CN104450586A - 一种干酪乳杆菌及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌及其组合物，属于微生物应用技术领域。本发明所提供的干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.4520，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明所提供的干酪乳杆菌与动物双歧杆菌、粪肠杆菌和蜡样胞杆菌具有协同生长作用，同时对糖肽类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受性，适用于食品、药品和/或保健品中。

Description

一种干酪乳杆菌及其组合物
技术领域
本发明涉及一种干酪乳杆菌及其组合物，属于微生物应用技术领域。
技术背景
众所周知，作为一种益生菌，乳杆菌以其所具备的优良的益生特性，诸如耐酸性、耐受胆盐胆汁、在消化道中定植生长以及缓解乳糖不耐症、抗变异突变、降低血清胆固醇、抗肿瘤、抑制肠道病原菌、改善肠道菌群和提高机体免疫功能等已经被广泛应用于食品发酵、动物饲料及医疗保健等领域中。
干酪乳杆菌与目前常用的嗜酸乳杆菌和双歧杆菌被称为“健康三益菌”。我国《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》列出了可用于保健食品的益生菌菌种名单(2005年7月1日实施)，即两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃，G+C含量为45.6％～47.2％；菌体长短不一，两端呈方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。干酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道中。干酪乳杆菌作为益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的发酵剂及辅助发酵剂，尤其在干酪中的应用较多，适应干酪中的高含量盐及低pH值，通过一些重要氨基酸的代谢以增加风味并促进干酪的成熟。同时干酪乳杆菌还具有良好的耐酸及胆汁抗性，可降低血浆胆固醇，增强宿主对微生物病原体的非特异性抵抗力，加快清除肠道内病原体，治疗肠道菌群紊乱和增强肠道透性，从而防止食物过敏和急性腹泻。此外，干酪乳杆菌还可以使抗低密度氧化脂抗体和淋巴细胞增加，使粒细胞的噬菌作用明显增强，对宿主进行免疫调节，防止肿瘤的产生。由于能够在人体肠道内稳定存活并具有众多医疗保健功能，干酪乳杆菌作为益生菌被广泛应用于功能性食品。
国内许多企业利用干酪乳杆菌冻干菌粉为原料生产生物制品。然而冻干菌粉中的活菌数量是评价益生菌产品质量好坏的关键，而当前许多产品都不能有效地防止活菌数的衰减。在菌粉制备过程中优化生产工艺，如：发酵条件的优化和冷冻干燥工艺参数的优化是最为关键的。所以，使产品能够保持足够多的活菌数量并延长菌种的保藏期，以便充分发挥其生理功能，降低成本，已成为干酪乳杆菌活菌制剂产品研究开发及其应用的技术关键。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种干酪乳杆菌，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌，该干酪乳杆菌对糖肽类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类抗生素和磺胺具有耐受性。
所述干酪乳杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.4520，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
所述糖肽类抗生素为万古霉素和替考拉宁。
所述单环β-内酰胺类抗生素为氨曲南。
所述碳青霉烯类抗生素为美洛培南。
本发明的另一目的在于提供一种含有所述干酪乳杆菌的组合物，该组合物含有干酪乳杆菌活菌和载体。
所述载体由脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、L-谷氨酸钠和低聚异麦芽糖组成。
所述载体组成如下：10％脱脂乳、4％海藻糖、4％麦芽糖糊精、4％L-谷氨酸钠和4％低聚异麦芽糖。
所述组合物含有干酪乳杆菌的活菌数在1ⅹ106CFU/g-1ⅹ1011CFU/g。
所述组合物剂型为粉剂，片剂，胶囊或颗粒剂。
本发明有益效果如下：
1.本发明根据人体肠胃的生理条件，从健康儿童的肠道内筛选出一种干酪乳杆菌。本发明所提供的干酪乳杆菌可以再人体内定植，发挥益生作用。对肠道内的有害菌群有较好的抑制作用，从而提到调节肠道微生物菌群的作用。
2.本发明所提供的干酪乳杆菌对对糖肽类、单环β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素及磺胺具有耐受性。
