CN106754472A - 一株果蔬发酵用植物乳杆菌grx15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株产酸、耐酸能力强的植物乳杆菌grx15及其应用。本发明的植物乳杆菌grx15是从四川老坛酸菜中分离的益生菌菌株，保藏号CGMCC NO.7.199。该菌株性状稳定、生长繁殖迅速、产酸能力强、对不同发酵环境的适应能力强以及对亚硝酸盐的降解能力强，能够有效抑制腐败菌和病原菌且不产生生物胺，将其应用于发酵果蔬，能确保纯种发酵产品的快速、安全、风味良好，易于消费者接受。

Description

一株果蔬发酵用植物乳杆菌grx15及其应用

技术领域

本发明属于食品加工领域，具体涉及一株植物乳杆菌grx15及该菌在发酵果蔬制品方面的应用。

背景技术

泡菜作为传统的发酵蔬菜食品，有着2000多年的悠久历史，在中国许多地区都有广泛的消费市场。中国传统泡菜是各种蔬菜，如白菜、青菜和萝卜经过预处理，然后浸没在6-8％(W/V)混合各种调味成分像大蒜和八角的盐溶液中，放入泡菜坛，然后放置在环境温度(20-25℃)下发酵6-10天而成。

在其原理上来说，泡菜是以微生物主导发酵进行生产加工的传统发酵食品，富含以乳酸菌为主的优势益生菌群。泡菜的泡渍发酵是对生鲜蔬菜进行“冷加工”，常温或低温下微生物的新陈代谢活动贯穿始终，泡渍与发酵伴随着一系列复杂的物理、化学和生物反应的变化，由此赋予泡菜鲜明独特的色彩和风味，再加上制作工艺简单、原料丰富，能够极好的储存蔬菜以及保持蔬菜的营养，使得泡菜从古至今受到人们的喜爱。

在我国，泡菜的制作长期采用自然发酵的生产工艺，但是该发酵工艺有着以下多个弊端：(1)发酵周期相对较长，生产力低下；(2)受卫生条件、生产季节和用盐量影响，发酵易失败；(3)发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准化生产；(4)沿用老泡渍盐水的传统工艺，难以实现大规模的工业化生产；(5)异地生产难以保证产品的一致性；(6)亚销酸盐、食盐含量高，食用安全性差。

要将泡菜的发酵模式由传统的自然发酵方式转变为生物制剂接种发酵的现代方式，并且能更好的控制发酵过程提高产品质量和稳定性的关键在于菌种。乳酸菌的发酵性能对缩短发酵时间、提高泡菜品质、延长保质期等方面都有重要影响。因此，根据泡菜发酵特性筛选优良菌种，要求其性状稳定、生长繁殖迅速、产酸高、对不同发酵环境的适应能力强以及对亚硝酸盐的降解能力强，且不产生生物胺等，能确保纯接种快速发酵技术的成功。

另外，泡菜产品的安全性和保质期长短与病原菌和腐败菌的存在息息相关。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌的存在会严重影响蔬菜产品的安全性。因此，筛选出能够有效抑制这些腐败菌和病原菌的乳酸菌用于蔬菜的发酵生产迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于从四川老坛酸菜分离筛选出一株中出可以耐受胃肠环境，产酸高、耐酸耐盐以及降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌，并对其部分生物学特性进行研究。为后续应用于泡菜发酵生产、提升泡菜营养功能和使用安全性奠定良好基础。

本发明涉及一株植物乳杆菌grx15，该菌株已于2016年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏号：CGMCC NO.7.199。

grx15不仅具有良好的产酸性能、耐酸性和耐盐性，能迅速产酸，抑制病原微生物，具有较强的亚硝酸盐降解能力，而且菌株的鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等氨基酸脱羧 酶活性呈阴性。

本发明还公开了所述的植物乳杆菌grx15在制备发酵果蔬产品中的应用。

进一步，公开了植物乳杆菌grx15单独或者与其他乳酸菌混合作为发酵剂在制备天然发酵果蔬产品中的应用。

所述的植物乳杆菌grx15的部分生物学特性如下：

本发明的植物乳杆菌grx15最适生长温度为30℃，最适生长初始pH为6.4。

本发明的植物乳杆菌grx15具有较高的产酸能力，在MRS中培养48h后总酸含量达到2.08％，pH下降到3.76。在pH为3.0的人工胃液和肠液中的存活率分别为69.5％和60.8％；在0.1％浓度的胆盐中存活率为68.4％；对亚硝酸盐的降解率达到83％，并且耐盐能力较强，能在0-8％盐浓度中生长良好，在14％的高盐浓度下仍能生长。

