CN102994420A - 一株具有ace抑制活性的耐低温乳酸菌 - Google Patents
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Abstract
一株具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它涉及一株乳酸菌。具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)I1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCCNo.6575。本发明中菌株I1，其ACE抑制率为66%，能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亚硝酸盐并能迅速产酸；它的生长温度为4～40℃，适用于低温发酵；它具有显著的蛋白酶活性，脂肪酶活性，不产粘液，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌效果明显，可以作为低温条件下肉制品发酵剂菌株使用。
Description
技术领域
本发明涉及一株乳酸菌。
背景技术
高血压是世界性难题，影响15-20% 的成年人健康。在控制人体血压的多种因素中，肾素——血管紧张素调节系统(Renia-angiotensin system，RAS)和激肽释放酶——激肽系统(Kallikrein-kininsystem，KKS)是人体内两种重要的调节系统。其中血管紧张素转换酶(ACE)是系统调节过程中起关键作用的酶，是使血压升高的主要因素。抑制ACE的活性，就能有效的防治和治疗高血压的发生。
筛选具有ACE抑制活性微生物的研究以及使其生产具有降血压功能多肽的食品主要集中在对乳制品的研究上。然而，筛选具有ACE抑制活性，具有耐低温、耐盐及耐亚硝酸盐等特性，适合用于发酵肉制品发酵剂的菌种还未见报道。
现有的植物乳杆菌通常为3.0 
～8.0 长，0.9 
～1.2 
宽；形成菌落约3
宽、凸起、圆、光滑、细密、白色、偶尔浅黄或深黄色；能产生乳酸，使牛奶酸化，并可能使之凝固；在15℃生长，通常最适温度为30℃～35℃（R.E., N.E. 伯杰细菌鉴定手册）；目前也尚未有植物乳杆菌具有ACE抑制活性的报导。
目前为止还未有植物乳杆菌ACE抑制活性测定的报导，也没有将其作为肉制品发酵剂菌株开发的相关报导，更没有筛选出具有ACE抑制活性并能作为低温发酵肉制品的植物乳杆菌菌株的报导。
发明内容
本发明目的是提供一株具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌。
本发明具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No.6575。
本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，它在MRS琼脂培养基中生长良好，菌落为针尖样湿润圆形小菌落、乳白色、边缘整齐；它为革兰氏阳性杆菌，无芽孢，大小为长(1.0 ～4.3 
)×宽(0.4 
～0.8 
)。
本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，其在含溴甲酚绿的MRS液体培养基中产酸为阳性、呈黄色，其葡萄糖发酵产酸为乳酸，还原石蕊牛奶呈阳性；植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1具有显著的蛋白酶活性，脂肪酶活性，不产粘液，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌效果明显，对志贺氏菌和沙门氏菌有抑菌效果。
本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，它的生长温度为4～40℃，最适生长温度为37℃；它在浓度为0.5%～6%的食盐中正常生长，在浓度为2%～4%的食盐中有最大生长量；它能在含亚硝酸盐100～300 mg/kg的亚硝酸盐培养基中生长，当亚硝酸盐为100mg/kg时生长最好。
本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，其ITS序列与GenBank中登录的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB617650.1的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性为99.9%，确定植物乳杆菌I1为乳杆菌属中植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 。
本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No.6575。
