ES2314407T3 - Clon sin plasmido de la cepa dsm 6601 de e. coli. - Google Patents
Clon sin plasmido de la cepa dsm 6601 de e. coli. Download PDFInfo
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Abstract
Clon sin plásmido de la cepa DSM 6601 de Escherichia coli. Procedimiento para preparar un clon sin plásmido según la reivindicación 1, caracterizado por las siguientes etapas: a) introducir un gen de resistencia en los plásmidos pMut1 y pMut2, b) introducir el gen sacB en los plásmidos obtenidos en la etapa a), c) introducir los plásmidos obtenidos en la etapa a) en la cepa DSM 6601 de E. coli y cultivar la cepa en condiciones en las que los plásmidos pMut1 y pMut2 de procedencia natural son desplazados por los plásmidos obtenidos en la etapa b); y d) cultivar los clones obtenidos en la etapa c) en condiciones que sólo permiten esencialmente un crecimiento de bacterias a las que les falta el gen sacB.
Description
Clon sin plásmido de la cepa DSM 6601 de E.
coli.
La invención se refiere a un clon sin plásmido
de la cepa DSM 6601 de E. coli, a un procedimiento para su
preparación, así como al uso de las bacterias así obtenidas como
vehículo de clonación.
La E. coli, una bacteria que se produce
en la naturaleza, especialmente en el intestino humano y animal, ya
es desde hace tiempo objeto de intensas investigaciones
microbiológicas y de ingeniería genética y en la ingeniería
genética se utiliza especialmente para la clonación y/o la expresión
de determinados genes o proteínas.
La mayoría de las cepas del género Escherichia
son patógenas fuera del lumen intestinal y en general producen
infecciones en los sitios infectados. Una cepa apatógena del género
Escherichia coli es la cepa DSM 6601 depositada en la
Colección alemana de microorganismos, que se desvía en algunas
características genéticas de todas las cepas de E. coli
restantes. Sin embargo, se ha mostrado que esta cepa sólo puede
manipularse genéticamente bajo difíciles circunstancias y en
absoluto parcialmente y por tanto no puede utilizarse como un simple
agente de clonación.
La DSM 6601 de E. coli contiene
naturalmente dos plásmidos que se denominan pMut1 o pMut2 y
presentan un tamaño de 3177 o 5552 kb. Estos plásmidos y sus
secuencias de ADN se describen, por ejemplo, en el documento
US-6.391.631.
Partiendo de la consideración de que la
patogenia o apatogenia de bacterias de E. coli se controla
evidentemente parcialmente por sus plásmidos y la consideración
adicional de que la "resistencia genética" de las cepas de
E. coli que parcialmente se produce también podría estar
relacionada con sus plásmidos crípticos, el objetivo de la
invención se basa en desarrollar una cepa de E. coli sin
plásmido que, aparte de en lo referente a su ADN genómico, sea
genéticamente completamente idéntica a la cepa original.
El objetivo anterior se alcanza proporcionando
un clon sin plásmido de la cepa DSM 6601 de E. coli, así como
mediante un procedimiento para preparar un clon de este tipo.
En las figuras,
la Fig. 1 muestra en forma esquemática la forma
de proceder para preparar el clon sin plásmido de la cepa DSM
6601;
la Fig. 2 muestra el mapa físico del plásmido
pMut1-Tc;
la Fig. 3 muestra el mapa físico del plásmido
pMut2-Kn.
Durante las largas investigaciones que llevaron
a la presente invención se ha mostrado que los clones sin plásmido
de la cepa DSM 6601 no pueden prepararse en absoluto con
procedimientos de ingeniería genética normales o sólo con grandes
dificultades, de manera que para generar clones de este tipo deben
tomarse rutas especiales. Debido a que el tipo salvaje de la cepa,
además de su ADN genómico, presenta dos plásmidos de diferente
tamaño, la eliminación de estos plásmidos debe realizarse en varias
etapas que transcurren en parte en paralelo.
