ES2315256T3 - Medios y procedimiento para la expresion de proteinas homologas y heterologas en cepas de rhodococcus. - Google Patents

Medios y procedimiento para la expresion de proteinas homologas y heterologas en cepas de rhodococcus. Download PDF

Info

Publication number
ES2315256T3
ES2315256T3 ES01200582T ES01200582T ES2315256T3 ES 2315256 T3 ES2315256 T3 ES 2315256T3 ES 01200582 T ES01200582 T ES 01200582T ES 01200582 T ES01200582 T ES 01200582T ES 2315256 T3 ES2315256 T3 ES 2315256T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
rhodococcus
activator
plasmid
genes
constitutive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01200582T
Other languages
English (en)
Inventor
Immacolata Margarit Y Ros
Luca Paolo Serbolisca
Francesca De Ferra
Francesco Rodriguez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eni SpA
Original Assignee
Eni SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eni SpA filed Critical Eni SpA
Application granted granted Critical
Publication of ES2315256T3 publication Critical patent/ES2315256T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
    • C10G32/00—Refining of hydrocarbon oils by electric or magnetic means, by irradiation, or by using microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Vector de expresión que comprende: (a) los genes de rep, ORF81 y trbA que codifican las proteínas implicadas en la replicación en Rhodococcus; (b) el gen parA que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 1; (c) un activador constitutivo de Rhodococcus que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 2; (d) una secuencia de clonación múltiple corriente abajo del activador; (e) por lo menos un gen que codifica un marcador genético seleccionado de entre los genes del operón cad, que proporcionan resistencia al cadmio, o los genes que codifican la resistencia a un antibiótico; y (f) el origen de replicación en E. coli.

Description

Medios y procedimientos para la expresión de proteínas homólogas y heterólogas en cepas de Rhodococcus.
La presente invención se refiere a un nuevo activador constitutivo de Rhodococcus, a un vector de expresión que contiene dicho activador, a microorganismos transformados con el vector de expresión y a su utilización en la producción de proteínas.
Las bacterias del tipo Rhodococcus son de gran interés en el campo de la biodegradación y transformación de compuestos orgánicos (Warhurst y Fewson, 1994, Crit. Rev. Biotechnol., 14:29-73).
Son conocidos los procedimientos, por ejemplo, que utilizan cepas de Rhodococcus para la eliminación selectiva del azufre de combustibles fósiles (documentos US nº 5.358.870, US nº 5.132.219, PCT/US92/01868, EP-445896) y para la producción de enzimas implicadas en la producción de acrilamidas (Kobayashi et al., 1992, Tends Biotechnol., 10:402-408), ácidos carboxílicos, L-aminoácidos (documento WO 98/04733) y enantiomorfos de compuestos quirales (documento US nº 5.672.504).
El principal factor de restricción en los procesos optimizadores de biocatálisis que utiliza estas bacterias es no obstante la falta de instrumentos genéticos adecuados.
Este término se refiere a los vectores de expresión en Rhodococcus que:
-
están presentes en las células en múltiples copias;
-
se mantienen constantemente en el interior de las células sin agentes selectivos costosos (por ejemplo, antibióticos), que influyen de manera considerable en la conveniencia económica de un proceso industrial; y
-
contienen un activador potente, es decir, que puede permitir una expresión eficaz de un gen, o un activador constitutivo potente que no requiere la utilización de inductores y no es sensible a los represores.
De hecho, un límite en la eliminación del azufre orgánico de los combustibles fósiles con las cepas de Rhodococcus que producen el complejo enzimático sox, es debido a la presencia, corriente arriba de los correspondientes genes, de un activador muy inhibido por el sulfato.
Para superar este inconveniente, los genes que codifican este complejo enzimático se colocaron en vectores de Rhodococcus bajo el control de activadores constitutivos heterólogos tales como los del gen con resistencia al cloranfenicol de Rhodococcus fascians (Piddington, C.S. et al., 1995, Appl. and Env. Microbiol., 61,2,: 468-475) o del gen sacB de B. subtilis (Denis-Larose, C. et al., 1998, Appl. and Env. Microbiol., 64,11,:4363-4367) y del gen con resistencia a Kanamicina de E. coli (Serbolisca et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52:122-126). El mantenimiento de los vectores, sin embargo, requería la presencia de un agente selectivo en el medio de cultivo y, además, la expresión del operón sox bajo el control del activador sac B demostró ser muy baja (Lau. P. et al. 1999 ACS Fuel Chem.:
32-33).
Otro documento de la técnica anterior da a conocer los vectores de clonación y expresión para Rhodococcus, en el que se utilizaron los genes rep, repA y repB, el gen par A y el gen con resistencia al cloranfenicol (De Mot Rene et al., Microbiology 1997, 143, 10: 3137-3147).
El problema técnico objetivo resuelto por la presente invención consiste en proporcionar un activador alternativo de Rhodococcus y el vector de expresión que debe utilizarse para la eliminación del azufre orgánico de los combustibles fósiles.
Se ha descubierto ahora que los inconvenientes de la técnica anterior descritos anteriormente pueden superarse por medio del vector de expresión de la presente invención.
Un primer objeto de la presente invención se refiere a un nuevo activador constitutivo de Rhodococcus capaz de dirigir la expresión de un gen homólogo o heterólogo con una gran eficacia y se caracteriza por la secuencia SEC. ID. nº 2.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un vector de expresión en Rhodococcus que comprende dicho activador constitutivo.
Un objeto adicional de la presente invención se refiere a una cepa de Rhodococcus transformada con dicho vector de expresión.
Otro objeto todavía de la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas homólogas o heterólogas en bacterias Rhodococcus transformadas con dicho vector de expresión.
Los objetos adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción y ejemplos siguientes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: muestra la cartografía de restricción del plásmido pSM841 de 11 kb.
Figura 2: muestra la cartografía de restricción del plásmido pSM843 de 7,3 kb.
Figura 3: muestra la cartografía de restricción del plásmido pSM839 de E. coli.
Figura 4: muestra la cartografía de restricción del plásmido pSM846.
