CN110591955A - 一株耐受低温酸性双胁迫的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐受低温酸性双胁迫的植物乳杆菌及其应用。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2，其保藏编号为CGMCC No.18495。植物乳杆菌NMGL2在制备发酵乳中的应用也属于本发明的保护范围。植物乳杆菌NMGL2在制备细菌抑制剂中的应用有而属于本发明的保护范围。本发明还保护一种发酵乳的制备方法，包括如下步骤：将植物乳杆菌NMGL2接种至液态奶并发酵，得到发酵乳。本发明发现了了一株植物乳酸菌，具有较强的耐低温、耐酸、耐胆盐以及具有广谱的抑菌性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株耐受低温酸性双胁迫的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
发酵乳是以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH值降低的产品。发酵乳具有易于消化吸收、提高食欲、营养保健功效较高的特点，因此得到了消费者的青睐。
发酵乳被认为是益生菌的良好载体。据报道，在发酵乳加工中添加益生菌具有诸多有利于人类健康的功效，包括增强免疫力、改善肠道消化功能及肥胖、调节肠道菌群、缓解类风湿性关节炎、缓解重度抑郁症、缓解胃肠炎症等。但是，发酵乳较高的酸度及产品货架期冷藏条件下乳基质低温和酸的双重胁迫易导致其中益生菌的亚致死甚至致死性损伤，致使冷藏后期产品中的益生菌活性下降，产品应有的健康功能得不到保证。同时由各种环境胁迫因素引起的益生菌产品货架期功能性下降甚至丧失也是当前益生菌产品功能界定和标称不明确及市场混乱的重要原因之一。
筛选具有低温酸性双胁迫的乳酸菌可以有效的保持乳酸菌在低温酸性双胁迫环境下菌数以及其他的性质不会发生变化。同时通过筛选到的乳酸菌研究发酵乳冷藏过程低温酸性双重胁迫对益生菌活性的影响机制，可以有效地保持益生菌的活性及产品功能性，这也是当前乳品健康产业发展亟待解决的科学技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐受低温酸性双胁迫的植物乳杆菌及其应用。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2，已于2019年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.18495。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2简称植物乳杆菌NMGL2。
植物乳杆菌NMGL2在制备发酵乳中的应用也属于本发明的保护范围。
植物乳杆菌NMGL2在制备细菌抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围；所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌和/或志贺氏菌。
本发明还保护一种细菌抑制剂，其活性成分为植物乳杆菌NMGL2；所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌和/或志贺氏菌。
本发明还保护一种发酵乳的制备方法，包括如下步骤：将植物乳杆菌NMGL2接种至液态奶并发酵，得到发酵乳。
所述方法中，植物乳杆菌NMGL2在所述液态奶中的初始密度为2.8×108-3×108cfu/ml。
所述发酵的条件为：37℃静置培养20-24小时。
所述发酵的条件为：37℃静置培养直至pH达到4.6。
所述液态奶为鲜牛奶和/或鲜羊奶和/或牛乳粉溶于水得到的液态奶和/或羊乳粉溶于水得到的液态奶。
所述液态奶具体可为将牛乳粉和/或羊乳粉溶于水得到的液态奶。乳粉与水的配比可为：10-15g乳粉：100ml水。乳粉与水的配比可为：12g乳粉：100ml水。
所述方法中，将植物乳杆菌NMGL2菌悬液接种至灭菌后的液态奶并发酵，得到发酵乳。所述菌悬液与所述液态奶的配比可为：3ml菌悬液：100ml液态奶。所述菌悬液中植物乳杆菌NMGL2的菌浓度为1010cfu/ml。所述灭菌为巴氏消毒杀菌。所述灭菌的参数具体可为：90℃，10min。
以上所述方法制备得到的发酵乳均属于本发明的保护范围。
本发明发现了了一株植物乳杆菌，具有较强的耐低温(4℃)、耐酸(pH3)、耐胆盐(0.3％)以及具有广谱的抑菌性(对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和志贺氏菌有较好的抑菌性)。
本发明提供的植物乳杆菌NMGL2可用于制备发酵乳，可用于研究发酵乳冷藏过程低温酸性双重胁迫对益生菌活性的影响机制，可以有效地保持益生菌的活性及产品功能性。
附图说明
图1为植物乳杆菌NMGL2的形态特征。
图2为植物乳杆菌NMGL2 16S rRNA的编码基因进行同源性比对鉴定的结果。
图3为4℃保存不同天数时的植物乳杆菌NMGL2的活菌浓度。