Para la preparación de los clones según la
invención, los plásmidos pMut1 y pMut2 existentes naturalmente en
la cepa DSM 6601 de E. coli se marcan según el procedimiento
según la invención en una primera etapa respectivamente con una
resistencia a antibióticos. Además, los plásmidos se aíslan según
procedimientos habituales y el gen de resistencia se introduce en
una posición deseada. Según una forma de realización preferida, el
gen de resistencia se introduce junto con un casete de expresión en
el plásmido respectivo que contiene un promotor que puede ser
constitutivo o también inducible.
Los plásmidos así obtenidos se introducen luego
según procedimientos habituales, por ejemplo el procedimiento de
CaCl_{2} o electroporación, en un huésped adecuado y allí se
clonan facilitando el gen de resistencia introducido en el plásmido
respectivo la selección de las células huésped que llevan el
plásmido. Un huésped adecuado para la clonación del plásmido que
lleva un gen de resistencia es, por ejemplo, las cepas DH5\alpha
de E. coli o HB101 de E. coli.
Los plásmidos que llevan el gen de resistencia
se aíslan y a continuación se introduce el gen sacB en los
plásmidos para proporcionar otro marcador.
Los plásmidos así obtenidos o marcados se
introducen entonces en la cepa DSM 6601 de E. coli.
Después de la transformación, la DSM 6601 de
E. coli se cultiva en un medio que contiene el
antibiótico/los antibióticos para el/los que los genes de
resistencia, que se introdujeron en las etapas precedentes en los
plásmidos, confieren resistencia.
Mediante el cultivo en un medio de este tipo
sólo crecen clones que son resistentes a los antibióticos contenidos
en el medio nutriente. Además, las bacterias, debido a que ya no
necesitan más los plásmidos pMut1 y pMut2 originarios para su
crecimiento, pierden material genético en exceso, de manera que
finalmente las bacterias sólo contienen los plásmidos pMut1 y pMut2
modificados (que contienen el gen/los genes de resistencia y el gen
sacB).
En otra etapa, las bacterias así cultivadas se
transfieren a un medio nutriente que inhibe el crecimiento de
bacterias que contienen sacB ejerciéndose una presión de
selección que esencialmente sólo permite el crecimiento de
bacterias que han perdido el gen sacB. Esto puede realizarse
mediante cultivo de la cepa a 30ºC en presencia de sacarosa al 10%,
ya que a condiciones de este tipo sólo pueden replicarse aquellos
clones que han perdido el plásmido que lleva el gen sacB.
Como consecuencia se obtiene un derivado sin
plásmido de la cepa DSM 6601. Se ha encontrado ahora que los clones
según la invención, con la condición de la pérdida de los plásmidos,
no han experimentado ningún tipo de modificación del ADN genómico y
pueden utilizarse de manera sorprendentemente buena como vehículo de
clonación.
Por esto pueden utilizarse sin riesgo en el
laboratorio como células huésped para la clonación o la expresión
de una pluralidad de genes o proteínas. Experimentos con la cepa DSM
6601 \DeltapMut1/2 según la invención han mostrado que es un
aceptor especialmente bueno para ADN alógeno cuando éste se integra
en sus propios plásmidos presentes en forma aislada, es decir, por
tanto, los propios plásmidos hacen de vectores de clonación para el
ADN alógeno. Además, debido a que se derivan de una cepa apatógena,
pueden utilizarse para el tratamiento de trastornos del tracto
gastrointestinal en animales y el ser humano. Además, si se desea,
pueden transformarse con genes alógenos que potencian la adhesión
de las bacterias a la mucosa, como por ejemplo adhesinas que
potencian la adhesión de las bacterias a la mucosa, dado el caso
específicamente para animales huésped, por ejemplo, ganado vacuno
y/o cerdos y con ello impedir o evitar el crecimiento otros
microorganismos patógenos.