Figura 5: muestra la cartografía de restricción del plásmido pSM847.
En particular, el vector de expresión según la presente invención comprende:
(a)
los genes de rep, ORF81 y trbA que codifican proteínas implicadas en la replicación en Rhodococcus;
(b)
un gen denominado parA cuyo producto es necesario para mantener el plásmido en ausencia de presión selectiva y se caracteriza por la secuencia SEC. ID. nº: 1;
(c)
un activador constitutivo de Rhodococcus que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 2;
(d)
una secuencia de clonación múltiple corriente abajo del activador; y
(e)
por lo menos un gen que codifica un marcador genético seleccionado, por ejemplo, de entre los genes del operón cad (SEC. ID. nº: 3), que proporciona resistencia al cadmio o los genes que codifican la resistencia a un antibiótico.
El vector de expresión contiene asimismo el origen de la replicación en E. coli y pueden por lo tanto utilizarse como vector lanzadera en Rhodococcus y E. coli.
El vector de expresión, indicado a continuación como pSM846, se obtuvo por:
(1)
construcción del vector de clonación pSM843 que comprende:
(a)
los genes de rep, ORF81 y trbA que codifican las proteínas implicadas en la replicación en Rhodococcus;
(b)
el gen parA que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 1; y
(c)
por lo menos un gen que codifica un marcador genético seleccionado de entre los genes del operón cad, que proporcionan resistencia al cadmio, o los genes que codifican la resistencia a un antibiótico;
(2)
aislamiento de un activador constitutivo de Rhodococcus que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 2; y
(3)
inserción de dicho activador constitutivo en el vector pSM843.
El vector del plásmido pSM843 se preparó reduciendo las dimensiones del plásmido de 130 kb de Rhodococcus sp. DS7 que contiene el operón sox, los genes que proporcionan resistencia al cadmio, y los que proporcionan resistencia al arsénico (Margarit et al., 1997 y Serbolisca et al., 1999). Esta reducción se efectuó mediante la estrategia siguiente:
(a)
búsqueda de los plásmidos procedentes de la eliminación del plásmido de 130 kb después de la transformación de una cepa receptora y aislamiento de un plásmido de 22 kb;
(b)
digestión de dicho plásmido con enzimas de restricción adecuadas, auto-ligasa e aislamiento del plásmido pSM841 de 11 kb;
(c)
caracterización del plásmido obtenido en (b) y
(d)
construcción del plásmido pSM843 de 7,3 kb que contiene por lo menos un marcador genético y los genes parA, rep y trbA respectivamente, necesarios para la estabilidad y replicación en Rhodococcus.
La estabilidad de los vectores obtenidos se controló después de cada reducción con el fin de seleccionar solamente los mantenidos en por lo menos el 90% de las células de la cepa hospedadora durante por lo menos 30 a 40 generaciones, en medio completo y en ausencia de presión selectiva.
La investigación en los activadores constitutivos dentro del cromosoma de una cepa de Rhodococcus fue efectuada para la construcción del vector de expresión, utilizando un nuevo procedimiento.
Este procedimiento se basa en la observación de que las cepas de Rhodococcus tienen capacidad de integración en fragmentos aleatorios del ADN extraño en su cromosoma, sin necesidad de una homología de secuencia mayor de 3 bp entre el ADN del donante y el del hospedador. La eficacia de integración se estimó en aproximadamente 10^{2}-10^{3} colonias por \mug de ADN en experimentos de transformación de células de Rhodococcus.
El procedimiento de investigación consiste en:
(i)
transformar una cepa de Rhodococcus directamente con un gen indicador sin su activador o con un plásmido multicopia de E. coli que contiene dicho gen y el gen indicador linealizado corriente arriba;
(ii)
seleccionar los clones que expresan dicho gen, es decir, los clones que presentan integrado el gen indicador en su cromosoma, corriente abajo de una secuencia activadora;
(iii)
digerir el ADN cromosómico de los clones seleccionados con enzimas de restricción que cortan corriente arriba y corriente abajo el gen;
(iv)
ampliar el ADN obtenido en la etapa (iii); y
(v)
secuenciar el activador corriente arriba del gen indicador.
\vskip1.000000\baselineskip
Gen indicador se refiere a un fragmento de ADN que codifica un producto que permite la selección de los clones que lo expresan. Los ejemplos de genes indicadores útiles para este fin pueden seleccionarse de entre los que codifican la resistencia a antibióticos o a metales pesados o a enzimas tales como XylE o las mismas proteínas Sox.
Con respecto a las técnicas utilizadas actualmente, este procedimiento de investigación es mucho más eficaz y rápido y no requiere la preparación de bancos genómicos con fragmentos de ADN cromosómico antes del gen indicador. Este procedimiento puede aplicarse a todos los microorganismos que, como Rhodococcus, pueden integrarse en los fragmentos aleatorios del ADN extraño en su cromosoma sin necesidad de gran homología de secuencia entre el ADN del donante y el del hospedador.
Con este procedimiento, se identificó un activador constitutivo de un gen de Rhodococcus con la secuencia SEC. ID. nº 2 que está comprendido en el alcance de la presente invención. Este activador se insertó en el vector del plásmido psM843, obteniéndose el vector de expresión pSM846 que puede utilizarse para la producción de proteínas de interés en Rhodococcus.
Se determinó la estabilidad de segregación y estructura del vector de expresión pSM846 en cepas de Rhodococcus actuando como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados demostraron que el vector se mantiene en más del 90% de la población celular, incluso después de atenuaciones del cultivo sucesivas con agentes selectivos, mostrando de este modo una gran estabilidad de segregación.
Además, los análisis de los plásmidos aislados a partir de cepas transformadas demostraron que, aún después de varias generaciones en el cultivo líquido, este plásmido permanece estructuralmente estable en diferentes cepas de Rhodococcus con de 4 a 8 copias por célula.