图4为4℃保存不同天数时的pH值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的志贺氏菌为福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，CICC，编号为21534。实施例中所用的金黄色葡萄球菌，CMCC，编号为26071。实施例中所用的沙门氏菌为肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica subsp.enterica serovarTyphimurium)，CICC，编号为22956。实施例中所用的大肠埃希氏菌，CMCC，编号为44825。CICC网址：http://www.china-cicc.org/。CMCC网址：http://www.cmccb.org.cn/cmccbnew/index.php。
液体MRS培养基：K2HPO4 0.2g，无水乙酸钠0.5g，酵母粉0.5g，MgSO4 0.05g，牛肉膏1g，柠檬酸铵0.2g，胰蛋白胨1g，葡萄糖2g，硫酸盐0.025g，吐温80 1mL，蒸馏水100mL；121℃灭菌15min。液体碳酸钙-MRS培养基：CaCO3 3g，K2HPO4 0.2g，无水乙酸钠0.5g，酵母粉0.5g，MgSO4 0.05g，牛肉膏1g，柠檬酸铵0.2g，胰蛋白胨1g，葡萄糖2g，硫酸盐0.025g，吐温801mL，蒸馏水100mL；121℃灭菌15min。液体LB培养基：胰蛋白胨1g，NaCl 1g，酵母膏0.5g，蒸馏水100mL；121℃灭菌15min。与液体培养基相比，固体培养基的差别仅在于增加1.5g-2g的琼脂。
实施例1、植物乳杆菌NMGL2的获得和保藏
一、从样品中筛选获得乳酸菌
样品分别为：采集自内蒙古呼伦贝尔陈巴尔虎旗传统的自然发酵干酪、酸奶和泡菜，采集自新疆维吾尔自治区的干酪和采集自甘肃陇南市的自然发酵浆水。
1、称取样品25g，用250mL无菌水均质混匀，使用倾注法接种在碳酸钙-MRS培养基平板上，37℃静置培养36h。
2、完成步骤1后，选取有溶钙圈的菌落(有溶钙圈的菌落即为乳酸菌)，在MRS培养基平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致。
3、完成步骤2后，挑取单菌落至液体MRS培养基静置培养24h。
4、完成步骤3后，使用冻存管将菌液和50％甘油等体积混匀，-80℃冰箱保存。
共得到21株纯培养的乳酸菌。21株乳酸菌分别命名为NMGL1、NMGL2、NMGL3、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、PC2、PC3、PC5、PC6、PC7、PC8、PC9、PC10、PC11、JS1和JS2。NMGL代表分离自内蒙古呼伦贝尔陈巴尔虎旗传统的自然发酵干酪。P和PC代表分离自内蒙古呼伦贝尔陈巴尔虎旗传统的泡菜，P和PC代表不同的泡菜。JS代表分离自甘肃陇南市的自然发酵浆水。
二、从乳酸菌中筛选目标菌株
1、取步骤一的冻存菌，以2％的接菌量接种至液体MRS培养基(pH6.5)，37℃静置培养24h。
完成培养后，NMGL1、NMGL2、NMGL3、P3、P4、PC10、PC11的菌浓度均为1010cfu/ml。
完成培养后，P1、P2、P5、P6、P7、JS1和JS2的菌浓度均为109cfu/ml。
完成培养后，PC2、PC3、PC5、PC6、PC7、PC8、PC9的菌浓度均为108cfu/ml。
2、耐低温菌株的筛选
取步骤1得到的菌液，转接至50ml液体MRS培养基(pH6.5)，体系中的初始菌浓度为107cfu/mL。然后静置培养。分别采用两种培养温度：4℃或10℃。从完成接种开始计时，每24小时作为一天，分别于1天后、2天后、3天后取样测定OD600nm值。
结果见表1。10℃培养时，绝大多数乳酸菌均能生长。4℃培养时，13株菌可以生长，具有较好的耐低温特性。具有耐低温特性的13株菌为：NMGL1、NMGL2、NMGL3、P1、P4、P5、P6、PC5、PC7、PC10、PC11、JS1、JS2。
表1
3、酸耐受菌株的筛选
取步骤1得到的菌液，转接至50ml液体MRS培养基，体系中的初始菌浓度为107cfu/mL。然后37℃静置培养24h。液体MRS培养基分别设置三种pH：3、4或6。每隔2h取样测定OD600nm值。
结果见表2和表3。培养基pH为4或6时，21株乳酸菌均能生长。培养基pH为3时，7株乳酸菌可以生长，具有较好的耐酸性。具有耐酸性的7株菌为：NMGL1、NMGL2、NMGL3、P3、PC11、JS1和JS2。
表2
表3
4、胆盐耐受菌株的筛选
取步骤1得到的菌液，转接至50ml含胆盐的液体MRS培养基(pH6.5)，体系中的初始菌浓度为107cfu/mL。然后37℃静置培养24h。每隔2h取样测定OD600nm值。分别设置三种胆盐浓度：0.1g/100mL、0.2g/100mL、0.3g/100mL。
结果见表4和表5。0.1g/100mL胆盐浓度下，21株乳酸菌均能生长。0.2g/100mL胆盐浓度下，有3株乳酸菌(NMGL1、NMGL2和NMGL3)能生长，具有较好的耐胆盐特性。0.3g/100mL胆盐浓度下培养10h后，NMGL2的OD600nm值仍然可以达到0.4以上，耐胆盐特性最佳。