La presente invención se explica ahora
adicionalmente con referencia a los ejemplos.
Los dos plásmidos pMut1 y pMut2 de procedencia
natural del tipo salvaje DSM 6601 se aíslan según el protocolo de
Midiprep de plásmidos de QIAGEN (QIAGEN Plasmid Purification
Handbook 12/2002, páginas 16-20).
Para el marcado del plásmido pMut1 se seleccionó
el casete con resistencia a tetraciclina derivado del vector
pBR322. El promotor correspondiente se extrajo del plásmido pASK75.
El plásmido resultante de esta clonación se denominó
pKS-tetA^{tetp/o}. El inserto
tetA^{tetp/o} (tamaño del inserto 1,5 kb) se cortó con las
enzimas de restricción XbaI y HindIII. El fragmento
XbaI/HindIII se insertó en el plásmido pMut1 mediante
un sitio de corte de restricción NdeI.
Para esto, después de la digestión de la
restricción de los plásmidos con las enzimas correspondientes, la
mezcla de restricción se purificó mediante una columna (Quiagen, PCR
Purification Kit) y se sometió a un tratamiento con Klenow para
formar "extremos romos". Para evitar un religamiento del
plásmido pMut1, se realizó una desfosforilación del plásmido
linealizado con la enzima de restricción NdeI y tratado con
la enzima de Klenow. A continuación se ligó el vector pMut1 y el
inserto tetA^{tetp/o} y con esto la cepa
K-12 de E. coli se transformó en
DH5\alpha.
Para la preparación de células competentes, 150
ml de medio LB (medio Luria-Bertani) se inocularon
con 1,5 ml de un cultivo ÜN y se agitó a 37ºC hasta una DO_{600}
= 0,5. Después se incubó el cultivo de bacterias 20 minutos sobre
hielo y se centrifugó 10 minutos con 4000 rpm a 4ºC. El sedimento de
bacterias se lavó 3 x en glicerina al 10% estéril fría en hielo,
primero con el 100%, luego con el 50% y por último con el 10% del
volumen de partida. Para terminar, el sedimento lavado se
resuspendió en 300 \mul de glicerina al 10%, se tomaron alícuotas
(40 \mul) y se guardó a -80ºC. Para la transformación de las
células bacterianas, 1-2 \mul de ADN de plásmido
(1-100 ng) se mezclaron con 40 \mul de células
competentes descongeladas sobre hielo y se incubaron 5 minutos
sobre hielo. Después, esta mezcla básica se pipeteó sin burbujas de
aire entre los dos electrodos de una cubeta de electroporación de 2
mm estéril y previamente enfriada. La cubeta se seca bien y se
utiliza en el portaelectrodos. Después de la realización del impulso
eléctrico a 2,5 kV, 200 \Omega y 25 \muF, la suspensión de
bacterias se lavó de la cubeta con 1 ml de medio LB y se incubó a
37ºC durante 1-2 horas en el agitador. A
continuación, las bacterias se eliminaron por centrifugación y el
sobrenadante se extrajo hasta 100 \mul. El sedimento se
resuspendió en los 100 \mul restantes, se sembró en una placa de
selección que contenía Tc y se incubó en ÜN a 37ºC.
El éxito de la clonación se comprobó mediante
minipreparación del plásmido respectivo de clones de bacterias por
separado. El plásmido pMut1 marcado con el casete de tetraciclina se
denominó pMut1-Tc. En la Fig. 2 se representa el
mapa físico del plásmido pMut1-Tc. Se especifica el
sitio de inserción (originariamente un sitio NdeI singular)
para el fragmento de ADN que confiere resistencia a tetraciclina.
Este fragmento de ADN también contiene la secuencia de EcoRI
singular adecuada para la clonación. Además, se especifican los
sitios de unión para los cebadores Muta 5 y Muta 6 que son
adecuados para la detección específica de este plásmido mediante
PCR.