El vector de expresión de la presente invención puede utilizarse para la expresión de genes que codifican proteínas de interés tales como, por ejemplo, las enzimas implicadas en la eliminación selectiva del azufre orgánico de combustibles fósiles (SoxA, SoxB, SoxC y SoxD), la producción de L-aminoácidos (amidasa, aspartasa), la producción de enantiomorfos de compuestos quirales (epóxido hidrolasa, cetoesterorreductasa), la producción de ácidos carboxílicos (nitrilasa), etc.
El vector de expresión puede utilizarse en varias especies de Rhodococcus y en bacterias filogenéticamente similares tales como Gordona y Nocardia.
La capacidad del activador de dirigir la expresión constitutiva del gen puesto bajo su control se verificó colocando corriente abajo dicho activador, el operón sox aislado según describe (Serbolisca, L., de Ferra, F., Margarit, I., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52:122-126.
Los resultados obtenidos demostraron que este activador permite una expresión eficaz y constitutiva de las proteínas SoxA, SoxB y SoxC en presencia de azufre inorgánico en el medio de cultivo.
Las cepas que contienen los vectores pSM843, pSM846 y pSM847 se depositaron en cultivos Centraalbureau Voor Schimmel como Rhodococcus SMV 112, SMV 113 y SMV114, donde recibieron los números CBS 102445, 102446 y 102447 respectivos.
Los siguientes se utilizaron en los experimentos descritos a continuación:
-
el plásmido de 130 Kb que contiene el operón sox que codifica la resistencia al cadmio y al arsénico. Dicho plásmido se aisló de la cepa Rhodococcus sp. DS7 (Margarit, I. et al., 1997, 9^{th} Proceedings of the International Conference on Coal Science: 1579-1582);
-
el plásmido pSM789, incapaz de autorreplicarse en Rhodococcus, obtenido insertando en el plásmido pUC18 de E. coli, el fragmento HindIII-EcorRI de 4549 bp que contiene el operón sox sin activador aislado de Rhodococcus sp. DS7 (Margarit, I. et al., 1997, 9^{th} Proceedings of the International Conference on Coal Science: 1579-1582);
La cepa Rhodococcus sp. fue clasificada previamente como Arthrobacter basándose en el ensayo microbiológico (D'Addario 1996 Proceedings of the Symposium AAA Biotechnology. Shejbal, E. y Ferrara: 139-149). Posteriormente, una comparación de la secuencia 16 S del ADN con la de los bancos de datos indicaron que la cepa pertenecía al género Rhodococcus. Las homologías más constantes se encontraron en Rhodococcus erithreus y Rhodococcus erythropolis.
-
la cepa DS-2 de Rhodococcus, obtenida a partir de DS7 Rhodococcus sp., es incapaz de desulfurarse ya que no tiene el plásmido de 130 kb (Margarit, I. et al., 1997, 9^{th} Proceedings of the International Conference on Coal Science: 1579-1582).
Los ejemplos siguientes son ilustrativos pero no limitativos del alcance de la propia invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Construcción del vector del plásmido pSM843
Células electrocompetitivas de DS-2 de Rhodococcus (100 \mul) (BIORAD Gene Pulser TM, 400 ohm, 25 uF) se transformaron con el plásmido de 130 kb (100 ng). Se seleccionaron clones recombinantes en placas de LB-agar que contenían 0,5 mM de CdCl_{2} y posteriormente se colocaron en medio mínimo (10 g/l de KH_{2}PO_{4} pH 7,4, 2,5 g/l de NH_{4}Cl, 0,2 g/l de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,02 g/l de CaCl_{2}, 0,01 g/l de FeCl_{3}, 0,005 g/l de MnCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,003 g/l de ZnCl_{2}, 0,0009 g/l de CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,8% de agarosa) que contenía dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre. Uno de los clones resistentes al cadmio demostró ser incapaz de desulfurar DBT. Se extrajo el ADN plásmido de este clon, que, después de ensayarse en gel de agarosa al 0,7%, demostró dimensiones de aproximadamente 100 kb.
Actuando como se describió anteriormente, a partir de la transformación de DS-2 con el plásmido de 100 kb, se obtuvo un plásmido de 35 kb que no proporcionó ya resistencia al arsénico, y a partir de éste un plásmido de 22 kb.
Se comprobó la estabilidad del plásmido para los tres vectores con el fin de seleccionar solamente los mantenidos en la cepa del hospedador durante por lo menos 30 a 40 generaciones en ausencia de presión selectiva.
Se digirió el plásmido de 22 kb (1 \mug) con 4 U de la enzima de restricción Sex AI (Boehringer), en 10 \mul de las sales suministradas por el productor, incubando durante 60 minutos a 37ºC y 15 minutos a 70ºC. El plásmido linealizado (2 \mul) se autoligó en 10 \mul de tampón, en presencia de 1 U de T4 ADN ligasa, durante 16 horas a 16ºC. Se utilizó 1 \mul de la mezcla de ligasa para transformar células DS-2 electrocompetentes. Se aisló un plásmido de 18,7 kb de uno de los clones que contenían plásmidos con dimensiones reducidas. Este plásmido se digirió con la enzima EcoRI obteniéndose un vector de 15,8 kb que se redujo más por digestión con las enzimas SspI y DraI, que dejan los extremos truncados.
El plásmido de 11 kb resultante, denominado pSM841 (figura 1), se secuenció y se demostró la presencia de:
-
el operón cad que proporciona resistencia al cadmio y que presenta la secuencia SEC. ID. nº 3;
-
los genes rep, ORF81 y trbA que codifican las proteínas implicadas en la replicación descrita por Denis-Larose, C. et al., 1998, App. And Env. Microbiol., 64, 11: 4363-4367. Se identificó una secuencia de 15 bp entre estos dos genes, que, por homología con otras secuencias, pueden corresponder al origen de la replicación del plásmido; y
-
un gen parA cuya secuencia (SEC. ID. nº 1) que presenta una homología parcial con la de los genes implicados en el reparto de los plásmidos que tiene lugar durante la división celular. Se identificaron 2 secuencias repetidas cada una de 24 bp, corriente arriba de este gen.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar la importancia de la zona del ADN que contiene el gen parA manteniendo el pSM841, se construyó un plásmido de 8,8 kb sin esta zona. Los resultados demostraron una reducción de más del 50% en la estabilidad del plásmido.