本发明的植物乳杆菌grx15’对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中度抑制，抑菌圈分别为18.45mm、17.42mm、15.65mm。grx15的产酸活力从最初原始菌株的1.65％到10代时的1.56％，期间有波动性变化，但是基本保持稳定。说明grx15遗传稳定性较好。grx15的冻干存活率为81.43％。

本发明的植物乳杆菌grx15安全性较高，经过氨基酸脱羧酶试验发现，鸟氨酸、精氨酸、组氨酸等的脱羧酶活性为阴性，说明不产生生物胺，有利于提高后续发酵泡菜的安全性。

附图说明

图1为植物乳杆菌的革兰氏染色的菌体形态图。

图2为不同pH条件下乳酸菌的生长情况

图3为不同盐浓度条件下乳酸菌的生长情况

图4为本发明所用菌株生长曲线图

图5为植物乳杆菌grx15在不同温度下的生长情况

具体实施方式

1乳酸菌的分离纯化

从四川、贵州等地采集老坛酸菜、酸汤、泡青菜样品，将其在发酵容器中充分搅样混匀后，用灭菌移液器吸取泡菜汁样品于灭菌采样瓶中，旋紧螺旋帽，做好标记并记录其发酵时间，放入冰盒内冷却，在较低状态下带回实验室，转放到-80℃冰箱冻藏，并尽快进行乳酸菌的分离。

利用MRS、改良MRS、PTYG和M17等培养基结合革兰氏染色、镜检，共分离得到37株乳酸菌，其中球菌2株，杆菌35株，grx15的菌体形态如图1。

2不同乳酸菌产酸特性比较

将37株试验菌活化后接种于MRS液体培养基，30℃条件下静置培养48h，其pH和总酸含量的结果如表1所示。

表1不同菌株培养48h的pH和酸度

注：n＝3，同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)，下表同。

从表1可以看出，grx15、5-2-5-3'、3-4-5-1'、3-7-3”等17株菌在MRS培养基中培养48h后pH显著低于其他组，总酸含量显著高于其他组(P<0.05)，说明其产酸能力较强，因此对这17株菌进行下一步研究。3乳酸菌对人工胃液、肠液和胆盐的耐受能力

乳酸菌必须要能克服胃肠道环境影响，对胃酸、肠液、胆盐等具有较强的耐受性，且活菌数在106CFU/mL以上，才能在人体中发挥重要作用。乳酸菌对人工胃液、人工肠液和不同浓度胆盐的耐受性如表2所示。

表2乳酸菌在人工胃液和人工肠液中的耐受能力

由表2可知，在pH3.0的人工胃液中培养3h有13株菌的存活率均大于50％，另外，人工肠液中培养 4h有12株菌的存活率大于50％，并且培养8h后仍有2株菌存活率大于50％。其中P-3-3-2在三种情况下的存活率均最高，达到77.4％，显著高于其他菌株(P<0.05)，其次为grx15。

选取在pH3.0的人工胃液及肠液中均具有一定的耐受能力的13株菌进行胆盐耐受能力试验。

表3乳酸菌在不同胆盐浓度培养基中的胆盐耐受力

结果如表3，试验株菌在0.1％、0.3％、0.5％浓度的胆盐培养基中存活率分别大于37.93％、25.29％、7.43％。当胆盐浓度为0.1％时，有8株菌的存活率大于50％，其中grx15、5-2-5-3'和7-7-2-2的存活率显著高于其他菌株(P<0.05)；当胆盐浓度达到了0.3％时，有7株菌的存活率大于30％，其中7-7-2-2的存活率显著高于其他菌株(P<0.05)；当胆盐浓度达到了0.5％时，有10株菌存活率大于10％，其中grx15的存活率显著高于其他菌株(P<0.05)，能在人体内发挥微生态调节等作用。

综合所筛乳酸菌在pH3.0人工胃液、肠液以及0.1％、0.3％、0.5％浓度的胆盐培养基中的耐受能力，选出耐受性较高的8株菌进行下一步试验，包括7-7-2-2、grx15、5-2-5-3’、L-4-3-3、M-4-3-2、P-3-3-2、M17-6-3-2和M-14-3-3’。

