CN114292780A - 一株植物乳杆菌nuff0412及其应用 - Google Patents

Abstract

一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NUFF0412，于2018年11月21日保藏与中国微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:16765，其氨基酸核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。对NaCl、胆盐、胃肠液、葡萄糖有很强的耐受能力，能作为益生菌在制备萝卜泡菜、制备发酵乳制品、制备发酵豆乳制品等食品技术领域应用。植物乳杆菌NUFF0412可以对果蔬的乳酸发酵工艺进行改善，提高产品的安全性、储藏品质、风味及营养价值等。

Description

一株植物乳杆菌NUFF0412及其应用

技术领域

本发明涉属于微生物领域具体涉及到植物乳杆菌。

背景技术

益生菌(probiotics)是一类通过改善宿主肠道微生物菌群的平衡而发挥作用的活性微生物，是人体肠道重要的生理菌，能够促进肠内微生物菌群的生态平衡，具有多种生理功能，如可改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌的增殖同时抑制有害菌的生长、提高机体免疫力，可防治高血脂、高血压、高血糖等。近年来益生菌在功能食品中的开发应用逐渐成为一个研究热点，同时消费者也越来越意识到益生菌对人体健康的重要作用。益生乳酸菌是益生菌中最重要的一族，其在食品中的应用很广泛。

乳酸菌在果蔬发酵领域中应用最为广泛的就是乳酸菌发酵蔬菜，乳酸菌发酵蔬菜以其独特的风味和丰富的营养吸引着国内外众多的消费者。蔬菜中含有丰富的营养成分，包括维生素、纤维素和矿物质等，这些成分在加工过程中又容易流失，而乳酸菌发酵的“冷加工”方法对蔬菜营养成分和色泽的保持极为有利。同时，泡菜中含有大量的乳酸菌，进入人体消化道后，通过促进肠胃蠕动，可以缓解便秘，经常食用泡菜还有降血脂、增强机体免疫力的作用。随着对乳酸菌发酵蔬菜日益广泛和深入的研究与开发，传统食品已成为新兴的现代化食品工业。另外，除发酵蔬菜外，乳酸菌发酵果蔬汁是近年发展起来的一类新型饮料。因其同样具有良好的风味和营养保健价值，乳酸菌发酵果蔬汁的研制和开发在丰富饮料市场、蔬菜增值等方面都有广阔的前景。

但是，在果蔬发酵食品加工制作过程中会有危害性物质产生如硝酸盐、生物胺及亚硝基化合物等，带来潜在的安全性问题。目前，随着食品安全事件的不断发生，消费者对食品安全问题的日益关注，政府以及各个食品企业都在致力于改善食品的安全性，保证食品健康无危害。其中泡菜中关于亚硝酸盐的安全问题也受到了广泛的关注。硝酸盐、亚硝酸盐普遍存在于自然环境中，是自然界中最普遍的含氮化合物，并且在一定的条件下可以相互转化。硝酸盐对人体没有直接的危害作用，但它一旦进入人体之后就会在人体的酶和微生物作用下经过一系列的生物化学反应转变为有毒的亚硝酸盐，成人摄入0.2-0.5g即可引起中毒，3g即可致死。亚硝酸盐与胃肠中次级胺结合，形成强致癌性的亚硝胺，从而诱发消化道系统癌变，还有引起遗传变异和畸形儿的潜在危险。如果累积量过多，与人体血液作用，可形成高铁血红蛋白，从而使血液失去携氧功能，使人缺氧中毒，严重者甚至死亡。亚硝酸盐是食品添加剂中急性毒性最强的物质之一，因此，含有亚硝酸盐的果蔬发酵食品就成为人们需要关注、研究和改进的焦点之一。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一株能够应用于果蔬发酵食品技术领域的植物乳杆菌NUFF0412。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为植物乳杆菌NUFF0412提供一种新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NUFF0412，于2018年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:16765，其氨基酸核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