Una vez identificados los genes indispensables para mantener el plásmido pSM841, se construyó un vector de 7,3 kb, que contiene:
1-
un fragmento DraI-EcoRI de 2717 bp que comprende el operón cad;
2-
un fragmento SspI-NcoI de 2716 bp que comprende los genes trb A y rep A;
3-
un fragmento EcoRI-NcoI de 1857 bp que comprende el gen par A y una secuencia de clonación múltiple (MCS).
Estos fragmentos se aislaron del plásmido pSM841 por medio de la ampliación y a continuación se ligaron en presencia de T4 ADN ligasa a 16ºC durante una noche.
El plásmido resultante, denominado pSM843, tiene la cartografía de restricción indicada en la figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Aislamiento del activador constitutivo
El plásmido pSM789 (5 \mug) se digirió con 40 unidades (U) de la enzima de restricción HindIII (Boehringer) en
50 \mul de tampón suministrado por el fabricante.
Tras la incubación a 37ºC durante 60 minutos se efectuó la desnaturalización/extracción de las proteínas añadiendo un volumen de fenol-cloroformo (1:1) y un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (23:1). El ADN se precipitó sucesivamente añadiendo 5 \mul de una solución 3 M de acetato Na y 300 \mul de etanol a la fase acuosa y a continuación se volvió a poner en suspensión en 10 \mul de H_{2}O. De esta manera, se obtuvo un plásmido lineal abierto exactamente corriente arriba de la zona RBS del primer gen del operón sox (sox A).
Se utilizó el ADN linealizado (0,2 \mug) para transformar 100 \mul de células de DS-2 de Rhodococcus sp. y se seleccionaron los transformantes en placas con medio mínimo que contenían 0,04 g/l de DBT y 1% de C_{2}H_{5}OH como fuentes únicas de azufre y de carbono, respectivamente.
Se aislaron 100 clones que pueden crecer utilizando DBT. Ya que el plásmido pSM789 no pudo autorreplicarse en Rhodococcus, los transformantes obtenidos (aproximadamente 10^{2} por \mug de ADN utilizado) tenían que contener el operón sox dentro de su cromosoma, corriente abajo de un activador que permitía su expresión.
Con el fin de determinar si la integración tuvo lugar en diferentes puntos del cromosoma, se extrajo el ADN cromosómico de 20 clones (Current Protocols in Molecular Biology - vol. 1) y se digirieron con 20 U de la enzima NotI, para que exista solamente una secuencia de unión en el interior del operón sox. El ADN digerido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, observada mediante coloración con EtBr al 0,5% y se transfirió sobre nilón (membranas de nilón, cargadas positivamente - Boehringer) mediante transferencia Southern (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual 2ª ed. Cold Spring Harbor, NY).
Se hibridó a continuación el ADN con una sonda cuya secuencia nucleotídica corresponde a un fragmento de 770 bp del gen sox C, utilizando el procedimiento no radioactivo proporcionado por el kit DIG SYSTEM de Boehringer. La reacción de hibridación se efectuó a 68ºC.
De los clones probados se observó una sola banda, con un peso molecular diferente para cada clon, que indicaba un solo episodio de integración del plásmido pSM789 en diferentes puntos del cromosoma.
Para verificar si estos clones podían desulfurar DBT en presencia de azufre inorgánico, se colocaron en medio mínimo que contenía tanto DBT como MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (0,20 g/l), en paralelo con la cepa DS7 de Rhodococcus sp. Después de 12 horas, exponiendo la placa a rayos UV a 254 nm, se observó un halo fluorescente en todos los clones recombinantes, mientras que no había halo visible en la cepa natural. Esto indicaba que la actividad de los activadores aislados no estaba reprimida por el sulfato. El clon que presentaba el halo más constante se denominó SMV110.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Caracterización del activador contenido en SMV110
Se digirió 1 \mug del ADN cromosómico del clon SMV110 con 20 U de la enzima ClaI, en 10 \mul de tampón (Boehringer), a 37ºC durante 16 horas. Tras la desactivación de las enzimas a 70ºC durante 15 minutos, 2 \mul del ADN digerido se trataron con 1 U de la enzima T4 ADN ligasa en 10 \mul de tampón (Boehringer), incubando a 16ºC durante 16 horas.
Se utilizó una alicuota (1 \mul) de la mezcla de ligasa para transformar las células de XL1-Blue de E. coli hechas electrocompetitivas (Dower, W.J. et al. 1988 Nucleic Acids Research, 16: 6127-6145).
Se seleccionaron los transformantes en placas de medio LB con agar-agar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Se analizó el ADN plásmido extraído de uno de los clones obtenidos de este modo mediante análisis de restricción. Los resultados indicaron que el plásmido estaba constituido por un fragmento de 4,5 kb, procedente del ADN cromosómico de DS-2 y el plásmido pSM789. La cartografía de este nuevo plásmido, denominado pSM839, se presenta en la figura 3.
El fragmento de 4,5 kb se amplió a continuación por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (Leung, D.W., Chen, E., Goeddel, D.V.; 1989 Tecnique- a Journal methods in cell and molecular biology, 1, nº 1: 11-15) utilizando el siguiente par de oligonucleótidos:
1) 5' CAGTCACGAC GTTGTAAAAC GA 3' (TRANSCRITA)
2) 5' TGCATTTGTC GTTGTTGAGT 3' (COMPLEMENTARIA)
Se realizó la ampliación en un aparato ciclador térmico 480 de ADN (Perkin-Elmer Cetus) utilizando 100 \mul de una mezcla de reacción que contenía: 5 ng del ADN plásmido, 60 pmoles de los dos oligonucleótidos, dNTP 200 \muM de (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) y 1 U de Taq polimerasa (Boehringer), en el tampón recomendado por el fabricante. Tras la desnaturalización durante 2 minutos a 94ºC, se inició el programa cíclico, que comprende: 1 minuto a 98ºC, 1 minuto a 60ºC y 3 minutos a 72ºC durante un total de 25 ciclos, seguido de 8 minutos a 72ºC (extensión final).
