CN107034161A - 一种产马乳酒乳杆菌及其在辣椒发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品微生物领域，特别涉及到一种高效快速降解亚硝酸盐，低产生物胺且具有抑制致病微生物的产马乳酒乳杆菌 (Lactobacillus kefiranofaciens) CICC 6287及其在新疆特色辣椒发酵中的应用。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC 14017。本发明所述的菌株在改良MRS 液体培养基中培养24 h，亚硝酸盐降解率能够达到94.8%；培养36 h，亚硝酸盐降全部降解。此外，该菌株氨基酸脱羧酶为阴性，且能够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌致病微生物。将该菌株用于新疆特色辣椒发酵，所得到发酵辣椒中亚硝酸盐的含量1.06 mg/kg，生物胺的含量为5.62 mg/kg，提高了发酵辣椒的食用安全性。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物领域，特别涉及到一种高效快速降解亚硝酸盐，低产生物胺且具有抑制致病微生物的产马乳酒乳杆菌 CICC 6287及其在新疆特色辣椒发酵中的应用。
背景技术
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，目前报道的乳酸菌超过了20个属，主要包括乳杆菌属，乳球菌属，链球菌属，片球菌属等，但它们具有一些共同的特征，包括革兰氏染色阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等。乳酸菌发酵能够产生大量的有机酸，具有耐酸和耐盐特性，亚硝酸盐降解能力，抑制致病微生物特性以及低产生物胺特性，广泛应用于果蔬发酵生产中。
蔬菜发酵是利用有益微生物的作用，控制一定生产条件对蔬菜进行加工的一种方式。蔬菜发酵属于一种冷加工方式,既能够最大程度的保持蔬菜的营养和色香味，又具有良好的感官品质，深受消费者喜爱。蔬菜发酵体系是一多种微生物相互作用的微生态环境，乳酸菌发挥着重要作用。目前由于果蔬种植过程中化肥使用量加大，果蔬中的硝酸盐残留显著增加。果蔬在腌制发酵过程中在硝酸盐还原菌的作用生成亚硝酸盐，人体摄取过量的亚硝酸盐会引起致癌、抵抗甲状腺素和智障等危害。果蔬在腌制发酵过程中在氨基酸脱羧酶的作用下积累大量的生物胺，一旦摄入过量的生物胺，会导致肾上腺素和胃酸过量分泌、心跳加快、血糖含量增加或血压升高等症状。因此，如何降低发酵果蔬中的亚硝酸盐和生物胺含量是亟待解决的技术问题，开发筛选出快速高效降解亚硝酸盐，低产生物胺的乳酸菌菌株将会成为研究的重点。本发明筛选得到的产马乳酒乳杆菌CICC 6287具有快速高效降解亚硝酸盐，低产生物胺和抑制致病微生物的特性，应用于新疆特色辣椒发酵生产中，能够降低产品中亚硝酸盐和生物胺的含量，提高发酵辣椒的食用安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一株产马乳酒乳杆菌CICC 6287，其特征在于快速高效的降解亚硝酸盐，低产生物胺，抑制致病微生物生长。
本发明的另一个目的是提供一种接种上述产马乳酒乳杆菌CICC 6287的亚硝酸盐和生物胺含量低的新疆特色发酵辣椒。
本发明在于克服现有技术的不足，通过接种能够快速高效的降解亚硝酸盐，低产生物胺，抑制致病微生物生长的产马乳酒乳杆菌CICC 6287，即可生产出亚硝酸盐和生物胺含量低的新疆特色发酵辣椒。
本发明的具体技术方案如下：
产马乳酒乳杆菌CICC 6287为实验室从新疆特色骆驼奶中分离得到的乳酸菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 14017，保藏日期为2017年4月12日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏分类命名为产马乳酒乳杆菌Lactobacillus kefiranofaciens。该菌株菌落乳白色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。菌体呈杆状，0.5-0.6 μm × 2.6-3.0 μm，成对或成堆排列，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶阴性。
产马乳酒乳杆菌CICC 6287具有较强亚硝酸盐降解能力，在MRS 液体培养基中培养24h，亚硝酸盐降解率能够达到94.8%，培养36 h，亚硝酸盐降解率达到100%，亚硝酸盐降解效率和速率都优于以往报道的产马乳酒乳杆菌菌株。产马乳酒乳杆菌CICC 6287具有较强的抑制致病微生物的能力，能够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌四种食品常见污染菌。产马乳酒乳杆菌CICC 6287氨基酸脱羧酶为阴性，在生长代谢过程中产生生物胺的能力较低。
产马乳酒乳杆菌CICC 6287具有较强亚硝酸盐降解能力，在MRS 液体培养基中培养24 h，亚硝酸盐降解率能够达到94.8%，培养36 h，亚硝酸盐降解率达到100%，亚硝酸盐降解效率和速率都优于以往报道的产马乳酒乳杆菌菌株。产马乳酒乳杆菌CICC 6287具有较强的抑制致病微生物的能力，能够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌四种食品常见污染菌。产马乳酒乳杆菌CICC 6287氨基酸脱羧酶为阴性，在生长代谢过程中产生生物胺的能力较低。
将产马乳酒乳杆菌CICC 6287应用于新疆特色辣椒的发酵过程中，所得到的发酵辣椒亚硝酸盐的含量1.06 mg/kg, 生物胺的含量为5.62 mg/kg，降低了发酵蔬菜中残留亚硝酸盐和生物胺，解决了亚硝酸盐和生物胺带来的食品安全问题；此外，接种该菌株，能够缩短辣椒发酵周期，并且发酵辣椒的总酸含量达到2.54%。
附图说明
图1示发明所述产马乳酒乳杆菌CICC 6287的扫描电镜形态