Para el marcado del plásmido pMut2 se seleccionó
un casete con resistencia a kanamicina que se derivó del vector
pACYC177. Además, de este se cortó el casete de resistencia (tamaño
1,34 kb) con la enzima de restricción StuI y se insertó en
el plásmido pMut2 mediante un sitio de corte de restricción
BglII. Después de la digestión de la restricción de los
plásmidos con las enzimas correspondientes, la mezcla de restricción
se purificó mediante una columna (Quiagen, kit de fracciones de
PCR) y el plásmido pMut2 se sometió a un tratamiento con Klenow
para formar "extremos romos" para la clonación. Para evitar un
religamiento del plásmido pMut2, se realizó una desfosforilación
del plásmido linealizado con la enzima de restricción BglII y
tratado con la enzima de Klenow. A continuación se ligó el vector
pMut2 y el casete de kanamicina y con esto la cepa
K-12 de E. coli se transformó en DH5\alpha,
como se describe en el ejemplo 1. La transformación se sembró en
placas de agar LB que contenían Kn. El éxito de la clonación se
comprobó mediante minipreparación del ADN de plásmido de clones de
bacterias por separado. El plásmido pMut2 marcado con el casete de
kanamicina se denominó pMut2-Kn.
En la Fig. 3 se representa el mapa físico del
plásmido pMut2-Kn. Se marca el sitio de inserción
(originariamente un sitio BglII) para el casete de
resistencia a kanamicina, así como la secuencia de EcoRI
singular y adecuada como sitio de clonación. Con Muta 7 a Muta 10
se caracterizan aquellas zonas que son complementarias a las
secuencias de los cebadores que son adecuadas para la detección
específica de este plásmido mediante PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Para introducir el gen sacB (codifica una
levansacarasa) en los plásmidos pMut1-Tc y
pMut2-Kn marcados con casetes de resistencia, en
ambos plásmidos se seleccionó el sitio de corte de restricción
EcoRI singular respectivo. El gen sacB (tamaño 2,6
kb) se aisló a partir del plásmido pCVD442 con la enzima de
restricción PstI. Para preparar los vectores
pMut1-Tc y pMut2-Kn, estos plásmidos
se linealizaron con EcoRI y a continuación se sometieron a
un tratamiento con Klenow para la formación de "extremos
romos", así como se desfosforilaron. El inserto sacB se
purificó después de la digestión de la restricción con PstI y
se trató con enzima de Klenow. Los vectores linealizados y el
inserto se ligaron y con ello la cepa K-12 de E.
coli se transformó en DH5\alpha, que se hizo competente como
se describe en el ejemplo 1. El éxito de la clonación se comprobó
mediante minipreparación del ADN de plásmido de clones de bacterias
por separado y posterior análisis de restricción. Los plásmidos
pMut1-Tc y pMut2-Kn marcados con el
gen sacB se denominaron pMut1-TcSac y
pMut2-KnSac.
\vskip1.000000\baselineskip
Inicialmente, el plásmido
pMut1-TcSac se transformó mediante electroporación
en esta cepa, como se describe en el ejemplo 1. Después de la
electroporación, para transferir el plásmido
pMut1-TcSac en la cepa DSM 6601, la mezcla se
sembró en placas de LB que contenían Tc (50 \mug/ml). En los
clones de bacterias resistentes a tetraciclina obtenidos se
comprobó la posesión del plásmido pMut1-TcSac y la
pérdida asociada a ello del plásmido pMut1 de procedencia natural.
La pérdida del plásmido pMut1 se detectó después de la preparación
del ADN de plásmido y la digestión de la restricción del mismo con
la enzima EcoRI después de separación electroforética de los
plásmidos linealizados mediante la falta de las bandas de ADN que
representan pMut1.