El fragmento ampliado de 4,5 kb se secuenció a continuación mediante un secuenciador de ADN ABI 373 (Perkin Elmer). La secuencia y los posibles marcos de lectura abiertos se compararon con los presentes en el ADN y los bancos de proteína utilizando el motor de investigación BLAST suministrado por NCBI (Altscul, S.F., Madden, Th., Schaffer, A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D., 1997 Nucleic Acids Research 25: 3398-3402).
Los resultados demostraron que la integración de pSM789 en el ADN cromosómico de la cepa DS-2 había tenido lugar dentro de un gen que codifica una proteína homóloga a algunas endoglucanasas y amilasas de otros microorganismos.
Se dedujo por consiguiente que en el clon SMV110, la expresión del operón sox estaba controlada por el activador de dicho gen. Con el fin de caracterizar este activador, el punto de partida exacto de la transcripción del operón sox fue determinada por la extensión del cebador utilizando el kit del sistema 5' RACE (BRL).
Los resultados indicaron que el comienzo de la transcripción del operón sox tuvo lugar a una distancia de 622 bp de 5' del operón y que el activador estaba por lo tanto situado inmediatamente corriente arriba de dicha zona.
El análisis de la secuencia corriente arriba de la secuencia de transcripción de partida puso de manifiesto la presencia de la supuesta zona 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Construcción del vector de expresión pSM846
Un fragmento de 1100 bp que contenía el activador constitutivo se amplió por medio de PCR partiendo del plásmido pSM839 utilizando los oligonucleótidos siguientes:
101
Se digirió el fragmento ampliado con las enzimas HindIII y BamHI, se eluyó en agarosa y se insertó en las enzimas AflIII-HpaI y se ligó a pSM843, previamente digerido con AflIII y NcoI (cuya forma compatible finaliza con el anterior) en presencia de T4 ADN ligasa a 16ºC durante una noche. De este modo se obtuvo un nuevo vector lanzadera de E. coli- Rhodococcus, denominado pSM846, que contenía el activador seguido de un MCS para la expresión constitutiva de proteínas en Rhodococcus. La cepa de DS-2 de Rhodococcus que contiene el plásmido pSM846, cuya cartografía se muestra en la figura 4, se denominó SMV112.
Ejemplo 5
Con el fin de verificar la estabilidad del plásmido pSM846 en las cepas transformadas de Rhodococcus después de un periodo prolongado de cultivo en ausencia de presión selectiva, se cultivaron tres clones independientes de la cepa SMV112 a 30ºC, 200 rpm durante 16 horas en matraces de 100 ml, que contenían 20 ml de medio LB (10 g/l de Bacto Triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl).
Se utilizaron los tres cultivos (0,1 ml) para inocular 20 ml más de los mismos medios, y los nuevos cultivos se cultivaron a 30ºC, 200 rpm durante 16 horas. Este procedimiento se repitió 3 veces más, siguiéndose el cultivo celular por un aumento de la densidad óptica medida a 600 nm (D.O. 600).
Al final de cada cultivo, se extrajeron alícuotas de los cultivos, diluidas de manera adecuada y a continuación se colocaron en placas con medio LB con agar. Se incubaron las placas a 30ºC durante 16 horas y se hizo el recuento de las colonias (CFU/ml) a continuación. De esta manera se determinó que había por lo menos 35 generaciones al final del experimento.
Con el fin de determinar el porcentaje de células que habían mantenido el plásmido durante por lo menos 35 generaciones, y eran por consiguiente resistentes al cadmio, 100 colonias individuales procedentes de la colocación en placas por dilución, después del 5º cultivo de los tres cultivos, se colocaron en placas LB que contenían CdCl_{2} a una concentración de 0,5 mM.
Se observó que el plásmido se mantenía en más del 90% de la población celular, demostrando de este modo una estabilidad de segregación considerable aun después de ulteriores atenuaciones en el cultivo en ausencia de presión selectiva.
Con el fin de verificar la estabilidad de la estructura del plásmido pSM846, al final de la 5ª atenuación del cultivo, se extrajo el ADN del plásmido procedente de una alícuota de los cultivos de 12 clones, utilizando el procedimiento descrito en Serbolisca et al. (1999). El ADN obtenido se digirió con varios enzimas de restricción para las cuales existen secuencias sencillas o dobles en el plásmido pSM846 y se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa durante 2 horas a 90 V, 90 mA; se colorearon los geles con 1 mg/ml de bromuro de etidio. La observación del gel en un transiluminador de luz UV mostró las bandas esperadas según la cartografía de restricción del plásmido, demostrando que el pSM846 era estructuralmente estable en Rhodococcus, durante varias generaciones en ausencia de presión selectiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Determinación del número de copias de pSM846 por célula
El número medio de copias del plásmido pSM846 por célula se estimó mediante PCR cuantitativa en preparaciones de ADN completo procedente de células de DS-2 de Rhodococcus que contenían dicho plásmido. El procedimiento se basa en la determinación de la cantidad de ADN obtenido por ampliación de un fragmento del plásmido. Esta cantidad está directamente relacionada con la concentración del propio plásmido, utilizado como molde en la reacción de ampliación.
El ADN completo se preparó según el procedimiento ilustrado en Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al., ed. Wiley Interscience apartado 2.4.1 con la modificación siguiente: para obtener una lisis celular completa se volvieron a poner en suspensión las células centrifugadas procedentes de 1,5 ml de cultivo en 567 microlitros de TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) que contenía 50 \mug/l de lisozima y se incubaron a 37ºC durante 20 minutos antes de añadir SDS y proteinasa K según el protocolo.
Tras un tratamiento de 10 minutos con RNasa, la concentración del ADN completo se estimó en gel de agarosa y las muestras se diluyeron hasta 100 pg de ADN por microlitro.