图2示发明所述产马乳酒乳杆菌CICC 6287的16S rRNA 基因系统发育树
图3示发明所述产马乳酒乳杆菌CICC 6287亚硝酸盐降解特性
图4示发明所述接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287发酵辣椒中亚硝酸盐含量
图5示发明所述接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287发酵辣椒中生物胺含量
具体实施方案
下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不
能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1 菌株CICC 6287的鉴定
本发明中的的菌株CICC 6287是从新疆传统发酵辣椒中分离筛选得到，利用形态学和分子生物学等方法将该乳酸菌鉴定为产马乳酒乳杆菌。
1、形态学鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》对CICC 6287进行形态特征和鉴定，并对其进行扫描电镜观察（图1）。MRS培养基，37℃培养24 h，菌落乳白色，圆形，表面光滑，不透明，边缘整齐。菌体呈杆状，0.5-0.6 μm × 2.6-3.0 μm，成对或成堆排列，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性。
2、16S rRNA 基因的PCR 扩增
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取乳酸菌的基因组。利用引27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 和1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 对16S rRNA基因进行扩增。PCR反应体系为：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、模板 2 μL、TaqDNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL, 补充去离子水至50 μL。反应条件: 94℃ 5 min，94℃ 50s，52℃ 50 s，72℃ 50 s，33个循环，72℃ 7 min。
3、序列分析
将所得的16S rRNA 基因和pheS基因序列用BLAST 软件与NCBI数据库进行相似性比对，运用MEGA 5.0 软件采用Neighbor Joining 方法构建系统发育树。菌株CICC 6287与产马乳酒乳杆菌处于同一个分支（图2），再结合形态学特征，鉴定为产马乳酒乳杆菌。其16SrRNA 基因序列登录号为KY694991。
实施例2 产马乳酒乳杆菌CICC 6287的特性研究
1、亚硝酸盐降解能力
按照GB 5009.33-2010：《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》测定产马乳酒乳杆菌CICC6287亚硝酸盐降解能力。1%接种量接种到含0.125 mg/ mL NaNO2的MRS培养基中，37℃培养24 h，亚硝酸盐降解率能够达到94.8%，培养36 h，亚硝酸盐降解率达到100%（图3）。
2、氨基酸脱羧酶试验
微生物代谢过程中，在氨基酸脱羧酶作用下，生成生物胺类物质。筛选氨基酸脱羧酶为阴性的菌株作为发酵剂，会降低果蔬发酵生产中生物胺的含量。氨基酸脱羧酶试验结果表明，产马乳酒乳杆菌CICC 6287对精氨酸双水解、色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶活性均为阴性。
3、抑菌能力
利用滤纸片法测定产马乳酒乳杆菌CICC 6287对肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制程度。产马乳酒乳杆菌CICC 6287过夜培养物对肠炎沙门氏菌的抑菌直径达到24.2 mm，对大肠杆菌的抑菌直径达到16.3mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径达到16.4 mm，对单增李斯特菌抑菌直径达到12.2 mm。
实施例3 产马乳酒乳杆菌CICC 6287在新疆特色辣椒发酵中的应用
选择新鲜的新疆辣椒，清洗，破碎后，加入3% 蔗糖和3% 盐，接种1%产马乳酒乳杆菌CICC 6287（108 CFU/mL），30℃恒温发酵7天，即得到发酵辣椒。将未接种乳酸菌的辣椒为对比试验组。按照GB 5009.33-2010：《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，测定发酵辣椒的亚硝酸盐含量（图4）。按照GB/T 5009.208-2008：《食品中生物胺含量的测定》，使用HPLC法对接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287的发酵辣椒和自然发酵辣椒中生物胺的种类和含量进行测定（图5）。按照GB/T 12456-2008：《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定发酵辣椒的总酸含量（表1）。
表1 发酵辣椒测定指标
| 测定指标 | 自然发酵 | 产马乳酒乳杆菌CICC 6287 |
| 亚硝酸盐（mg/kg） | 2.63 ± 0.11 | 1.06 ± 0.13 |
| 生物胺（mg /kg） | 19.36 ± 0.24 | 5.62 ± 0.11 |
| 总酸含量（%） | 2.09 ± 0.08 | 2.54 ± 0.05 |