本发明具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，对ACE的抑制率为66%。它能耐受6%的NaCl及100mg/kg的亚硝酸盐并能迅速产酸。它的生长温度为4～40℃，最适生长温度为37℃，适用于低温发酵。同时，它具有显著的蛋白酶活性，脂肪酶活性，不产粘液，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌效果明显，对志贺氏菌和沙门氏菌有抑菌效果，因此，本发明中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，即植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1可以作为低温条件下肉制品发酵剂菌株使用。
附图说明
图1为具体实施方式一中纯菌株I1连接到pMD19-T载体中的PCR鉴定结果图，其中1-7泳道分别为I1的7个转化菌落PCR产物，M泳道为DNA Marker；
图2为具体实施方式一中纯菌株I1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB617650.1的16S基因序列分析结果图；
图3为具体实施方式一中纯菌株I1的耐氯化钠结果的柱状图；
图4为具体实施方式一中纯菌株I1的耐亚硝酸盐结果的柱状图；
图5为具体实施方式一中纯菌株I1的生长与温度关系的曲线图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No.6575。
本实施方式中具体的保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。
本实施方式中具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，该菌株自大庆新百大超市购买的泡菜中分离纯化得到，其样本现存于黑龙江八一农垦大学食品学院微生物实验室；它按以下步骤进行分离纯化培养：泡菜用稀释涂布法接种于MRS琼脂培养基中，37℃培养24h，然后将生长出的菌落用MRS琼脂培养基进一步分离纯化得到纯菌株，命名为纯菌株I1[即植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1]。
MRS琼脂培养基（g/L）：蛋白胨 10g、牛肉粉 8g、酵母粉 4g、葡萄糖 20g、磷酸氢二钾 2g、柠檬酸氢二铵 2g、乙酸纳 5g 、硫酸镁 0.2g 、硫酸锰 0.04g 、吐温80 1g 、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL 、pH 5.7±0.2 ，118℃ 灭菌 15 分钟。
MRS 肉汤培养基（g/L）：按上述配方去掉琼脂。培养条件如上。
的测定：
纯菌株I1接种到MRS肉汤培养基中，37℃培养24h，取培养液离心（4000rpm, 5min）后取上清液用NaOH调整pH值到8.3，根据表1，将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入1moL/L HCl以终止反应，然后各试管中加入乙酸乙酯1.5mL，旋涡混合后进行离心（4000rpm, 10min）；吸取1.0mL乙酸乙酯于另一试管中，放入真空烘箱中，100℃挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合后用紫外分光光度计在228nm测定其吸光值，按以下公式计算ACE抑制率。
式中：Aa为样品a 的光密度值，样a在反应中加抑制剂，是ACE与HHL同时反应的样品；Ab为样品b的光密度值，样b 在反应中不加抑制剂，反应结束后添加抑制剂以维持整个反应体系平衡，是ACE与HHL完全反应的对照；Ac为样品c的光密度值，样c在反应前先失活ACE，再加抑制剂，是ACE 与HHL反应的空白。
结果：纯菌株I1具有ACE抑制活性，ACE抑制率可达到66%。
微生物鉴定：
本实施方式中纯菌株I1在MRS琼脂培养基中生长良好，菌落为针尖样湿润圆形小菌落、乳白色、边缘整齐；它为革兰氏阳性杆菌，无芽孢，大小为长(1.0 
～4.3 
)×宽(0.4 
～0.8 
)。
本实施方式中纯菌株I1其在含溴甲酚绿的MRS液体培养基中产酸为阳性、呈黄色，葡萄糖发酵产酸为乳酸，还原石蕊牛奶呈阳性。
分子生物学鉴定：
从纯菌株I1转化平板挑取7个菌落，进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。I1中1、3-6得到大小约1500bp的条带明显，证明I1连接到pMD19-T载体中(图1)。经测定重组质粒I1的ITS序列长度为1515bp（包括上下游引物），与GenBank中登录的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AB617650.1的基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性为99.9%（见图2），确定纯菌株I1为乳杆菌属植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
