CN115786158B - 一种耐药的干酪乳杆菌sicau-lab26及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐药的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SICAU‑LAB26及其应用，该菌分离自川西高原自然发酵的牦牛乳奶酪，该菌株已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M20211648，其16SrRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。该菌株菌落为乳白色，圆形或类圆形，直径在1.0mm以上；表面隆起光滑，边缘整齐；菌体为短杆状，两端钝圆，呈短链状排列。该菌产酸能力较强，经验证，该菌具有较强的抗生素抗性，同时也是耐酸、耐渗透压、耐胆盐、耐高温、抗病原菌强的优势菌株，该菌及其制备的生物菌剂具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐药的干酪乳杆菌SICAU-LAB26及其应用。
背景技术
乳酸菌(LacticAcidBacteria,LAB)是一种主要在兼性厌氧环境中生存，在胃肠道中易生存和定植，能够产酸抑制有害病原菌生长，维持肠道的菌群平衡，提高机体免疫力的一类益生菌。而自然界中的乳酸菌数量庞大，种类繁多，不同地区不同气候孕育的乳酸菌种类也拥有着不同的优良性状。我国饲养牦牛的主要地域位于川西高原及青藏高原地区，由于特殊的地理位置和气候条件，牦牛乳奶酪的营养价值丰富，内含大量的蛋白质、氨基酸、乳糖和矿物质，其发酵产物中乳酸菌资源丰富，益生性极高，是开发优良野生型乳酸菌的天然宝库，具有相当大的研究价值。
乳酸菌的性能决定了发酵乳制品的风味和营养价值，因此，性能优良的乳酸菌资源的开发一直是乳品行业研究的热点。乳酸菌对抗生素具有明显有耐药现象。乳酸菌作为益生菌，它的耐药性具有重要意义。当人或动物服用抗生素时，会把肠道中有益和有害的细菌同时杀灭，引起腹泻，如果乳酸菌对抗生素有抗性，就可以缓解这种不良反应，帮助宿主恢复肠道菌群平衡，促进动物肠道正常菌群的建立、从而提高畜禽生产能力。目前，关于乳酸菌的耐药性研究国内外都不多，耐药性高效发酵菌株的筛选工作也尚无相关报道。
川西牧区少数民族千百年来沿袭古老而传统的方法制作酸奶，生产方法简单，产品风味独特，而且在当地自然温度下存放较长时间还能保证其口感和状态。这些传统发酵乳中含有传代性好、抗逆性强、凝乳状态好、风味独特的优良乳酸菌菌群，经历几千年的自然选择和驯化，一些兼具优良发酵性能和抗逆性强的高效乳酸菌保留下来，对这些菌株的挖掘筛选及评价对于丰富现有乳酸菌生物多样性研究、构建具有应用价值的乳酸菌资源库、提高酸奶发酵品质都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐药的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SICAU-LAB26及其应用，经验证，该菌具有较强的抗生素抗性，同时也是耐酸、耐渗透压、耐胆盐、耐高温、抗病原菌强的优势菌株，该菌及其制备的生物菌剂具有很好的应用前景。
为了达到上述目的，本发明提供了一种耐药的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)SICAU-LAB26，该菌株已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M20211648，其16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，该干酪乳杆菌SICAU-LAB26具有磺胺间甲氧嘧啶抗性，其抗性限度可达2560μg/mL。
优选地，该干酪乳杆菌SICAU-LAB26具有万古霉素抗性，其抗性限度可达4μg/mL。
优选地，该干酪乳杆菌SICAU-LAB26具有红霉素抗性，其抗性限度可达160μg/mL。
本发明提供的耐药的干酪乳杆菌SICAU-LAB26可应用于制备生物菌剂。
本发明还提供了一种由上述耐药的干酪乳杆菌SICAU-LAB26制备的生物菌剂。
本发明提供的生物菌剂可应用于制作酸奶。
优选地，该生物菌剂可用于制作银耳发酵酸奶。
本发明的一种耐药的干酪乳杆菌SICAU-LAB26及其应用，解决了乳杆菌抗生素抗性差，以及限制了乳杆菌的应用范围等问题，并具有以下优点：
本发明提供的干酪乳杆菌SICAU-LAB26相对常规的干酪乳杆菌具有更强更广谱的抗生素抗性，极大的扩宽了乳杆菌的应用范围，由其制备的生物菌剂具备更广的应用性和市场前景。
附图说明
图1为本发明中四株耐酸菌株在不同pH下OD600测定结果图。
图2为本发明中菌株RC3和SICAU-LAB26在不同渗透压环境下OD600测定结果图。
图3为本发明中三株耐胆盐菌株的OD600测定结果图。
图4为本发明中干酪乳杆菌SICAU-LAB26在平板上的生长菌落形态；其中，图中的A为SICAU-LAB26划线图，图中的B为SICAU-LAB26涂板图。
图5为本发明中干酪乳杆菌SICAU-LAB26的革兰氏染色结果图。
图6为本发明中干酪乳杆菌SICAU-LAB26的过氧化氢实验结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1乳杆菌的分离与初步鉴定
1.1菌株来源
以在川西红原县、若尔盖县、康定县、和壤塘县等地区采集的11份牦牛乳奶酪为材料进行试验，采样信息见表1。采集材料后装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，带回实验室保存。
表1川西地区牦牛奶酪样品来源
1.2乳酸菌的分离
采用稀释涂布法分离样品中的乳酸菌，37℃下培养48h，观察平板菌落生长情况，挑取具有溶钙圈的乳白色圆形的单菌落在MRS培养基上划线纯化，培养24h后，挑取单菌落的一半做革兰氏染色与过氧化氢酶实验，结果可见，革兰氏染色结果为紫色，过氧化氢酶实验结果为产生气泡，则说明分离出的细菌为革兰氏阳性细菌，能够进一步筛选乳酸菌，实验结果如表2及图5和图6所示。筛选出来的菌株用30％甘油保存于-80℃冰箱。
从采集的样品中分离出72株菌株，其中HA样品中共分离出8株，分别标记为HA1～HA8；HB样品中共分离出7株，分别标记为HB1～HB7；HC样品中共分离出7株，分别标记为HC1～HC7；HD样品中共分离出8株，分别标记为HD1～HD8；RA样品中共分离出9株，分别标记为RA1～RA9；RB样品中共分离出5株，分别标记为RB1～RB5；RC样品中共分离出5株，分别标记为RC1～RC5；KA样品中共分离出2株，分别标记为KA1～KA2；TA样品中共分离出6株，分别标记为TA1～TA6；TB样品中共分离出7株，分别标记为TB1～TB7；YA样品中共分离出8株，分别标记为YA1～TA8。经初步鉴定后判定为乳酸菌，部分结果如表2所示。
表2革兰氏染色与过氧化氢实验鉴定部分结果
实验例2耐高温、产酸及抑菌能力测定
2.1耐高温能力测定
将待测菌株活化后，分别于45℃和50℃的恒温箱中培养48h，观察记录其生长情况，部分菌株的耐高温能力见表3。
2.2产酸能力测定
初筛采用钙溶圈法，钙溶圈的大小反映菌株产酸能力的强弱。分别挑1环活化好的菌株接种于10mL MRS液体培养基中，37℃恒温培养24h。在含有质量浓度为1％CaCO3的MRS琼脂平板上间隔适宜距离用直径为5mm的灭菌吸管打孔后，向孔中分别注入100μL菌液并做好标记，将接入菌液的平板置于37℃的培养箱培养2-3d后测量钙溶圈直径大小，部分菌株的产酸见表3。
2.3抑菌能力测定
抑菌试验采用牛津杯法。取108cfu/mL大肠杆菌的LB溶液100μL，涂板于已灭菌的LB培养基中，上面水平放置牛津杯，分别加入200μL相同浓度的目标菌液，设置3个重复，37℃培养24h，记录其抑菌圈直径，部分菌株的耐高温、产酸及抑菌能力见表3。
表3牦牛乳奶酪部分乳酸菌菌株耐高温、产酸及抑菌能力测定
结果显示，不同菌株在测定结果中差异明显，其中菌株HA1、RB5、SICAU-LAB26均能在50℃条件下生长，展现了较为优越的耐高温能力。在产酸能力测定中，HD1、SICAU-LAB26的钙溶圈直径均大于11mm，产酸能力较强；在抑大肠杆菌试验中发现各菌株均对大肠杆菌有一定抑制作用，但抑菌能力差异较明显。例如KA1的抑菌圈直径为6.02mm，是所有菌株中最小的，而HB2的抑菌能力最强，其抑菌圈直径为20.00mm。
实验例3耐酸性测定