表4
表5
5、抑菌菌株的筛选
指示菌为志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠埃希氏菌。带有指示菌的平板的制备方法：灭菌后的固体LB培养基自然冷却，尚未凝固时加入指示菌并混匀(混匀后，指示菌在体系中的菌浓度为105cfu/ml)，然后倒平板，自然冷却。
供试菌菌液的制备方法：取步骤1得到的菌液，转接至50ml液体MRS培养基(pH6.5)，37℃静置培养至菌浓度为109cfu/mL。
取带有指示菌的平板，将无菌的牛津杯水平放置在平板上(每个平板均匀放置3只牛津杯，牛津杯内直径为8mm、外直径为10mm)。每个牛津杯中加入0.2mL供试菌菌液。然后37℃静置培养24h，拍照并测量抑菌圈直径(单位：cm)。
抑菌圈直径见表6。与其他乳酸菌相比，NMGL2对4株致病菌均有较强抑菌作用。
表6
经过步骤2至步骤5的筛选，NMGL2具有较强的耐低温(4℃)、耐酸(pH3)、耐胆盐(0.3％)以及具有广谱的抑菌性(对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和志贺氏菌菌有较好的抑菌性)。
三、NMGL2的鉴定
形态特征(见图1)：圆端直杆菌，大约1.0μm×5.0μm，单个状；表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白。
生理生化特征：革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性反应。
16S rDNA鉴定：提取NMGL2的基因组DNA，通过PCR扩增获得16S rRNA的编码基因(如序列表的序列1所示)，然后NCBI网站基因库中进行同源性比对鉴定，结果见图2。
经鉴定，NMGL2属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，将其命名为植物乳杆菌NMGL2。
四、NMGL2的保藏
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2，已于2019年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.18495。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2简称植物乳杆菌NMGL2。
实施例2、植物乳杆菌NMGL2在发酵乳中的应用
1、菌种的活化
将-80℃甘油管保存的植物乳杆菌NMGL2以3％的接菌量接种至液体MRS培养基，37℃静置培养48h；然后以3％的接菌量转接至液体MRS培养基，37℃静置培养48h，获得菌悬液(菌悬液的菌浓度为1010cfu/ml)。
2、脱脂乳的前处理
制备液态脱脂乳(6瓶，每瓶100ml)(每瓶的制备方法：12g乳粉溶于100ml水；乳粉为恒天然合作社集团有限公司产品，货号：000022)，巴氏消毒杀菌(90℃，10min)，冷却至37℃备用。
3、将步骤1得到的菌悬液加至步骤2得到的液态脱脂乳(每瓶加入3ml菌悬液)，37℃静置发酵，直至pH达到4.6时停止发酵(大约22h)。
4、完成步骤3后，4℃保存，分别于停止发酵0时刻、1天后、7天后、14天后、21天后，取样测量pH值和植物乳杆菌NMGL2活菌数。
进行三次重复试验，每次重复试验设置5个重复处理，结果取平均值。
植物乳杆菌NMGL2活菌数检测方法：将20mL发酵乳样本和180mL无菌生理盐水混匀，然后用无菌生理盐水进行梯度稀释；取灭菌后尚未凝固的液体MRS培养基(约50℃)，与稀释液混匀，然后自然冷却并凝固，37℃倒置静置培养48h，观察菌落生长情况并计数。
植物乳杆菌NMGL2活菌浓度＝发酵乳样本的植物乳杆菌NMGL2活菌数÷发酵乳样本的体积。
4℃保存不同天数时的植物乳杆菌NMGL2的活菌浓度见图3和表7。4℃条件下存放21d，植物乳杆菌NMGL2活菌浓度从3.2×1010cfu/ml下降到1.2×109cfu/ml。结果表明，发酵乳4℃存放21d后植物乳杆菌NMGL2仍具有较高的活菌数。
表7
| 植物乳杆菌NMGL2活菌浓度 | |
| 4℃保存0天 | 3.2×10<sup>10</sup>cfu/ml |
| 4℃保存1天后 | 2.6×10<sup>10</sup>cfu/ml |
| 4℃保存7天后 | 1.5×10<sup>10</sup>cfu/ml |
| 4℃保存14天后 | 6.7×10<sup>9</sup>cfu/ml |
| 4℃保存21天后 | 1.2×10<sup>9</sup>cfu/ml |
4℃保存不同天数时发酵乳样本的pH值见图4。
在储藏期间，由于外界温度和发酵乳酸度的变化，影响了植物乳杆菌NMGL2的生长，使其增殖受到抑制，活菌数和pH呈下降的趋势。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京工商大学
<120> 一株耐受低温酸性双胁迫的植物乳杆菌及其应用