Se efectuaron reacciones de PCR en el ADN obtenido de este modo, utilizando dos oligonucleótidos (cebadores) que aparecen en el interior del operón para la resistencia al cadmio y que presentan la secuencia siguiente:
- 5' TGGCCCGGCC GGAATTGATG GAC 3' (cebador Cd4) y
- 5' GCCGACGGCC GCGATCGTGA TCAG 3' (cebador Cd17).
La normalización se efectuó por medio de una segunda reacción de PCR en la parte del ADN cromosómico que codifica el ARN 16S de DS7 de Rhodococcus utilizando oligonucleótidos específicos para esta secuencia.
El número de copias del plásmido se estimó tanto en la cepa que contenía el plásmido pSM846 como en una cepa que contenía una copia única de los genes para la resistencia al cadmio integrada en el cromosoma y en la cepa DS7.
Se realizaron las reacciones de ampliación según las instrucciones del kit Syber Green de Perkin Elmer-AB.
El ADN ampliado se marcó con el marcador fluorescente Syber Green y se cuantificó con el instrumento GeneAmp 5700 de PE Applied Biosystems. Cada muestra se amplió por triplicado y los valores de la fluorescencia se compararon con curvas de calibración incluidas en cada experimento para cada par de cebadores. La cantidad de ADN obtenida ampliando con los cebadores específicos para el plásmido se corrigió a continuación para la cantidad de ADN cromosómico ampliado con los cebadores específicos para los genes 16S del ARN.
Al comparar las tres cepas ensayadas se demostró que la cepa DS7 contiene un promedio de 2 a 3 copias del plásmido de 130 kb por célula, mientras que las células de DS-2 de Rhodococcus transformadas con pSM846 contienen de 4 a 8 copias de plásmido por célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Construcción del plásmido pSM847
El objetivo del experimento consistía en obtener una cepa que contiene varias copias de genes sox bajo el control del activador constitutivo identificado.
El fragmento de ADN que contiene el activador identificado en el ejemplo 3, se amplió a partir del plásmido pSM839 por medio de PCR, utilizando los oligonucleótidos siguientes:
- 5' ATTCGAGAGT GCATATGCGG AAC 3' (TRANSCRITO)
- 5' CCATTTCTTC CAAGCTTCCG CCG 3' (COMPLEMENTARIO)
cuyo par con la SEC. ID. nº 2, en la que se introdujeron las secuencias de restricción NdeI y HindIII.
Aproximadamente 500 ng del ADN obtenido a partir de la reacción de ampliación se digirieron con 4 U de las enzimas NdeI y HindIII durante 60 minutos a 37ºC y se purificaron en gel de agarosa Nusieve al 1,5% (productos de FMC). En paralelo, se digirieron 1 \mug del plásmido pSM789 con 4 U de las mismas enzimas durante 60 minutos a 37ºC. 50 ng del vector y 25 ng de la inserción purificados en agarosa se ligaron a continuación en presencia de 1 U de la enzima T4 ligasa. La mezcla de ligasa se utilizó posteriormente para transformar células competitivas de XL-blue de E. coli.
Se digirieron por separado 500 ng del plásmido extraídos de uno de los clones de E. coli que contenían la inserción deseada y 500 ng del plásmido pSM843 con 4 U de la enzima de restricción SspI (New England Biolabs). Se realizaron las reacciones a 37ºC durante 60 minutos y a 70ºC durante 10 minutos.
Se ligaron 150 ng del plásmido lineal pSM843 a continuación con 50 ng del plásmido de E. coli en 10 \mul de tampón (Boehringer), en presencia de 1 U de T4 ADN ligasa, incubando durante 16 horas a 16ºC. 1 \mul de la mezcla de ligasa se utilizó para transformar células electrocompetitivas de DS-2 de Rhodococcus. Se colocaron en placas las células en medio mínimo en presencia de DBT y se cultivaron a 37ºC durante 4 a 5 días.
Se extrajo el ADN plásmido de una de las colonias obtenidas de este modo, según el procedimiento descrito en Serbolisca et al. (1999, Appl. Env. Microbiol. 52:122-126) y se sometieron a análisis de restricción con enzimas para las que existen secuencias en los plásmidos de partida. El vector obtenido de este modo, que contiene el operón sox bajo el control del activador constitutivo, se denominó pSM847 (Figura 5) y la cepa SMV114 que lo contiene.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8
Se cultivó la cepa SMV114 en paralelo con la cepa DS7 de Rhodococcus en medio mínimo más DBT con y sin 0,20 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O.
La electroforesis y el análisis por electrotransferencia Western de las proteínas solubles extraídas de los cultivos bacteriano demostraron que:
1.
cuando las cepas se cultivan en DBT sin sulfato, SMV114 expresa cantidades mayores de proteínas Sox A, B y C que DS7;
2.
en presencia de sulfato inorgánico, la DS7 de Rhodococcus no expresa las enzimas Sox, mientras que SMV114 expresa la misma cantidad de enzimas con respecto al cultivo con sulfato.
Se midió la actividad de desulfuración de la cepa SMV114 en las células restantes utilizando DBT como sustrato y en comparación con la de la cepa DS7 de Rhodococcus sp. A partir de un preinóculo en medio mínimo, se efectuaron dos inóculos para cada cepa en 100 ml del mismo medio, sin y con azufre inorgánico (0,20 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O,
80 mM). Los cultivos se efectuaron durante 20 horas a 30ºC en matraces con protección de rompetorbellinos. La densidad óptica de partida, medida a 660 nm, fue de D.O. 0,25 para los cultivos en MgSO_{4} + DBT y 0,4 para los cultivos con DBT solo. El peso en seco se determinó por triplicado a partir de 5 ml de cultivo centrifugado a 5.000-6.000 rpm durante 10 minutos, se congeló a -80ºC y se liofilizó.
Para la medición de la actividad de desulfuración, se extrajeron 10 ml de cultivo y se centrifugaron entre 5.000 y 6.000 rpm durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Las células se volvieron a poner en suspensión en 9,75 ml de Tris\cdotHCl 20 mM pH 7, se introdujeron en matraces de 50 ml y se incubaron en un baño agitado a 30ºC durante 5 minutos. Una vez añadidos 250 \mul de DBT 40 mM a la suspensión, se efectuó inmediatamente un primer muestreo (1 ml) que se extrajo con 2 ml de acetato de etilo, para determinar el producto de fondo en tiempo cero. Se tomaron muestras sucesivas después de 1 y 2 horas.