将菌株接入pH值为3.0、4.0、5.0的MRS培养基中，37℃静置培养24h，观察其生长情况，挑选生长情况较好的菌株活化，将活化好的浓度为106cfu/mL的菌株分别接入pH值为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5的MRS液体培养基中，37℃静置培养，于0、2、4、6、24h分别测定发酵液的OD600值，以对应的pH值培养基调零，以自然pH的MRS培养基接入相同浓度菌株作为对照，每个菌设置3个重复。
结果显示有64株乳酸菌能够耐受pH＝5.0的环境，26株对pH为4.0的环境具有耐受性，但在pH为3.0的条件下还能继续生长的菌株只有4株。图1是对耐酸性能较优越的4株菌株进行酸性条件下的OD600测定，其中HB2和RA2均在4-6h时均有小幅下调，但4株菌均能在强酸性条件下持续生长，在pH＝1.5的环境培养24h时OD600值由大到小依次为：SICAU-LAB26>HB2>HD1>RA2。由此可知，SICAU-LAB26(标记为SICAU-B26)菌株耐酸性较强。
实验例4耐渗透压能力测定
将菌株接入NaCl质量分数为6％的MRS培养基中，37℃静置培养24h，观察其生长情况，挑选生长情况较好的菌株活化，将活化好的浓度为106cfu/mL的菌株分别接入NaCl质量分数为3％、5％、7％、9％的MRS液体培养基中，37℃静置培养，分别于0、2、4、6、8、24h测定发酵液的OD600值，以对应的盐培养基调零，以不加NaCl的MRS培养基接入相同浓度菌株作为对照，每个菌设置3个重复。
以NaCl质量分数为6％的MRS培养基初筛得到15株耐受菌株，经OD600测定后部分结果如图2所示。由图2可得，虽然不同菌株对NaCl的耐受程度不同，但样品菌株在24h的OD600值均随NaCl质量分数增大而减小。其中菌株RC3在9％NaCl的环境中与在无NaCl的环境中相比，OD600值仅小幅度下调，表明该菌株能够耐受高渗透压环境；而其他菌株例如SICAU-LAB26，在高盐环境中虽能生长但被大幅抑制，表明其对高盐环境耐受度不强。
实验例5耐胆盐能力测定
将菌株接入牛胆盐质量分数为0.2％的MRS培养基中，37℃静置培养24h，观察其生长情况，挑选生长情况较好的菌株活化，将活化好的浓度为106cfu/mL的菌株分别接入牛胆盐质量分数为0.2％、0.3％、0.5％的MRS液体培养基中，37℃静置培养，分别于0、2、4、6、8、24h测定发酵液的OD600值，以对应浓度的胆盐培养基调零，以不加牛胆盐的MRS培养基接入相同浓度菌株作为对照，每个菌设置3个重复。
以牛胆盐质量分数为0.2％的MRS培养基初筛得到3株耐受菌株，经OD600测定后结果如图3所示。三株菌均能在0.3％胆盐的溶液里生长，但当盐浓度升高至0.5％时，HB1几乎不生长，RB5和SICAU-LAB26能够继续生长但长势较弱。
实验例6优势菌种干酪乳杆菌SICAU-LAB26的抗生素抗性能力测定及进一步鉴定
6.1抗生素抗性能力测定
采用平板涂布法，用抗生素选择性培养基研究干酪乳杆菌SICAU-LAB26对常见的10种抗生素的耐药性。挑选单菌落乳酸菌接种到液体培养基中，培养24h后调节其初始接种OD600为0.5，分别取100μL菌悬液涂布于基础培养基：四环素类选择培养基(土霉素选择培养基)，磺胺类选类择培养基(磺胺间甲氧嘧啶选择培养基)，喹诺酮类选择培养基(环丙沙星选择培养基)，氨基糖苷类选择培养基(硫酸庆大霉素选择培养基、链霉素选择培养基、卡那霉素选择培养基)，氯霉素选择培养基(氯霉素选择培养基)，大环内酯类选择培养基(红霉素选择培养基)，糖肽类选择培养基(万古霉素培养基)，盐酸克林霉素培养基，抗生素浓度分别为0.2、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120μg/mL每个样品3个平行实验，培养48h后，将每个培养皿用肉眼观察，并与对照组进行对比，没有细菌生长的培养皿所对应的抗生素浓度即为菌株的最小抑制浓度。同时要对质控菌株副干酪乳杆菌ATCC334进行最小抑制浓度的测定，如果测定值在下表4所示的浓度范围之内，则说明抗生素浓度配制、实验操作是正确的，实验结果可信。
表4质控菌株及干酪乳杆菌SICAU-LAB26的抗生素抗性(μg/mL)
其中，“/”代表在目前搜查文献中，国内外暂无发现有相关数据。