<130> GNCYX192070
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
gggagggcgc gtgctataat gcagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca 60
tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag 120
cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcatggtcc 180
gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta ttagctagat 240
ggtggggtaa tggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca 300
cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360
atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa 420
ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac 480
cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540
tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct 600
tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg 660
gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720
gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca 840
gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc 900
aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc 960
gaagaaccct taccagtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg 1020
gggacaatgg atacagtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttggataa 1080
gtccgcaacg agcgcaacct tattatcagt gcagcataag tggcactctg gtgagactgc 1140
cgtgacaacc gagagtggga tgacgtcaat catcatgcct atgactgcta acacgtgcta 1200
catgatggta cacgagttgc gaacctcgcg aag 1233
Claims (10)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2，其保藏编号为CGMCC No.18495。
2.权利要求1所述植物乳杆菌NMGL2在制备发酵乳中的应用。
3.权利要求1所述植物乳杆菌NMGL2在制备细菌抑制剂中的应用；所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌和/或志贺氏菌。
4.一种细菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述植物乳杆菌NMGL2；所述细菌为沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌和/或志贺氏菌。
5.一种发酵乳的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述植物乳杆菌NMGL2接种至液态奶并发酵，得到发酵乳。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，权利要求1所述植物乳杆菌NMGL2在所述液态奶中的初始浓度为2.8×108-3×108cfu/ml。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为：37℃静置培养20-24小时。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为：37℃静置培养直至pH达到4.6。
9.如权利要求5至8中任一所述的方法，其特征在于：所述液态奶为鲜牛奶和/或鲜羊奶和/或牛乳粉溶于水得到的液态奶和/或羊乳粉溶于水得到的液态奶。
10.权利要求5至9中任一所述方法制备得到的发酵乳。
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