3.本发明所提供的干酪乳杆菌，与其他益生菌具有良好的协同生长作用，复配效果较好。尤其是与干酪乳杆菌、粪链球菌和蜡样芽胞杆菌，适用于制备多联益生菌制剂。所制备的益生菌制剂的活菌数高，可达1ⅹ1011CFU/g。
附图说明
图1为实施例2中酪乳杆菌的显微镜图；
(放大倍数为100倍)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所述方法未经特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所述试剂和仪器未经特殊说明，均为本领域中常规试剂和仪器可从商业渠道获取。
实施例1菌株的获得
干酪乳杆菌，为分离自杭州市江干区健康人体肠道，筛选出适合人体的菌株，干酪乳杆菌的保藏号为CGMCC No.4520，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
干酪乳杆菌采自杭州市江干区20名2-6岁的健康儿童，男女各10名，均无胃肠病史，采样前两周内均为服用任何抗菌类药物。采样时用无菌玻璃棒挑取自然排出的新鲜粪便4-10g，置于无菌平皿中，迅速放入厌氧罐中，带回实验室分离。
实施例2菌株的鉴定和培养
2.1采用稀释涂布的方法，分别对采集的菌株样品进行分离纯化。纯化培养后观察菌落形态，取新鲜培养物，接种糖发酵试管，鉴定菌株的生化反应特性。同时取待测菌株的新鲜培养物，采用法国梅里埃公司的API 50CHL生化鉴定条，参照梅里埃公司的生化判定数据库对待测菌株进行API生化鉴定。同时将提取分离纯化号菌株的16SrRNA，并测定序列，并将测序结果与NCBI的GeneBank已有的序列进行比对。分离纯化好的菌种于2-8℃下保存。
经过鉴定，待测菌株的菌落特征为乳白色，圆形，边缘整齐，隆起，湿润。菌株形态为：革兰氏阳性，无芽孢、无荚膜、短杆菌，两端钝圆。链状排列或单一排列。菌株的生化反应特性见表1。
表1待测菌株的生化反应特性
待测菌株的API 50CHL生化反应特性见表2。
表2待测菌株的API生化反应特性
待测菌株的16SrRNA的序列与GeneBank序列进行比对后，结果显示，其与对照菌株中-干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 334株同源性为98％。
2.2干酪乳杆菌的培养
培养干酪乳杆菌所用的MRS培养基和发酵培养基的配方如下：
MRS培养基:
发酵培养基：
将分离纯化得到的干酪乳杆菌以5％的接种量接种到MRS培养基中，于36-38℃下，厌氧培养14-16h。
将经过检验合格的干酪乳杆菌种子液，接种于发酵罐中的发酵培养基中，于36-38℃下，厌氧培养16-20h。培养过程中取样镜检，测定pH值，培养结束后取样做纯菌检查(图1)。实施例3菌株的耐胃酸耐胆盐实验
3.1胆盐耐受实验
培养菌株所用的改良MRS培养液的组成为：
将分离纯化获得的菌株用灭菌的改良的MRS培养基液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10％接种量接入含有不同胆盐浓度的无菌改良MRS液体培养基中(胆盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％)，同时以不含有胆盐的改良MRS培养液为对照。在37℃厌氧培养0、6、12、18、24h后取样测定活菌数。
3.2酸耐受性实验
将分离得到的菌株用无菌改良的MRS培养液37℃严格厌氧培养15h。将活化菌株培养液以10％接种量接入不同pH的无菌改良MRS培养液中(pH分别为1、2、3、4、5)，同时以pH7.0的培养液为对照。37℃厌氧培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min，取样测定活菌。
3.3实验结果
待测菌株对不同浓度的胆盐的耐受性见表3。
表3菌株对不同浓度的胆盐的耐受性
胆盐浓度 0h(LOG cfu/ml) 6h 12h 18h 24h
7％ 10.86 10.70 10.68 10.49 10.28
6％ 10.86 10.73 10.69 10.51 10.32
5％ 10.86 10.76 10.69 10.59 10.32
4％ 10.86 10.78 10.70 10.61 10.48
3％ 10.86 10.80 10.76 10.68 10.51
2％ 10.86 10.83 10.79 10.75 10.64
1％ 10.86 10.85 10.83 10.78 10.77
从表3中可以看出，培养24h后，干酪乳杆菌活菌数随胆盐的浓度增加而降低，在常规体内盐浓度4％下，存活率为39.34％，随着盐浓度的增高，活菌数虽有下降，但在7g/100ml的高盐浓度下，存活率为22.95％，菌数仍然可以达到1010cfu/mL以上，说明干酪乳杆菌可有效耐受生物体高盐环境。由此说明，双歧杆菌耐高渗环境能力较强，可在人体内良好的生存。待测菌株对酸的耐受性见表4。
表4待测菌株对酸的耐受性
0min(LOGcfu/ml) 30min 60min 90min 120min
