFU/g大便）
  菌群   菌液1治疗前   菌液1治疗后#
  细菌总数   9.38±2.48   20.12±1.21
  双歧杆菌   2.67±2.88   9.47±1.34
  乳杆菌   3.54±1.91   8.07±1.24
  肠杆菌   3.17±2.53   7.99±1.52
  肠球菌   1.42±0.92   2.11±0.91
注：#，与大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）治疗前比较p＜0.01；治疗后肠杆菌数量比较p＜0.01。
2)Ⅱ度菌群紊乱症
a.Ⅱ度菌群紊乱症判定标准：①细菌总数明显减少；②各类菌比例明显改变，临床常见类酵母菌占绝对优势＞10-30%。
b.用6.0×108CFU/ml 50ml的菌液1对患者进行灌肠，每日一次，连续灌肠三日。
c.效果
表8大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）灌肠液治疗Ⅱ度菌群紊乱症病人的肠道菌群变化（X±SD,lgCFU/g大便）
  菌群   菌液1治疗前   菌液1治疗后#
  细菌总数   8.42±2.34   20.07±1.19
  双歧杆菌   2.05±2.51   9.31±1.40
  乳杆菌   2.98±1.83   8.01±1.23
  肠杆菌   2.85±2.45   7.54±1.48
  肠球菌   1.78±1.02   2.03±1.01
注：#，与大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）治疗前比较p＜0.01；治疗后肠杆菌数量比较p＜0.01。
3)Ⅲ度菌群紊乱症
a.Ⅲ度菌群紊乱症判定标准：①细菌总数明显减少；②各类菌比例显著改变，临床常见革兰阳性菌缺如或减少或杆球菌比例倒置③严重者出现类酵母菌占绝对优势＞40%，或出现抗酸杆菌或白色念珠菌的“纯”培养现象。
b.用9.0×108CFU/ml 50ml的菌液1对患者进行灌肠，每日一次，连续灌肠三日。
c.效果
表9大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）治疗Ⅲ度菌群紊乱症病人的肠道
菌群变化（X±SD,lgCFU/g大便）
  菌群   菌液1治疗前   菌液1治疗后#
  细菌总数   6.58±2.50   19.92±1.19
  双歧杆菌   1.85±2.49   9.11±1.40
  乳杆菌   2.04±1.56   7.92±1.23
  肠杆菌   2.11±2.40   7.34±1.48
  肠球菌   2.32±1.21   2.91±1.01
注：#，与大肠埃希氏菌CGMCC No.4697（菌液1）治疗前比较p＜0.01；治疗后肠杆菌数量比较p＜0.01。

Claims (10)

1.一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的大肠埃希氏菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）GC-01，其保藏编号为CGMCCNo.4697。
2.一种用于治疗菌群失调症菌群紊乱症的灌肠制剂，其特征在于，所述制剂包含有权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01。
3.根据权利要求2所述的灌肠制剂，其特征在于，所述灌肠制剂为栓剂或灌肠液。
4.根据权利要求3所述的灌肠制剂，其特征在于，所述栓剂或灌肠液中含有保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01的菌液，菌液浓度为1.5×108～9.0×108CFU/ml。
5.一种灌肠制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）挑取保藏编号为CGMCC No.4697大肠埃希氏菌GC-01菌落，接种到5ml营养肉汤中，置30～35℃电热恒温培养箱培养6h；
（2）用营养肉汤调制成0.5～3.0麦氏浊度大肠埃希氏菌液，得到活菌终浓度为1.5×108～9.0×108CFU/ml的大肠埃希氏菌液；
（3）分装即得。
6.根据权利要求5所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在使用前进行纯培养，方法为：接种保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在血琼脂平板和麦康凯平板上，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h后进行菌种鉴定。
7.根据权利要求6所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，菌种鉴定方法为：挑取血琼脂平板上的灰白色菌落或麦康凯平板上乳糖发酵菌落，涂片革兰染色镜检为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，做双糖、尿素、吲哚、枸橼酸盐、鸟氨酸、赖氨酸、氨基酸空白试验，若产酸/产气、不产硫化氢、尿素酶阴性，吲哚阳性、枸橼酸盐阴性、赖氨酸阳性，鉴定为大肠埃希氏菌；经VITEK鉴定仪确认为大肠埃希氏菌，并经血清学检测最终确认为非引起肠道感染的大肠埃希氏菌。
8.根据权利要求7所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01纯培养后的菌种直接使用或转种在脱脂牛奶中，-70℃保存，使用时复苏。
9.根据权利要求8所述的灌肠制剂的制备方法，其特征在于，所述复苏步骤为：将保存在-70℃冰箱中的相应菌株取出转种血琼脂平板或麦康凯平板，置35℃电热恒温培养箱培养18～24h，复苏后用于制备灌肠制剂。
10.权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.4697的大肠埃希氏菌GC-01在制备治疗菌群失调症灌肠制剂或菌群紊乱症灌肠制剂中的应用。
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