植物乳杆菌NUFF 0412在制备萝卜泡菜中的用途。

植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵乳制品中的用途。

植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵豆乳制品中的用途。

本发明公开一株植物乳杆菌NUFF0412，可以对果蔬的乳酸发酵工艺进行改善，提高产品的安全性、储藏品质、风味及营养价值等。

植物乳杆菌NUFF0412能够高产乳酸高降解亚硝酸盐，产酸量为106.05g/L，亚硝酸盐降解率为97.28％。该菌株经对胃液耐受性试验、对肠液耐受性试验、对胆盐耐受性试验、对NaCl耐受性试验、对葡萄糖耐受性试验，实验结果表明，植物乳杆菌NUFF0412对NaCl、胆盐、胃肠液、葡萄糖有很强的耐受能力，能够作为益生菌用于食品领域。

附图说明

图1为植物乳杆菌NUFF0412的菌落形态。

图2为植物乳杆菌NUFF0412在显微镜下(放大倍数400倍)的细胞形态。

图3为植物乳杆菌NUFF0412的生长曲线。

图4为温度对植物乳杆菌NUFF0412菌体生长的影响。

图5为pH对植物乳杆菌NUFF0412菌体生长的影响。

图6为植物乳杆菌NUFF0412在模拟胃液中的存活率。

图7为植物乳杆菌NUFF0412在模拟肠液(pH 8.0)中的存活率。

图8为NaCl对植物乳杆菌NUFF0412菌体生长的影响。

图9为葡萄糖对植物乳杆菌NUFF0412菌体生长的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于下述的实施方式。

实施例1

一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NUFF0412，于2018年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No:16765，其氨基酸核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

上述的植物乳杆菌NUFF0412的筛选方法由以下步骤组成：

1、初筛

在陕南地区共采泡菜汁样品33份，将低温保存的泡菜液稀释至10³、10⁴、10⁵倍，分别以灭菌的移液枪取1mL，用平板倾注法培养于含有质量浓度为0.5％CaCO₃的MRS固体培养基上，37℃培养48小时，观察菌落的生长情况。

在无菌条件下挑取所有培养基上，最先长出且周围出现较大溶钙圈的菌落，采用平板划线法获得单菌落，再将分离出、具有典型乳酸菌性状的菌种转移到含有质量浓度为0.5％CaCO₃的MRS固体培养基上，37℃培养48小时，重复2-3次。选择生长状况良好的菌株，对其进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，将革兰氏染色呈阳性反应、过氧化氢酶试验呈阴性反应且最先长出、溶钙圈大的菌株转接到质量浓度为50％的甘油MRS液体培养基，-80℃保藏，保存备用。

2、复筛

在无菌条件下，将初步筛选的菌株置于无菌的pH为7的MRS液体培养基中，摇晃混匀，并用封口膜以及皮筋密封瓶口，形成厌氧环境，随后置于恒温培养箱中，37℃进行培养，以每毫升菌液浓度为1×10⁸进行接种，37℃培养24小时。离心，去除菌体，稀释后测定产酸量。同前述，将初步筛选的菌株置于无菌的pH为7的液体MRS培养基，加入200ug/mL的亚硝酸钠，37℃培养48小时，测定亚硝酸盐含量。取降解亚硝酸盐最高同时产酸量最高的菌株，命名为NUFF0412。

植物乳杆菌NUFF0412为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态呈圆形，乳白色不透明，表面光滑，有凸起，边缘整齐，不产生色素，挑取能拉丝。菌株细胞形态为短杆状。菌落形态见图1。在显微镜下(放大倍数400倍)的细胞形态见图2。

对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，以2％的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃培养2小时，开始进入对数生长期，培养12小时到达稳定期，活菌数可达到10⁸CFU/mL。植物乳杆菌NUFF0412的生长曲线见图3。

取对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，按接种量2％接种，分别在17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、38℃、42℃、47℃培养18小时，测定其菌液OD_600nm值。测试结果表明，菌株在温度为22-42℃范围内均可以生长，37℃生长最好，说明NUFF0412生长最适温度为37℃。见图4.

以HCl(1mol/L)调节MRS液体培养基不同pH值，取对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，以2％的接种量接种，混合均匀，37℃培养18小时，测定其菌液OD_600nm值。在pH为5.0-6.0时，OD_600nm值最高，说明植物乳杆菌NUFF0412生长最适pH为5.0-6.0，见图5。

3、菌株鉴定

将植物乳杆菌NUFF0412送往华大基因生物公司进行16S rDNA测序，并经过BLAST对比分析其与Lactobacillus plantarum亲源关系最近。故可确定植物乳杆菌NUFF0412为Lactobacillus plantarum，其氨基酸核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

实施例2

植物乳杆菌NUFF 0412在制备萝卜泡菜中的用途，其使用方法如下：

(1)制备泡菜卤水

制备泡菜卤水1000mL按下述质量配比的原料制成：

白糖20g 食盐10g 生姜10g

大蒜10g、 八角0.5g

水加至 1000mL

其制备方法如下：

将上述制备泡菜卤水的原料煮沸15分钟，加开水至1000mL，自然冷却，制备成泡菜卤水。

(2)制备萝卜条

将新鲜无伤萝卜，洗净，晾干，切条，称取萝卜条，装入泡菜坛内，将泡菜卤水加入到泡菜坛内，1000g萝卜条加入1000mL泡菜卤水、10mL菌落数为(0.8～1)×10⁹cfu/mL的植物乳杆菌NUFF 0412菌液，加水至萝卜条浸没密封。

(3)制备萝卜泡菜

泡菜坛置于室温下密闭发酵5～7天，制备成萝卜泡菜。

本发明植物乳杆菌NUFF 0412在制备萝卜泡菜中的用途，仅仅是一个实施例，植物乳杆菌NUFF 0412也可在制备黄瓜泡菜中的用途，在制备包菜泡菜中的用途，在制备芹菜泡菜中的用途，也可用于制备其它蔬菜泡菜，只是对蔬菜的品种做简单的替换，均在本发明的保护范围之内。

实施例3

植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵乳制品中的用途，其使用方法如下：

(1)料制备全脂复原乳

按下述质量百分比的原料制备全脂复原乳：

(2)制备发酵乳制品

将上述的原料加入到加热锅内搅拌加热，煮沸杀菌，自然冷却至42℃，在1000mL全脂复原乳中加入10mL菌落数为(1.8～2)×10⁹cfu/mL的植物乳杆菌NUFF 0412菌液，发酵12小时，制备成发酵乳制品。

实施例4

植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵豆乳制品中的用途，其使用方法如下：

(1)液备菌悬液

将植物乳杆菌NUFF 0412接种于MRS液体培养基中，活化3代，6000转/分钟离心15分钟，菌体用灭菌生理盐水洗涤3次，制成菌悬液备用。

(2)制备豆浆

大豆去杂，100℃水热烫灭酶4分钟，用质量浓度为0.5％NaHCO₃溶液浸泡12小时，用水清洗去皮，加入到磨浆机，再加入水，豆水质量比为7：1，80℃热水磨浆，过滤，加7％白砂糖调浆，浆液均质，121℃杀菌15分钟，制备成豆浆。

(3)制备发酵豆乳制品

在1000mL豆浆中加入10mL菌落数(4.5～5)×10⁹cfu/mL的植物乳杆菌NUFF0412菌液，发酵8小时，制备成发酵豆乳制品。

为了确定植物乳杆菌NUFF0412的有益效果，发明人采用本发明实施例1的植物乳杆菌NUFF0412进行大量的实验室研究实验，各种实验情况如下：

1、模拟植物乳杆菌NUFF0412对胃液耐受性试验

用PBS(pH 3.0)配置浓度为3g/L的胃蛋白酶，过0.22μm滤膜后制备成模拟胃液。将植物乳杆菌NUFF0412以无菌生理盐水重悬，并将其菌液密度在模拟胃液(pH 3.0)中调节至1×10⁹CFU/mL，混匀，37℃培养1、2、3小时，检测活菌数。植物乳杆菌NUFF0412在人工模拟胃液(pH 3.0)中随时间延长，活菌数下降，在3小时时植物乳杆菌NUFF0412的存活率大于85％，存活率用以下公式计算：

存活率(％)＝log cfu N₁/log cfu N₀×100％

N₁＝经过模拟胃肠液处理后的活菌数

N₀＝未经胃肠液处理前的活菌数

植物乳杆菌NUFF0412具有耐受胃液的能力，见图6

2、模拟植物乳杆菌NUFF0412对肠液耐受性试验

用PBS(pH 8.0)配置浓度为1g/L的胰蛋白酶，过0.22μm滤膜后制备成模拟肠液。取实施例1中含菌模拟胃液(pH 3.0)3的培养液1mL加入至9mL的模拟肠液(pH 8.0)中，充分混匀，在37℃培养2、4、6、8h后检测活菌数。NUFF0412在人工模拟肠液(pH 8.0)中随时间延长，活菌数下降，在8小时时存活率大于92％。乳酸菌的存活率计算与实验1相同，结果见图7。

3、植物乳杆菌NUFF0412对胆盐耐受性试验

取对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，以2％的接种量分别接种于含有或不含0.3％胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2％的巯基乙酸钠)培养中，混合均匀，37℃培养，其延迟时间如表1，植物乳杆菌NUFF0412对于胆盐的延迟时间为0.96小时。说明此菌株对胆盐具有很好的耐受性。

表1胆盐对植物乳杆菌NUFF0412生长的作用

由表1可见，植物乳杆菌NUFF0412对胆盐具有很好的耐受性。

4、植物乳杆菌NUFF0412对NaCl耐受性试验

取对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，以2％接种量分别接入到NaCl质量分数为0％、2％、4％、6％、7％、8％、10％的MRS液体培养基中，充分混合均匀，37℃培养18小时，测定其菌液OD_600nm值。当NaCl的质量浓度超过2％，菌株的生长能力急剧下降。NaCl的浓质量度为10％时，植物乳杆菌NUFF0412仍然可以存活，见图8。

5、植物乳杆菌NUFF0412对葡萄糖耐受性试验

取对数生长期的植物乳杆菌NUFF0412，分别依照2％的接种量置于添加了不同浓度葡萄糖(10％、20％、30％、40％、50％、60％)的液体培养基中，37℃培养20小时，于600nm波长测菌液的OD值。随葡萄糖浓度提高，OD值缓慢下降，当葡萄糖浓度达30％时，植物乳杆菌NUFF0412生长能力大幅度下降，当葡萄糖浓度高达60％时仍能生长。说明植物乳杆菌NUFF0412对葡萄糖耐受能力良好，见图9。

序列表

<110> 陕西师范大学

<120> 一株植物乳杆菌NUFF0412及其应用

<141> 2021-12-27

<150> 2020116259933

<151> 2020-12-31

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

gcatgctata atgcaagtcg acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac 60

atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat 120

aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagcttga 180

aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt 240

aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga 300

ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga 360

aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg 420

ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc 480

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt 540

tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca 600

accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca 660

tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg 720

gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt 780

agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca 840

gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat 900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc 960

ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg 1020

gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080

aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc 1140

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200

gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat 1260

ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat 1320

cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380

cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca 1440

gccgcctaag gtgatc 1456

Claims (4)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NUFF0412，于2018年11月21日保藏与中国微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo:16765，其氨基酸核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1的植物乳杆菌NUFF 0412在制备萝卜泡菜中的用途。

3.权利要求1的植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵乳制品中的用途。

4.权利要求1的植物乳杆菌NUFF 0412在制备发酵豆乳制品中的用途。

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