pH5.0 10.86 10.83 10.79 10.74 10.72
pH 4.0 10.86 10.81 10.78 10.74 10.72
pH 3.0 10.86 10.81 10.76 10.44 9.51
pH 2.0 10.86 10.72 10.58 6.6 5.81
pH 1.0 10.86 7.49 5.97 0 0
从表4中可以看出，干酪乳杆菌耐受pH 2.0和pH 1.0条件较差，处理1h后，活菌数明显下降，在pH 3.0条件下处理1h-2h，存活率分别为52.46％、45.90％和39.34％，对pH3.0具有较强的耐受能力，可见，该菌株具备耐受胃中酸性环境的能力。
实施例4菌株对抗生素药物的敏感性
本实施例采用琼脂扩散纸片法，检测纯化后的菌株对抗生素药物的敏感性。用于检测的标准药敏纸片包括10类20种抗生素：青霉素类(氨苄西林、青霉素)、头孢菌素类(头孢哌酮、头孢呋新)、全诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、单环β-内酰胺类(氨曲南)、四环素类(四环素、米诺环素)、糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、碳青霉烯类(美罗培南)及其他类(氯霉素)。上述纸片均购自北京天坛药物生物技术开发公司，纸片直径6mm，质量符合WHO标准规定。
取新制备的2个麦氏单位的检测菌株悬液0.5ml加入MRS平皿表面，无菌条件下通风吹干表面液体后，贴放标准药物纸片，培养24-48h后测量并记录抑菌圈直径。参照金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Stahpylococcus aureus ATCC 25923)判断标准。检测结果如表5所示。
表5待测菌株对抗生素药物的敏感性
注：R＝耐药；I＝中介；S＝敏感；-＝无抑菌圈；*＝参照肠球菌判定标准。
从表5可知，待测菌株对头孢菌素类(头孢哌酮、头孢呋辛钠)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)、四环素类(四环素、米诺环素)及氯霉素抗生素敏感；对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素)中度敏感；对糖肽类(万古霉素、替考拉宁)、单环β内酰胺类(氨曲南)、碳青霉烯类(美洛培南)抗生素和磺胺耐药。
实施例5干酪乳杆菌菌粉的制备
5.1干酪乳杆菌菌种活化
在无菌条件下，将干酪乳杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的MRS培养基成分：酪蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钾2.5g、柠檬酸三铵1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.025g、吐温-800.5、纯化水定容至500ml
5.2干酪乳杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液按5％的接种比例接种至种子罐种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，pH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：干酪乳杆菌培养，36-38℃16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行pH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
5.3干酪乳杆菌活菌菌粉的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂一定的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装至大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样送质检处检验。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空保存。
实施例6干酪乳杆菌菌片的制备
6.1干酪乳杆菌菌种活化
在无菌条件下，将干酪乳杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的MRS培养基成分：酪蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钾2.5g、柠檬酸三铵1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.025g、吐温-800.5、纯化水定容至500ml