结果显示，干酪乳杆菌SICAU-LAB26对常见的10种抗生素均具有一定的耐药性，其中，对磺胺间甲氧嘧啶及红霉素的耐药性较强。
6.2干酪乳杆菌SICAU-LAB26的进一步鉴定
用细菌基因组提取试剂盒进行细菌DNA提取，稀释10倍作为PCR反应的模板进行细菌16S扩增，扩增引物采用细菌16S rRNA通用引物27F和1492R，然后将扩增产物回收并进行测序，测得扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，16S rRNA基因的NCBI基因登录号为OL989974。
其中，采用的引物序列如下(5’-3’)：
27F(SEQ ID NO.1)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R(SEQ ID NO.2)：GGTTACCTTGTTACGACTT
基于以上特征，将菌株SICAU-LAB26鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。该菌株已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M20211648。
实验例7酸奶发酵能力测定
将具有优良性能的乳酸菌菌种活化，接种至脱脂乳培养基中，37℃培养至凝乳，于4℃冰箱冷藏后进行感官评价。感官评分依照GB 19302-2010《食品国家安全标准发酵乳》的指标稍加改动，具体评价标准见表5。
表5酸奶感官评价指标及标准
经上述筛选鉴定结果，选择SICAU-LAB26、RA2、RB5等3株菌制作酸奶，邀请了30名评价员对酸奶进行感官评价，整理评价结果如下表6所示。由表得，混菌酸奶评分均大于单菌酸奶，且在混菌酸奶中，组合RB5+SICAU-LAB26的总体感官评分最高，更能满足消费者需求。在单菌酸奶中，SICAU-LAB26得分也优于RA2和RB5，所以综合数据后，认为SICAU-LAB26是性状优良、具有应用价值潜力的一株乳酸菌。
表6酸奶感官评价得分汇总
实验例8银耳酸奶发酵品质测定
银耳多糖还原乳的制备：用少量水溶解奶粉，不同组别分别添加0、1％、3％、6％的银耳多糖溶液，最终加水达到奶粉与水的质量体积比为12.5：100，再加入4％的蔗糖，充分溶解，混匀。杀菌、冷却：将混合好的料液在95℃下保温15min杀菌，室温冷却至44℃，待用。接种：在超净工作台中，向混合乳液中接种0.5％的发酵剂，分别对应编号为SICAU-LAB26-0、SICAU-LAB26-1％、SICAU-LAB26-3％、SICAU-LAB26-6％，充分混合均匀。灌装封口、发酵及冷藏成熟：将混合均匀的乳液灌装于灭菌的玻璃瓶中并封口，于42℃恒温培养箱中发酵，凝固取出，转入4℃冰箱冷藏24h得成品。将成品送至成都戴维赛特生物科技有限公司，测定其蛋白质和总糖含量。结果如下表7所示。由表可知，随着银耳多糖含量的增加，蛋白质和总糖均有小幅上升。
表7银耳酸奶的品质测定
尽管本发明的内容已经通过上述优选实验例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
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Claims (5)
1.一种耐药的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)SICAU-LAB26，其特征在于，该菌株已于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M20211648，其16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的干酪乳杆菌SICAU-LAB26在制备生物菌剂中的应用。
3.一种由权利要求1所述的干酪乳杆菌SICAU-LAB26制备的生物菌剂。
4.如权利要求3所述的生物菌剂在制作酸奶中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酸奶为银耳发酵酸奶。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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