4乳酸菌的耐酸性能

优良菌种应该具备对特殊酸碱环境的适应能力，图2显示了8株乳酸菌的耐酸性能。

人体胃液的pH在1.5-4.5之间变化，平均值在3左右。因此，筛选能够在pH为3的情况下生长良好的菌株对于蔬菜发酵极为有益。从图2中可以看到：pH在4.5-6.4时，8株菌都能较好地生长，pH低于4时，菌株的OD600明显下降。pH降到3时，菌株7-7-2-2、grx15、5-2-5-3’、L-4-3-3、P-3-3-2和M-14-3-3'的OD600显著大于另外2株菌(P<0.05)，生长情况良好，说明其耐酸能力比较强，所以选这6株菌进行进一步研究。

5乳酸菌对亚硝酸盐的降解能力

乳酸菌降解亚硝酸盐的能力大不相同，即使同一个种内的不同菌株之间也会有所差异。因此筛选出降解亚硝酸盐能力强的菌株作为发酵剂应用于泡菜生产，有利于降低泡菜发酵过程及最终产品的亚硝酸盐含 量，从而提高产品的安全性。

表4不同菌株在72h内对NaNO2的降解率

不同菌株对NaNO₂的降解率如表2-5所示。其中grx15、L-4-3-3、7-7-2-2和M-14-3-3'对亚硝酸盐的降解能力比较强，降解率都达到80％-85％，均能较好降解酸菜中的亚硝酸盐，提高发酵制品的食用安全性，因此对这4株菌进行下一步实验。

6乳酸菌的耐盐能力

由于泡菜中食盐一般含量较高，在发酵过程中起调味和抑菌作用，因此，研究菌种对不同盐度的适应能力可以筛选出耐盐性好的菌株满足泡菜发酵不同盐量的特殊要求。4株乳酸菌的耐盐能力图3。

图3中的数据表明，盐浓度为0％-8％的情况下4株菌都生长良好；当盐浓度达到10％时，菌株的OD值下降，但是在14％的高盐浓度下，这4株菌仍然能够生长。发酵蔬菜所用的盐浓度一般为4％-6％，因此可知此4株菌可以满足发酵要求，其中grx15耐盐性更出色，在2％-14％盐浓度范围内，OD值都显著高于其他菌株(P<0.05)。

综合以上试验结果发现，grx15具有较强的产酸能力和耐酸能力，其对人工胃液、肠液和胆盐的耐受性也高于其它菌株，且具有较强的降解亚硝酸盐的能力和耐盐性，可作为发酵泡菜的参选菌株。

7乳酸菌的鉴定

7.1API鉴定

利用API50CHL系列鉴定试剂对菌株grx15进行鉴定，鉴定结果如表5和表6所示。

表5 API50CHL系统鉴定结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

将API鉴定产生的生化图谱提交数据库进行在线比对，可以得出此株乳酸菌的菌种名称及鉴定率，结果见表6。

表6 API比对结果

7.2 16S rDNA测序鉴定

采用CTAB法提取乳酸菌DNA，以基因组DNA作为模板，采用25μL反应体系进行PCR扩增，引物为T1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID NO.1)T2(5′-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3′，SEQ ID NO.2)，均由上海生物工程公司合成。PCR反应程序为：94℃5min；94℃1min，64℃45s，72℃1min，循环35次；72℃8min。取PCR产物5.00μL与1.00μL6×Loading buffer混合，用1.00％琼脂糖凝胶电泳，100v电压30min。电泳结束后用EB染色15min，凝胶成像仪拍照观察。扩增产物委托上海生工生物工程公司进行测序。将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行在线比对以得出结果，结果如表7所示。

表7 16S rDNA比对结果

结合API及16S rDNA鉴定结果，将菌株grx15鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

8植物乳杆菌grx15的生长曲线

通过对乳酸菌进行生长曲线的测定可以了解其生长周期及生长情况。将活化3代后的植物乳杆菌grx15按3％的接种量接种到新鲜MRS培养基中，混匀并精确吸取300μL菌液到培养板中，放入自动生长曲线分析仪中，37℃培养48h，每隔2h读取数据。以OD600值为纵坐标，时间为横坐标作图，即为植物乳杆菌grx15在MRS培养基中的生长曲线。由生长曲线图可知，grx15在6h后进入对数生长期，在18h开始进入稳定期，之后OD值较为稳定。具体见附图4。

9乳酸菌的最适生长温度

将grx15按3％添加量接种于MRS液体培养基中，置于不同温度下培养24h后，观察菌株的生长情况，结果发现，30℃发酵条件下grx15发酵液的OD值显著高于其他组(P<0.05)，说明其最适生长温度为30℃，温度过高或过低都会影响乳酸菌的生长。具体见附图5。