产马乳酒乳杆菌CICC 6287用于新疆特色辣椒发酵，所得到的发酵辣椒亚硝酸盐的含量1.06 mg/kg, 低于对照组亚硝酸盐含量（2.63 mg/kg），远远低于国家标准20 mg/kg。接种菌株CICC 6287的发酵辣椒中生物胺主要为腐胺，其含量为5.62 mg/kg，大大低于对照组腐胺含量。因此接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287，能够显著降低了发酵蔬菜中残留亚的硝酸盐和生物胺含量，解决了亚硝酸盐和生物胺带来的食品安全问题。此外，接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287的发酵辣椒总酸含量2.54%，高于自然发酵辣椒中总酸含量，在生产中能够缩短辣椒发酵的周期。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国食品发酵工业研究院； 新疆中亚食品研发中心（有限公司）
<120> 一种产马乳酒乳杆菌及其在辣椒发酵中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 产马乳酒乳杆菌 Lactobacillus kefiranofaciens CICC 6287
<400> 1
gagcgagcgg aaccagcaga atcacttcgg tgaggacgct gggaaagtga gcggcggatg 60
ggtgagtaac acgtggggaa cctgccctta agtctgggat accacttgga aacaggtgct 120
aataccggat aagaaagcag ttcgcatgaa cagcttttaa aaggcggcgc aagctgtcgc 180
taaaggatgg acccgcggtg cattagctag ttggtaaggt aacggcctac caaggcagtg 240
atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc 360
gcgtgagtga agaaggtttt cggaccgtaa agctctgttg ttggtgaaga aggatagagg 420
tagtaactgg cctttatttg acggtaatca accagaaagt cacggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 540
caggcggaag aataagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaat tgcatcggaa 600
actgtttttc ttgagtgcag aagaggagag tagaactcca tgtgtagcgg tggaatgcgt 660
agatatatgg aagaatacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgcaact gacacgctga 720
ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga 780
tgagtgctaa gtgttgggag gcttccgcct ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact 840
ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900
gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 960
tagtgccatt tgtagagata caaagttccc ttcggggacg ctaagacagg tggtgcatgg 1020
ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt 1080
tattagttgc cagcattaag ttgggcactc taatgagact gccggtgaca aaccggagga 1140
aggtggggat gacgtcaagt catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200
tgggcagcac aacgagcagc gagcctgcga aggcaagcaa atctctgaaa gctgttctca 1260
gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca cgaagctgga atcgctagta atcgcggatc 1320
agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380
tctgcaatgc ccaa 1394
Claims (4)
1.一种产马乳酒乳杆菌CICC 6287，其特征在于：该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号是CGMCC 14017。
2.根据权利要求1所述的产马乳酒乳杆菌CICC 6287，其特征在于：该菌株菌体呈杆状，0.5-0.6 μm × 2.6-3.0 μm，属于革兰氏阳性菌；在改良MRS 液体培养基中培养24 h，亚硝酸盐降解率能够达到94.8%，培养36 h，亚硝酸盐降解率达到100%；该菌株氨基酸脱羧酶为阴性，并且能够抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌四种致病微生物。
3.根据权利要求1所述的产马乳酒乳杆菌CICC 6287，其特征在于：菌株CICC 6287可应用于果蔬发酵，尤其是新疆特色辣椒发酵。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：接种产马乳酒乳杆菌CICC 6287发酵的新疆特色辣椒，亚硝酸盐含量为1.06 mg/kg，生物胺的含量为5.62 mg/kg，显著低于国家食品安全标准，提高了发酵辣椒的食用安全性。
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