6.2干酪乳杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液按5％的接种比例接种至种子罐种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，pH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：干酪乳杆菌培养，36-38℃16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行pH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
6.3干酪乳杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按一定的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装至大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样送质检处检验。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空封口，寄库保存。
6.4干酪乳杆菌活菌片剂制备
将制备的菌粉转入高速压片机中进行压片。在压片过程中须先调节填充量，再调节压力，使压出的素片重量差异、脆碎度、崩解度、外观等符合质量标准要求。压片过程中，每隔10分钟称一次平均片重，重量差异限度在±5％的范围内。
实施例7干酪乳杆菌胶囊的制备
7.1干酪乳杆菌菌种活化
在无菌条件下，将干酪乳杆菌工作种子批中的一支，加入少许无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的MRS培养基成分：改良的MRS培养基成分：酪蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钾2.5g、柠檬酸三铵1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.025g、吐温-800.5、纯化水定容至500ml
7.2干酪乳杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将一级种子液按5％的接种比例接种至种子罐种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，pH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：干酪乳杆菌培养，36-38℃16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行PH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
7.3干酪乳杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在低温条件10000rpm离心15min。离心结束后将菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按一定比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装至大盘中。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样送质检处检验。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空封口，寄库保存。
7.4干酪乳杆菌胶囊的制备
将冷冻干燥的菌粉按照规格，机械分装粉末，制备胶囊。
实施例8
8.1干酪乳杆菌菌种活化
在局部100级的条件下，将干酪乳杆菌工作种子批中的一支，加入1ml无菌水溶解，镜检确认符合该菌特征，用接种环蘸取少量菌液，在斜面上划“之”字，37±1℃厌氧培养48小时，镜检合格的斜面装入厌氧罐厌氧后移至冰箱中2～8℃保存。
改良的MRS培养基成分：改良的MRS培养基成分：酪蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖10g、磷酸氢二钾2.5g、柠檬酸三铵1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.025g、吐温-800.5、纯化水定容至500ml
8.2干酪乳杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
将工作种子(斜面)启开溶解、涂片染色、镜检合格接种至200ml一级种子培养基中，培养条件及培养时间：37±1℃厌氧培养14～16h。
2)种子罐种子的制作
将培养好的200ml一级种子液按5％的接种比例接种至装有4L种子培养基种子罐中。培养条件及培养时间：37±1℃培养14～16h。在培养过程中用N2保压，罐压维持在0.04-0.06Mpa，每小时搅拌15分钟。培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，PH值控制在6.2-6.8范围内。转入发酵罐前取样镜检，合格后方可转入发酵罐内。