10乳酸菌最适初始pH的测定

将grx15按3％添加量接种于MRS液体培养基中，置于不同初始pH条件下培养24h后，观察菌株的生长情况，结果见表8。

表8不同初始pH条件下菌株生长情况

由表8可以看出，grx15随着pH的升高，OD值都先上升再下降，pH为6.4时，OD值最大，为1.8865，显著高于其他组(P<0.05)，即grx15的最适生长初始pH为6.4。

11乳酸菌抑菌性试验

采用牛津杯法测定grx15的抑菌能力，结果如表9所示。

表9乳酸菌对致病菌的抑制作用

注：抑菌圈直径包含牛津杯外径(8mm)。

grx15对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌三种致病菌的抑菌圈均大于10mm并且小于20mm，表明grx15对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中度抑制。

12乳酸菌遗传稳定性

微生物传代时间一般较短，在长期连续传代过程中极易发生变异甚至死亡，因此常常造成工业菌种的退化，甚至可能使优良菌种丢失。通常，菌株的一个或多个形态特征和生理性状会在退化过程中逐渐减退或消失。这种退化是从量变到质变的过程，不是单个细胞的改变，而是整个群体特性的变化。

对两株乳酸菌进行连续传代培养，菌株在不同时间内产酸及OD值变化如下表所示。

表10菌株在不同时间内菌体产酸及OD₆₀₀值变化

由表10可以看出，菌株grx15的产酸活力从最初原始菌株的1.65％左右，到10代时的1.56％，期间有波动性变化，但是基本保持稳定。在10代的连续培养过程中，与原始菌株相比，grx15在培养基中的产酸活力并没有发生显著性变化(P>0.05)。说明菌株grx15在传代时菌株活力可以很好地维持。

培养基中光密度的变化可以总生物量的变化情况。在连续培养10代过程中，培养周期末各菌株的OD值变化情况如表所示。从中可以看出，OD值在传代过程中虽然有变化，但是没有随传代数目的变化而呈递减或递增趋势，总生物量呈波动性变化。说明菌株在一开始的适应期后，均可适应其生长环境，并基本维持总生物量相对稳定。这表明grx15和P-3-3-2在连续传代10代后总生物量仍能保持良好的稳定性。

13乳酸菌酶活性测定

生物胺是一种有害物质，确保用于发酵的乳酸菌不产生生物胺对于提高泡菜产品的安全性具有十分重 要意义。将活化好的乳酸菌接种于pH6.4的MRS液体培养基中，30℃下培养，活化3代，收集处于对数后期的菌体，测定菌株氨基酸脱羧酶活性。测定结果如表11所示。

经过氨基酸脱羧酶试验发现grx15的试验结果皆为阴性，说明不产生生物胺，有利于提高后续发酵泡菜的安全性。

表11乳酸菌的氨基酸脱羧酶试验

注：+为阳性反应，－为阴性反应。

14乳酸菌保藏试验

将grx15冻干后测定其存活率，结果如表12所示

表12乳酸菌的冻干存活率

由表12可知，grx15的冻干存活率较高为81.43％。

应用示例

实施例1：

选取成熟度高，无腐烂变质无机械损伤和虫害斑点的莲藕100.0kg，经流动水洗净附着在上面的杂质，用自动切片机去皮、切片(0.3cm-0.8cm)，再用清水冲洗干净。

在泡菜坛内加人大蒜2kg、生姜2kg、辣椒1kg、以及香料0.3kg(茴香：花椒：八角＝2:1:1)，投入预处理过的莲藕，加入90升溶有食盐2kg、白砂糖2.5kg的凉开水，接种10升的植物乳杆菌grx15发酵剂，最后水封并且定期检查坛内pH变化。泡菜水pH达3.5左右，泡菜水、莲藕泡菜的盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味，调味后包装成约500g的小袋，真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到莲藕泡菜成品。

实施例2：

在发酵罐中装入90升凉开水，添加糖2kg，盐6kg，投入100kg清水洗净去蒂的辣椒，接种植物乳杆菌grx15发酵剂10升，水封并且定期检查pH坛内变化。泡菜水pH达3.5左右，泡菜水、辣椒泡菜的盐浓度一致时泡菜成熟。出坛调味。调味后包装成约500g的小袋。然后真空密封。采用巴氏灭菌法，在85℃水浴中加热15min，取出后迅速用冷水冷却，即得到辣椒泡菜成品。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一株果蔬发酵用植物乳杆菌grx15及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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Claims (3)

1.一株果蔬发酵用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)grx15，它的保藏号为CGMCC NO.7.199。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌grx15在制备发酵果蔬产品中的应用。

3.权利要求1所述植物乳杆菌grx15单独或者与其他乳酸菌混合作为发酵剂在制备天然发酵果蔬产品中的应用。