Se analizaron 20 \mul de la fase orgánica clarificada por HPLC en una columna cromatográfica en C18 Vydac tipo TP218-5418 en fase inversa, con un programa que comprende un caudal de 1 ml/min durante 15 minutos en 80% de acetonitrilo. La actividad específica, expresada como mg de 2HBP producida por hora por gramo de peso en seco, se calculó a partir del área correspondiente al producto 2-hidroxibifenilo (2-HBP) y teniendo en cuenta el peso en seco.
Se obtuvieron valores de actividad sin azufre inorgánico correspondientes a 5 \pm 0,6 mg/h.g tanto para la cepa natural como para SMV114. Cuando se cultivan en presencia de 0,2 g/l de MgSO_{4}, la cepa DS7 de Rhodococcus no expresó ninguna actividad de desulfuración, mientras que la cepa SMV114 mantenía su actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Se examinó también la posibilidad de utilizar el plásmido pSM847 en otras especies de Rhodococcus. Se utilizaron 100 ng del plásmido para transformar células electrocompetitivas de las cepas de Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous y Rhodococcus opacus. En todos los casos se obtuvieron colonias capaces de desulfurar DBT, que contenían el plásmido con las dimensiones estimadas. Asimismo en este caso, por lo menos el 90% de los clones mantenían el plásmido durante aproximadamente 40 generaciones en ausencia de presión selectiva.
SEC ID nº: 1
TIPO SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 2290 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal 
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 2
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 1355 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Promotor 
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\newpage
SEC ID nº: 3
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2806 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Operón
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 4
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 22 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
9 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 5
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 20 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
10 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 6
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 23 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
11 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 7
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 58 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
12
SEC ID nº: 8
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 23 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
13 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 9
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 24 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
14 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 10
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 23 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
15 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº: 11
TIPO DE SECUENCIA:: Nucleótido
LONGITUD DE SECUENCIA: 23 pares de bases
TIPO DE FILAMENTO: Único
TOPOLOGÍA: Lineal
PROPIEDADES: Cebador
100

Claims (13)

1. Vector de expresión que comprende:
(a)
los genes de rep, ORF81 y trbA que codifican las proteínas implicadas en la replicación en Rhodococcus;
(b)
el gen parA que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 1;
(c)
un activador constitutivo de Rhodococcus que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 2;
(d)
una secuencia de clonación múltiple corriente abajo del activador;
(e)
por lo menos un gen que codifica un marcador genético seleccionado de entre los genes del operón cad, que proporcionan resistencia al cadmio, o los genes que codifican la resistencia a un antibiótico; y
(f)
el origen de replicación en E. coli.
2. Vector según la reivindicación 1, que comprende corriente abajo del activador constitutivo uno o más genes que codifican una proteína de interés.
3. Vector de expresión según la reivindicación 2, en el que las proteínas se seleccionan de entre las enzimas implicadas en la eliminación selectiva de azufre orgánico de los combustibles fósiles o de las enzimas implicadas en la producción de L-aminoácidos, enantiomorfos de compuestos quirales y ácidos carboxílicos.
4. Vector de expresión según la reivindicación 2, que comprende corriente abajo del activador constitutivo el operón sox que codifica las enzimas SoxA, SoxB y SoxC.
5. Vector de expresión según la reivindicación 1, obtenido por:
(1)
construcción de un vector plásmido de clonación que comprende:
(a)
los genes de rep, ORF81 y trbA que codifican las proteínas implicadas en la replicación en Rhodococcus;
(b)
el gen parA que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 1; y
(c)
por lo menos un gen que codifica un marcador genético seleccionado de entre los genes del operón cad, que proporcionan resistencia al cadmio, o los genes que codifican la resistencia a un antibiótico;
(2)
aislamiento de un activador constitutivo de Rhodococcus que presenta la secuencia SEC. ID. nº: 2; y
(3)
inserción de dicho activador constitutivo en el vector de clonación anterior.
6. Microorganismo que comprende el vector de expresión según las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho microorganismo se selecciona de entre Rhodococcus, Gordona y Nocardia.
7. Cepa de Rhodococcus que comprende el vector de expresión según las reivindicaciones 1 a 4, depositada con el número CBS 102447.
8. Procedimiento para la producción de proteínas homólogas o heterólogas de interés que comprende cultivar, en condiciones adecuadas, un microorganismo que comprende el vector de expresión según las reivindicaciones 1 a 4.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la proteína se selecciona de entre las enzimas implicadas en la eliminación selectiva del azufre orgánico de combustibles fósiles y en la producción de L-aminoácidos, enantiomorfos de compuestos quirales y ácidos carboxílicos.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que las proteínas son enzimas Sox y la cepa es SMV114 CBS 102447 de Rhodococcus.
11. Procedimiento para la eliminación del azufre orgánico de los combustibles fósiles caracterizado porque utiliza un microorganismo seleccionado de entre Rhodococcus, Gordona y Nocardia que comprende el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene el operón sox corriente abajo del activador constitutivo.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el microorganismo es SMV114 CBS 102447 de Rhodococcus.
13. Activador constitutivo de Rhodococcus que comprende la secuencia SEC. ID. nº: 2.
ES01200582T 2000-02-24 2001-02-19 Medios y procedimiento para la expresion de proteinas homologas y heterologas en cepas de rhodococcus. Expired - Lifetime ES2315256T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITMI00A0332 2000-02-24
IT2000MI000332A IT1317849B1 (it) 2000-02-24 2000-02-24 Mezzi e metodi per l'espressione di proteine omologhe ed eterologhe inceppi di rhodococcus.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2315256T3 true ES2315256T3 (es) 2009-04-01

Family

ID=11444153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01200582T Expired - Lifetime ES2315256T3 (es) 2000-02-24 2001-02-19 Medios y procedimiento para la expresion de proteinas homologas y heterologas en cepas de rhodococcus.

Country Status (7)

Country Link
EP (2) EP1127943B9 (es)
AT (1) ATE410517T1 (es)
DE (1) DE60136022D1 (es)
DK (1) DK1127943T3 (es)
ES (1) ES2315256T3 (es)
IT (1) IT1317849B1 (es)
SI (1) SI1127943T1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITMI20021217A1 (it) * 2002-06-05 2003-12-05 Enitecnologie Spa Promotore e vettore ad espressione in rhodococcus ed escherichia coli
JP3793812B2 (ja) * 2002-08-12 2006-07-05 独立行政法人産業技術総合研究所 低温での組み換えタンパク質の発現に適した新規発現ベクター
JP3944577B2 (ja) 2003-04-21 2007-07-11 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における組換えタンパク質を生産する方法
SG128683A1 (en) * 2003-10-31 2007-01-30 Daiichi Fine Chem Co Ltd Novel plasmids and utilization thereof
JP4493011B2 (ja) * 2004-06-11 2010-06-30 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸還元酵素及びその遺伝子
EP2970799A4 (en) 2013-03-14 2016-10-19 Univ Wyoming METHOD AND SYSTEMS FOR BIOLOGICAL COAL-TO-BIOFUELS AND BIOPRODUCTS
AU2014278749B2 (en) 2013-03-14 2018-03-08 The University Of Wyoming Research Corporation Conversion of carbon dioxide utilizing chemoautotrophic microorganisms

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132219A (en) 1990-02-28 1992-07-21 Institute Of Gas Technology Enzymes from Rhodococcus rhodochrous strain ATCC No. 53968, Bacillus sphaericus strain ATCC No. 53969 and mixtures thereof for cleavage of organic C--S bonds of carbonaceous material
US5358870A (en) 1990-02-28 1994-10-25 Institute Of Gas Technology Microemulsion process for direct biocatalytic desulfurization of organosulfur molecules
US5232854A (en) 1991-03-15 1993-08-03 Energy Biosystems Corporation Multistage system for deep desulfurization of fossil fuels
DE69432576T2 (de) 1993-02-15 2004-03-18 Daicel Chemical Industries, Ltd., Sakai Verfahren zur Herstellung von optischaktiven Epoxiden
GB9615852D0 (en) 1996-07-29 1996-09-11 Allied Colloids Ltd Production of amino acids and enzymes used therefor
US5804433A (en) * 1996-10-23 1998-09-08 Energy Biosystems Corporation Rhodococcus flavin reductase complementing DszA and DszC activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP2025755A8 (en) 2009-05-13
ATE410517T1 (de) 2008-10-15
ITMI20000332A0 (it) 2000-02-24
EP1127943A2 (en) 2001-08-29
ITMI20000332A1 (it) 2001-08-24
SI1127943T1 (sl) 2009-04-30
IT1317849B1 (it) 2003-07-15
EP1127943B9 (en) 2009-08-05
EP1127943B1 (en) 2008-10-08
EP1127943A3 (en) 2001-09-19
DK1127943T3 (da) 2009-02-16
EP2025755A1 (en) 2009-02-18
DE60136022D1 (de) 2008-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Debellé et al. Nucleotide sequence of Rhizobium meliloti RCR2011 genes involved in host specificity of nodulation
Sato et al. The cisA cistron of Bacillus subtilis sporulation gene spoIVC encodes a protein homologous to a site-specific recombinase
Grinter A broad-host-range cloning vector transposable to various replicons
Friedberg et al. The 5'-flanking region of the gene encoding the large subunit of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase is crucial for growth of the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 at the level of CO2 in air
Holloway et al. Identification and analysis of the dissimilatory nitrous oxide reduction genes, nosRZDFY, of Rhizobium meliloti
Hidalgo et al. Nucleotide sequence and characterization of four additional genes of the hydrogenase structural operon from Rhizobium leguminosarum bv. viciae
Kusano et al. Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase in Thiobacillus ferrooxidans
Hooykaas et al. Molecular mechanism of Ti plasmid mobilization by R plasmids: isolation of Ti plasmids with transposon-insertions in Agrobacterium tumefaciens
Mueller et al. Isolation and sequence of ctaA, a gene required for cytochrome aa3 biosynthesis and sporulation in Bacillus subtilis
Yang et al. A small plasmid, pCA2. 4, from the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 encodes a rep protein and replicates by a rolling circle mechanism
JPH08509873A (ja) ヘリコバクター感染に対する免疫組成物、該組成物に用いられるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸配列
US20220056457A1 (en) Cis conjugative plasmid system
Norel et al. Nucleotide sequence and functional analysis of the two nifH copies of Rhizobium ORS571
JP2021509582A (ja) ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の栄養要求株
ES2315256T3 (es) Medios y procedimiento para la expresion de proteinas homologas y heterologas en cepas de rhodococcus.
Essich et al. Chromosomal transformation in the cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum
Leyva et al. Genetic organization of the hydrogen uptake (hup) cluster from Rhizobium leguminosarum
ES2699479T3 (es) Microorganismos recombinantes y sus métodos de uso
Temple et al. Two genes for carbohydrate catabolism are divergently transcribed from a region of DNA containing the hexC locus in Pseudomonas aeruginosa PAO1
IL167067A (en) Plasmid-free clone of e. coli strain dsm 6601
Inouye et al. Expression and complementation analyses of a chloroplast-localized homolog of bacterial RecA in the moss Physcomitrella patens
Schäferjohann et al. Regulation of CO2 assimilation in Ralstonia eutropha: premature transcription termination within the cbb operon
Winteler et al. Anaerobically controlled expression system derived from the arcDABC operon of Pseudomonas aeruginosa: application to lipase production
Brehm et al. Molecular cloning and nucleotide sequence determination of the Bacillus stearothermophilus NCA 1503 superoxide dismutase gene and its overexpression in Escherichia coli
ES2285095T3 (es) Procedimiento para la introduccion selectiva de un enlace doble en un entramado de esteroide.