3)发酵
接种：用蒸汽对接种管道灭菌30分钟，当温度降至36-38℃时，准备接种。接种前对种子液、发酵培养基进行涂片、染色、镜检。检查管道连接严密后，利用压差法将种子液接入发酵罐中。
培养：将4L干酪乳杆菌种子液按5％的比例接种至装有80L发酵液的发酵罐中，在36-38℃条件下培养16～20h，培养过程中用N2保压,罐压维持0.04—0.06Mpa,每小时搅拌15分钟，在培养6小时后取样镜检，以后每隔2小时取样镜检，视情况进行PH调节，培养过程中PH值控制范围6.2—6.8,并检测其生长情况及纯菌检查。
8.3干酪乳杆菌活菌制剂的制备
1)离心收集
菌体培养完成以后通过离心收集菌体，将发酵液通过离心管道进入离心机，在4℃条件下件10000rpm离心15min；为去除菌体中的培养基成分，将得到的菌泥用无菌水洗涤两遍将洗涤后的菌泥称量后转入混合预冻容器。
2)添加冻干保护剂
冻干保护剂成分为：脱脂乳10％(w/v)、海藻糖4％(w/v)、麦芽糖糊精4％(w/v)、L-谷氨酸钠4％(w/v)、低聚异麦芽糖4％(w/v)。保护剂按上述比例添加混合后，121℃，30min高压灭菌，4℃保存备用。
将离心得到的菌泥与上述保护剂按1:4的比例进行添加，搅拌均匀得到菌体悬浮液。
3)菌体冷冻干燥
将菌悬液放入不锈钢方盘中，分装15-20个大盘中，每盘装量450±50ml。分装后放入低温冰柜中预冻至充分冻结(显示温度-40～-80℃表明冻实)或放入冻干机内充分冻结。干燥箱制冷到-30℃以下，制品入箱，当制品充分冻结后停止干箱制冷，转向冷凝器制冷，温度达到-40℃以下时，开始真空干燥，当箱内真空度在30-10Pa以下时对干箱进行加热，温度控制在37—40℃，在接近此温度时应再持续2小时以上，当温度不再变化时证明制品已干燥，此时可以停机收粉。
4)粉碎包装
菌粉经装有80目筛网的粉碎机粉碎，然后过60目筛，最后用手顺时针搅拌2分钟，再逆时针搅拌2分钟，使其混合均匀，取样、检验，冻干菌粉中干酪乳杆菌的活菌数达到1.0×1012cfu/ml。将菌粉装入菌粉内包装袋内，称量并贴标签，抽真空封口保存。
8.4干酪乳杆菌的组合物制备
将制备的干酪乳杆菌冻干菌粉与动物双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌按一定的比例混合并添加一定辅料制备富含干酪乳杆菌的组合物，所制备的富含干酪乳杆菌的组合物中干酪乳杆菌的活菌数达到1010cfu/ml。
8.5干酪乳杆菌活菌制剂的稳定性检测
将制备的富含干酪乳杆菌的活菌制剂置于4℃和25℃条件下，每隔30天对制剂中的活菌数进行测定。同时测定利用本发明制备的干酪乳杆菌菌粉以及市售干酪乳杆菌菌粉在4℃和24℃下单独储藏24个月活菌数变化。表6，表7为4℃和25℃条件下组合制剂中各菌粉在24个月储存期间活菌数的变化情况。
表6实施案例8组合制剂中四种菌粉分别在4℃条件下储存24个月活菌数的变化
表7实施案例8组合制剂中四种菌粉分别在25℃条件下储存24个月活菌数的变化
表8实施案例8干酪乳杆菌菌粉和市售双歧杆菌菌粉分别在4℃和25℃条件下储存24个月活菌数的变化
结果表明，将干酪乳杆菌和动物双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌按一定的比例混合并添加一定辅料制备四联活菌制剂各菌的活力在储藏24个月期间稳定性较好，干酪乳杆菌的活菌数在108cfu/ml以上，动物双歧杆菌的活菌数在109cfu/ml以上，蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌的活菌数在105cfu/ml以上。同时将实施案例8制备的干酪乳杆菌菌粉与市售干酪乳菌粉进行了比较(表8)，结果表明利用本发明制备的干酪乳杆菌菌粉在4℃和25℃条件下储藏24个月期间，虽然菌种活力有一定程度的下降，但在第24个月时4℃和25℃条件下储藏的干酪乳杆菌活菌数分别为6.64Log cfu/ml和5.39Log cfu/ml(活菌数＞106cfu/ml)；而市售干酪乳杆菌菌粉在第24个月时4℃和25℃条件下储藏的的菌体活菌数已经下降到106cfu/ml以下。由此说明利用本发明方法制备的组合活菌制剂中干酪乳杆菌菌在24个月的储藏期间活菌数具有较好的稳定性；另外用这种方法制备的富含干酪乳杆菌菌粉和动物双歧杆菌粉、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌组合制剂在24个月储藏期间活菌数下降不明显，使得干酪乳杆菌的有效期远比常规方法长。说明在干酪乳杆菌与动物双歧杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌制备的组合制剂中，四种菌具有一定的协同作用，更有利于干酪乳杆菌菌体的稳定性。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种干酪乳杆菌，其特征在于，对糖肽类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类抗生素和磺胺具有耐受性。
2.权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCC No.4520，于2010年12月29日，保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
3.权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，所述糖肽类抗生素为万古霉素和替考拉宁。
4.权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，所述单环β-内酰胺类抗生素为氨曲南。
5.权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，所述碳青霉烯类抗生素为美洛培南。
6.一种含有权利要求1所述干酪乳杆菌的组合物，其特征在于，含有干酪乳杆菌活菌和载体。
7.权利要求6所述组合物，其特征在于，所述载体由脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、L-谷氨酸钠和低聚异麦芽糖组成。
8.权利要求6所述组合物，其特征在于，所述载体组成如下：10％脱脂乳、4％海藻糖、4％麦芽糖糊精、4％L-谷氨酸钠和4％低聚异麦芽糖。
9.权利要求6所述组合物，其特征在于，所述组合物含有干酪乳杆菌的活菌数在1ⅹ106CFU/g-1ⅹ1011CFU/g。
10.权利要求6所述组合物，其特征在于，所述组合物剂型为粉剂，片剂，胶囊或颗粒剂。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113925886A (zh) * 2021-09-28 2022-01-14 杭州远大生物制药有限公司 四联活菌组合物的新应用
CN115478025A (zh) * 2021-06-15 2022-12-16 杭州远大生物制药有限公司 益生菌组合物及其用途
CN115786158A (zh) * 2022-07-05 2023-03-14 四川农业大学 一种耐药的干酪乳杆菌sicau-lab26及其应用
CN116836868A (zh) * 2023-07-03 2023-10-03 山东大树生命健康科技有限公司 一株干酪乳杆菌bigtree-b101142及其菌剂与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144065A (zh) * 2007-09-03 2008-03-19 江南大学 一种耐过氧化氢、清除自由基的抗氧化干酪乳杆菌及其用途
CN101475918A (zh) * 2008-12-10 2009-07-08 江南大学 一种具有降低牛乳中β-乳球蛋白抗原性能力的干酪乳杆菌与用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144065A (zh) * 2007-09-03 2008-03-19 江南大学 一种耐过氧化氢、清除自由基的抗氧化干酪乳杆菌及其用途
CN101475918A (zh) * 2008-12-10 2009-07-08 江南大学 一种具有降低牛乳中β-乳球蛋白抗原性能力的干酪乳杆菌与用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
熊涛: "鼠李糖乳杆菌冻干保护剂的研究", 《生物工程》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115478025A (zh) * 2021-06-15 2022-12-16 杭州远大生物制药有限公司 益生菌组合物及其用途
CN113925886A (zh) * 2021-09-28 2022-01-14 杭州远大生物制药有限公司 四联活菌组合物的新应用
CN113925886B (zh) * 2021-09-28 2024-02-02 杭州远大生物制药有限公司 四联活菌组合物的新应用
CN115786158A (zh) * 2022-07-05 2023-03-14 四川农业大学 一种耐药的干酪乳杆菌sicau-lab26及其应用
CN115786158B (zh) * 2022-07-05 2024-03-08 四川农业大学 一种耐药的干酪乳杆菌sicau-lab26及其应用
CN116836868A (zh) * 2023-07-03 2023-10-03 山东大树生命健康科技有限公司 一株干酪乳杆菌bigtree-b101142及其菌剂与应用
CN116836868B (zh) * 2023-07-03 2023-11-21 山东大树生命健康科技有限公司 一株干酪乳杆菌bigtree-b101142及其菌剂与应用

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