A continuación, uno de estos clones se cultivó
durante la noche en medio LB con sacarosa al 10% a 30ºC y luego se
sembró en placas de LB con sacarosa al 10% (el medio LB está
constituido por 10 g de peptona de caseína, 5 g de extracto de
levadura y 5 g de cloruro sódico en 1 l de agua destilada). El medio
LB que contenía sacarosa se preparó añadiendo una proporción hasta
una concentración final del 10% al medio tratado en autoclave
después del enfriamiento hasta 45ºC de una disolución madre de
sacarosa al 50 por ciento (peso/vol.) esterilizada por filtración.
Las placas se incubaron a 30ºC. Bajo estas condiciones sólo pueden
replicarse aquellos clones que ya no expresan sacB, es
decir, aquellos que han perdido el plásmido que lleva el gen
sacB. La cepa DSM 6601\DeltapMut1 resultante de esto se
comprobó para la pérdida del plásmido
pMut1-TcSac.
Después se introdujo mediante electroporación el
plásmido pMut2-KnSac en la cepa DSM
6601\DeltapMut1.
Después de la electroporación, para transferir
el plásmido pMut2-KnSac a la cepa DSM
6601\DeltapMut1, la mezcla se sembró en placas de LB que
contenían Kn (50 \mug/ml). En los clones de bacterias resistentes
a kanamicina obtenidos se comprobó la posesión del plásmido
pMut2-KnSac y la pérdida asociada a ello del
plásmido pMut2 de procedencia natural. A continuación, uno de estos
clones se cultivó durante la noche en medio LB con sacarosa al 10%
a 30ºC y luego se sembró en placas de LB con sacarosa al 10%. Las
placas se incubaron a 30ºC. La cepa DSM 6601 \DeltapMut1/2
resultante de esto se comprobó para la pérdida del plásmido
pMut2-KnSac.
Además, se realizó una electroforesis en gel de
campo pulsado de la cepa sin plásmido DSM 6601 \DeltapMut1/2 para
excluir eventuales modificaciones cromosomales de la cepa. Se
comprobó que no había modificaciones detectables y otras
investigaciones han dado como resultado que el clon sin plásmido no
muestra ningún tipo de modificación morfológica, bioquímica o
fermentativa.
Claims (8)
1. Clon sin plásmido de la cepa DSM 6601 de
Escherichia coli.
2. Procedimiento para preparar un clon sin
plásmido según la reivindicación 1, caracterizado por las
siguientes etapas:
- a)
- introducir un gen de resistencia en los plásmidos pMut1 y pMut2,
- b)
- introducir el gen sacB en los plásmidos obtenidos en la etapa a),
- c)
- introducir los plásmidos obtenidos en la etapa a) en la cepa DSM 6601 de E. coli y cultivar la cepa en condiciones en las que los plásmidos pMut1 y pMut2 de procedencia natural son desplazados por los plásmidos obtenidos en la etapa b); y
- d)
- cultivar los clones obtenidos en la etapa c) en condiciones que sólo permiten esencialmente un crecimiento de bacterias a las que les falta el gen sacB.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque los genes de resistencia se presentan en
un casete de expresión.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
caracterizado porque los genes de resistencia se seleccionan
entre resistencia a tetraciclina o resistencia a kanamicina.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el plásmido
pMut1 está marcado con un casete de resistencia a tetraciclina y el
gen sacB y porque el plásmido pMut2 originario está marcado
con un casete de resistencia a kanamicina y el gen sacB.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 5, en el que las bacterias transformadas con el
plásmido pMut1, que está marcado con un casete de resistencia a
tetraciclina y el gen sacB, se cultivan en placas que
contienen tetraciclina y a continuación en placas que contienen
sacarosa y porque después de eliminar el plásmido pMut1 en la
primera etapa, la eliminación del plásmido pMut2 se realiza mediante
cultivo en placas de kanamicina y posterior cultivo en placas de
sacarosa.
7. Uso del clon sin plásmido según la
reivindicación 1 como cepas de clonación.
8. Uso del clon sin plásmido según la
reivindicación 1 para la preparación de un agente para el
tratamiento de trastornos gastrointestinales en animales.
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