发酵特性：
选取ACE抑制率大于65%的菌株，以1%接种量分别接种于添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%食盐的MRS肉汤培养基中，37℃培养48h后，450nm测定其OD值，比较微生物生长情况，并以不加食盐的相应培养基作空白对照。
把纯菌株I1接种于添加100、150、200、250及300mg/kg NaNO2的MRS肉汤培养基中，37℃培养48h后，450nm测定OD值，比较其生长情况，以不加NaNO2的相应液体培养基作空白对照。
结果，纯菌株I1能耐食盐，在浓度为2%～4%的食盐中有最大生长量，在6%食盐中也能正常生长。发酵肉制品中食盐的添加量通常为2.5～6.0%。Dlbel认为发酵剂菌种应该具有食盐耐受性，即在浓度为6.0%的食盐中微生物仍能正常生长。纯菌株I1在含6％NaCl的液体培养基中，生长良好，吸光度值达到1.717（见图3）。
纯菌株I1能在含亚硝酸盐100～300 mg/kg MRS肉汤培养基中生长，其中当亚硝酸盐为100mg/kg时，生长最好（见图4）。发酵肉制品，例如香肠(干发酵香肠除外)一般添加亚硝酸盐浓度可达到150mg/kg，而干发酵香肠通常加入硝酸盐添加量为200～600mg/kg，甚至更高一些。但在加工过程中，起发色和抑菌作用的主要是亚硝酸盐，筛选菌株必须具有良好的亚硝酸盐耐受性。同时做为发酵剂菌种，必须能在100 mg/kg亚硝酸盐介质中正常生长。
可见，纯菌株I1既能在6%食盐中，又能在100mg/kg NaNO2的相应液体培养基中生长，符合对发酵剂菌种的要求。
产酸速度：
将活化后的纯菌株I1的菌液按5%的接种量接种到MRS肉汤中，37℃培养后，在450 nm处，以空白培养基做对照，分别测其在0、2、4、6、16、18、20、22h 培养基pH值；结果见表2，纯菌株I1做为一种产酸菌，在0h～22h的生长过程中，能将培养基的pH在6小时内迅速地从5.05降到4.62，至22h时pH已降到4.36，即纯菌株I1产酸速率较快。产酸速率是衡量菌株发酵能力强弱的重要指标，菌株具备足够的产酸速度才能有效抑制有害微生物的生长。腐败菌及肠道有害菌正常生长一般在碱性条件下，在酸性条件下其生长会受到抑制，因此在肉制品的发酵生产过程中，纯菌株I1能够抑制这部分有害菌的生长，达到长期保藏肉制品的目的。
最适生长温度的确定：
纯菌株I1，以5%的接种量分别接种到MRS肉汤培养基中，在4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃和40℃的培养箱中培养24h后，在450nm处测定其OD值，确定菌株最适生长温度。
结果，纯菌株I1的生长状态跟温度密切相关，其OD值会随着温度的变化发生变化（见图5），纯菌株I1的生长温度为4～40℃，最适生长温度为37℃，这说明纯菌株I1可适用于低温发酵。
菌株性能测试：
a. 蛋白酶活性检测：将乳酸菌在酪蛋白培养基I上分离划线，37℃培养48h后观察结果，若酪蛋白被分解，菌落周围则出现透明圈。
b. 脂肪酶活性检测：将乳酸菌在脂肪酶活性检测培养基I上分离划线，37℃培养48h后观察结果。如平板上出现红色透明斑点，即为阳性，表明其具有脂肪酶活性。
c. 产粘性试验：将乳酸菌接入MRS固体培养基，37℃培养24h后，用接种针挑取菌落，观察有无粘丝出现，若有即可判定所检测菌株产粘，若无则判定该菌株不产粘。
d. 微生物抑菌实验：37℃，24h活化大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌及金黄色葡萄球菌后，将其分别制成菌悬液。采用牛津杯法，研究乳酸菌对上述四种微生物的抑菌效果。
酪蛋白培养基I：酪蛋白1g，葡萄糖0.2g，酵母浸膏0.2g，磷酸氢二钾0.8g，磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.02g，琼脂粉4g，蒸馏水200mL，pH6.5±0.2。
脂肪酶活性检测培养基I：15％猪油、0.2 g中性红指示剂、100 mL MRS琼脂培养基。
结果见表3，纯菌株I1具有显著的蛋白酶活性，脂肪酶活性，不产粘液，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌抑菌效果明显，对志贺氏菌和沙门氏菌有抑菌效果。
Claims (1)
1.一株具有ACE抑制活性的耐低温乳酸菌，其特征在于它为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)I1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年9月18日，保藏编号为CGMCC No.6575。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |